Summary
이 원고는 계면 형태를 시각화하면서 계면 장력과 표면 팽창 유변학을 동시에 측정하기 위해 마이크로 텐시오미터 / 공초점 현미경의 설계 및 작동을 설명합니다. 이것은 기술 및 생리학에서 중요한 인터페이스의 구조 - 속성 관계의 실시간 구축을 제공합니다.
Abstract
유체-유체 계면에 대한 표면-활성 분자의 흡착은 자연에서 유비쿼터스적이다. 이러한 계면을 특성화하려면 계면활성제 흡착률을 측정하고, 벌크 계면활성제 농도의 함수로서 평형 표면 장력을 평가하고, 평형 후 계면 영역의 변화에 따라 표면 장력이 어떻게 변하는지를 연관시켜야 합니다. 고속 공초점 현미경으로 형광 이미징을 사용하여 계면을 동시에 시각화하면 구조-기능 관계를 직접 평가할 수 있습니다. 모세관 압력 마이크로텐시오미터(CPM)에서, 반구형 기포가 1 mL 부피의 액체 저장소에서 모세관의 끝에 고정된다. 버블 인터페이스를 가로지르는 모세관 압력은 라플라스 방정식에 기초한 모델 기반 압력, 버블 곡률 또는 버블 영역 제어를 허용하는 상용 미세유체 유동 제어기를 통해 제어됩니다. Langmuir 물마루 및 펜던트 드롭과 같은 이전 기술과 비교하여 측정 및 제어 정밀도 및 응답 시간이 크게 향상되었습니다. 모세관 압력 변동을 밀리초 단위로 적용하고 제어할 수 있습니다. 버블 인터페이스의 동적 반응은 버블이 확장되고 수축함에 따라 두 번째 광학 렌즈를 통해 시각화됩니다. 버블 윤곽선은 원형 프로파일에 적합하여 버블 곡률 반경, R 및 결과를 무효화하는 원형으로부터의 편차를 결정합니다. 라플라스 방정식은 계면의 동적 표면 장력을 결정하는 데 사용됩니다. 평형 후, 컴퓨터 제어 마이크로 유체 펌프에 의해 작은 압력 진동을 부과하여 버블 반경 (0.001-100 사이클 / 분의 주파수)을 진동시켜 팽창 모듈러스를 결정할 수 있습니다 시스템의 전체 치수는 마이크로 텐시오미터가 고속 공초점 현미경의 렌즈 아래에 들어갈 정도로 충분히 작아서 형광 태그가 지정된 화학 종을 서브 미크론 측방향 분해능으로 정량적으로 추적 할 수 있습니다.
Introduction
계면활성제 필름으로 덮인 공기-물 계면은 일상 생활에서 유비쿼터스입니다. 계면 활성제 - 물 주입은 고갈 된 들판에서 오일 회수를 향상시키는 데 사용되며 셰일 가스 및 오일의 유압 파쇄 용액으로 사용됩니다. 기액 거품 및 액체 - 액체 에멀젼은 윤활유 및 세정제로서 많은 산업 및 과학 공정에 공통적이며 식품에서 일반적입니다. 계면에서의 계면활성제 및 단백질은 포장, 저장 및 투여 동안 항체 입체 형태를 안정화 1,2,3,4,5, 눈에서의 눈물막 안정성 6,7,8, 및 폐 역학9,10,11,12,13,14, 15.
계면과 그 성질에 흡착하는 표면 활성제 또는 계면활성제에 대한 연구는 많은 다른 실험 기술로 오랜 역사를 가지고 있습니다 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . 최근의 개발은 모세관 압력 마이크로 텐시오미터 (CPM)로, 다른 일반적인 방법 9,23,24,25보다 훨씬 적은 재료를 사용하면서 훨씬 작은 길이 스케일에서 고도로 곡선 된 인터페이스에서 계면 특성을 검사 할 수 있습니다. 공초점 형광 현미경 (CFM)은 CPM 22 또는 Langmuir 골짜기 20,26,27,28,29의 공기 - 물 계면에서 지질 및 단백질의 형태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 CPM과 CFM은 형태학적 현상을 동적 및 평형 계면 특성에 연결하여 생물학적 및 기술적 인터페이스에 대한 구조-기능 관계를 개발하기 위해 결합되었다.
CPM-CFM에 접근할 수 있는 계면 계면활성제 시스템에서 중요한 수많은 파라미터가 있다. CPM에서, 직경 30-200 μm의 기포가 유리 모세관 튜브의 팁에 고정된다. CPM의 이전 버전에서, 기포의 내부와 외부 사이의 모세관 압력 차이는 물 컬럼 및 진동 주사기 펌프 9,30을 통해 제어되었다; 여기에 설명 된 새 버전은 이들을 더 높은 정밀도의 컴퓨터 제어 마이크로 유체 펌프로 대체합니다. 표면 장력 (γ)은 펌프에 의해 설정된 계면을 가로 지르는 압력 강하, ΔP 및 기포의 곡률 반경, R의 광학 분석으로부터 라플라스 방정식 인 ΔP = 2γ / R을 통해 결정됩니다. 계면의 동적 표면 장력은 가용성 계면활성제를 함유하는 벌크 액체와 접촉하는 새로운 기포의 생성에 이어 10 ms 시간 분해능으로 결정될 수 있다. 계면활성제 흡착 역학은 확산도, 표면 커버리지, 벌크 농도와 평형 표면 장력 사이의 관계를 포함하는 계면활성제의 필수 특성을 결정하기 위해 고전적인 Ward-Tordai 방정식 10,31에 의해 설명될 수 있다. 일단 평형 표면 장력이 달성되면, 계면 영역은 진동화되어 팽창 탄성률을 측정하고, 표면 장력의 변화를 기록함으로써, 기포 표면적의 작은 변화에 의해 유도된, 
A32일 수 있다. 얽힌 중합체 또는 단백질과 같은 그들 자신의 내부 구조를 개발하는 보다 복잡한 계면의 경우, 표면 장력은, 보다 일반적인 표면 응력(4,33
)으로 대체된다.
호흡 동안의 폐 안정성은 폐포 공기-액체 계면(9,10)에서 낮은 표면 장력 및 높은 팽창 모듈러스 둘 다를 유지하는 것에 직접적으로 연결될 수 있다. 모든 내부 폐 표면은 조직 수화를 유지하기 위해 상피 라이닝 유체의 연속적이고 미크론 두께의 필름으로 라이닝된다(34). 이 상피 라이닝 유체는 주로 염 및 다양한 다른 단백질, 효소, 당 및 폐 계면 활성제와 함께 물입니다. 임의의 곡선형 액체-증기 계면의 경우와 마찬가지로, 모세관 압력은 폐포(또는 버블)의 내부에서 더 높은 압력으로 유도된다. 그러나 표면 장력이 폐 내의 모든 곳에서 일정하다면 라플라스 방정식 인 ΔP = 2γ / R은 작은 폐포가 더 큰 폐포에 비해 더 높은 내부 압력을 가하여 더 작은 폐포의 가스 내용물이 더 크고 낮은 압력 폐포로 흐르게한다는 것을 보여줍니다. 이것은 "라플라스 불안정"9,35로 알려져 있습니다. 최종 결과는 가장 작은 폐포가 붕괴되어 액체로 채워지고 다시 팽창하여 폐의 일부가 붕괴되고 다른 부분이 과도하게 팽창하여 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 전형적인 증상입니다. 그러나 제대로 기능하는 폐에서는 폐포 계면 영역의 공기 - 상피액 계면이 호흡 중에 팽창하고 수축함에 따라 표면 장력이 동적으로 변합니다. 만약, 또는 
라플라스 압력이 반경이 감소함에 따라 감소하고 반경이 
증가함에 따라 증가하여 라플라스 불안정성을 제거함으로써 폐(9)를 안정화시킨다. 따라서, 빈도, 
단층 형태학 및 조성, 및 폐포액 조성에 어떻게 의존하는지는 폐 안정성에 필수적일 수 있다. CPM-CFM은 또한 계면활성제 흡착(25), 단층형태학(22) 및 팽창 모듈러스(9)에 대한 계면 곡률의 효과에 대한 첫 번째 시연을 제공하였다. CPM 내의 저장소의 작은 부피(∼1 mL)는 액상의 신속한 도입, 제거 또는 교환을 허용하고, 고가의 단백질 또는 계면활성제(10)의 필요한 양을 최소화한다.
CPM-CFM 이미지에서의 콘트라스트는 계면(16,27)에서 형광 태깅된 지질 또는 단백질의 작은 분획의 분포에 기인한다. 2차원 계면활성제 단층은 종종 표면 장력 또는 표면 압력의 함수로서 측방향 상 분리를 나타내는데, 이는 깨끗한 유체-유체 계면의 표면 장력 차이이며, 
π0 및 계면활성제-피복 계면의 γ γ는 순수한 유체 표면 장력을 낮추π는 작용을 하는 계면에서의 계면활성제 분자의 상호작용에 의해 야기되는 2차원 "압력"으로 생각될 수 있다. 낮은 표면 압력에서, 지질 단일층은 액체-유사 무질서한 상태에 있고; 이것은 액체 팽창 (LE) 상으로 알려져 있습니다. 표면 압력이 증가하고 지질 분자 당 면적이 감소함에 따라, 지질은 서로 배향하고 장거리 정렬된 액체 응축 (LC) 상 16,20,27로 1차 상 전이를 겪을 수 있다. LE 및 LC 상은 다양한 표면 압력에서 공존할 수 있고, 형광 태깅된 지질이 LC 상으로부터 배제되고 LE 상으로 분리됨에 따라 가시화될 수 있다. 따라서, LE 상은 밝고 LC 상은 CFM16으로 이미징될 때 어둡다.
이 원고의 목표는 결합 된 공초점 현미경 마이크로 텐시오미터를 만들고 작동하는 데 필요한 단계를 설명하는 것입니다. 이를 통해 독자는 흡착 연구를 수행하고, 표면 장력, 유변학 적 행동을 측정하고, 미크론 규모의 공기 / 물 또는 오일 / 물 계면 계면에서 동시에 계면 형태를 검사 할 수 있습니다. 여기에는 필요한 모세혈관을 당기고, 자르고, 소수화하는 방법, 압력, 곡률 및 표면적 제어 모드를 사용하기 위한 지침, 그리고 마이크로텐시오미터 곡선 계면으로의 불용성 계면활성제의 계면 전달에 대한 논의가 포함된다.
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Protocol
1. 모세관의 제조
- 모세관을 모세관 풀러에 넣고 원하는 당김 프로그램을 실행하여 팁에서 ~ 1 μm의 외경 (OD)을 가진 두 개의 테이퍼 모세 혈관을 만듭니다.
참고: 당기기 전에 모세관의 OD는 마이크로텐시오미터 셀의 모세관 홀더에 맞도록 지정된 OD여야 합니다. 모세관의 내경(ID)은 다양할 수 있지만, 당김 후 모세관의 임계 반경에 영향을 미칠 것이다. 결과 테이퍼가 초기에 모세관 OD 및 ID를 신속하게 감소시킨 다음 원하는 모세관 OD 및 ID 근처의 반경에 도달한 다음 직경을 더 느리게 줄일 수 있도록 풀링 프로그램이 선택됩니다. 이것은 ID에서 30-100 μm의 사용 가능한 모세관을 산출하기 위해 스코어링될 수 있는 더 큰 모세관 길이를 생성할 것이다. - 원하는 지점에서 모세관의 팁을 스코어링하여 30-100 μm의 ID를 얻고 팁을 떼어내십시오. 모세관은 이제 팁에서 원하는 반경의 OD 및 ID를 갖습니다 (그림 1A). 모세혈관은 2단계까지 저장할 수 있다.
참고: 모세관의 절단면은 90° 깨끗한 파손이어야 합니다. 절단면의 결함은 모세관 및 불량한 표면 특성 측정에 대한 버블의 잘못된 고정으로 이어질 것입니다. 테이퍼 모세관 팁은 매우 섬세합니다. 그들은 해결책 이외의 것 (예 : 바이알 벽, 공기 노즐)과 접촉하면 파괴됩니다.
2. 모세혈관의 소수배양
- 당겨진 유리 모세관, 산성 세척 용액, 플라스틱 핀셋, 탈 이온화 (DI) 물, 소수화 용액 (에탄올 중 2 % 실란), 진공 펌프 및 에탄올 용액을 수집하십시오. 자세한 내용은 자료표를 참조하십시오.
주의: 산성 세척 용액은 절단 독성이 있고, 피부와 눈의 부식/자극을 일으키고, 산화되고 있습니다. 소수화 용액은 피부/눈/호흡기 자극제입니다. 눈 보호, 실험실 코트 및 장갑을 착용하고 흄 후드에서 솔루션으로 작업하십시오. - 산성 - 모세 혈관을 청소
참고: 모세관을 산 세척하면 모세관 내부의 유기 잔류물을 제거하고 모세관 소수성을 렌더링하는 실란화 반응을 위해 유리 표면을 준비합니다.- 핀셋으로 넓은 끝 근처에 모세관을 단단히 잡으십시오.
- 테이퍼 팁을 산성 세척액에 담그고 진공 펌프에서 모세관의 넓은 끝으로 호스를 부착하십시오. 이것은 모세관으로 용액을 빨아 들일 것입니다.
참고: 모세관 호스의 끝에 피펫 팁을 부착하여 모세관 끝단에 더 잘 맞을 수 있습니다. - 산 세척 용액이 모세관의 약 절반을 채우면 멈추십시오.
참고 : 산 세척 용액에서 모세관 팁을 제거한 후 모세관 외부의 용액은 종종 모세관 팁 근처에 비드를 형성합니다. 용액 바이알의 목에 모세관을 부드럽게 만져서 과도한 용액을 제거하십시오. - 산 세척 용액이 모세 혈관에 적어도 30 분 동안 남아있게하여 액체의 플러그가 모세관의 테이퍼 끝에 남아 있도록하십시오.
- 핀셋으로 모세관을 단단히 잡고 진공 호스를 사용하여 모세관의 큰 끝에서 액체를 꺼내 모세관에서 산 세척 용액을 제거하십시오.
- 모세관을 헹구십시오.
- 모세관의 테이퍼 끝단을 DI 물에 담그고 산성 세정액에 잠겨 있던 외부를 덮을 수 있을 만큼 충분히 깊게 잠기도록 합니다. 팁이 잠기는 동안 진공 호스를 사용하여 모세관을 통해 DI 물을 당깁니다. 물에서 모세관을 제거하고 진공 호스로 나머지 물을 제거하십시오.
- 위의 단계를 최소 4x 반복하십시오.
- 에탄올을 DI 물로 대체하는 단계 2.3을 다시 수행하십시오.
- 에탄올이 모세관 내부에서 완전히 증발 할 때까지 지속적으로 흡입하십시오. 모세관은 에탄올이 증발하기 시작할 때 흐리고 시원해지지만 30 ~ 45 초 후에 깨끗해질 것입니다.
- 모세관을 소수화 용액으로 코팅하십시오.
- 모세관의 넓은 끝을 에탄올 용액에 ~2% 실란에 간단히 담그십시오. 모세관 작용은 코팅 용액이 모세관 내에서 상승하도록 할 것이다. ~ 1cm 크기의 플러그가 모세관 내에서 상승하면 용액에서 모세관을 제거하십시오.
- 테이퍼 팁이 아래쪽을 향하도록 모세관의 방향을 조정하여 코팅 용액이 가늘어진 팁 쪽으로 중력과 함께 떨어지도록 합니다.
- 코팅 용액이 적어도 3분 동안 모세관에 남아 있도록 허용한다.
참고: 테이퍼 팁의 내부와 접촉하는 코팅 용액의 플러그에 기포가 없어야 합니다. 기포가 있는 경우, 모세관 내부는 단계 2.5에서 충분히 건조되지 않았을 가능성이 높다. 이 문제를 해결하려면 필요에 따라 2.4-2.6단계를 반복합니다.
- 모세혈관을 단계 2.3과 동일한 방법으로 에탄올 1x로 헹구었다.
- 모세관에 소수성 코팅을 설정하십시오.
- 깨끗하고 건조한 섬광 바이알을 120°C로 설정된 진공 오븐에 넣습니다. 코팅 된 모세 혈관을 바이알 (이상적으로는 바이알 당 하나의 모세관)에 넣고 넓은 끝이 바이알 바닥에 놓여 있습니다. 모세혈관이 모세혈관에 소수성 실란 층의 영구적인 결합을 달성하기 위해 적어도 6 h (하룻밤 선호) 동안 오븐에 남아있도록 허용한다. 모세혈관은 단계 4까지 저장될 수 있다.
3. 시료 준비 및 보관
- 오염을 피하기 위해 계면활성제와 형광단 용액을 깨끗한 산 세척 바이알에 혼합하고 보관하십시오.
참고: 상업적으로 이용가능한 지질은 가장 높은 순도를 가져야 하며 -20°C에서 사용 사이에 저장되어야 한다. 오래되거나 오염 된 지질은 종종 결과를 재현하기 어렵게 만듭니다.
4. 마이크로 텐시오미터 설정
- 도 2에 설명된 바와 같이 CPM 셀을 조립한다.
- 모세관의 큰 면을 CPM 셀의 위쪽에 놓고 세포의 아래쪽으로 밀어 넣을 때까지 놓습니다.
- PEEK 플러그를 부드럽게 조여 모세관을 고정한 다음 미세유체 펌프의 튜브를 모세관의 큰 쪽에 부착합니다. 테이퍼 모세관 팁에 닿지 않도록 주의하십시오.
- 필요한 경우 저장소 교환 및/또는 온도 제어 호스를 CPM 셀의 각 입구 및 출구에 연결합니다(그림 2). 그렇지 않으면 사용하지 않는 입구와 콘센트를 꽂습니다.
- CPM 셀을 공초점 현미경 단계에 부착하여 CFM 목표, CPM 카메라 및 CPM 광원과 대략적으로 정렬합니다(그림 3).
- 펌프의 권장 작동 압력(여기에 사용된 미세유체 펌프의 경우 150 mbar)에서 미세유체 펌프로의 가스 유동을 열고 모세관으로의 흐름이 개방되어 있는지 확인하십시오.
- 모세관 압력 진동 주파수 및 진폭이 0으로 설정된 상태에서 압력 제어 모드에서 CPM 가상 인터페이스(보충 코딩 파일 1: 마이크로텐쇼미터 가상 Interface.vi) 실행을 시작합니다(그림 4-7). 그림 4는 가상 인터페이스의 스크린샷을 보여 줍니다. DI 물과 ~35 μm의 모세관 반경의 경우, ~20 mbar의 압력은 모세관에 물이 들어가지 않도록 보장합니다.
- 피펫을 사용하여 CPM 셀을 물로 채웁니다.
- 마이크로 텐시오미터 카메라를 사용하여 모세관 팁에 초점을 맞춥니다.
- CFM으로 모세관 팁에 초점을 맞춥니다. 모세관을 찾는 데 어려움이 있는 경우 CPM 카메라를 사용하여 CFM 목표를 찾으십시오. 이렇게 하면 CFM 목표와 버블 사이의 거리를 근사화하여 올바른 작동 거리를 달성하는 데 도움이 됩니다.
- 환부(녹색 섹터 투영)가 거품에 중심을 둔 후 거품 가장자리를 명확하게 볼 수 있도록 수동으로 초점을 조정합니다(그림 4-3).
참고: 환부의 위치, 시작 및 끝 각도, 환부의 내부 및 외부 반지름은 보기 창 아래의 메뉴를 통해 조정할 수 있습니다. - 버블 재설정을 클릭하고 새 버블이 형성되었는지 확인하십시오 (이전 버블 팝을들을 수 있으며 제어판보기 창에서 새 버블을 관찰 할 수 있습니다). 그림 4-3). 거품이 터지지 않으면 재설정 압력을 높이거나 보기 창 아래의 버블 재설정 탭에서 재설정 지연 시간을 늘립니다. 표면 장력이 약 73mN/m(식염수 또는 물/기포의 경우)인지 확인합니다(그림 4-9).
- 직접 세포 주사기를 통해 물을 꺼내고(그림 3-13), 비운 다음 다시 부착합니다. 샘플을 로드하여 실험을 실행할 준비가 되었습니다.
5. 흡착 연구
- CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 원하는 샘플로 셀을 채웁니다. 새 버블 인터페이스가 생성될 때 초기 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
- 새로 형성된 버블의 반지름을 결정하고 해당 값을 중심선 영역 컨트롤에 입력하고(그림 4-7) 영역 제어 탭(그림 4-8)을 클릭하여 컨트롤 유형을 영역 컨트롤로 변경합니다.
참고: 일정한 압력 제어도 사용할 수 있지만 이로 인해 인터페이스의 표면 장력이 변경됨에 따라 버블 반경이 지속적으로 변경됩니다. 이러한 변화 영역은 계면활성제 흡착률의 분석을 복잡하게 만들고 연구 중에 기포를 터뜨릴 수 있다. - 공초점 비디오 녹화를 시작합니다.
- 버블 재설정(그림 4-5)을 클릭하고 즉시 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다. 버튼의 신호등이 녹색으로 바뀝니다.
- 도 4-6에 도시된 바를 슬라이딩하여 시료의 농도에 따라 데이터 기록 속도를 조절한다. 흡착률이 더 느리려면 더 느린 기록 속도를 사용합니다. 이는 초기에 더 높은 기록 속도가 필요한 경우 실행 중간에 조정할 수 있지만 파일 크기를 줄이기 위해 긴 연구에서는 느린 속도가 바람직합니다.
- 실험이 끝난 후(최종 표면 장력 고원에 도달한 경우) 올바른 파일 경로(그림 4-1)를 선택하고 저장 단추(그림 4-2)를 클릭하여 파일을 저장합니다.
- CFM에도 녹화를 중지하고 저장합니다.
6. 진동 / 이완 연구
- CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
- 샘플이 인터페이스에 완전히 흡착 될 때까지 기다리십시오. 이것은 새로운 버블 인터페이스로 다시 시작하는 대신 흡착 연구 직후에 수행 할 수 있습니다.
- 적절한 탭을 선택하고 원하는 기준선 값, 진동% 및 진동 주파수(그림 4-7)를 입력하여 진동이 압력 진동, 면적 진동 또는 곡률 진동인지 여부를 결정합니다.
참고: 톱니, 정사각형 및 삼각형 파동 영역 진동은 기타 영역 진동 탭의 드롭다운 메뉴에서도 액세스할 수 있습니다. - 공초점 비디오의 녹화를 시작하고 CPM 소프트웨어에서 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다.
- 진동을 시작합니다. 최상의 결과를 얻으려면 적어도 일곱 사이클을 기록해야 합니다. 데이터 수집 속도(그림 4-6)를 선택하여 각 발진 주기에 대해 적절한 수의 데이터 포인트를 제공합니다.
- 다른 진동 진폭 또는 주파수가 필요한 경우 실험 중에 값을 변경하십시오.
- 5.6단계와 5.7단계와 같이 결과를 저장합니다.
7. 용매 교환 연구
- CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
참고: 흡착 및/또는 진동 연구는 용매 교환 연구 이전에 수행될 수 있다. - 입구 튜브를 원하는 교환 용액 병(그림 3-11)과 연동 펌프(그림 3-10)에 연결합니다.
- 공초점 소프트웨어에서 비디오 녹화를 시작하고 CPM 소프트웨어에서 데이터 수집(그림 4-6)을 클릭합니다.
- 연동 펌프 속도를 설정합니다. 이것은 유체 교환 속도를 제어하며 실험에 대한 요구 사항, 즉 용매를 얼마나 빨리 교환해야하는지에 따라 선택되어야합니다.
- 여러 유체를 교환해야 하는 경우 연동 펌프를 중지하고 입구를 다른 교환 솔루션에 연결합니다.
- 교환이 완료된 후(~20분) 5.6단계와 5.7단계와 같이 결과를 저장합니다.
8. 불용성 계면활성제 흡착
참고: 흡착될 계면활성제가 저장고 액체에 용해되지 않는 경우, 이 방법은 단층을 세포의 공기/물 계면으로부터 기포 표면으로 전달하는 데 사용될 수 있다. 많은 이중층 형성 지질은 식염수 용액에 거의 불용성이며 저장고 용액에 현탁될 때 기포에 자발적으로 흡수되지 않는다.
- CPM 소프트웨어를 압력 제어 모드로 유지하는 오토클레이브 피펫을 사용하여 셀을 샘플로 채웁니다. 새로운 버블 인터페이스가 생성될 때 표면 장력이 약 73mN/m인지 확인하십시오.
- 불용성 계면활성제의 단일층을 휘발성 유기 용액 중의 용액으로부터 세포의 공기-물 계면 상에 증착한다. 주사기를 사용하여 계면에 작은 물방울을 증착하고 용매가 증발하여 지질을 박막으로 남겨 둡니다.
주의: 클로로포름은 포스파티딜콜린 및 지방산과 같은 인지질의 용매로 사용됩니다. 확산 용액은 보통 용매의 mL 당 0.01-0.02 mg의 지질이다. 클로로포름은 독성이 강하고 피부와 눈에 자극을 줄 수 있으며 발암 성입니다. 적절한 눈 보호, 실험실 코트 및 장갑을 착용하고 흄 후드에 용액을 만드십시오. - 거품이 거의 평평해질 때까지 기포의 중심선 압력 제어(그림 4-7)를 통해 표면적을 줄입니다. 이것은 계면활성제가 흡착된 후에 거품이 터지는 것을 방지한다.
- 공기/물 계면이 모세관의 끝을 지나 이동할 때까지 직접 세포 주사기를 통해 세포에서 저수지 액체를 제거합니다. 주사기 펌프를 사용할 수 있지만, 이 단계는 주사기를 수동으로 사용하여 달성될 수 있다.
- 저수지 액체 높이를 초기 수준으로 높입니다.
참고: 팁이 다시 잠기면 현재 계면에 흡착된 계면활성제로 인해 거품이 더 커집니다. 단층은 이제 진동 또는 용매 교환 실험을 위해 준비될 것이다.
9. 정리
- CFM을 끕니다.
- 압력 제어 모드로 변경합니다.
- 피펫을 사용하여 셀에서 샘플을 제거합니다. DI 물로 셀을 로드하고 ~ 50mbar까지 압력을 높여 거품이 모세관을 지속적으로 빠져나와 모세관 팁을 청소합니다. 이 과정을 2 배 반복하십시오.
- 안전 밸브를 닫고 왼쪽 상단 모서리에 있는 빨간색 버튼을 클릭하여 CPM을 끄고 표시등 및 파란색 압력 컨트롤 패널을 끄고 압력 소스를 닫습니다.
- 공초점 현미경 단계에서 세포를 제거하십시오. 에탄올과 DI 물로 세포를 헹구십시오. CPM 세포로부터 모세관 튜브를 제거한다.
10. 셀 청소
- 셀을 분해합니다. DI 물로 헹구는 동안 칫솔로 안쪽 벽을 닦으십시오. 부분을 에탄올에 담그고 ~ 30 분 동안 초음파 처리하십시오.
- DI 물로 모든 부분을 몇 번 헹구십시오. 질소 가스로 불거나 진공 오븐 안에서 건조시켜 부품을 건조시킵니다.
11. 진동 분석
- Dilatational_Rheology_Analysis.m 코드(보조 코딩 파일 2)를 실행하여 CPM 가상 인터페이스에서 저장할 원하는 파일을 선택합니다. 샘플 데이터는 보충 파일에 포함됩니다.
- 압력 대 시간 플롯은 보충 그림 1과 같이 표시됩니다. 진동이 시작되는 지점을 마우스 왼쪽 단추로 클릭하고 진동이 끝나는 지점을 다시 마우스 왼쪽 단추로 클릭합니다. 데이터에 여러 진동이 포함된 경우 모든 진동에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
- 모든 시작점과 끝점을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하면 아무 곳에서나 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 예를 들어, 보충 그림 1에 표시된 것처럼 1, 2, 3 및 4 지점을 마우스 왼쪽 단추로 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭할 수 있습니다.
참고: 코드는 확장 모듈러스와 위상각을 계산하고 결과는 원래 파일 위치의 새 .csv 파일에 기록됩니다. 샘플 데이터에 대한 결과는 보충 코딩 파일 2에 제공된 코드 결과에서 볼 수 있습니다. MATLAB은 또한 보충 그림 2와 같이 데이터의 여러 그래픽 표현을 생성합니다.
- 모든 시작점과 끝점을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하면 아무 곳에서나 마우스를 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다. 예를 들어, 보충 그림 1에 표시된 것처럼 1, 2, 3 및 4 지점을 마우스 왼쪽 단추로 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭할 수 있습니다.
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Representative Results
측정 오류의 주요 원인은 절단 공정(그림 5A,B) 또는 코팅 공정(그림 5D)에서 결함이 있는 모세혈관에서 발생합니다. 두 가지 유형의 결함 모두 광학 이미지 분석 시스템에 의해 버블 모양과 크기를 결정하는 데 오류를 일으켜 부정확 한 표면 장력 값을 초래합니다. 모세관을 CPM에 삽입하기 전에 광학 현미경으로 당겨서 코팅 한 후에 각각의 새로운 모세관을 신중하게 검사하는 것이 중요합니다. 잘못 절단된 모세관은 폐기해야 하지만, 제대로 코팅되지 않은 모세관은 산-세척되고 재코팅되어 모세관의 끝에서 버블 핀닝을 개선할 수 있다(프로토콜의 2단계). 모세관은 엔드 컷이 모세관(그림 5C)과 모세관 끝에 직접 있는 버블 핀(그림 5E)에 완벽하게 수직인 경우에 가장 잘 작동합니다. 모세관의 소수성 코팅은 사용시 핀닝에 덜 효과적이되어 모세관을 다시 청소하고 다시 코팅해야합니다.
계면활성제 흡착 대 시간에 대한 대표적인 데이터는 도 6에 제시되어 있다. 계면활성제 흡착을 측정하기 위해 사용된 펜던트 또는 세실 방울과 같은 이전의 실험 기술들은 표면 장력의 변화가 흡착 동안 기포 면적의 변화를 야기함에 따라 모세관 압력을 동적으로 조절하는 메커니즘을 갖지 않았다(30,36,37). 실제로, 더 큰 기포 및 방울의 경우, 모세관 압력이 독립적으로 측정되지 않고 모세관 압력이 방울 또는 기포 표면(37)에 걸쳐 변하기 때문에 계면 형상의 분석으로부터 표면 장력을 결정하기 위해 기포 또는 방울 형상(및 그에 따른 표면적)의 변화가 요구된다. 이것은 또한 계면에 계면활성제가 흡착됨에 따라 표면 장력이 감소하고 라플라스 방정식을 만족시키기 위해서는 기포의 표면적이 증가해야하므로 평형에 도달하기 위해 흡착하기 위해 추가 계면활성제가 필요하기 때문에 흡착 분석을 복잡하게 만듭니다. CPM에서, 고정된 모세관 압력은 표면 장력이 너무 많이 감소할 경우 기포가 모세관으로부터 토출되는 것을 방지하기 위해 계면활성제 흡착 전에 초기 기포 반경이 작은 범위 내에 있어야 함을 요구한다. 계면활성제 흡착 역학은 종종 일정한 계면 영역의 깨끗한 계면에 계면활성제 분자의 흡착을 설명하는 고전적인 Ward-Tordai 방정식31에 의해 모델링됩니다. Ward-Tordai 방정식은 변화하는 표면적을 설명하기 위해 수정 될 수 있지만, 이것은 추가 매개 변수를 도입하고 분석38,39를 크게 복잡하게 만듭니다.
이러한 문제를 극복하기 위해, 모세관 압력을 동적으로 조정함으로써 흡착 공정 전반에 걸쳐 기포 상수의 곡률(및 표면적)을 보유하는 라플라스 방정식을 사용하여 모델 기반 피드백 루프가 개발되었다. 기포의 면적이 지속적으로 증가하지 않기 때문에 표면 장력의 변화율에 상당한 차이가 있습니다. 흡착 중 기포 영역의 변화는 표면 장력이 처음에는 천천히 변한 다음 평형 전에 빠르게 가속화됨에 따라 시간이 지남에 따라 일정하지 않습니다. 또 다른 합병증은 영역의 분수 변화가 초기 기포 반경에 달려 있다는 것입니다. 일정한 버블 반경의 또 다른 이점은 버블 표면이 고정된 상태로 유지됨에 따라 계면을 이미징하는 것이 단순화되어 CFM의 초점을 단순화한다는 것입니다. 흡착 과정 동안, 계면활성제가 계면에 흡착함에 따라(비디오 1), 계면으로부터의 형광 신호가 증가한다. 계면활성제가 표면 도메인을 형성하는 경우, 이들 도메인은 형성 및 성장(22)을 관찰할 수 있다.
영역 진동 동안의 표면 장력의 변화는 그림 7에 나와 있습니다. CPM의 이전 버전에서, 진동은 기포 모세관 압력에서 이루어졌다; 그러나 모세관 압력에서 사인파를 생성하는 것은 라플라스 방정식을 통해 두 가지가 관련되어 있기 때문에 표면적의 사인파로 직접 변환되지 않습니다. Laplace 방정식을 사용하는 모델 기반 피드백 루프를 활용하면 모세관 압력이 아닌 영역에서 진동이 생성되어 더 넓은 범위의 진폭에서 분석하고 수집하기가 더 쉬운 데이터로 이어집니다. 그 결과, 이 방법으로부터 수집된 표면 장력 대 면적 데이터는 계면활성제 층의 계면 팽창 모듈러스를 직접 계산하는데 사용될 수 있고(도 8), 
여기서 
시스템의 총 응력 및 τ 응력은 단순 계면활성제 용액(4,33)에서 종종 부재하는 비등방성 일탈적 응력이다. 따라서, 간단한 계면활성제 시스템의 경우, 
. 표면 활성 단백질과 같이 탄성 네트워크가 형성 될 수있는 인터페이스의 경우, 여분의 스트레스가 종종 존재하므로 팽창 모듈러스를 정의 할 때 설명해야합니다. 비디오 2는 인지질 단일층에서 연속적인 착색된 LE 상 매트릭스에서 검정 LC 도메인의 움직임의 CFM 비디오를 도시한다. 인터페이스 상의 별개의 LC 도메인들은 곡선형 버블(22,40) 상에서 진동이 일어날 때 인터페이스를 커버하는 분지화 네트워크로 재구성된다. 기타 영역 진동 탭은 보충 그림 3에서 볼 수 있듯이 톱니, 사각형 및 삼각형 파동을 만드는 데 사용할 수 있으며 압축 탭은 일정한 속도 영역 압축 및 확장을 허용합니다.
용매 교환 연구를 위해, 계면활성제는 먼저 계면에 흡착되도록 허용되고, 그 다음에는 저장고 액체가 교환되어 두 번째 표면 활성 종들이 그 계면에 접촉할 수 있게 한다. 두 번째 계면활성제가 계면에서 원래의 계면활성제와 경쟁함에 따라 표면 장력의 변화를 조사할 수 있다. 표면 팽창 모듈러스는 종종 CFM을 통한 표면 형태학과 함께 계면활성제 교환의 더 민감한 프로브이다. 도 9는 이러한 용매 교환이 일어나는 하나로서 표면 장력, 표면 팽창 모듈러스, 및 표면 모폴로지의 변화를 보여준다. 이러한 교환의 특이성은 다양할 수 있지만, 세 가지 특성 중 어느 하나에 대한 변경은 두 번째 성분을 단층으로 통합하거나 일차 성분을 벌크로 용매화하는 것을 나타낼 수 있다. 두 번째 형광 태그는 CFM 이미지로부터의 인터페이스와의 상호작용을 관찰하기 위해 이차 종에 부착될 수 있다.
도 1: 모세관 처리 . (A) 모세관의 스코어링을 보여주는 이미지. 유리 스코어링 세라믹은 클램프에 고정되어 안정적으로 유지됩니다. (B) 모세관의 산-세정. 산 세척 용액은 진공 펌프로 모세관으로 끌어 당겨진다. (c) 모세관의 소수화. 모세관 내부에 보관 된 실란 솔루션 플러그 는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 셀 구성. (1) 대형 알루미늄 셀 홀더, (2) 불소 엘라스토머 가스켓 (총 4개), (3) 유리 슬라이드 (총 2개), (4) PEEK 셀 및 (5) 소형 알루미늄 셀 홀더. 조립될 때, 플루오로엘라스토머 가스켓은 각 유리 슬라이드의 양쪽에 배치된다. 셀은 나사와 볼트와 함께 고정됩니다. PEEK 셀의 줌인 이미지는 (6) 모세관 포트, (7) 용매 교환 유입구, (8) 용매 교환 출구, 및 (9,10) 온도 조절 재킷 입구 및 출구와 같은 다양한 포트의 위치를 보여줍니다. PEEK 플러그를 사용하여 튜브 또는 모세관을 셀에 부착할 수 있습니다. 사용하지 않는 포트는 채널이 없는 플러그로 완전히 닫을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 확장하지 않는 CPM/CFM의 회로도. (1) CPM 세포, (2) 팁에 기포가 있는 모세관 튜브, (3) 공초점 현미경 목표물, (4) 필터가 있는 현미경 카메라 대물, (5) CPM 광원, (6) 미세유체 펌프, (7) 안전 밸브, (8) 유체 교환 유입구, (9) 유체 교환 출구, (10) 연동 펌프, (11) 교환 유체 저장소, (12) 유체 교환 폐기물, (13) 세포 주사기에 직접 연결, (14) 온도 조절 재킷 입구 및 출구, 및 (15) 온도 제어 저장소 및 펌프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CPM 가상 인터페이스. (1) 데이터가 저장될 파일 경로; (2) 시스템 매개 변수, 주석 및 저장 버튼. 이 영역의 모든 필드는 최종 데이터 파일에 저장됩니다. (3) CPM 카메라 영상; (4) 이미지 분석, 환부 측정, 버블 리셋 및 초당 프레임 추적을 제어하는 설정; (5) 버블 리셋 버튼; (6) 데이터 수집 버튼, 데이터 기록 속도 제어 및 데이터 수집 표시기; (7) 모든 작동 모드 중심선 값, 발진 진폭 및 발진 주파수에 대한 제어; (8) 작동 모드 전환 : 각 탭을 클릭하면 해당 제어 모드로 변경됩니다. 각 모드는 "압력 신호"그래프에서 펌프로 전송되는 압력 신호와 몇 가지 추가 제어를 보여줍니다. (9) 살아있는 표면 장력 데이터; (10) 라이브 압력 데이터; (11) 곡률 데이터의 라이브 반경; (12) 라이브 표면적 데이터; 및 (13) 진동 연구 동안 위상각을 대략적으로 결정하는데 사용될 수 있는 라이브 표면 장력 및 표면적 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 모세관 결함. (A) 및 (B) 모세혈관의 미스컷; (C) 모세관을 정확하게 절단하고, (D) 불량 또는 열화 된 코팅으로 인한 불량 피닝이있는 모세관, (E) 모세관을 적절하게 고정시킵니다. D 와 E 의 빨간색 화살표는 거품이 고정된 위치를 나타냅니다. 최상의 결과를 얻으려면 거품이 모세관 팁에 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 정압(주황색) 및 정영역(파란색) 흡착 모두에 대한 흡착 연구 마이크로텐시오미터 결과. 일정한 영역 흡착에 대한 기포 표면적은 연구 전반에 걸쳐 상당히 증가하고, 흡착이 동일한 표면 장력에 도달하는 데 더 오래 걸리게 한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 일반적인 표면적 제어 진동 . (A) 압력, (B) 곡률 및 (C) 표면적 데이터. 표면적 데이터는 정현파이지만 압력 및 곡률 데이터는 진동의 중간 지점에 있지 않은 중심선 값에 의해 입증 된 바와 같이 정현파입니다. 세 값 사이의 수학적 관계는 오직 하나만 진정한 정현파가 될 수 있음을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 8: 분석 후 샘플 유변학적 결과. 리소 PC (1-팔미토일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포콜린)의 확장 모듈러스는 ~45 μm 반경 기포에 대한 라이소 PC의 농도를 증가시키기 위한 빈도의 함수이다. 염증을 동반하는 >0.1 mM의 Lyso PC의 농도는 정상 환기/호흡률(황색)의 범위에 걸쳐 팽창 모듈러스를 감소시켜 2ε-γ < 0을 만들며, 이는 라플라스 불안정(점선 빨간색 선)을 유도하기 위한 크로스오버 값이다. 정상 폐에서 발생할 수 있는 Lyso PC ≤0.01 mM의 저농도는 불안정성을 유도하지 않는다. >10rad/sec의 주파수에서 모든 Lyso PC 농도는 크로스오버 이상이며 라플라스 불안정에 취약하지 않습니다. 실선은 이론적으로 데이터에 적합합니다. 도 9로부터 재현된도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 9: DI 물 및 이어서 Lyso PC로 교환된 폐 계면활성제에 대한 용매 교환 연구에 대한 CFM 및 CPM 결과 . (A)는 연구 전반에 걸쳐 표면 장력 및 표면 팽창 모듈러스가 어떻게 변하는지를 보여준다. 그래프는 네 개의 영역으로 나뉘어집니다 : 폐 계면 (파란색), LS가 DI 물과 교환 될 때 (녹색), 교환 용액이 Lyso PC 용액으로 전환 될 때 (빨간색), 그리고 세포가 Lyso PC 용액으로 채워질 때 (주황색). 이 속성은 인터페이스가 변경되고 있음을 나타내는 다양한 교환기 전체에서 변경되는 것을 볼 수 있습니다. (B)는 교환 전에 계면에 흡착된 폐 계면활성제의 공초점 이미지를 나타내고, (C)는 Lyso PC 용액과의 교환이 완료된 후의 동일한 표면을 나타낸다. 두 경우 모두 흰색 점선 원은 모세관의 내부 가장자리를 나타냅니다. 단층 상의 도메인의 구조는 용매 교환 후에 급격하게 변화하여, CPM 결과를 확증한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 : 폐 계면 활성제에 대한 정압 흡착 연구의 공초점 비디오. false-color는 비디오의 왼쪽에 있는 색상 막대와 함께 z 방향의 거리를 표시하며, 보라색은 모세관 근처의 거품을 나타내고 녹색은 거품의 상단입니다. 계면은 초기에 단지 약간의 형광 계면활성제만이 흡착됨에 따라 희미하게 조명된다. 점점 더 많은 계면활성제가 흡착됨에 따라, 색상이 녹색으로 점점 더 이동함에 따라 거품이 커지기 시작하고 인터페이스는 인터페이스를 가로 질러 이동할 수있는 검은 LC 도메인으로 채워집니다. 용액 중의 계면활성제의 응집체는 밝은 비정질 형상으로 용액 중에 떠 다니는 것을 볼 수 있으며, 몇몇은 기포 계면 상에 정착하여 계면활성제를 분해하고 계면 상에 증착한다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 폐 계면 활성제에 대한 진동 연구의 공초점 비디오. false-color는 비디오의 왼쪽에 있는 색상 막대가 있는 z 방향의 거리를 표시합니다. 표면은 여러 가지 다른 진동 주파수를 겪게 되고 계면 상의 어두운 LC 도메인은 진동 전반에 걸쳐 변화함을 알 수 있다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 확장 유변학을 결정하기 위한 코드의 중간 단계의 예. 이 화면이 나타나면 사용자가 분석할 진동의 가장 왼쪽 가장자리를 마우스 왼쪽 단추로 클릭한 다음 맨 오른쪽 가장자리를 마우스 왼쪽 단추로 클릭해야 합니다. 다중 진동을 분석하여 사용자가 1, 2, 3 및 4를 마우스 왼쪽 단추로 클릭한 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 이 두 진동을 분석할 수 있습니다. 표시된 진동은 진폭과 주파수가 다릅니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: 확장 유변학 코드에 의해 생성된 그래픽 결과의 예. 이것은 압력, 반경, 표면적 및 표면 장력의 진동에 대한 정현파의 적합뿐만 아니라 각 진동의 푸리에 변환을 보여줍니다. 이상적으로, 푸리에 변환의 두 번째 고조파는 표면적 및 표면 장력에 대한 첫 번째 고조파의 10% 미만이어야 합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 3: 대체 작동 모드. (A) 사인파, (B) 톱니파, (C) 구형파, (D) 삼각형파, (E) 일정한 속도 팽창 및 (F) 일정한 속도 압축. 압축 및 광대 한 모드는 Langmuir 유형 등온선이 불용성 계면 활성제에 대해 생성 될 수있게합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 1 : 마이크로 텐시오미터 가상 Interface.vi. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 파일 2: Dilatational_Rheology_Analysis분 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
결합 된 CPM / CFM은 계면 역학, 평형 및 형태를 검사하기위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 CPM/CFM으로 데이터를 얻는 데 필요한 단계를 설명합니다.
도 2는 표시된 모세관, 용매 및 열 교환을 위한 채널을 갖는 셀 설계를 도시한다. 용매 교환을위한 입구는 세포의 하단에 있어야하며 출구는 상단에 있어야하므로 교환 중에 셀이 오버플로되지 않도록해야합니다. 실제로, 입구 및 출구 유량은 동일한 연동 펌프에 대해 약간 다를 수 있다. 이 셀 설계의 한 가지 일반적인 문제점은 셀에서 누출되는 것입니다. 이것은 셀과 연결 중 하나 사이의 연결 불량으로 인해 가장 자주 발생하지만 모든 연결이 건조하고 누출되지 않으면 셀을 둘러싼 볼트의 과도한 조임으로 인해 셀의 유리 슬라이드에 균열이 생길 수 있습니다.
그림 3은 다양한 펌프와 셀 간의 연결뿐만 아니라 CFM 및 CPM 목표와 셀의 정렬을 보여줍니다. CPM 카메라(4)는 동작 중에 버블 형상을 영상화하는데 사용된다. CPM 카메라에는 CFM 흥미 진진한 레이저 빛이 CPM 카메라에 들어 가지 못하게하는 광학 필터가 장착되어 있어야합니다. 그렇지 않으면 CFM 레이저가 CPM 카메라의 이미지를 매우 시끄럽고 이미지 분석을 사용하여 맞추기 어렵게 만듭니다. 안전 밸브는 모세관과 미세 유체 펌프 (7)를 연결하고 셀에서 펌프에 도달하는 역류의 위험없이 펌프 및 공기 압력 소스를 변경할 수 있도록합니다. 두 번째 밸브(13)는 주사기에 대한 접근을 제공하여 저장고 내외로 유체를 직접 주입할 수 있게 한다. 유체는 누출의 경우에 저장고에 첨가될 필요가 있을 수 있고, 프로토콜의 단계 8(불용성 계면활성제 흡착) 동안 제거될 필요가 있거나 공초점 목적에 부착되어 있는 경우 모세관으로부터 퍼징된 기포를 제거해야 할 수도 있다.
각 실험 중에 몇 가지 주요 단계를 신중하게 수행해야 합니다. 장비가 작동 중일 때 발생하는 대부분의 문제는 모세관 자체와 관련이 있습니다. 따라서 신중한 절단 및 코팅은 어려움을 최소화 할 수 있습니다. 모세관을 원하는 직경으로 절단하는 것은 어렵고 수율이 낮은 공정입니다. 모세관의 끝에있는 칩이나 고르지 않은 것은 거품 반경의 가난한 판독으로 이어질 것입니다. 또한 소수성 코팅이 올바르게 적용되지 않거나 시간과 사용에 따라 분해되면 거품이 모세관 끝에 제대로 고정되지 않습니다. 이것은 진동 연구 중에 모세관 내부에 고정되거나 모세관 내부를 따라 미끄러지는 것처럼 보이는 기포로 나타낼 수 있습니다. 잘 자르지 만 제대로 고정되지 않는 모세관은 회수되고 소수성으로 처리 될 수 있습니다.
또 다른 주요 단계와 가능한 오류 원인은 동일한 물질의 다른 재료 또는 다른 농도 사이의 세포 저장소, 튜브 및 모세관을 청소하는 것입니다. 저수지에는 많은 작은 틈새가 있으며 계면 활성제는 제대로 청소하지 않으면 나중에 취한 측정을 흡착하고 변경할 수 있습니다. 전지의 완전한 분해 및 흡수는 종종 과도한 표면 활성 물질의 제거를 보장하기 위해 요구된다. 동일한 계면활성제의 일련의 농도를 연구해야하는 경우 가장 낮은 농도를 사용하여 시작하는 것이 좋습니다.
때로는 공초점 목적으로 모세관 튜브를 정렬하는 것이 어려울 수 있습니다. 마이크로 텐시오미터 카메라는 공초점 목표를 정렬하는 데 사용할 수 있지만 CFM 목표의 작동 거리가 넓으면 도움이되지 않을 수 있습니다. 공초점 현미경이 모세관의 끝 너머로 초점을 맞추는 경우, 형광 물질이 없는 영역인 모세관 단면도 목적의 배향을 돕기 위해 사용될 수 있다. 모세관 기포가 배출되지 않으면, 모세관에 공급되는 압력에 문제가 있을 수 있다(이는 정상 작동 시 150 mbar로 가정됨). 이것은 압력 제어 모드로 들어가서 압력을 높은 값으로 설정하여 확인할 수 있습니다. 압력이 설정 압력에 도달하지 않으면, 미세유체 펌프로부터 튜빙에 누출이 발생하거나 펌프가 충분한 가스 압력을 받지 못할 가능성이 있다. 표면 과학과 관련된 많은 연구와 마찬가지로, 오염 물질이 어느 시점에서도 솔루션에 도입되지 않도록하는 것이 중요합니다. 판독값이 예상과 맞지 않는 경우(표면 장력이 너무 낮게 시작되거나 너무 빨리 감소하는 경우), 새 샘플을 만들거나 잘 연구된 샘플 또는 순수한 액체를 사용하는 것도 문제 해결의 초기 단계입니다.
다른 실험 목표를 달성하기 위해 장치에 몇 가지 변형이 이루어질 수 있다. 오일 또는 물이 모세관 내에 추가될 수 있어서, 공기-물 계면(39) 대신에 오일-물의 연구를 가능하게 한다. 이것은 펌프로의 역류의 위험을 증가시키므로 추가적인주의를 기울여야하며, 잠재적으로 펌프와 모세관 사이의 튜브에 오일 트랩을 추가해야하는 경우가 있습니다.
CPM/CFM에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. CPM은 시스템의 펌프 및 광학 장치에 대한 모세관 OD에 대해 20-300 μm의 제한된 모세관 크기의 작동 범위를 갖는다. 용매 교환기(41) 또는 여기에 기술된 방법을 사용하여 계면에 불용성 계면활성제를 첨가할 수 있지만, 표면 농도는 표면 장력 대 면적 등온선을 수행하고 랑뮤어 트로프로부터 수득된 것과 비교하는 것으로부터만 추론될 수 있다. CFM은 형광 물질만 검출할 수 있으므로 형광이 아닌 물질이나 형광으로 태그가 지정되지 않은 물질은 시각화할 수 없습니다. 많은 계면활성제는 작은 분자이며, 이들을 태깅하면 잠재적으로 그들의 특성을 변화시킬 수 있지만, 이것은 단백질 또는 폴리머26,27과 같은 더 큰 표면 활성 분자에 대해서는 덜 문제가되어야합니다.
이 방법은 계면활성제가 함유된 계면의 이전 CPM 및 CFM 분석에 비해 몇 가지 주요 이점을 가지고 있습니다. 가장 중요한 것은 하이브리드 계측기가 다양한 동적 및 평형 표면 특성을 측정하는 동안 인터페이스를 시각화 할 수 있다는 것입니다. 계면의 형태학의 변화는 계면 역학 및 유변학적 특성에 직접적으로 연결될 수 있다. 계면활성제-함유 계면의 이전 CFM은 평평한 랑뮤어 트로프 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47을 사용하여 수행되었으며, 한편 여기에 설명된 방법은 고도로 곡선화된 계면(22)에서 수행될 수 있다. . 또한 전체 인터페이스를 한 번에 이미징하여 특정 도메인의 실시간 추적 가능한 변화를 보여주는 반면, Langmuir 트로프의 표면 흐름은 공초점 시각적 창 안팎으로 흐르는 도메인으로 이어졌습니다. 이 장치의 표면 압축도 등방성이며 Langmuir 골짜기의 장벽은 특정 압축 방향을 가지고 있습니다. CPM은 Langmuir 트로프에서 가능한 것보다 훨씬 빠른 영역 진동을 허용합니다.
본 연구에서 새로운 곡률 및 영역 기반 제어는 CPM30의 이전 버전에 비해 큰 이점을 갖는다. 전형적으로, 기포 크기는 고정된 모세관 압력을 설정함으로써 조절되었다; 팽창 모듈리 측정을 위해, 모세관 압력이 진동되었다. 모세관 압력이 일정하게 유지되면, 계면활성제가 계면에 흡착함에 따라, 기포의 표면 장력이 감소한다. 라플라스 방정식인 ΔP = 2γ/R을 만족시키려면 표면 장력이 감소함에 따라 곡률 반경이 감소해야 합니다. CPM 내의 반구형 기포의 경우, 기포 곡률 반경을 감소시키면 기포 면적이 9,48로 증가한다:
여기서 Rc는 모세관 반경이고 R은 곡률의 기포 반경이다. 기포의 변화하는 반경은 흡착 동안 계면의 면적을 변화시켜 Ward-Tordai 방정식10,38을 사용하여 흡착 분석을 복잡하게 만듭니다 또한 기포의 표면 장력이 충분히 낮아지면 기포 반경이 모세관 반경보다 작아지고 기포가 배출됩니다. 이 새로운 CPM/CFM의 피드백 루프는 흡착 전반에 걸쳐 버블 영역을 일정하게 유지하므로 원래의 Ward-Tordai 방정식을 사용할 수 있고 기포 배출의 위험이 없으며 표면이 영역에서 증가하지 않을 때 흡착이 더 빨리 발생합니다. 진동 연구를 위해, 압력에서 사인파를 생성해도 표면적(48)에서 사인파가 생성되지 않는다. 이전의 CPM 방법들은 압력 구동 진동에 의해 야기된 영역 변화가 사인파(48)에 근사하도록 하기 위해 진동을 작게 유지하는 것에 의존하였다. 설명된 방법은 버블의 영역을 직접 제어하고 계면 영역에서 진정한 사인파 진동을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 응력 (표면 장력의 변화)을 계면 변형 (표면적의 변화)과 직접 관련시켜 확장 모듈러스를 계산할 수 있습니다.
이 프로토콜의 구현을 돕기 위해 마이크로텐시오미터를 제어하는 코드에 대한 간략한 설명이 여기에 설명되어 있습니다. 이 코드는 루프의 세 세그먼트로 구성됩니다 : 하나는 미세 유체 펌프에 명령을 실행하고, 하나는 버블의 리셋 메커니즘을 제어하고, 다른 하나는 버블의 반경을 측정하고 계산 된 값을 저장합니다. 펌프 컨트롤러에는 압력 제어, 곡률 제어 및 영역 제어의 세 가지 주요 작동 모드가 있습니다. 압력 제어에서 사용자는 펌프에 의해 생성 된 압력에 대한 설정점을 직접 입력합니다. 이 모드는 피드백 루프가 필요하지 않기 때문에 중요하며 모드 중 가장 안정적입니다. 곡률 제어는 이전에 측정된 표면 압력과 라플라스 방정식을 사용하여 주어진 곡률의 계면을 생성하는 데 필요한 압력을 계산합니다. 표면적 제어 모드는 구형 캡의 형상을 기반으로 주어진 표면적을 생성하는 데 필요한 곡률을 계산하여 이를 기반으로 하며, 모세관 반지름을 정밀하게 측정해야 합니다. 이 두 모드는 흡착 및 진동 연구에 특히 유용하지만 일관된 표면 압력 데이터의 꾸준한 스트림이 필요합니다. 따라서 이러한 두 컨트롤러로의 피드는 더 나은 기능을 위해 원시 데이터에서 매끄럽게 처리해야 할 수 있습니다. 용액이 충분히 명확하지 않을 때, 종종 매우 탁한 샘플로 인해, 버블 인터페이스의 좋은 이미지를 얻는 것이 불가능하기 때문에이 모드는 제대로 작동하지 않습니다. 진동에 대한 컨트롤도 코드의 이 섹션에 포함되어 있습니다. 코드의 중간 세그먼트를 사용하면 모세관 내에서 거품을 제거 할 수 있습니다. 여기서, 모세관의 설정 압력은 높은 값으로 설정되고 설정된 시간 동안 유지되어 기포가 터지고 새로운 인터페이스가 생성될 수 있게 한다. 코드의 마지막 섹션은 비전 수집 소프트웨어를 사용하여 거품의 가장자리를 추적하고 반경을 측정합니다. 이 반지름은 라플라스 방정식과 함께 사용되어 표면 장력을 계산한 다음 루프의 초기 부분에 공급됩니다.
이 하이브리드 CPM/CFM 기술은 공기-물 계면에서 모델 및 임상 폐 계면활성제에 대한 우리의 연구에 크게 도움이 되는 것으로 입증되었습니다. 기포 치수는 인간 폐의 폐포에 있는 치수와 근사하며, 폐 계면활성제 단층의 형태학 및 역학에 대한 계면 곡률의 영향은 9,10,22로 관찰될 수 있다. 하이브리드 기기는 또한 석유 화학에서 가정용 화학 물질, 눈물 필름에서 항체 안정화에 이르기까지 다양한 응용 분야에서 유비쿼터스 인 다른 표면 활성 물질의 연구에도 중요합니다. 결합 된 CPM / CFM을 통해 위상으로 분리 된 도메인의 규모에서 동적 계면 특성을 조사하고 외부 조건이 변함에 따라 표면의 형태를 시각화 할 수 있습니다. 이 방법은 최소한의 크기의 샘플을 사용하여 값 비싼 재료가 필요한 응용 분야에서 특히 유용합니다. 계면 역학과 단층 형태학의 동시 관찰은 다른 어떤 기술로도 거의 불가능하므로 계면 과학 분야에 광범위하게 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
모든 공초점 현미경 이미지는 니콘 A1RHD 멀티포톤 직립 공초점 현미경을 사용하여 수득하였다. 우리는 미네소타 대학의 대학 이미징 센터에서 지원 직원, 특히 기예르모 마르크스 (Guillermo Marques)의지도와 도움을 인정합니다. 이 작업은 NIH Grant HL51177에 의해 지원되었습니다. SI는 Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 O.D. Tygon tubing | Fischer Scientific | Tubing | |
| A1RHD Multiphoton upright confocal microscope | Nikon | Confocal Microscope | |
| Acid Cleaning Solution | Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting | ||
| Alnochromix | Alconox | 2510 | Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution |
| Ceramic glass cutter | Sutter Instruments | ||
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650471 | HPLC Plus |
| Curosurf | Chiesi | Lung Surfactant | |
| Di Water | 18.5 MΩ - cm | ||
| Ethanol | any | 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning | |
| Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator | Dolan-Jenner Industries Inc. | 281900100 | Light source; other light sources should work as well |
| Flow EZ F69 mbar w/Link Module | Fluigent | LU-FEZ-0069 | Microfluidic Pump |
| Fluigent SDK VIs | Fluigent | Required for CPM virtual Interface | |
| Fluoroelastomer gaskets | Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3 | ||
| Gas filter | Norgren | F07-100-A3TG | Put between microfluidic pump and pressure regulator |
| Gas regulator | Norgren | 10R0400R | Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi |
| Glass Capilary | Sutter Instruments | B150-86-10 | Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm |
| Glass Slide | any | 75 mm x 25 mm | |
| Glass Syringe | Hamilton | 84878 | 25 μL glass syringe |
| Hydrophobizing Agent | Sigma-Aldrich | 667420 | 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted |
| Insoluble surfactant | Avanti | 850355C-200mg | 16:0 DPPC in chloroform |
| LabVIEW Software | National Instruments | 2017 | |
| Longpass Filter | ThorLabs | FEL0650 | 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence |
| Lyso-PC | Avanti | 855675P | 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine |
| Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/ Easy-Load II pump head | Masterflex | HV-77916-20 | Peristaltic Pump |
| MATLAB | Mathworks | R2019 | |
| Micropipette Puller P-1000 | Sutter Instruments | Capillary Puller | |
| Microtensiometer Cell and Holder | Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4 | ||
| Microtensiometer Objective | Nikon | Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm | |
| NI Vision Development Module | National Instruments | Required for CPM virtual Interface | |
| PEEK finger tight fittings | IDEX | F-120x | 10-32 Coned Ports |
| PEEK plug | IDEX | P-551 | 10-31 Coned Ports |
| pippette tips | Eppendorf | 22492225 | 100 μL - 1000 μL, Autoclaved |
| Plastic Forceps | Thermo Scientific | 6320-0010 | |
| Plastic Syringe | Fischer Scientific | 14-955-459 | 10 mL |
| Plumbing parts | Fischer Scientific | 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing. | |
| Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL | Eppendorf | 3123000063 | Micro pipetter |
| Sulfuric Acid | any | Used for acid cleaning solution | |
| T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm | Nikon | Confocal Microscope Objective | |
| Texas Red DHPE triethylammonim salt | Thermo Fischer Scientific | 1395MP | Fluorophore |
| Vaccum Pump | Gast | DOA-P704-AA |
References
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