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Engineering

Microtensiometer para Visualização de Microscopia Confocal de Interfaces Dinâmicas

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Este manuscrito descreve o desenho e o funcionamento de um microscópio microtensiômetro/confocal para fazer medições simultâneas de tensão interfacial e reologia dilatacional superficial enquanto visualiza a morfologia interfacial. Isso proporciona a construção em tempo real das relações estrutura-propriedade de interfaces importantes em tecnologia e fisiologia.

Abstract

A adsorção de moléculas ativas da superfície para interfaces fluido-fluido é onipresente na natureza. Caracterizar essas interfaces requer medir as taxas de adsorção de surfactantes, avaliar as tensões superficiais de equilíbrio em função da concentração de surfactante em massa e relacionar como a tensão superficial muda com as mudanças na área interfacial após o equilíbrio. A visualização simultânea da interface usando imagens de fluorescência com um microscópio confocal de alta velocidade permite a avaliação direta das relações estrutura-função. No microtensiometer de pressão capilar (CPM), uma bolha de ar hemisférica é fixada no final do capilar em um reservatório líquido de volume de 1 mL. A pressão capilar através da interface de bolha é controlada através de um controlador de fluxo microfluido comercial que permite pressão baseada em modelo, curvatura de bolhas ou controle de área de bolha com base na equação de Laplace. Em comparação com técnicas anteriores, como o cocho Langmuir e a queda do pingente, a precisão de medição e controle e o tempo de resposta são muito aprimorados; variações de pressão capilar podem ser aplicadas e controladas em milissegundos. A resposta dinâmica da interface de bolha é visualizada através de uma segunda lente óptica à medida que a bolha se expande e contrai. O contorno da bolha é adequado a um perfil circular para determinar o raio de curvatura da bolha, R, bem como quaisquer desvios de circularidade que invalidariam os resultados. A equação de Laplace é usada para determinar a tensão dinâmica da superfície da interface. Após o equilíbrio, pequenas oscilações de pressão podem ser impostas pela bomba microfluida controlada por computador para oscilar o raio da bolha (frequências de 0,001-100 ciclos/min) para determinar o módulo dilatational As dimensões gerais do sistema são suficientemente pequenas para que o microtensiômetro se encaixe sob a lente de um microscópio confocrática de alta velocidade permitindo que espécies químicas fluorescentes marcadas sejam rastreadas quantitativamente com resolução lateral.

Introduction

Interfaces ar-água cobertas por filmes surfactantes são onipresentes no cotidiano. As injeções de água surfactante são usadas para melhorar a recuperação de óleo de campos empobrecidos e são usadas como soluções de fraturamento hidráulico para gás de xisto e óleo. Espumas gás-líquido e emulsões líquido-líquidos são comuns a muitos processos industriais e científicos como lubrificantes e agentes de limpeza e são comuns em alimentos. Surfactantes e proteínas nas interfaces estabilizam as conformações de anticorpos durante a embalagem, armazenamento e administração 1,2,3,4,5, estabilidade do filme lacrimal no olho 6,7,8 e mecânica pulmonar 9,10,11,12,13,14, 15 anos.

O estudo de agentes superanativos ou surfactantes que adsorvam interfaces e suas propriedades tem uma longa história com muitas técnicas experimentais diferentes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Um desenvolvimento recente é o microtensiometer de pressão capilar (CPM), que permite o exame de propriedades interfaciais em interfaces altamente curvas, em escalas de comprimento muito menores, ao mesmo tempo em que utiliza significativamente menos materiais do que outros métodos comuns 9,23,24,25. A microscopia de fluorescência confocal (CFM) pode ser usada para estudar a morfologia de lipídios e proteínas nas interfaces ar-água no CPM22 ou nos cochos langmuir 20,26,27,28,29. Aqui, um CPM e CFM foram combinados para conectar fenômenos morfológicos a propriedades interfaciais dinâmicas e de equilíbrio para desenvolver relações estrutura-função para interfaces biológicas e tecnológicas.

Existem inúmeros parâmetros de importância em sistemas de surfactante interfacial acessíveis ao CPM-CFM. No CPM, uma bolha de ar de 30-200 μm de diâmetro é fixada na ponta de um tubo capilar de vidro. Nas versões anteriores do CPM, a diferença de pressão capilar entre o interior e o exterior da bolha foi controlada através de uma coluna de água e bomba de seringa oscilatória 9,30 ; a nova versão descrita aqui substitui-as por uma bomba microfluidica de maior precisão, controlada por computador. A tensão superficial (γ) é determinada através da equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir da queda de pressão através da interface definida pela bomba, ΔP, e análise óptica do raio de curvatura da bolha, R. A tensão dinâmica da superfície da interface pode ser determinada com resolução de tempo de 10 ms após a geração de uma nova bolha em contato com um líquido a granel contendo um surfactante solúvel. A dinâmica de adsorção surfactante pode ser descrita pela clássica equação Ward-Tordai10,31 para determinar propriedades essenciais do surfactante, incluindo a difusividade, a cobertura da superfície e a relação entre concentração a granel e tensão superficial de equilíbrio. Uma vez alcançada uma tensão superficial de equilíbrio, a área interfacial pode ser oscilada para medir o módulo dilatational, Equation 1registrando as mudanças na tensão superficial, induzidas por pequenas mudanças na área da superfície da bolha, A32. Para interfaces mais complexas que desenvolvem suas próprias estruturas internas, como polímeros emaranhados ou proteínas, a tensão superficial, é substituída por um estresse superficial mais geral 4,33, Equation 2.

A estabilidade pulmonar durante a respiração pode estar diretamente ligada à manutenção de uma tensão superficial baixa e um módulo dilatational elevado na interface alveolar ar-líquido 9,10. Todas as superfícies pulmonares internas são forradas com uma película contínua e espessa de fluido de revestimento epitelial para manter a hidratação tecidual34. Este fluido de forro epitelial é principalmente água, com sais e várias outras proteínas, enzimas, açúcares e surfactante pulmonar. Como é o caso de qualquer interface curva de vapor líquido, uma pressão capilar é induzida com a pressão maior no interior do alvéolo (ou bolha). No entanto, se a tensão da superfície era constante em todos os lugares dentro dos pulmões, a equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, mostra que alvéolos menores teriam uma pressão interna maior em relação aos alvéolos maiores, forçando o conteúdo gasoso dos alvéolos menores a fluir para alvéolos de menor pressão. Isso é conhecido como "Instabilidade Laplace"9,35. O resultado líquido é que os menores alvéolos entrariam em colapso e seriam preenchidos com líquido e se tornariam difíceis de reinflar causando o colapso de parte do pulmão, e outras partes inflariam demais, ambas sintomas típicos da síndrome do sofrimento respiratório agudo (ARDS). No entanto, em um pulmão em funcionamento adequado, a tensão da superfície muda dinamicamente à medida que a interface do fluido ar-epitelial na área interfacial alveolus se expande e contrai durante a respiração. Se Equation 3, ou Equation 4, a pressão de Laplace diminuir com o raio decrescente e aumenta com o raio crescente de modo a eliminar a instabilidade de Laplace, estabilizando assim o pulmão9. Assim, Equation 5e como depende da frequência, da morfologia e composição da monocameira, e da composição do fluido alveolar pode ser essencial para a estabilidade pulmonar. O CPM-CFM também forneceu as primeiras demonstrações dos efeitos da curvatura interfacial na adsorçãosurfactante 25, morfologia monocamadas22 e módulo dilatational9. O pequeno volume (~1 mL) do reservatório no CPM permite a rápida introdução, remoção ou troca da fase líquida e minimiza a quantidade necessária de proteínas caras ou surfactantes10.

O contraste em uma imagem CPM-CFM deve-se à distribuição de pequenas frações de lipídios ou proteínas fluorescentes na interface16,27. Monocamadas surfactantes bidimensionais geralmente exibem separação de fase lateral em função da tensão superficial ou pressão da superfície, Equation 6 π é a diferença entre a tensão superficial de uma interface fluido-fluido limpo, γ0, e uma interface coberta de surfactante, γ. π pode ser pensado como a "pressão" 2D causada pelas interações de moléculas surfactantes na interface que age para diminuir a superfície de tensão pura. Em baixas pressões superficiais, as monocamadas lipídicas estão em um estado desorganizado semelhante a líquido; isso é conhecido como a fase expandida líquida (LE). À medida que a pressão superficial aumenta e a área por molécula lipídica diminui, os lipídios se orientam entre si e podem passar por uma transição de fase de primeira ordem para a fasecondensada líquida de longo alcance (LC) fase 16,20,27. As fases LE e LC podem coexistir em várias pressões superficiais e podem ser visualizadas à medida que lipídios marcados fluorescentes são excluídos da fase LC e segregados à fase LE. Assim, a fase LE é brilhante e a fase LC é escura quando imagens com CFM16.

O objetivo deste manuscrito é descrever os passos necessários para construir e operar o microtensiometer de microscópio confocal combinado. Isso permitirá ao leitor realizar estudos de adsorção, medir a tensão superficial, o comportamento reológico e examinar a morfologia interfacial simultaneamente em uma interface de ar/água/água em escala de míccro ou óleo/água. Isso inclui uma discussão sobre como puxar, cortar e hidrofobizar os capilares necessários, instruções para o uso de modos de controle de pressão, curvatura e área de superfície, e transferência interfacial de surfactante insolúvel para a interface curva do microtensiometer.

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Protocol

1. Preparação de tubos capilares

  1. Coloque o capilar em um puxador capilar e execute o programa de puxar desejado para fazer dois capilares afilados com um diâmetro externo (OD) de ~1 μm na ponta.
    NOTA: O OD do capilar antes de puxar deve ser o OD especificado para caber no suporte capilar na célula microtensiômetro. O diâmetro interno (ID) do capilar pode variar, mas afetará o raio crítico do capilar após a puxar. Um programa de puxar é escolhido para que o taper resultante inicialmente reduza o OD capilar e o ID rapidamente, em seguida, atinge um raio perto do desejado capilar OD e ID, e, em seguida, reduz o diâmetro mais lentamente. Isso criará um comprimento capilar maior que pode ser pontuado para produzir um capilar utilizável de 30-100 μm em ID.
  2. Marque a ponta do capilar no local desejado para obter um ID de 30-100 μm e quebrar a ponta. O capilar agora terá um OD e Y do raio desejado na ponta (Figura 1A). Os capilares podem ser armazenados até o passo 2.
    NOTA: A borda cortada do capilar deve ser uma ruptura limpa de 90°. Qualquer defeito na borda de corte levará a uma má fixação da bolha nas medidas capilares e ruins da propriedade superficial. Pontas capilares cilarias são muito delicadas. Eles serão destruídos se entrarem em contato com qualquer outra coisa que não as soluções (por exemplo, paredes de frasco, bico de ar).

2. Hidrofobização de capilares

  1. Reúna capilares de vidro puxados, solução de limpeza de ácido, pinça plástica, água desionizada (DI), solução de hidrofobização (2% de silano no etanol), bomba de vácuo e solução de etanol. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes.
    ATENÇÃO: A solução de limpeza de ácido é acutly tóxica, causa corrosão/irritação da pele e dos olhos, é oxidante. A solução de hidrofobização é um irritante de pele/olho/respiratório. Use proteção ocular, jalecos e luvas e trabalhe com soluções em um capô de fumaça.
  2. Limpe o capilar
    NOTA: A limpeza ácida do capilar remove quaisquer resíduos orgânicos dentro do capilar e prepara a superfície de vidro para a reação de silanização que torna o hidrofóbico capilar.
    1. Pegue um capilar firmemente perto de sua extremidade larga com a pinça.
    2. Mergulhe a ponta afilada na solução de limpeza de ácido enquanto prende a mangueira da bomba de vácuo à extremidade larga do capilar. Isso vai sugar a solução para o capilar.
      NOTA: Uma ponta de pipeta pode ser anexada à extremidade da mangueira capilar para permitir um melhor ajuste com a extremidade capilar.
    3. Pare quando a solução de limpeza de ácido tiver preenchido cerca de metade do capilar.
      NOTA: Após a remoção da ponta capilar da solução de limpeza ácida, a solução no exterior do capilar muitas vezes forma uma pérola perto da ponta capilar. Toque suavemente o capilar no pescoço do frasco de solução para remover o excesso de solução.
    4. Permita que a solução de limpeza de ácido permaneça nos capilares por pelo menos 30 minutos, garantindo que o plugue do líquido permaneça na extremidade afilada do capilar.
    5. Remova a solução de limpeza de ácido do capilar, segurando firmemente o capilar com a pinça e usando a mangueira de vácuo para retirar o líquido da extremidade grande do capilar.
  3. Enxágüe o capilar
    1. Submergir a extremidade cila círada do capilar em água DI garantindo que ela esteja submersa o suficiente para cobrir qualquer exterior que tenha sido submerso na solução de limpeza de ácido. Enquanto a ponta estiver submersa, use a mangueira de vácuo para puxar a água DI através do capilar. Retire o capilar da água e remova a água restante com a mangueira de vácuo.
    2. Repita o passo acima pelo menos 4x.
  4. Realizar a etapa 2.3 novamente substituindo o etanol por água DI.
  5. Aplique a sucção continuamente até que o etanol evapore completamente do interior do capilar. O capilar ficará nublado e frio ao tocar à medida que o etanol começa a evaporar, mas vai limpar depois dos 30 a 45 s.
  6. Cubra o capilar com a solução de hidrofobização
    1. Mergulhe brevemente a extremidade larga do capilar no silano de ~2% na solução de etanol. A ação capilar fará com que a solução de revestimento suba dentro do capilar. Remova o capilar da solução uma vez que um plugue de tamanho de ~1 cm tenha aumentado dentro do capilar.
    2. Oriente o capilar para que a ponta afilada fique voltada para baixo, permitindo que a solução de revestimento caia com gravidade em direção à ponta afilada.
    3. Deixe que a solução de revestimento permaneça no capilar por pelo menos 3 minutos.
      NOTA: Não deve haver bolhas de ar no plugue da solução de revestimento que esteja em contato com o interior da ponta afilada. Se houver uma bolha de ar, então o interior capilar provavelmente não secou suficientemente na etapa 2.5. Para remediar isso, repita as etapas 2.4-2.6 conforme necessário.
  7. Enxágüe os capilares com etanol 1x da mesma forma que o passo 2.3.
  8. Coloque o revestimento hidrofóbico no capilar
    1. Coloque frascos de cintilação limpos e secos em um forno a vácuo definido para 120 °C. Coloque capilares revestidos nos frascos (idealmente um capil por frasco) com extremidades largas apoiadas na base do frasco. Permita que os capilares permaneçam no forno por pelo menos 6h (pernoite preferido) para alcançar a ligação permanente da camada de silano hidrofóbico com os capilares. Os capilares podem ser armazenados até o passo 4.

3. Preparação e armazenamento de amostras

  1. Misture e armazene soluções de surfactante e fluorforeiro em frascos limpos lavados com ácido para evitar contaminação.
    NOTA: Os lipídios disponíveis comercialmente devem ser da maior pureza e armazenados entre o uso a - 20 °C. Lipídios velhos ou contaminados muitas vezes causam dificuldades de reprodução de resultados.

4. Configuração do microtensiômetro

  1. Monte a célula CPM conforme descrito na Figura 2.
    1. Coloque o lado grande do capilar na parte superior da célula CPM até que ele empurre para a parte inferior da célula.
    2. Aperte suavemente o plugue PEEK para fixar o capilar e, em seguida, conecte o tubo da bomba microfluidica ao lado grande do capilar. Tenha cuidado para não tocar na ponta capilar afilada.
  2. Conforme necessário, conecte as mangueiras de troca e/ou controle de temperatura das respectivas entradas e saídas na célula CPM (Figura 2); caso contrário, conecte as entradas e tomadas nãousadas.
  3. Conecte a célula CPM ao estágio do microscópio confocal, alinhando-a aproximadamente com o objetivo cfm, câmera CPM e fonte de luz CPM (Figura 3).
  4. Abra o fluxo de gás para a bomba microfluida na pressão de operação recomendada da bomba (150 mbar para a bomba microfluida usada aqui) e garanta que o fluxo para o capilar esteja aberto.
  5. Comece a executar a interface virtual CPM (Arquivo de Codificação Suplementar 1: Microtensiometer Virtual Interface.vi) no modo controle de pressão com a frequência de oscilação de pressão capilar e amplitude definida para zero (Figura 4-7). A Figura 4 mostra uma captura de tela da interface virtual. Para água DI e um raio capilar de ~35 μm, uma pressão de ~20 mbar garante que nenhuma água entre no capilar.
  6. Encha a célula CPM com água usando uma pipeta.
  7. Concentre-se na ponta capilar usando a câmera microtensiometer.
  8. Concentre-se na ponta capilar com o CFM. Se houver dificuldade em encontrar o capilar, use a câmera CPM para encontrar o objetivo do CFM. Isso ajudará a aproximar a distância entre o objetivo do CFM e a bolha, alcançando a distância de trabalho correta.
  9. Depois que o anulus (projeção do setor verde) estiver centrado na bolha, ajuste manualmente o foco para que a borda da bolha possa ser vista claramente (Figura 4-3).
    NOTA: A posição, o ângulo de partida e a extremidade e os raios internos e externos do anulo podem ser ajustados através do menu abaixo da janela de exibição.
  10. Clique em Reset Bubble e certifique-se de que uma nova bolha seja formada (será possível ouvir o velho estouro de bolha, e a nova bolha será observável da janela de visualização do painel de controle; Figura 4-3). Se a bolha não estourar, aumente a pressão de reset ou aumente o tempo de atraso de reset na guia Redefinir bolhas abaixo da janela de visualização. Verifique se a tensão superficial está em torno de 73 mN/m (para bolhas salinas ou de água/ar) (Figura 4-9).
  11. Tire a água através da seringa direta à célula (Figura 3-13), esvazie-a e recoloque-a. A amostra está pronta para carregar para executar o experimento.

5. Estudo de adsorção

  1. Encha a célula com a amostra desejada usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão inicial da superfície está em torno de 73 mN/m quando uma nova interface de bolha é criada.
  2. Determine o raio da bolha recém-formada e a entrada que valorizem o controle da área central (Figura 4-7) e altere o tipo de controle para o controle da área clicando na guia Controle de área (Figura 4-8).
    NOTA: O controle constante de pressão também pode ser usado, mas isso faz com que o raio da bolha mude continuamente à medida que a tensão superficial da interface muda. Essa mudança de área pode complicar a análise das taxas de adsorção de surfactantes e fazer com que a bolha estoure durante o estudo.
  3. Comece a gravar o vídeo confocal.
  4. Clique em Reset Bubble (Figura 4-5) e clique imediatamente em Coletar Dados (Figura 4-6). A luz de sinalização no botão ficará verde.
  5. Ajuste a taxa de registro de dados de acordo com a concentração da amostra deslizando a barra mostrada na Figura 4-6. Para adsorções mais lentas, use uma taxa de gravação mais lenta. Isso pode ser ajustado no meio de uma corrida se uma taxa de gravação mais alta for desejada no início, mas uma taxa mais lenta é preferível para estudos longos, a fim de reduzir o tamanho do arquivo.
  6. Após o término do experimento (quando um platô de tensão de superfície final foi atingido), salve o arquivo escolhendo o caminho correto do arquivo (Figura 4-1) e clicando no botão Salvar (Figura 4-2).
  7. Pare e salve a gravação no CFM também.

6. Estudo de oscilação/relaxamento

  1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m quando uma nova interface de bolha é criada.
  2. Aguarde até que a amostra seja totalmente adsorvida à interface. Isso pode ser realizado diretamente após um estudo de adsorção em vez de começar de novo com uma nova interface de bolha.
  3. Decida se a oscilação será uma oscilação de pressão, oscilação de área ou oscilação de curvatura selecionando a guia apropriada (Figura 4-8) e digitando o valor de linha de base desejada, oscilação% e frequência de oscilação (Figura 4-7).
    NOTA: As oscilações da área de onda detomó, quadrada e triangular também estão acessíveis a partir do menu suspenso na guia Oscilação de Outras Áreas .
  4. Inicie a gravação do vídeo confocal e clique em Coletar dados (Figura 4-6) no software CPM.
  5. Comece a oscilação. Certifique-se de registrar pelo menos sete ciclos para melhores resultados. Escolha uma taxa de aquisição de dados (Figura 4-6) para dar um número adequado de pontos de dados para cada ciclo de oscilação.
  6. Se forem desejadas outras amplitudes de oscilação ou frequências, altere os valores durante o experimento.
  7. Guarde os resultados como nas etapas 5.6 e 5.7.

7. Estudo de troca de solventes

  1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo de controle de pressão. Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m, quando uma nova interface de bolha é criada.
    NOTA: Estudos de adsorção e/ou oscilação podem ser realizados antes do estudo de troca de solventes.
  2. Conecte o tubo de entrada com a garrafa da solução de troca desejada (Figura 3-11) à bomba peristáltica (Figura 3-10).
  3. Inicie a gravação do vídeo no software confocal e clique em Coletar dados (Figura 4-6) no software CPM.
  4. Defina a velocidade da bomba peristáltica. Isso controlará a taxa de troca de fluidos e deve ser escolhido com base nos requisitos para o experimento, ou seja, quão rápido o solvente precisa ser trocado.
  5. Se vários fluidos precisarem ser trocados, pare a bomba peristáltica e conecte a entrada a outra solução de troca.
  6. Após o término da troca (~20 min), guarde os resultados como na etapa 5.6 e 5.7.

8. Adsorção de surfactante insolúvel

NOTA: Se o surfactante a ser adsorvido não for solúvel no líquido do reservatório, este método pode ser usado para transferir uma monocamada da interface ar/água da célula para a superfície da bolha. Muitas bicamadas que formam lipídios são quase insolúveis em solução salina e não absorvem espontaneamente a bolha quando suspensas na solução do reservatório.

  1. Encha a célula com a amostra usando uma pipeta autoclaved mantendo o software CPM no modo controle de pressão . Certifique-se de que a tensão da superfície está em torno de 73 mN/m, quando uma nova interface de bolha é criada.
  2. Deposite uma monocamada de surfactante insolúvel na interface ar-água da célula a partir de uma solução em uma solução orgânica volátil. Usando uma seringa, deposite pequenas gotículas na interface e permita que o solvente evapore deixando o lipídio para trás como um filme fino.
    ATENÇÃO: O clorofórmio é usado como solvente para fosfolipídios como fosfattidylcholinas e ácidos graxos. As soluções de disseminação são geralmente 0,01-0,02 mg de lipídio por mL do solvente. O clorofórmio é agudamente tóxico, pode causar irritação na pele e nos olhos, e é cancerígeno. Use proteção ocular adequada, jaleco e luvas e faça a solução em um capô de fumaça.
  3. Diminua a área da superfície através do controle de pressão da linha central (Figura 4-7) da bolha até que ela esteja quase plana. Isso evita que a bolha apareça depois que o surfactante tenha adsorte.
  4. Remova o líquido do reservatório da célula através da seringa direta à célula até que a interface ar/água passe pela ponta do capilar. Enquanto uma bomba de seringa pode ser usada, esta etapa pode ser alcançada usando manualmente a seringa.
  5. Aumente a altura líquida do reservatório para o nível inicial.
    NOTA: Depois que a ponta for resubssumida, a bolha será maior devido ao surfactante que agora é adsorvida na interface. A monocamadas estará agora pronta para experimentos de oscilação ou troca de solventes.

9. Limpar

  1. Desligue o CFM.
  2. Mude para o modo controle de pressão .
  3. Remova a amostra da célula usando uma pipeta. Carregue a célula com água DI e apareçam a pressão para ~50 mbar para fazer com que as bolhas escapem constantemente da capilaridade e limpem a ponta capilar. Repita este processo em 2x.
  4. Feche a válvula de segurança e desligue o CPM clicando no botão vermelho no canto superior esquerdo, desligue a luz e o painel de controle de pressão azul e feche a fonte de pressão.
  5. Remova a célula do estágio do microscópio confocal. Enxágüe a célula com etanol e água DI. Remova o tubo capilar da célula CPM.

10. Limpeza da célula

  1. Desmonte a cela. Escove a parede interna com uma escova de dentes enquanto enxagua em água DI. Submergir as peças no etanol e sonicá-la por ~30 min.
  2. Enxágüe todas as peças com água DI algumas vezes. Seque as peças soprando-as com gás nitrogênio ou secando-as dentro de um forno a vácuo.

11. Análise de oscilação

  1. Execute o código Dilatational_Rheology_Analysis.m (Arquivo de Codificação Suplementar 2), escolhendo o arquivo desejado salvo da interface virtual CPM. Os dados da amostra estão incluídos nos arquivos suplementares.
  2. O gráfico de pressão versus tempo aparecerá como mostrado na Figura Suplementar 1. Clique à esquerda no ponto onde a oscilação começa e clique à esquerda novamente onde a oscilação termina. Se os dados contiverem múltiplas oscilações, repita este processo para todas as oscilações.
    1. Quando todos os pontos de partida e final tiverem sido clicados à esquerda, clique à direita no mouse em qualquer lugar. Por exemplo, como mostrado na Figura Suplementar 1, pode-se deixar o clique nos pontos 1, 2, 3 e 4, seguido por um clique à direita.
      NOTA: O código calculará o módulo dilatational e o ângulo de fase e os resultados serão escritos em um novo arquivo .csv no local do arquivo original. Os resultados dos dados da amostra podem ser vistos nos resultados do código fornecidos no Arquivo de Codificação Suplementar 2. O MATLAB também gerará várias representações gráficas dos dados, conforme mostrado na Figura Suplementar 2.

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Representative Results

Uma das principais fontes de erro de medição surge dos capilares que possuem defeitos, seja do processo de corte (Figura 5A,B) ou do processo de revestimento (Figura 5D). Ambos os tipos de defeitos levam a erros na determinação da forma e tamanho da bolha pelo sistema óptico de análise de imagens, levando a valores imprecisos de tensão superficial. É importante examinar cuidadosamente cada novo capilar depois de ser puxado e revestido sob o microscópio óptico antes de inserir o capilar no CPM. Um capilar de corte errado deve ser descartado, mas um capilar mal revestido pode ser limpo a ácido e revestido para melhorar a bolha fixando no final do capilar (passo 2 do Protocolo). Os capilares funcionam melhor se o corte final for perfeitamente perpendicular ao capilar (Figura 5C) e os pinos de bolha diretamente no final do capilar (Figura 5E). O revestimento hidrofóbico no capilar se tornará menos eficaz na fixação com uso, exigindo que o capilar seja re clean e revestido.

Os dados representativos para adsorção de surfactante versus tempo são apresentados na Figura 6. Técnicas experimentais anteriores, como um pingente ou gotas de sessile usadas para medir a adsorção de surfactantes, não tinham um mecanismo para ajustar dinamicamente a pressão capilar, pois a mudança na tensão superficial faz com que a área da bolha mude durante a adsorção 30,36,37. De fato, para bolhas e gotas maiores, mudanças na forma de bolha ou queda (e, portanto, área da superfície) são necessárias para determinar a tensão superficial a partir da análise da forma da interface, uma vez que a pressão capilar não é medida independentemente e a pressão capilar varia sobre a superfície de gota ou bolha37. Isso também complica a análise da adsorção, pois como adsorbs surfactantes para a interface, a tensão superficial diminui, e para satisfazer a equação de Laplace a área de superfície da bolha deve aumentar, exigindo surfactante adicional para adsorb para alcançar o equilíbrio. No CPM, uma pressão capilar fixa requer que o raio inicial da bolha deve estar dentro de uma pequena faixa antes da adsorção surfactante para evitar que a bolha ejete do capilar se a tensão da superfície diminuir demais. A dinâmica de adsorção surfactante é frequentemente modelada pela clássica equação Ward-Tordai31, que descreve a adsorção de moléculas surfactantes para uma interface limpa de área interfacial constante. Embora a equação Ward-Tordai possa ser modificada para explicar a mudança da área da superfície, isso introduz parâmetros adicionais e complica muito a análise38,39.

Para superar essas questões, um loop de feedback baseado em modelo foi desenvolvido usando a equação de Laplace que mantém a curvatura (e a área da superfície) da bolha constante durante todo o processo de adsorção, ajustando dinamicamente a pressão capilar. Há diferenças significativas na taxa de mudança da tensão superficial porque a área da bolha não está aumentando constantemente. As mudanças na área da bolha durante a adsorção não são constantes com o tempo, pois a tensão da superfície muda lentamente no início, e depois acelera rapidamente antes do equilíbrio. Uma complicação adicional é que a mudança fracionária na área depende do raio inicial da bolha. Um benefício adicional do raio de bolha constante é que a imagem da interface é simplificada à medida que a superfície da bolha permanece fixa, o que simplifica o foco do CFM. Durante o processo de adsorção, como adsorbs surfactantes para a interface (Vídeo 1), o sinal fluorescente da interface aumenta. Se o surfactante formar domínios de superfície, esses domínios podem ser observados formando e crescendo22.

As alterações na tensão superficial durante as oscilações da área são mostradas na Figura 7. Nas versões anteriores do CPM, oscilações foram feitas na pressão capilar da bolha; no entanto, gerar uma onda senoidal na pressão capilar não se traduz diretamente em uma onda seno na superfície, pois os dois estão relacionados através da equação de Laplace. Ao aproveitar um loop de feedback baseado em modelos usando a equação de Laplace, as oscilações são criadas na área e não na pressão capilar, levando a dados mais fáceis de analisar e coletar sobre uma gama maior de amplitudes. Como resultado, os dados de tensão superficial versus área coletados a partir deste método podem ser usados para calcular diretamente o módulo dilatational interfacial da camada surfactante: Equation 7 (Figura 8), onde Equation 8 está o estresse total do sistema e oestressenãoisotrópico é o estresse desviatório não isotrópico muitas vezes ausente em soluções simples de surfactante 4,33. Assim, para um simples sistema de surfactante, Equation 9. Para interfaces onde redes elásticas podem ser formadas, como proteínas superativas, tensões extras estão frequentemente presentes e, portanto, devem ser contabilizadas na definição do módulo dilatacional. O vídeo 2 mostra um vídeo CFM do movimento de domínios LC pretos em uma matriz de fase LE colorida contínua em monocamadas fosfolipídidas. Os distintos domínios de LC na interface se reorganizam em uma rede de ramificação que cobre a interface quando as oscilações ocorrem na bolha curva22,40. A guia Oscilações de Outras Áreas pode ser usada para criar ondas de dente de serra, quadradas e triangulares, como visto na Figura Suplementar 3 e a guia Compressão permite a compressão e expansão constantes da área de taxa.

Para estudos de troca de solventes, um surfactante é primeiro autorizado a adsorb para a interface, e então o líquido do reservatório é trocado para permitir que uma segunda espécie ativa da superfície entre em contato com essa interface. É possível examinar a mudança na tensão superficial à medida que o segundo surfactante compete com o surfactante original na interface. O módulo dilatational da superfície é frequentemente uma sonda mais sensível da troca de surfactantes, juntamente com a morfologia da superfície via CFM. A Figura 9 mostra a mudança na tensão superficial, módulo dilatational da superfície e morfologia superficial como uma dessas trocas de solventes ocorre. Embora as especificidades de tal troca possam variar, uma alteração em qualquer uma das três propriedades pode indicar a integração do segundo componente na monocamadas ou solvação do componente principal no volume. Uma segunda tag fluorescente poderia ser anexada à espécie secundária para observar sua interação com a interface das imagens CFM.

Figure 1
Figura 1: Tratamento capilar. (A) Imagem mostrando a pontuação do capilar. A cerâmica de pontuação de vidro é mantida em um grampo para mantê-la estável. (B) Limpeza ácida do capilar. A solução de limpeza ácida é puxada para dentro do capilar com a bomba de vácuo. (C) Hidrofobização do capilar. Plugue de solução Silane mantido dentro do capilar Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Construção celular. (1) Grande suporte de célula de alumínio, (2) junta de fluoroeelômero (quatro no total), (3) lâmina de vidro (duas no total), (4) célula PEEK e (5) pequeno suporte de célula de alumínio. Quando montada, uma junta fluoroestomer é colocada em ambos os lados de cada lâmina de vidro. A célula é mantida junto com parafusos e parafusos. A imagem ampliada da célula PEEK mostra os locais das várias portas: (6) porta capilar, (7) entrada de troca de solventes, (8) saída de troca de solventes e (9,10) entrada e saída de controle de temperatura. Um plug peek pode ser usado para anexar o tubo ou capilar à célula. As portas que não estão sendo utilizadas podem ser completamente fechadas por plugues sem canais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Esquema de CPM/CFM, para não escalar. (1) a célula CPM, (2) o tubo capilar com uma bolha na ponta, (3) objetivo do microscópio confocal, (4) objetivo da câmera do microscópio com filtro, (5) fonte de luz CPM, (6) bomba microfluidica, (7) válvula de segurança, (8) entrada de troca de fluidos, (9) saída de troca de fluidos, (10) bomba peristáltica, (11) reservatório de fluido de troca, (12) resíduos de troca de fluidos, (13) direto para a ingestão de células, (14) entrada e saída da jaqueta de controle de temperatura e (15) reservatório e bomba controlados pela temperatura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Interface virtual CPM. (1) o caminho do arquivo onde os dados serão salvos; (2) parâmetros do sistema, comentários e o botão Salvar. Todos os campos nesta área são salvos no arquivo de dados final; (3) a imagem da câmera CPM; (4) configurações que controlam a análise da imagem, medição de anular, redefinição de bolhas e quadros por segundo; (5) o botão Redefinição de bolha; (6) o botão Coletar dados, o controle da taxa de registro de dados e os indicadores de coleta de dados; (7) controles para todos os valores da linha central do modo operacional, amplitude de oscilação e frequência de oscilação; (8) interruptor de modo de funcionamento: clicar em cada guia muda para esse modo de controle. Cada modo mostra o sinal de pressão sendo enviado para a bomba no gráfico "Sinal de Pressão", bem como alguns controles adicionais; (9) dados de tensão da superfície ao vivo; (10) dados de pressão ao vivo; (11) raio ao vivo dos dados de curvatura; (12) dados da área de superfície viva; e (13) tensão da superfície viva e dados da área da superfície, que podem ser usados para determinar aproximadamente o ângulo de fase durante um estudo de oscilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Defeitos Capilares. (A) e (B) Capilares miscut; (C) corte corretamente capilar, (D) capilar com fixação ruim devido ao revestimento ruim ou degradado, e (E) corretamente fixado capilar. As setas vermelhas em D e E indicam onde as bolhas estão presas. Para os melhores resultados, a bolha vai fixar na ponta capilar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Estudo de adsorção resultados microtensiometer para adsorção de pressão constante (laranja) e área constante (azul). A área de superfície da bolha para a proliferação constante da área aumenta significativamente ao longo do estudo e faz com que a adsorção deva mais tempo para atingir a mesma tensão superficial. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Oscilação típica da área de superfície. (A) Pressão, (B) curvatura e (C) dados da superfície. Os dados da área de superfície são um sinusoide enquanto os dados de pressão e curvatura não são, como evidenciado pelos valores da linha central não estar no ponto médio da oscilação. A relação matemática entre os três valores significa que apenas um pode ser um verdadeiro sinusoide. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Resultados reológicos da amostra após análise. Módulo dilatational de Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfocholina) em função da frequência para o aumento das concentrações de Lyso PC para bolhas de raio de ~45 μm. Concentrações >0,1 mM de Lyso PC que acompanham inflamação diminuem o módulo dilatational sobre a faixa de ventilação/taxas de respiração normais (amarelo) para fazer 2ε-γ < 0, que é o valor do crossover para induzir a instabilidade de Laplace (linha vermelha pontilhada). Baixas concentrações de Lyso PC ≤0,01 mM, que podem ocorrer em pulmões normais não induzem instabilidade. Em frequências >10 rad/seg, todas as concentrações do Lyso PC estão acima do crossover, e não seriam suscetíveis à instabilidade de Laplace. Linhas vermelhas sólidas são ajustes de teoria para os dados. Figura reproduzida a partir da referência9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Os resultados de CFM e CPM para um estudo de troca de solventes para surfactante pulmonar trocado com água DI e, em seguida, Lyso PC. (A) mostra como a tensão superficial e o módulo dilatational da superfície mudam ao longo do estudo. O gráfico é separado em quatro regiões: quando o surfactante pulmonar é adsorvido à interface (azul), quando o LS é trocado com água DI (verde), quando a solução de troca é mudada para uma solução de PC Lyso (vermelho), e quando a célula é preenchida com a solução Lyso PC (laranja). As propriedades podem ser vistas para mudar ao longo das várias trocas indicando que a interface está mudando. (B) mostra uma imagem confocal do adsorte de surfactante pulmonar atribuído à interface antes da troca e (C) mostra a mesma superfície após a troca com a solução lyso PC estiver completa. Em ambos os casos, o círculo branco traço indica a borda interna do capilar. A estrutura dos domínios na monocamadas muda drasticamente após a troca de solventes, corroborando os resultados do CPM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeo confocal de estudo de adsorção de pressão constante para surfactante pulmonar. A cor falsa mostra a distância na direção z com a barra de cor no lado esquerdo do vídeo, com roxo indicando a bolha perto do capilar e verde sendo o topo da bolha. A interface é inicialmente pouco iluminada como apenas um pouco do surfactante fluorescente é adsorvida. À medida que cada vez mais adsorbs surfactantes, a bolha começa a crescer à medida que a cor muda mais para verde e a interface se torna povoada por domínios LC pretos que podem se mover através da interface. Agregados de surfactante na solução podem ser vistos flutuando na solução como formas amorfas brilhantes e vários se acomodam na interface da bolha, desintegrando e depositando seu surfactante na interface. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeo confocal de estudo de oscilação para surfactante pulmonar. A cor falsa mostra a distância na direção z com a barra de cor no lado esquerdo do vídeo. A superfície é submetida a várias frequências de oscilação diferentes e os domínios escuros de LC na interface podem ser vistos para mudar ao longo das oscilações. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figura suplementar 1: Exemplo de uma etapa intermediária no código para determinar a reologia dilatational. Quando esta tela aparecer, o usuário deve clicar à esquerda na borda mais à esquerda da oscilação para analisar e, em seguida, clique à esquerda na borda mais à direita. Várias oscilações podem ser analisadas para que o usuário possa clicar à esquerda em 1, 2, 3 e 4 e, em seguida, clicar com o botão direito do mouse para analisar essas duas oscilações. As oscilações mostradas são de diferentes amplitudes e frequências. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 2: Exemplo dos resultados gráficos produzidos pelo código de reologia dilatational. Isso mostra os ataques dos sinusoides às oscilações na pressão, raio, área da superfície e tensão superficial, bem como a transformação de Fourier de cada oscilação. Idealmente, a segunda harmônica na transformação Fourier deve ser inferior a 10% da primeira harmônica para a área de superfície e tensão superficial. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar 3: Modos de operação alternados. (A) Onda de sine, (B) onda de dente-de-serra, (C) onda quadrada, (D) onda triangular, (E) Expansão constante da taxa e (F) compressão constante da taxa. Os modos de compressão e expansivo permitem que isotherms do tipo Langmuir sejam criados para surfactantes insolúveis. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: microtensiometer Virtual Interface.vi. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 2: Dilatational_Rheology_Analysis.m. Clique aqui para baixar este Arquivo.

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Discussion

O CPM/CFM combinado é uma poderosa ferramenta para examinar dinâmicas interfaciais, equilíbrio e morfologia. Este protocolo descreve as etapas necessárias para a obtenção de dados com CPM/CFM.

A Figura 2 mostra o design celular com canais para a troca capilar, solvente e de calor indicada. A entrada para troca de solventes deve estar na parte inferior da célula, enquanto a tomada deve estar na parte superior, permitindo que a célula não transborda durante a troca. Na prática, as taxas de fluxo de entrada e saída podem ser ligeiramente diferentes para a mesma bomba peristáltica. Um problema comum com este design de célula é o vazamento da célula. Isso é mais frequentemente causado por uma conexão ruim entre a célula e uma das conexões, mas se todas as conexões estão secas e não vazam, isso pode ser devido a uma rachadura no deslizamento de vidro da célula devido ao excesso de aperto dos parafusos ao redor da célula.

A Figura 3 mostra as conexões entre as várias bombas e a célula, bem como o alinhamento da célula com os objetivos cfm e CPM. A câmera CPM (4) é usada para imaginar a forma da bolha durante a operação. A câmera CPM deve ser equipada com um filtro óptico que impede que a luz laser excitante do CFM entre na câmera CPM. Caso contrário, o laser CFM torna as imagens na câmera CPM extremamente barulhentos e difíceis de encaixar usando análise de imagem. Uma válvula de segurança conecta o capilar e a bomba microfluidica (7) e permite que sejam feitas alterações na bomba e na fonte de pressão de ar, sem o risco de o fluxo de volta da célula atingir a bomba. Uma segunda válvula (13) fornece acesso a uma seringa para permitir a injeção direta de fluido dentro e fora do reservatório. O fluido pode precisar ser adicionado ao reservatório em caso de vazamento e pode precisar ser removido para a etapa 8 do protocolo (adsorção de surfactante insolúvel) ou remover bolhas expurgadas do capilar se tiverem se ligado ao objetivo confocal.

Durante cada experimento, várias etapas-chave devem ser realizadas cuidadosamente. A maioria dos problemas que ocorrem quando o instrumento está em execução, envolvem o próprio capilar. Como tal, o corte cuidadoso e o revestimento podem minimizar as dificuldades. Cortar o capilar ao diâmetro desejado é um processo difícil e de baixo rendimento. Qualquer chip ou irregularidade na ponta do capilar levará a leituras ruins do raio da bolha. Além disso, se o revestimento hidrofóbico não for aplicado corretamente, ou se se degradar com o tempo e o uso, a bolha não fixará corretamente na ponta do capilar. Isso pode ser indicado pela bolha que parece estar presa dentro do capilar ou deslizando ao longo do interior do capilar durante um estudo oscilatório. Um capilar que é bem cortado, mas não fixando corretamente pode ser recleanado e tratado hidrofobicamente.

Outra etapa fundamental e possível fonte de erro é a limpeza do reservatório celular, tubulação e capilar entre diferentes materiais ou diferentes concentrações do mesmo material. Há muitas pequenas fendas no reservatório e o surfactante pode adsorb e alterar medidas tomadas em momentos posteriores se não forem limpas corretamente. A desmontagem completa e a imersão da célula são frequentemente necessárias para garantir a remoção de qualquer excesso de material ativo da superfície. É melhor começar usando a menor concentração se uma série de concentrações do mesmo surfactante for estudada.

Às vezes, alinhar o tubo capilar com o objetivo confocal pode ser difícil. A câmera microtensiometer pode ser usada para ajudar a alinhar o objetivo confocal, mas para uma grande distância de trabalho do objetivo cfm, isso pode não ser útil. Se o microscópio confocal estiver focado além da ponta do capilar, a seção transversal capilar, uma região desprovida de qualquer material fluorescente, também pode ser usada para ajudar a orientar o objetivo. Se a bolha capilar não ejetar, pode haver um problema com a pressão que está sendo fornecida ao capilar (que deveria ser de 150 mbar em operação normal). Isso pode ser verificado inserindo o modo de controle de pressão e definindo a pressão para um alto valor. Se a pressão não atingir a pressão definida, é provável que haja um vazamento na tubulação da bomba microfluidica ou a bomba não esteja recebendo pressão suficiente do gás. Como acontece com muitos estudos envolvendo ciência superficial, é importante garantir que os materiais contaminantes sejam introduzidos nas soluções a qualquer momento. Se as leituras não forem como esperado (a tensão superficial começando muito baixa ou diminuindo muito rapidamente), fazer uma nova amostra ou usar uma amostra bem estudada ou líquido puro também é um bom passo inicial na solução de problemas.

Várias modificações podem ser feitas no aparelho para alcançar outras metas experimentais. Óleo ou água podem ser adicionados ao capilar permitindo o estudo da água-óleo em vez das interfaces ar-água39. Isso aumenta o risco de retrocesso na bomba, de modo que deve-se tomar cuidado adicional, potencialmente até mesmo adicionar uma armadilha de óleo ao tubo entre a bomba e o capilar pode ser necessário.

Existem várias limitações para o CPM/CFM. O CPM tem uma faixa de trabalho limitada de tamanho capilar, 20-300 μm para o OD capilar para a bomba e óptica no sistema. Embora seja possível adicionar surfactante insolúvel à interface usando o solvente exchange41 ou o método descrito aqui, a concentração de superfície só pode ser inferida a partir de fazer tensão superficial versus isotherms de área e comparar com aqueles obtidos a partir de um cocho Langmuir. O CFM só pode detectar materiais fluorescentes, de modo que quaisquer materiais não fluorescentes ou não fluorescentes não podem ser visualizados. Muitos surfactantes são pequenas moléculas, e marcá-los pode potencialmente mudar suas propriedades, embora isso deva ser menos um problema para moléculas superativas maiores, como proteínas ou polímeros26,27.

Este método tem várias vantagens fundamentais em relação às análises anteriores de CPM e CFM de interfaces carregadas de surfactantes. O mais importante é que o instrumento híbrido permite a visualização da interface enquanto várias propriedades dinâmicas e de superfície de equilíbrio estão sendo medidas. Mudanças na morfologia da interface podem estar diretamente ligadas à dinâmica interfacial e propriedades reológicas. CFM anterior de interfaces carregadas de surfactante foi feito usando um Langmuir plano atravésde 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, enquanto o método descrito aqui pode ser realizado em interfaces altamente curvas 22 . Além disso, toda a interface pode ser visualizada de uma só vez, mostrando uma mudança rastreável em tempo real de domínios específicos, enquanto os fluxos de superfície no cocho Langmuir levaram a domínios que entravam e saíam da janela visual confocal. As compressões de superfície neste aparelho também são isotrópicas, enquanto as barreiras nos cochos langmuir têm direções particulares de compressão. O CPM permite oscilações de área muito mais rápidas do que seria possível em um cocho Langmuir.

A nova curvatura e controle baseado em área neste estudo tem grandes vantagens em relação às versões anteriores do CPM30. Normalmente, o tamanho da bolha era controlado por meio da definição de uma pressão capilar fixa; para medidas de moduli dilatational, a pressão capilar foi oscilada. Quando a pressão capilar é mantida constante, como adsorbs surfactantes para a interface, a tensão superficial da bolha diminui. Para satisfazer a equação de Laplace, ΔP = 2γ/R, o raio de curvatura deve diminuir à medida que a tensão superficial diminui. Para a bolha hemisférica no CPM, a diminuição do raio de bolha da curvatura aumenta a área da bolhaem 9,48:

Equation 10

em que Rcé o raio capilar e R é o raio bolha da curvatura. A mudança do raio da bolha altera a área da interface durante a adsorção, o que complica a análise da adsorção usando as equações Ward-Tordai10,38 Além disso, se a tensão superficial da bolha for reduzida o suficiente, o raio da bolha se tornará menor do que o raio capilar e a bolha será ejetada. O loop de feedback neste CPM/CFM mais recente mantém a área de bolha constante ao longo da adsorção, o que significa que a equação original Ward-Tordai pode ser usada, não há risco de ejeção de bolhas, e a adsorção acontece mais rapidamente à medida que a superfície não está aumentando na área. Para estudos oscilatórios, produzir uma onda seno na pressão não produz uma onda seno na área48 da superfície. Os métodos anteriores do CPM dependiam de manter as oscilações pequenas para que a mudança de área causada pela oscilação orientada à pressão se aproximasse de uma onda seno48. O método descrito controla diretamente a área da bolha e pode ser usado para criar verdadeiras oscilações de ondas seno na área interfacial. É possível relacionar diretamente o estresse (mudança na tensão superficial) com a cepa interfacial (mudança na área da superfície) para calcular o módulo dilatational.

Para ajudar na implementação deste protocolo, uma breve descrição do código que controla o microtensiômetro é descrita aqui. O código consiste em três segmentos em um loop: um emitindo comandos para a bomba microfluidica, um controlando o mecanismo de reset da bolha, e um medindo o raio da bolha e salvando os valores calculados. O controlador da bomba tem três modos principais de operação: controle de pressão, controle de curvatura e controle de área. No controle de pressão, o usuário insira diretamente um ponto de partida para a pressão criada pela bomba. Este modo é importante porque não requer um loop de feedback, e como tal é o mais estável dos modos. O controle de curvatura usa a pressão superficial previamente medida e a equação de Laplace para calcular qual pressão é necessária para criar uma interface de uma determinada curvatura. O modo de controle da área de superfície baseia-se nisso calculando qual curvatura é necessária para criar uma determinada área de superfície baseada na geometria da tampa esférica, que também requer uma medição precisa do raio capilar. Esses dois modos são especialmente úteis para estudos de adsorção e oscilação, mas requerem um fluxo constante de dados consistentes de pressão superficial. Como tal, o feed desses dois controladores pode precisar ser suavizada a partir dos dados brutos para uma melhor função. Quando a solução não é clara o suficiente, muitas vezes devido a uma amostra altamente turva, este modo não funcionará corretamente, pois obter uma boa imagem da interface de bolha não é possível. Os controles para a oscilação também estão incluídos nesta seção do código. O segmento médio do código permite que a bolha seja limpa do capilar. Aqui, a pressão definida do capilar é definida como um alto valor e mantida lá por um determinado período de tempo permitindo que a bolha estoure e uma nova interface seja criada. A última seção do código usa software de aquisição de visão para rastrear a borda da bolha e medir seu raio. Este raio é então usado com a equação de Laplace para calcular a tensão da superfície, que é então alimentada para a parte inicial do loop.

Esta técnica híbrida de CPM/CFM provou ser muito benéfica para nossos estudos de surfactantes pulmonares modelos e clínicos em interfaces ar-água. As dimensões da bolha aproximam as dos alvéolos no pulmão humano e os efeitos da curvatura interfacial na morfologia e dinâmica das monocamadas surfactantes pulmonares podem ser observados 9,10,22. O instrumento híbrido também será importante para estudos de outros materiais ativos da superfície que são onipresentes com aplicações que vão desde petroquímicos até produtos químicos domésticos, desde filmes de lágrimas até estabilização de anticorpos. O CPM/CFM combinado nos permite sondar propriedades interfaciais dinâmicas na escala de domínios separados por fases e visualizar as morfologias na superfície à medida que as condições externas mudam. Este método é particularmente útil em aplicações onde materiais caros requerem o uso de amostras de tamanho mínimo. A observação simultânea da dinâmica interfacial e da morfologia monocamadas é quase impossível com qualquer outra técnica, tornando-a amplamente aplicável ao campo da ciência interfacial.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Todas as imagens de microscopia confocal foram obtidas usando o microscópio confocal Multifocal Nikon A1RHD. Reconhecemos a orientação e assistência da equipe de apoio, especialmente Guillermo Marques, do Centro universitário de imagem da Universidade de Minnesota. Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant HL51177. O SI foi apoiado por um Ruth L. Kirschstein NRSA Institutional Research Training Grant F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

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References

  1. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Interfacial rheology of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface: Comparison of shear and dilatation deformation. Journal of Physical Chemistry B. 108 (12), 3835-3844 (2004).
  2. Freer, E. M., Yim, K. S., Fuller, G. G., Radke, C. J. Shear and dilatational relaxation mechanisms of globular and flexible proteins at the hexadecane/water interface. Langmuir. 20 (23), 10159-10167 (2004).
  3. Kannan, A., Shieh, I. C., Fuller, G. G. Linking aggregation and interfacial properties in monoclonal antibody-surfactant formulations. Journal of Colloid and Interface Science. 550, 128-138 (2019).
  4. Kannan, A., Shieh, I. C., Leiske, D. L., Fuller, G. G. Monoclonal antibody interfaces: Dilatation mechanics and bubble coalescence. Langmuir. 34 (2), 630-638 (2018).
  5. Li, J. J., et al. Interfacial stress in the development of biologics: Fundamental understanding, current practice, and future perspective. The AAPS Journal. 21 (3), 44 (2019).
  6. Bhamla, M. S., Giacomin, C. E., Balemans, C., Fuller, G. G. Influence of interfacial rheology on drainage from curved surfaces. Soft Matter. 10 (36), 6917-6925 (2014).
  7. Fuller, G. G., Vermant, J. Complex fluid-fluid interfaces: Rheology and structure. Annual Review of Chemical and Biomolecular Engineering. 3, 519-543 (2012).
  8. Rosenfeld, L., et al. Structural and rheological properties of meibomian lipid. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (4), 2720-2732 (2013).
  9. Barman, S., Davidson, M. L., Walker, L. M., Anna, S. L., Zasadzinski, J. A. Inflammation product effects on dilatational mechanics can trigger the Laplace instability and acute respiratory distress syndrome. Soft Matter. 16 (29), 6890-6901 (2020).
  10. Barman, S., et al. Recent Advances in Rheology: Theory, Biorheology, Suspension and Interfacial Rheology. Ramachadran, A., et al. , chap. 7 (2022).
  11. Alonso, C., Zasadzinski, J. A. A brief review of the relationship between monolayer viscosity, phase behavior, surface pressure and temperature using a simple monolayer viscometer. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (44), 22185-22191 (2006).
  12. Alonso, C., et al. More than a monolayer: Relating lung surfactant structure and mechanics to composition. Biophysical Journal. 87 (6), 4188-4202 (2004).
  13. Alonso, C., Bringezu, F., Brezesinski, G., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Modifying calf lung surfactant by hexadecanol. Langmuir. 21 (3), 1028-1035 (2005).
  14. Alonso, C., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: Protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophysical Journal. 89 (1), 266-273 (2005).
  15. Zasadzinski, J. A., et al. Inhibition of pulmonary surfactant adsorption by serum and the mechanisms of reversal by hydrophilic polymers: Theory. Biophysical Journal. 89 (3), 1621-1629 (2005).
  16. McConnell, H. M. Structures and transitions in lipid monolayers at the air-water-interface. Annual Reviews of Physical Chemistry. 42, 171-195 (1991).
  17. McConnell, H. M., Moy, V. T. Shapes of finite two-dimensional lipid domains. Journal of Physical Chemistry. 92 (15), 4520-4525 (1988).
  18. Zasadzinski, J. A., Stenger, P., Shieh, I., Dhar, P. Overcoming rapid inactivation of lung surfactant: analogies between competitive adsorption and colloid stability. Biochemica et Biophysica Acta. 1798 (4), 801-828 (2010).
  19. Zasadzinski, J. A., et al. Surfactant Progress. Nag, K. , New York. (2008).
  20. Valtierrez-Gaytan, C., et al. Spontaneous evolution of equilibrium morphology in phospholipid-cholesterol monolayers. Science Advances. 8 (14), (2022).
  21. Williams, I., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial rheology and direct imaging reveal domain-templated network formation in phospholipid monolayers penetrated by fibrinogen. Soft Matter. 15 (44), 9076-9084 (2019).
  22. Sachan, A. K., Zasadzinski, J. A. Interfacial curvature effects on the monolayer morphology and dynamics of a clinical lung surfactant. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (2), 134-143 (2018).
  23. Alvarez, N. J., Anna, S. L., Saigal, T., Tilton, R. D., Walker, L. M. Intefacial dynamics and rheology of polymer grafter nanoparticles at air-water and xylene-water interfaces. Langmuir. 28 (21), 8052-8063 (2012).
  24. Alvarez, N. J., Vogus, D. R., Walker, L. M., Anna, S. L. Using bulk convection in a microtensiometer to approach kinetic-limited surfactant dynamics at fluid-fluid interfaces. Journal of Colloid and Interface Science. 372 (1), 183-191 (2012).
  25. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. Diffusion-limited adsorption to a spherical geometry: The impact of curvature and competitive time scales. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 82, 011604 (2010).
  26. Shieh, I., Waring, A. J., Zasadzinski, J. A. Visualizing the analogy between competitive adsorption and colloid stability to restore lung surfactant function. Biophysical Journal. 102 (4), 777-786 (2012).
  27. Shieh, I., Zasadzinski, J. A. Visualizing monolayers with a water-soluble fluorophore to quantify adsorption, desorption and the double-layer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (8), 826-835 (2015).
  28. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Takamoto, D. Y., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Coexistence of buckled and flat monolayers. Physical Review Letters. 81, 1650-1653 (1998).
  29. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Fluorescence, polarized fluorescence, and Brewster angle microscopy of palmitic acid and lung surfactant protein B monolayers. Biophysical Journal. 72 (6), 2783-2804 (1997).
  30. Alvarez, N. J., Walker, L. M., Anna, S. L. A microtensiometer to probe the effect of radius of curvature on surfactant transport to a spherical interface. Langmuir. 26 (16), 13310-13319 (2010).
  31. Ward, A. F. H., Tordai, L. Time dependents of boundary tensions of solutions. 1. The role of diffusion in time-effects. Journal of Chemical Physics. 14, 453-461 (1946).
  32. Lucassen, J., Vanden Tempel, M. Dynamic measurements of dilatational properties of a liquid interface. Chemical Engineering Science. 27 (6), 1283-1291 (1972).
  33. Lin, G. L., et al. Interfacial dilatational deformation accelerates particle formation in monoclonal antibody solutions. Soft Matter. 12 (14), 3293-3302 (2016).
  34. Bastacky, J., et al. Alveolar lining layer is thin and continuous: low temperature scanning electron microscopy of rat lung. Journal of Applied Physiology. 79 (5), 1615-1628 (1995).
  35. Adamson, A. W., Gast, A. P. Physical Chemistry of Surfaces, Sixth ed. , Wiley-Interscience. New York. 784 (1997).
  36. del Rio, O. I., Kwok, D. Y., Wu, R., Alvarez, J. M., Neumann, A. W. Contact angle measurements by axisymmetric drop shape analysis and an automated polynomial fit program. Colloids and Surfaces A Physicochemical and Engineering Aspects. 143 (2-3), 197-210 (1998).
  37. Kanthe, A., et al. No ordinary proteins: Adsorption and molecular orientation of monoclonal antibodies. Science Advances. 7 (5), 14 (2021).
  38. Manikantan, H., Squires, T. M. Surfactant dynamics: hidden variables controlling fluid flows. Journal of Fluid Mechanics. 892, 115 (2020).
  39. Narayan, S., et al. Dilatational rheology of water-in-diesel fuel interfaces: effect of surfactant concentration and bulk-to-interface exchange. Soft Matter. 17 (18), 4751-4765 (2021).
  40. Meng, G. N., Paulose, J., Nelson, D. R., Manoharan, V. N. Elastic instability of a crystal growing on a curved surface. Science. 343 (6171), 634-637 (2014).
  41. Kotula, A. P., Anna, S. L. Insoluble layer deposition and dilatational rheology at a microscale spherical cap interface. Soft Matter. 12 (33), 7038-7055 (2016).
  42. Lipp, M. M., Lee, K. Y. C., Zasadzinski, J. A., Waring, A. J. Phase and morphology changes in lipid monolayers induced by SP-B protein and its amino-terminal peptide. Science. 273 (5279), 1196-1199 (1996).
  43. Pocivavsek, L., et al. Stress and fold localization in thin elastic membranes. Science. 320 (5878), 912-916 (2008).
  44. Pocivavsek, L., et al. Lateral stress relaxation and collapse in lipid monolayers. Soft Matter. 4 (10), 2019-2029 (2008).
  45. Kim, K., Choi, S. Q., Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Cholesterol nanodomains: their effect on monolayer morphology and dynamics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 3054-3060 (2013).
  46. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  47. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Nonlinear chiral rheology of phospholipid monolayers. Soft Matter. 14 (13), 2476-2483 (2018).
  48. Kotula, A. P., Anna, S. L. Regular perturbation analysis of small amplitude oscillatory dilatation of an interface in a capillary pressure tensiometer. Journal of Rheology. 59, 85-117 (2015).

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