Summary
يصف البروتوكول كيفية توليد الخلايا العضلية بالضربة القاضية باستخدام CRISPR / Cas9 ، بدءا من تصميم الحمض النووي الريبي الموجه إلى الاستنساخ الخلوي وتوصيف النسخ القاضية.
Abstract
أحد التطبيقات المهمة للتكرارات الباليندرومية القصيرة المجمعة بين المسافات (CRISPR) / Cas 9 هو تطوير خطوط الخلايا القاضية ، وتحديدا لدراسة وظيفة الجينات / البروتينات الجديدة المرتبطة بالمرض ، والتي تم تحديدها أثناء التشخيص الجيني. لتطوير مثل هذه الخطوط الخلوية ، يجب فك تشابك قضيتين رئيسيتين: إدخال أدوات كريسبر (Cas9 والحمض النووي الريبي الدليلي) بكفاءة عالية في الخلايا المختارة ، وتقييد نشاط Cas9 على الحذف المحدد للجين المختار. البروتوكول الموصوف هنا مخصص لإدخال أدوات كريسبر في الخلايا التي يصعب نقلها، مثل الخلايا العضلية. ويستند هذا البروتوكول إلى استخدام فيروسات lentiviruses، التي يتم إنتاجها باستخدام البلازميدات المتاحة للجمهور، والتي يتم وصف جميع خطوات الاستنساخ الخاصة بها لاستهداف جين ذي أهمية. تم إجراء التحكم في نشاط Cas9 باستخدام تكييف لنظام موصوف سابقا يسمى KamiCas9 ، حيث يسمح نقل الخلايا باستخدام فيروس lentivirus بتشفير الحمض النووي الريبي الإرشادي الذي يستهدف Cas9 بالإلغاء التدريجي لتعبير Cas9. تم تطبيق هذا البروتوكول على تطوير خط خلايا العضلات البشرية RYR1-knock ، والذي تم تمييزه بشكل أكبر على المستوى البروتيني والوظيفي ، لتأكيد خروج قناة الكالسيوم المهمة هذه المشاركة في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا في العضلات وفي اقتران الإثارة والانكماش. يمكن بسهولة تطبيق الإجراء الموصوف هنا على جينات أخرى في خلايا العضلات أو في خلايا أخرى يصعب نقلها وإنتاج أدوات قيمة لدراسة هذه الجينات في الخلايا البشرية.
Introduction
مع تقدم تسلسل الجينات وتحديد الطفرات في الجينات ذات الوظائف غير المعروفة في نسيج معين ، فإن تطوير النماذج الخلوية ذات الصلة لفهم وظيفة الجين المستهدف الجديد وتأكيد مشاركته في الآليات الفسيولوجية المرضية ذات الصلة يشكل أداة أساسية. بالإضافة إلى ذلك ، هذه النماذج ذات أهمية كبيرة للتطورات العلاجية المستقبلية 1,2 ، وتشكل بديلا مثيرا للاهتمام لتطوير نماذج حيوانية بالضربة القاضية بما يتماشى بشكل مستقيم مع التوصيات الدولية للحد من استخدام الحيوانات في التجريب. يعد تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 من بين أقوى الأدوات المتاحة حاليا ، مما سمح بتطوير العديد من نماذج الضربة القاضية / الضربة القاضية ، والتحقق من صحة الجينات المستهدفة باستخدام CRISPR / Cas9 هو من بين التطبيقات الأكثر استخداما على نطاق واسع ل CRISPR / Cas93. يعتمد نجاح تحرير الجينات على القدرة على إدخال أدوات كريسبر (الحمض النووي الريبي الإرشادي و nuclease Cas9) في نموذج الخلية المستهدفة ، والتي يمكن أن تشكل تحديا في العديد من الخلايا التي يصعب نقلها ، مثل خلايا العضلات4. يمكن التغلب على هذا التحدي باستخدام الفيروس ، وعادة ما يكون الفيروس lentivirus ، والذي يتمتع بميزة كبيرة لنقل العديد من أنواع الخلايا بكفاءة وتقديم الجينات المحورة. لكن عيبه الرئيسي هو دمج الجين المتحول في جينوم الخلية المضيفة ، مما يؤدي إلى تغيير محتمل في الجينات الموضعية في موقع التكامل وإلى التعبير الدائم عن الجين المتحول ، والذي في حالة nuclease Cas9 سيؤدي إلى عواقب وخيمة5. تم اقتراح حل ذكي من قبل Merienne وزملاؤه6 ، والذي يتكون من إدخال الحمض النووي الريبي الإرشادي في الخلايا الذي يستهدف جين Cas9 نفسه ، مما يؤدي إلى تعطيل Cas9. يتم تقديم تكييف لهذه الاستراتيجية هنا كبروتوكول سهل الاستخدام ومتعدد الاستخدامات يسمح بضرب أي جين تقريبا في الخلايا التي يصعب نقلها.
الهدف من البروتوكول المقدم هنا هو الحث على تعطيل جين ذي أهمية في خلايا العضلات الخالدة. يمكن استخدامه للقضاء على أي جين ذي أهمية ، في أنواع مختلفة من الخلايا الخالدة. يحتوي البروتوكول الموصوف هنا على خطوات لتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي واستنساخها إلى بلازميدات فيروسية ، لإنتاج أدوات كريسبر في ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية ، لتحويل الخلايا باستخدام فيروسات لينتيفيروسات مختلفة ، واستنساخ الخلايا لإنتاج خط خلوي محرر متجانس.
باستخدام هذا البروتوكول ، تم تطوير خلايا العضلات الهيكلية البشرية المخلدة مع حذف مستقبلات الريانودين من النوع الأول (RyR1) ، وهي قناة كالسيوم أساسية تشارك في إطلاق الكالسيوم داخل الخلايا وتقلص العضلات7. تم تأكيد خروج الضربة القاضية (KO) للجين على مستوى البروتين باستخدام اللطخة الغربية ، وعلى المستوى الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على خزعات العضلات من بنك الأنسجة للبحوث (Myobank ، وهو شريك في شبكة الاتحاد الأوروبي EuroBioBank ، باريس ، فرنسا) وفقا للتوصيات الأوروبية والتشريعات الفرنسية. وتم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع الأفراد. تم إنتاج الأرومات العضلية المخلدة من قبل الدكتور V. Mouly (معهد علم الفطريات ، باريس ، فرنسا) ، وتمت الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة أخلاقيات معهد علم الميولوجيا (MESRI ، n AC-2019-3502).
1. تصميم دليل كريسبر
- تحديد منطقة الجين المراد حذفه. ابحث عن تسلسلها الجينومي باستخدام أدوات متصفح الجينوم مثل ensembl.org أو genome.ucsc.edu وحدد الإحداثيات الكروموسومية للمنطقتين للبحث عن دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) ، على جانبي المنطقة المراد حذفه.
- بالنسبة للجين المستخدم هنا ، احصل على تسلسل FASTA لجين RYR1 وتسلسل exon 101 على النحو التالي. في المجموعة ، ابحث عن RYR1 في أحدث إصدار من الجينوم البشري ، وحدد الإدخال الأول ، وانقر فوق نص تسلسل ترميز البروتين. ثم انقر فوق Exons لإعادة التوجيه إلى قائمة exons للجين.
- انقر فوق تنزيل التسلسل وحدد التسلسل الجينومي فقط لتنزيل تسلسل الإجماع الكامل للجين بأكمله. قم بالتمرير لأسفل قائمة الإكسونات والإنترونات الخاصة بالجين وحدد الشخص (الأشخاص) المستهدف.
- أوجد تسلسل النيوكليوتيدات المقابل في الجين. حدد تسلسلات النيوكليوتيدات للإنترونات مباشرة في المنبع والمصب من exon ليتم حذفها ، والتي سيتم استخدامها للبحث عن gRNAs.
- صمم اثنين من gRNA ، يسمى الدليل 1 والدليل 2 هنا ، في المناطق المحددة في الخطوة 1.1 (الإنترونات في المنبع والمصب في المنطقة المراد حذفها) باستخدام أدوات عبر الإنترنت مثل Crispor.tefor.net8. اختر اثنين من gRNAs مفصولة ببضع مئات من أزواج القاعدة (bp) ، وتسلسل كل gRNA هو بالضبط 20 نيوكليوتيدات طويلة دون الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM). اختر أفضل الأدلة المتاحة من أجل الحد من الخروج عن الهدف. انظر الشكل 1 للحصول على مثال على تصميم الدليل.
- من المتوقع حذف التسلسل بين الدليلين ، ويؤدي إلى خروج الجين محل الاهتمام ، وبالتالي اختيار موضع الدليلين بحيث يحذف تسلسلا أساسيا أو إكسون أساسيا في الجين محل الاهتمام. تأكد من أن التسلسل المحذوف / exon غير موجود حصريا في نسخة بديلة من الجين و / أو أنه يشفر جزءا مهما من البروتين ، وبالتالي فإن حذفه سيؤدي إلى ضربة قاضية وظيفية.
ملاحظة: على الرغم من أنه من المتوقع أن يحدث موقع الانقسام Cas9 على بعد 3 نقاط أساس في المنبع من الشكل المجاور للفاصل الأولي (PAM) ، إلا أن الانقسام على مسافة أكبر يمكن أن يحدث أيضا ، وبالتالي فإن الحل الجيد هو عدم الاعتماد على التوطين الدقيق لموقع الانقسام ، مثل الانقسام في الإنترون.
- من المتوقع حذف التسلسل بين الدليلين ، ويؤدي إلى خروج الجين محل الاهتمام ، وبالتالي اختيار موضع الدليلين بحيث يحذف تسلسلا أساسيا أو إكسون أساسيا في الجين محل الاهتمام. تأكد من أن التسلسل المحذوف / exon غير موجود حصريا في نسخة بديلة من الجين و / أو أنه يشفر جزءا مهما من البروتين ، وبالتالي فإن حذفه سيؤدي إلى ضربة قاضية وظيفية.
- حدد تسلسل المكمل العكسي (RC) لكل gRNA ، بدون PAM ، من أجل الحصول على التسلسلات التالية: الدليل 1 والدليل 1-RC والدليل 2 والدليل 2-RC.
- اطلب من الاشعال المعروضة في الجدول 1 إجراء استنساخ للبلازميدات. طوال البروتوكول ، استخدم الاشعال بتركيز 10 نانومتر في H2O المعقمة.
ملاحظة: تتوافق التسلسلات المضافة إلى gRNAs في هذه الاشعال (الجريئة والمسطرة) مع تسلسل البلازميد قبل وبعد الدليل ، promotor ، و Transactivating Crispr RNA (tracrRNA) ، على التوالي ، ولا ينبغي تعديلها من أجل ضمان تداخل جيد بين الاشعال والبلازميد.
2. استنساخ البلازميد
ملاحظة: في هذه الخطوة، سيتم إدخال gRNAs في العمود الفقري البلازميد لإنتاج lentivirus. يتم إنتاج كاسيت يقوم بترميز اثنين من gRNAs لأول مرة بواسطة تفاعلات البوليميراز المتتالية (PCR) ، باستخدام الاشعال المتداخلة. ثم يتم إدخال الكاسيت الجديد في بلازميد العمود الفقري للفيروسات اللنية #87919.
- احصل على البلازميدات التالية: البلازميد #87919 ، ترميز الحمض النووي الريبي لتوجيه كريسبر في ناقل فيروسي عدي وترميز البلازميد #87904 لتسلسل SpCas9 في ناقل فيروسي عدي.
- بناء الكاسيت
ملاحظة: يرد ملخص لبروتوكول الاستنساخ في الشكل 2.- قم بتشغيل تفاعل PCR (A) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide1R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O. قم بتشغيل برنامج PCR التالي (البرنامج 1): تمسخ أولي 5 دقائق عند 98 درجة مئوية ، متبوعا ب 30 دورة من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 1 دقيقة 45 ثانية عند 72 درجة مئوية، واستطالة نهائية لمدة 7 دقائق عند 72 درجة مئوية. Tm من الاشعال الموصوفة في الخطوة 1.4 هو 60 درجة مئوية.
ملاحظة: على الرغم من أن وقت الاستطالة في البرنامج 1 يبدو طويلا جدا ، فقد تم اختيار وقت الاستطالة هذا لضمان إنتاج ما يكفي من المواد بالحجم المناسب. في الواقع ، بسبب التسلسلات المتكررة في البلازميد (يتم تكرار تسلسل tracrRNA بعد أدلة الحمض النووي الريبي ثلاث مرات في البلازميد # 87919) ، فإن تضخيم PCR للحمض النووي المتوقع أمر صعب ، ويتم إنتاج نطاقات أصغر إضافية في PCR المتتالية. وبالتالي ، بسبب المنافسة بين منتجات PCR المختلفة ، إما تم زيادة وقت الاستطالة (لصالح أطول واحد والحصول على ما يكفي من المواد النقية في النهاية) ، أو تم استخدام PCR الهبوطي (البرنامج 2) للجزء الطويل (مثل الموصوف ل PCR (النهائي) في الخطوة 2.2.6). - افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في المخزن المؤقت Tris-Borate-EDTA (TBE) ، وقم بقص وتنقية جزء 300 نقطة أساس. قم بإجراء التنقية باستخدام مجموعة مخصصة باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، مع الإزالة في حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر.
- قم بتشغيل تفاعل PCR (B) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide1F ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على هلام الأغاروز بنسبة 1٪ في TBE ، وقم باستئصال وتنقية جزء 400 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. استخدم الجزء المنقى مباشرة أو اخزنه عند -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.5.
- قم بتشغيل تفاعل PCR (C) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2F ، و 2 ميكرولتر من primer_BlpIR ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE. اقتطاع وتنقية جزء 600 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. إما استخدام الجزء المنقى مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.6.
ملاحظة: قد يكون هناك جزء آخر عند 900 نقطة أساس مرئية، بسبب تهجين التمهيدي على المناطق المتكررة في البلازميد، كما هو موضح في ملاحظة الخطوة 2.2.1. إذا كان موجودا ، فيجب التخلص من هذه الفرقة. - قم بتشغيل تفاعل PCR (D) ، مع 2 ميكرولتر من الاستخلاص PCR A (من الخطوة 2.2.2) ، و 2 ميكرولتر من إزالة PCR B (من الخطوة 2.2.3) ، و 2 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide2R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O ، باستخدام برنامج PCR 1. افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE ؛ اقتطاع وتنقية جزء 700 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج. إما استخدام الجزء المنقى مباشرة أو تخزينها في -20 درجة مئوية للخطوة 2.2.6.
ملاحظة: قد تكون النطاقات الأخرى مرئية عند >1000 نقطة أساس و 400 نقطة أساس و 300 نقطة أساس ، بسبب تهجين الاشعال في المناطق المتكررة ويجب التخلص منها. - قم بتشغيل تفاعل PCR (النهائي) ، مع 4 ميكرولتر من الاستخلاص PCR C (من الخطوة 2.2.4) ، و 4 ميكرولتر من الاستخلاص PCR D (من الخطوة 2.2.5) ، و 4 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 4 ميكرولتر من primer_BlpIR ، و 50 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 34 ميكرولتر من H2O. البرنامج المستخدم هو التالي (برنامج PCR 2): تمسخ أولي لمدة 5 دقائق عند 98 درجة مئوية. ست دورات من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 66 درجة مئوية (انخفاض في درجة حرارة التهجين بمقدار 1 درجة مئوية لكل دورة) ، 1 دقيقة 45 عند 72 درجة مئوية ؛ 35 دورة من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 1 دقيقة 45 عند 72 درجة مئوية، واستطالة نهائية لمدة 5 دقائق عند 72 درجة مئوية.
ملاحظة: برنامج PCR لهذا التضخيم النهائي هو PCR هبوط ، يختلف عن السابق ، بسبب الحجم الكبير للتضخيم النهائي الذي يحتوي على تسلسلين متكررين tracrRNA بعد كل دليل مباشرة. - افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE ؛ قم بقص وتنقية الكاسيت النهائي ، الذي يهاجر عند حوالي 1300 نقطة أساس في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت. تحديد كمية المنتج المسحوق. استخدم الجزء المنقى مباشرة أو اخزنه عند -20 درجة مئوية للخطوة 2.3.2.1. هذا هو المنتج النهائي الذي سيتم إدخاله في البلازميد lentivirus.
ملاحظة: قد تكون الشظايا الأخرى مرئية عند >1000 نقطة أساس و 400 نقطة أساس و 300 نقطة أساس ، المقابلة لشظايا PCR غير المكتملة التي يجب التخلص منها.
- قم بتشغيل تفاعل PCR (A) ، مع 2 ميكرولتر من البلازميد # 87919 ، و 2 ميكرولتر من primer_XmaIF ، و 2 ميكرولتر من primer_Guide1R ، و 25 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 19 ميكرولتر من H2O. قم بتشغيل برنامج PCR التالي (البرنامج 1): تمسخ أولي 5 دقائق عند 98 درجة مئوية ، متبوعا ب 30 دورة من: 30 ثانية عند 98 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية، 1 دقيقة 45 ثانية عند 72 درجة مئوية، واستطالة نهائية لمدة 7 دقائق عند 72 درجة مئوية. Tm من الاشعال الموصوفة في الخطوة 1.4 هو 60 درجة مئوية.
- إدخال كاسيت gRNAs في العمود الفقري للبلازميد lentivirus.
- خطي البلازميد عن طريق الهضم المزدوج للبلازميد #87919 مع إنزيمات التقييد XmaI و BlpI.
- تحضير التفاعل مع 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت الموصى به ، و 15 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم BlpI (عند 10 U / μL) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم XmaI (عند 10 U / μL) ، و112.5ميكرولتر من H 2 O. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. قم بتحميل الكمية الإجمالية على هلام أغاروز بنسبة 1٪ ، وقطع وتنقية البلازميد ~ 10 كيلو بايت مع مجموعة مناسبة. يتم إجراء الاستخلاص في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ويتم تحديد المنتج المكشوف كميا باستخدام قياس الكثافة البصرية.
ملاحظة: استخدم بروتوكول تنقية مناسب لجزء كبير من الحمض النووي، مثل البروتوكول الموصوف بواسطة Sun و coll9.
- تحضير التفاعل مع 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت الموصى به ، و 15 ميكرولتر من البلازميد (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم BlpI (عند 10 U / μL) ، و 7.5 ميكرولتر من إنزيم XmaI (عند 10 U / μL) ، و112.5ميكرولتر من H 2 O. احتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، ثم لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. قم بتحميل الكمية الإجمالية على هلام أغاروز بنسبة 1٪ ، وقطع وتنقية البلازميد ~ 10 كيلو بايت مع مجموعة مناسبة. يتم إجراء الاستخلاص في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، ويتم تحديد المنتج المكشوف كميا باستخدام قياس الكثافة البصرية.
- ربط كاسيت gRNA والبلازميد. تحضير مزيج التفاعل مع كاسيت gRNA من الخطوة 2.2.7 والبلازميد الخطي من الخطوة 2.3.1.1 ، إضافة 2 ميكرولتر من الإنزيم و H2O للحصول على حجم نهائي من 10 p_guides ميكرولتر.
ملاحظة: يجب أن تكون كمية كاسيت الحمض النووي بين 50-100 نانوغرام وكمية البلازميد بين 100-200 نانوغرام، مع نسبة مولية 2: 1.
- خطي البلازميد عن طريق الهضم المزدوج للبلازميد #87919 مع إنزيمات التقييد XmaI و BlpI.
- استخدم 2 ميكرولتر من البلازميد المحضر حديثا لتحويل E.Coli المختص كيميائيا مثل Stbl3 (50 ميكرولتر) أو XL10-Gold وانتشر على صفيحة أجار LB مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين بعد نمو 1 ساعة عند 37 درجة مئوية بدون مضاد حيوي. تحضن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. اختر بعض المستعمرات وقم بإجراء إعداد صغير باستخدام مجموعة تجارية باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
- قم بإجراء تضخيم PCR على الحمض النووي المصغر مع Primer_XmaI Primer_BlpR باستخدام برنامج PCR 1 (انظر الشكل 2). افصل منتجات PCR على جل أغاروز بنسبة 1٪ في مخزن مؤقت TBE. حدد بعض المستعمرات (~ 5) مع شريط في الحجم المتوقع من حوالي 1300 نقطة أساس.
- قم بإجراء تسلسل الحمض النووي للمستعمرات المختارة ، باستخدام Primer_XmaI أو Primer_BlpR ، لتأكيد الإدخال الصحيح لكاسيت gRNA.
ملاحظة: يتم استخدام إحدى المستعمرات التي تم التحقق من تسلسلها في الدراسة ، وتسمى البلازميد p_guides. - كرر ذلك من الخطوة 2.2 (بناء الكاسيت) مع Primers-Killer F و R ، و Primers-mCherry F و R. استخدم مستعمرة واحدة تم التحقق من تسلسلها لمزيد من التحليل. يسمى البلازميد p_Killer.
3. إنتاج الفيروس العاص
- قم بإنتاج وتنقية كمية كبيرة من جميع البلازميدات المطلوبة باستخدام مجموعة أدوات ماكسي الجاهزة الخالية من السموم الداخلية باتباع تعليمات الشركة المصنعة. تحضير الأليكوتات عند 2 ميكروغرام / ميكرولتر.
- تحضير الخلايا (اليوم 1)
- قم بإعداد 18 طبقا من 145 سم منزوع البذور مع 1 × 106 خلايا HEK293 لكل طبق في 16 مل من الوسط المكون من بيروفات النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز من Dulbecco ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تضخيم الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
ملاحظة: يجب أن يتم إنتاج الفيروس اللينتيري بحذر في مختبر السلامة الأحيائية من المستوى 2، باستخدام معدات حماية مكيفة، بما في ذلك البدلة الواقية التي يمكن التخلص منها، والغطاء الواقي، والقفازات. يجب إجراء جميع التجارب تحت غطاء تدفق صفحي (خزانة أمان BSLII) مع نصائح مرشح. يجب تعطيل جميع المحلول الذي يحتوي على فيروسات lentiviruses وجميع النفايات البلاستيكية / الزجاجية المستخدمة باستخدام الإيثانول 70٪ أو أي معطل آخر للفيروسات.
- قم بإعداد 18 طبقا من 145 سم منزوع البذور مع 1 × 106 خلايا HEK293 لكل طبق في 16 مل من الوسط المكون من بيروفات النسر المعدل (DMEM) عالي الجلوكوز من Dulbecco ، مع استكمال 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تضخيم الخلايا عند 37 درجة مئوية ، في حاضنة 5٪ CO2 لمدة 3 أيام.
- نقل الخلايا (اليوم 4)
- تحقق من التقاء الخلايا ، للتأكد من أنها وصلت إلى 60٪ -65٪ التقاء.
- قم بإعداد محلول النقل الذي يحتوي لكل صفيحة على: 20.8 ميكروغرام من البلازميد محل الاهتمام (p-guides ، أو p-Killer ، أو pCas9 # 87904) ، 4.8 ميكروغرام من البلازميد الذي يشفر المغلف (VSV-G ، # 8454) ، 20.8 ميكروغرام من البلازميد psPAX2 (# 12260) للتغليف الفيروسي العدسي ، 136 ميكرولتر من فوسفات الكالسيوم واضبط مع H2O إلى حجم نهائي قدره 1000 ميكرولتر. أضف هذا المحلول قطريا وتحت الإثارة إلى 1 مل من 2x محلول ملحي مخزن مؤقتا ب HEPES (HBS).
ملاحظة: لا تقم بإعداد مزيج لجميع الألواح في نفس الوقت لضمان التحضير الأمثل للكواشف. قم بإعداد مزيج لستة أطباق في نفس الوقت ، على سبيل المثال ، ل 18 لوحة ، قم بإعداد ثلاث مرات مزيج لستة أطباق. - احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق على الأقل وإضافة 2 مل من المحلول قطرة إلى الخلايا. قم بتجانس كاشف النقل مع تحريك لطيف للصفيحة للخلف وإلى الأمام والأعلى والأسفل ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ CO2 لمدة 5 ساعات على الأقل.
ملاحظة: من هذه النقطة وحتى نهاية إنتاج lentivirus ، ارتد معدات حماية إضافية ، بما في ذلك زوج ثان من القفازات وأكمام الحماية و plastron القابل للتصرف. - بعد خمس ساعات من النقل ، قم بإزالة الوسط من الألواح وشطفه باستخدام PBS للتخلص من كواشف النقل. أضف 12 مل من الوسط الطازج واحتضن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- جمع الجسيمات الفيروسية (اليوم 6)
- جمع وتجميع الوسط من جميع اللوحات. جهاز طرد مركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، لتكوير الحطام الخلوي. قم بتصفية supernatant باستخدام مرشح 0.45 ميكرومتر (يلزم وجود مرشحات متعددة).
- جهاز طرد مركزي عند 68,300 × g لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح. قم بإزالة المادة الفائقة واترك الأنابيب مقلوبة رأسا على عقب تحت خزانة الأمان على ورقة لمدة 5-10 دقائق لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل ، ثم أضف 100 ميكرولتر من وسط انتشار HEK لكل حبيبة. بعد 2 ساعة على الأقل عند 4 درجات مئوية ، أعد تعليق الكريات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. تجمع جميع الكريات المعاد تعليقها.
ملاحظة: يمكن ترك الكريات في الوسط بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية قبل الاقتباس. - Aliquot lentivirus في حجم عينة 10 ميكرولتر أو 25 ميكرولتر (اعتمادا على الاستخدام) والتجميد المفاجئة مع النيتروجين السائل. يخزن على درجة حرارة -80 درجة مئوية. لا تقم بتجميد aliquot الذي تم إذابته.
- كرر الخطوات من 3.2 إلى 3.4 مع البلازميدات الأخرى ذات الأهمية لإنتاج أدلة LV و LV-Killer و LV-Cas9.
ملاحظة: كبديل ، يمكن شراء فيروسات lentiviruses من شركة أو منشأة فيروسات.
4. معايرة فيروس Lentivirus
ملاحظة: يتم إجراء معايرة الفيروسات على خلايا HEK293. من المهم أن تتضمن المعايرة بالتحليل الحجمي في الخطوات اللاحقة عددا دقيقا من فيروسات lentivirus لكل خلية (مهما كانت دفعة lentivirus) ، للخلايا ذات الاهتمام. يسمى عدد الجسيمات الفيروسية التي تنقل الخلية بكفاءة تعدد العدوى (MOI): وبالتالي يتوافق MOI 10 مع إدخال 10 جزيئات فيروسية لكل خلية. نظرا لأن دورة التجميد / الذوبان تؤثر على صلاحية الفيروس ، يتم إجراء المعايرة بالتحليل الحجمي باستخدام أليكوت فيروس لينتيفيروس مجمد ، وسيتم إجراء كل تجربة لاحقة باستخدام أليكوت جديد من نفس التجمع. يتم وصف إحدى طرق المعايرة بالتحليل الحجمي هنا ، ولكن يمكن استخدام طرق أخرى.
- في اليوم الأول ، البذور 1 × 105 خلايا لكل لوحة في خمس لوحات 35 مم مع أغطية زجاجية في القاع ولوحين 35 مم بدون غطاء.
- في اليوم 2 ، من اللوحتين بدون أغطية ، قم بجمع وحساب عدد الخلايا بعد التربسينات ، وحدد متوسط كمية الخلايا لكل لوحة (N).
- تحضير 100 ميكرولتر من الفيروس المخفف عند 1/10 في وسط الانتشار. قم بتحويل الصفائح الخمسة المستزرعة بأحجام مختلفة من الفيروس المخفف ، من 1 إلى 50 ميكرولتر من الفيروس المخفف. بالنسبة لهذا البروتوكول ، استخدم الأحجام التالية لتحويل الصفائح الخمسة: 1 ميكرولتر ، 5 ميكرولتر ، 10 ميكرولتر ، 20 ميكرولتر ، 50 ميكرولتر.
- في اليوم الرابع ، قم بإصلاح الخلايا عن طريق حضانة الأغطية في RT لمدة 20 إلى 30 دقيقة في 4٪ paraformaldehyde. بالنسبة ل LV-Cas9 ، قم بتخلل الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton X100 في محلول ملحي مخزن مؤقت للفوسفات (PBS) لمدة 10 دقائق في RT ، وتشبع في PBS-0.1٪ Triton X100-2٪ مصل الماعز - 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) لمدة 20 دقيقة في RT ، وتسمية لمدة 45 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الأولية V5 (تخفيف 1/400) تليها حضانة لمدة 30 دقيقة في RT مع الأجسام المضادة الثانوية الفلورسنت. قم بتسمية النوى باستخدام Hoescht (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 10 دقائق في RT.
- قم بتركيب الأغطية على شريحة وراقب باستخدام مجهر فلورسنت مجهز بهدف 20x. بالنسبة لأدلة LV و LV-Killer ، بعد التثبيت ، انتقل مباشرة إلى وضع العلامات على النوى وقم بتركيب الأغطية. لكل زلة غطاء، احسب العدد الإجمالي للنوى (إجمالي عدد الخلايا) في مجال الرؤية وعدد الخلايا المصنفة (إما ب V5 أو mCherry)، وحدد نسبة الخلايا المصنفة لكل زلة غطاء.
- حدد غطاء تكون فيه نسبة الخلايا المحولة 10٪ على الأقل ولا تتجاوز 50٪. حدد كفاءة النقل (X) لهذا الغطاء ، ولاحظ حجم الفيروس المخفف (V ، في μL) المستخدم للحصول على كفاءة النقل هذه.
- حدد عيار الفيروس (في الجسيمات المعدية ، ممثلة في IP / mL) وفقا للصيغة التالية:
عامل التخفيف هو تخفيف الفيروس lentivirus الذي يتم إجراؤه في الخطوة 4.3. حصلنا بشكل روتيني على عيار نهائي من 1 × 109 ip / mL ل LV-Cas9 و 1 × 1010 ip / mL لدليل LV ، يتم تحديده في خلايا HEK.
5. نقل Myoblast
ملاحظة: يتم نقل الخلايا العضلية المخلدة على التوالي مع فيروسات lentivirus الثلاثة التي تم إنتاجها سابقا. يتم الحفاظ عليها بكثافة أقل من 50٪ في وسط انتشار يتكون من F10 من Ham مع 20٪ FBS ، 2٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 2٪ Ultroser G ، ومستزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- تحديد حجم الفيروس lentivirus اللازم لعلاج العدد المختار من الخلايا باستخدام MOI 10 ل LV-Cas9 و LV-guides و MOI 20 ل LV القاتل ، وفقا للصيغة التالية:
ملاحظة: في تجربة موازية، تمت مقارنة كفاءة النقل على الأرومات العضلية وHEK، باستخدام فيروس lentivirus الضابطة (lenti-GFP)، وقررنا أن هناك حاجة إلى خمسة أضعاف فيروسات lentivirus لنقل الخلايا العضلية بكفاءة مقارنة بخلية HEK. وبالتالي ، فإن MOI 10 المقاسة على HEK تتوافق مع جزيئين فيروسيين لكل أرومة عضلية. يتم حساب MOI المستخدمة هنا على خلايا HEK. - في اليوم الأول ، بذور 96 لوحة بئر مع 10000 خلية في 100 ميكرولتر من وسط الانتشار لكل بئر. في اليوم 2، قم بنقل الخلايا الموجودة أسفل خزانة الأمان عن طريق إضافة الحجم المناسب من أدلة LV و LV-Cas9 المحسوبة في الخطوة 5.1. أعد الخلايا إلى الحاضنة حتى اليوم 7.
ملاحظة: قد لا يؤدي استخدام MOI أعلى من 25 ، خاصة بالنسبة ل LV-Cas9 ، إلى تحسين عدد الخلايا المحررة بسبب ارتفاع موت الخلايا عند تركيز عال من lentivirus. - في اليوم 7 ، قم بإجراء التربسين وعد الخلايا. زرع الخلايا عند التقاء 40٪ إلى 50٪ في لوحة جديدة وإعادة الخلايا إلى الحاضنة. بعد خمس ساعات ، قم بتحويل الخلايا باستخدام LV-Killer عند MOI من 20 (الحجم المحسوب في الخطوة 5.1). تضخيم الخلايا لمدة 5 إلى 10 أيام بعد النقل ، لمدة مقطعين على الأقل ، والحفاظ عليها دائما عند التقاء منخفض يبلغ <50٪. الخلايا جاهزة للخطوة التالية ، استنساخ الخلايا ، عندما يعود نموها إلى طبيعته (يقدر بوقت الانقسام).
ملاحظة: قد يكون الانتشار أبطأ قليلا بعد النقل. يمكن تحديد نمو الخلايا الطبيعي قبل هذا الإجراء التجريبي عن طريق تقدير وقت انقسام الخلايا.
6. استنساخ الخلايا
ملاحظة: نظرا لأن نقل myoblast صعب ولا يصل أبدا إلى كفاءة 100٪ ، حتى عند استخدام lentivirus ، فإن استنساخ الخلايا مطلوب من أجل الحصول على خط خلية مصحح بالكامل. هذا ممكن فقط مع الخلايا الخالدة ، أو الخلايا التي يمكن زراعتها وتضخيمها خلال بضعة أسابيع / أشهر.
- التربسين وعد الخلايا. تمييع الخلايا في وسط الانتشار عند 10 خلايا / مل وزرع الخلايا في خلية واحدة / بئر في لوحات 96 بئر تحتوي على 100 ميكرولتر / بئر من الوسط.
ملاحظة: يعتمد عدد اللوحات المراد بذورها على احتمال تحرير الجينات المتوقع ، ويتم استخدام 2 إلى 10 لوحات بشكل روتيني. - راقب الخلايا من أجل النمو وقم بتضخيم كل بئر تدريجيا في صفيحة أكبر حتى تصل إلى صفيحة 35 مم على الأقل ، مع الحفاظ على التقاء الخلايا العضلية أقل من 50٪. يمكن أن تستمر هذه الخطوة من 2 إلى 6 أسابيع ، اعتمادا على الخلايا المستخدمة وقدرتها على النمو بمجرد عزلها في البئر.
7. اختيار استنساخ
ملاحظة: يتم تنفيذ هذه الخطوة لتحديد أي من الحيوانات المستنسخة المتنامية قد تم تعديلها بشكل مناسب.
- صمم مجموعة من الاشعال تتكون من تمهيدي يقع قبل الدليل الأول (Primer_BeforeGuide1F) وتمهيدي آخر يقع بعد الدليل الثاني (Primer_AfterGuide2R) من أجل تضخيم المنطقة التي تحيط بالتسلسل المعدل المفترض. انظر الجدول 1 للاطلاع على الاشعال المستخدمة هنا.
- جمع الخلايا من كل استنساخ ، وتجنيب ما لا يقل عن 300000 خلية للتضخيم في المستقبل ، واستخراج الحمض النووي الجيني باستخدام أي بروتوكول قياسي على الخلايا المتبقية.
- إذا كان هناك عدد كبير من الحيوانات المستنسخة تنمو ، للتخلص من تلك غير المحررة ، فقم بإجراء اختبار سريع عن طريق تجميع الخلايا من خمسة مستنسخات في نفس الأنبوب لاستخراج الحمض النووي من هذا التجمع واختباره باستخدام PCR. كرر ذلك مع أكبر عدد ممكن من الحيوانات المستنسخة حسب الضرورة. بعد ذلك ، قم بفصل التجمعات التي تحتوي على خلايا تم تحريرها لإجراء تحليل فردي.
- التحكم في التحرير بواسطة PCR على النحو التالي. قم بإعداد تفاعل PCR باستخدام 1 ميكرولتر من Primer_BeforeGuide1F ، و 1 ميكرولتر من Primer_AfterGuide2R ، و 12.5 ميكرولتر من مزيج البوليميراز ، و 3 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني ، و 7.5 ميكرولتر من H2O. تضخيم في جهاز تدوير حراري وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ومعلمات التمهيدي. تشغيل على هلام الأغاروز 1٪ لتحديد الحيوانات المستنسخة المعدلة.
- تحكم في التحرير عن طريق التسلسل على النحو التالي. قم بإجراء تسلسل Sanger للنسخ المستنسخة المحددة لتأكيد الحذف وتحديد كيفية إجراء التحرير في كل نسخة. احتفظ بأكثر من نسخة معدلة للتأكد من أن الجين المستهدف فقط قد تم تعديله وهو المسؤول عن التأثير الفسيولوجي الذي لوحظ واحتفظ باستنساخ غير محرر سيتم استخدامه كاستنساخ تحكم (CTRL) في التجارب اللاحقة.
- قم بتوسيع النسخ المستنسخة المحددة. بمجرد أن يصل التقاء كل استنساخ إلى حوالي 50٪ ، قم بالتربسين بالخلايا وقم بصفيحة الخلايا في طبق أكبر ، حتى يتم إنتاج ما يكفي من الخلايا لأداء التوصيفات الكيميائية الحيوية والوظيفية (عادة أكثر من 1 × 106 لكل استنساخ) ، وتخزين الأليكوتات المجمدة لكل استنساخ للاستخدام في المستقبل.
8. توصيف الحيوانات المستنسخة المحررة
ملاحظة: بمجرد اختيار عدد قليل من الحيوانات المستنسخة وتأكيدها عن طريق تسلسل الحمض النووي ، يمكن تأكيد حذف الجين المستهدف على مستوى البروتين باستخدام اللطخة الغربية ، وعلى المستوى الوظيفي إذا كان الفحص الخلوي الوظيفي متاحا لهذا الجين. في حالة RYR1-KO ، نظرا لأن RyR1 عبارة عن قناة كالسيوم ، فقد تم إجراء التوصيف الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم على الخلايا المستزرعة.
- تعبير البروتين في النسخ المستنسخة المحررة
ملاحظة: يتم التعبير عن RyR1 فقط في الأنابيب العضلية المتباينة10. تم تقييم تعبيره في الأنابيب العضلية باستخدام اللطخة الغربية ، لتأكيد الحذف على مستوى البروتين في RyR1 ، وكذلك حذف بروتين Cas9.- صفيحة 200000 خلية في وسط الانتشار (الموصوف أعلاه ، الخطوة 5) على سطح يبلغ طوله حوالي 1.76 سم2 في صفيحة 35 مم مغلفة باللامينين (سطح يتوافق مع قطرة 200 ميكرولتر من اللامينين عند 10 ملغ / مل في PBS مع الكالسيوم). بمجرد أن تلتصق الخلايا باللوحة بعد احتضانها لمدة 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 ، قم بتحويل وسط المزرعة إلى وسط تمايز يتكون من DMEM منخفض الجلوكوز + 10٪ مصل الحصان + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، وأعد الخلايا إلى الحاضنة لمدة 6 أيام.
- بعد 6 أيام من التمايز ، قم بجمع الخلايا وتحليلها باستخدام 200 ميكرولتر من RIPA المكمل بمثبطات الأنزيم البروتيني. تحديد تركيز البروتين باستخدام طريقة فولين لوري11.
- قم بتحميل 15 ميكروغرام من البروتين ، بعد تمسخ لمدة 30 دقيقة في RT في مخزن تمسخ Laemmli ، على هلام أكريلاميد متدرج بنسبة 5٪ -15٪. بعد الفصل الكهربائي ، انقل البروتينات الموجودة على Immobilon P عند 0.8 فولت لمدة 4 ساعاتو 11.
- بعد تشبع الغشاء لمدة 30 دقيقة في RT في PBS يحتوي على 0.1٪ Tween 20 و 5٪ حليب جاف خالي الدسم ، احتضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية المخففة في نفس المخزن المؤقت لمدة 2 ساعة في RT أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، واغسل الغشاء 5x لمدة 5 دقائق مع PBS-0.1٪ Tween 20 واحتضن الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية لمدة 1 ساعة في RT. الأجسام المضادة الأساسية المستخدمة هي: الأجسام المضادة ضد V5-tag (التخفيف: 1/5000) للكشف عن Cas9 ، anti-GAPDH (التخفيف: 1/1000) كعنصر تحكم في التحميل ، الأجسام المضادة المضادة RyR1 12,13 (التخفيف: 1/10.000) ، الأجسام المضادة ضد الوحدة الفرعية alpha 1 من DHPR (التخفيف: 1/1000) والأجسام المضادة ضد سلسلة الميوسين الثقيلة MF20 (التخفيف: 1/1000).
- اغسل الغشاء 5x لمدة 5 دقائق باستخدام PBS-0.1٪ Tween 20 ، وجفف فائض السائل وأضف الركيزة الكيميائية. تابع على النحو الموصى به من قبل مزود الركيزة للكشف عن الإشارة الكيميائية.
- التوصيف الوظيفي للنسخ المستنسخة المحررة
ملاحظة: تم تقييم وظيفة RyR1 باستخدام تصوير الكالسيوم في الأنابيب العضلية المتباينة ، المنتجة من استنساخ CTRL أو KO14.- طبق 50000 خلية على سطح 0.2 سم2 في وسط أطباق 35 مم مغلفة باللامينين (السطح مغطى بقطرة صفيحة 50 ميكرولتر ، عند 10 ملغ / مل في PBS مع الكالسيوم) وحث التمايز لمدة 6 أيام كما هو موضح في الخطوة 8.1.1. إعداد ثلاث لوحات لكل تحفيز ، للحصول على ثلاثة أضعاف بيولوجية.
- قم بتحميل الأنابيب العضلية ب 50 ميكرولتر من الفلو 4 مباشرة ، مخففة 1: 1 في وسط التمايز ومحتضنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. شطف الخلايا مرتين مع المخزن المؤقت KREBS مع استكمال الجلوكوز في 1 ملغ / مل.
- قم بقياس اختلافات التألق باستخدام مجهر فلورسنت مقلوب أو مجهر بؤري باستخدام هدف 10x. قم بتثبيت اللوحة على مرحلة المجهر وابدأ عملية الاستحواذ بمعدل 1 إطار في الثانية لمدة 90 ثانية.
- قم بإزالة KREBS المتبقية وتحفيز الخلايا في الإطار 25 عن طريق إضافة 2 مل من KCl لإزالة الاستقطاب الغشائي (التركيز النهائي 140 mM) أو 2 مل من 4 CmC (التركيز النهائي 500 μM) للتحفيز المباشر RyR1. تأكد من وجود 10 أنابيب عضلية على الأقل في الحقل المسجل.
- حدد مقدار تباين التألق في كل أنبوب عضلي ، باستخدام برنامج مخصص. حدد للتحليل ما لا يقل عن 10 أنابيب عضلية لكل طبق (من الناحية المثالية 20-30 myotubes لكل طبق) ، وارسم خطا (أو منطقة اهتمام (ROI)) على المحور الطويل لكل أنبوب عضلي وجمع التألق F على طول هذا الخط لجميع الإطارات.
- أوجد قيمة الفلورسنت الأولية، F0، المقابلة للإطارات من 1 إلى 24. ارسم تباين الفلورسنت (F-F0)/F0 كدالة للوقت من 0 إلى 90 ثانية. كرر التجربة ثلاث مرات للحصول على تباين التألق من 90 أنبوب عضلي على الأقل من ثلاث ثقافات مختلفة. قم بتجميع جميع النتائج الخاصة بالأنابيب العضلية 90 واحسب متوسط ± SEM ل (F-F0) / F0 في كل إطار زمني. حدد كمية ذروة إطلاق الكالسيوم لكل تحفيز وكل استنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تطبيق هذا البروتوكول على الأرومات العضلية المخلدة من موضوع صحي15 (ما يسمى خلايا HM ، للخلايا العضلية البشرية) ، حيث تم تمييز RyR1 سابقا16 ، من أجل ضرب جين RYR1 الذي يشفر بروتين RyR1 . تم تصميم أدلة الحمض النووي الريبي لحذف التسلسل الذي يشمل جزءا من exon 101 و intron 101 من الجين. من المتوقع أن يؤدي حذف جزء من exon 101 إلى تعطيل إطار القراءة. بالإضافة إلى ذلك ، يقوم exon 101 بتشفير مسام البروتين وبالتالي فهو مطلوب لإنتاج قناة كالسيوم وظيفية. العديد من المرضى المصابين باعتلال عضلي حاد مرتبط ب RyR1 لديهم طفرة في هذه المنطقة من الجين7. تم اختيار أفضل الأدلة المتوقعة باستخدام برنامج Crispor من أجل الحصول على أقل عدد ممكن من الأهداف خارج الأهداف ، مع الحفاظ على أفضل كفاءة. لقد اخترنا استخدام دليلين في نفس الوقت في نفس الناقل الفيروسي ، للتأكد من أن جزءا كبيرا من الخلايا سيتم ضربه بالضربة القاضية ، ولتسهيل اكتشاف الحذف في النسخ المستنسخة المعدلة باستخدام PCR. يتم ترجمة الدليلين المختارين (انظر الجدول 2 والشكل 1) ، على التوالي ، في نهاية exon 101 وفي بداية intron 101 ، مما يؤدي إلى حذف 326 bp وتحول إطار لاحق. هذا يضمن أن الخلايا التي تم تحريرها ستكون RYR1-KO.
كان الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يستهدف SpCas9 هو الذي صممه بالفعل Merienne وزملاؤه6 والموجود في البلازميد #87919 تحت المروج الضعيف 7SK. نظرا لأن كفاءته في استهداف تسلسل SpCas9 قد أثبتت بالفعل في دراستهم6 ، فقد تم استخدامه لإنشاء p_Killer البلازميد ، ولكن تحت سيطرة المروج القوي H1. تم تصميم الدليل الثاني في p_Killer البلازميد لاستهداف تسلسل mCherry تحت المروج U6. سيسمح هذا بحذف mCherry ، والذي قد يكون مزعجا في بعض التجارب اللاحقة مع خط الخلية الذي تم إنشاؤه حديثا.
تم إنشاء البلازميدات p_guides p_killer وتم إنتاج جميع فيروسات lentivirus المطلوبة في غرفة الثقافة BSL2 المخصصة. بعد نقل الأرومات العضلية ، تم زرع الخلايا لمدة 2 أسابيع حتى استعادة النمو وتحليلها باستخدام PCR لتأكيد وجود الخلايا المحررة. بالنسبة للاستنساخ الخلوي ، تم زرع صفيحتين من 96 بئرا بخلايا معالجة عند خلية واحدة لكل بئر. لوحظ نمو الخلايا في 32٪ من الآبار المستزرعة. ثم تم استخراج الحمض النووي الجينومي من المستنسخات وتم إجراء تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل حتى تم تحديد اثنين من المستنسخات المصححة (ما يسمى Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2) ، انظر الشكل 3. تم تأكيد حذف الجزء المستهدف من RYR1 بواسطة تسلسل Sanger. تم استخدام خلايا تحكم إضافية ، مثل خلايا HM الأولية ، أو خلايا HM المعالجة بنفس الإجراء ولكن لم يتم تحريرها كما هو مؤكد بواسطة PCR والتسلسل (Cl-CTRL). ثم تم تضخيم النسخ المستنسخة المختارة وتمييزها بشكل أكبر على مستوى البروتين والمستوى الوظيفي.
للتحقق من الانقراض الكامل ل RyR1 و Cas9 على مستوى البروتين ، تم إجراء تحليل اللطخة الغربية. وترد النتائج في الشكل 4. تم اكتشاف بروتين Cas9 ، الغائب في خلايا HM ، بعد 5 أيام من نقل الخلايا مع LV-Cas9 (HM + LV-Cas9) ، وكما هو متوقع ، تم إلغاء تعبيره في Cl-CTRL وفي Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2 المحررين ، على الرغم من أنه لا يزال يتم اكتشاف كمية صغيرة من Cas9 في Cl-KOR-2 (الشكل 3A). نظرا لأن gRNA الذي يستهدف Cas9 لا يزال يتم التعبير عنه ، فمن المتوقع أن تختفي كمية Cas9 المتبقية تدريجيا. كما تم تقييم التعبير عن البروتينات المهمة الأخرى باستخدام اللطخة الغربية: RyR1 ، لتأكيد الحذف الكامل للبروتين ، والوحدة الفرعية alpha1 من DHPR ، والتي تعد الشريك الوظيفي ل RyR1 المشاركة في اقتران الإثارة والانكماش ، وسلسلة الميوسين الثقيلة كعلامة على التمايز ، لأن RyR1 و DHPR يتم التعبير عنهما فقط في أنابيب عضلية متباينة (الشكل 3B ). لا يفترض تعديل DHPR و MYHC. على الرغم من أن اللطخة الغربية أكدت الحذف الكامل ل RyR1 في نسختي RyR1-KO المستنسختين (Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2) ، إلا أن تعديلات إضافية - ناتجة عن Cas9 أو من إجراء الاستنساخ - ربما حدثت في Cl-KOR-2 ، والتي قدمت بالإضافة إلى ذلك عدم وجود DHPR وانخفاض في سلسلة الميوسين الثقيلة (MHC). وبما أن كلا البروتينين يتم التعبير عنهما فقط في أنابيب عضلية متباينة ، فإن غيابهما يعكس على الأرجح تغييرا في التمايز ، والذي يمكن أن ينبع من إجراء استنساخ الخلية الواحدة الطويل المرتبط بفرط النمو المحلي للخلايا مما يؤدي إلى فقدان إمكاناتها العضلية. وبالتالي ، تم تمييز Cl-KOR-1 فقط على المستوى الوظيفي. هذا يدل على أن اختيار العديد من النسخ المستنسخة المحررة أمر مهم لتكون قادرا على العمل مع أفضل واحد (ق).
تم إجراء التوصيف الوظيفي باستخدام تصوير الكالسيوم. يتم تمثيل متوسط تباين التألق كدالة للوقت في الشكل 5 ، على ما لا يقل عن 180 أنبوب عضلي لكل نمط وراثي ، إما باستخدام تحفيز RyR1 المباشر بواسطة 4-CMC أو تحفيز مجمع إطلاق الكالسيوم (DHPR المرتبط ب RyR1) عن طريق إزالة الاستقطاب الغشائي KCCL.
أظهرت هذه التجارب أن Cl-CTRL غير المعدل كان له سلوك مشابه لمجتمع الخلايا الأولي (خلايا HM) واستجاب لتحفيز RyR1 المباشر بواسطة منشطه 4-CmC وعن طريق تحفيز مجمع إطلاق الكالسيوم عن طريق إزالة الاستقطاب الغشائي. في المقابل ، لم يتمكن Cl-KOR-1 المحرر من الاستجابة لأي من التحفيز (إزالة الاستقطاب 4-CmC و KCl) ، كما هو متوقع ل RyR1-KO.
إجمالا ، أكدت اللطخة الغربية والتوصيف الوظيفي أن خط خلية Cl-KOR-1 هو خط خلية عضلية RyR1-KO. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على أي جين آخر يتم التعبير عنه في العضلات الهيكلية ، أو أي نوع آخر من الخلايا (مثل الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات - iPSC). ويوضح الشكل 6 البروتوكول الكامل.
الشكل 1: توطين وتصميم أدلة الحمض النووي الريبي. (أ) التعريب التخطيطي للأدلة المصممة لإنشاء خط خلية RYR1-KO. يستهدف الدليل 1 نهاية exon 101 في جين RYR1 ، ويستهدف الدليل 2 intron 101 ، مما يؤدي إلى حذف 326 نقطة أساس وتغيير الإطار. يستهدف Guide Killer كودون البدء في تسلسل SpCas9 ، ويستهدف Guide mCherry نهاية تسلسل mCherry. (ب) تعريب الأدلة في التسلسلات الجينومية للدليل 1 الموصوف سابقا والدليل 2 والدليل القاتل والدليل mCherry. يتم تقديم تسلسل كل دليل (بطول 20 نقطة أساس) بالألوان ويتم كتابة PAM لكل دليل بخط غامق وتحته. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء الاستنساخ لإنتاج الكاسيت. عرض تخطيطي لمختلف PCR الذي تم إجراؤه لإنتاج أشرطة الكاسيت مع الأدلة ، ليتم إدخالها في بلازميد العمود الفقري للفيروس lentivirus. يتم تحقيق PCR A و PCR B و PCR C و PCR D مع البرنامج 1 الموضح في الجزء العلوي الأيمن ، و PCR النهائي مع برنامج PCR 2 ، الموضح في الأسفل الأيمن. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: اختيار المستنسخات باستخدام PCR. (A) عرض تخطيطي لتضخيم PCR لمنطقة 1,200 bp تشمل الأدلة ، مع الاشعال الأمامي والخلفي الذي تمثله الأسهم الرمادية. ومن المتوقع أن يؤدي انقسام الحمض النووي في كلا الدليلين إلى انخفاض بمقدار 326 نقطة أساس في حجم جزء تفاعل البوليميراز المتسلسل، كما هو موضح في الخطوط العمودية الخضراء المنقطة أسفل المقص. (ب) تم تحميل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل المنتجة من خلايا HM و Cl-CTRL و Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2 على هلام أغاروز بنسبة 1٪. يبدو الحمض النووي ل HM و Cl-CTRL غير معدل (الطول الكامل) ، في حين أن الحمض النووي ل Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2 أقصر من عنصر التحكم ، كما هو متوقع (مشقوق). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: توصيف الخلايا على مستوى البروتين . (أ) تحليل اللطخة الغربية لوجود بروتين Cas 9 باستخدام علامة V5 في خلايا HM ، وخلايا HM المحولة باستخدام LV-Cas9 و Cl-CTRL و Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2. يتم الكشف عن Cas9 بوضوح في خلايا HM المحولة باستخدام LV-Cas9 ، في حين تم إلغاء تعبيره تماما (في Cl-CTRL و Cl-KOR-1) أو بالكامل تقريبا (في Cl-KOR-2) بواسطة LV-Killer. (ب) التعبير عن RyR1 وسلسلة Myosin الثقيلة (MYHC) والوحدة الفرعية alpha1 من DHPR و GAPDH كعنصر تحكم في التحميل في Cl-CTRL و Cl-KOR-1 و Cl-KOR-2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: التوصيف الوظيفي للخلايا. تم إجراء تصوير الكالسيوم Fluo-4 على الأنابيب العضلية المنتجة من خلايا HM و Cl-CTRL و Cl-KOR-1. تمثل المنحنيات تباين التألق في أنابيب HM العضلية (المنحنيات السوداء) أو الأنابيب العضلية Cl-CTRL (المنحنيات الرمادية) أو Cl-KOR-1 (المنحنيات الخضراء). يتم تقديم جميع القيم كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) ل n myotubes. في كل حالة ، تم تحليل n = 180 إلى 256 myotubes ، من ثلاث تجارب مختلفة على الأقل (العدد الدقيق المشار إليه لكل منحنى). تم استخدام 4 سم مكعب (500 ميكرومتر) لتحفيز RyR1 مباشرة في وجود 2 مللي متر من الكالسيوم الخارجي. تم تحفيز إزالة الاستقطاب KCl (140 mM) في وجود 2 mM الكالسيوم الخارجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: عرض تخطيطي للبروتوكول بأكمله. يتم تقديم الخطوات المختلفة للبروتوكول ، من تصميم silico في إلى الاستنساخ الجزيئي في المختبر واختيار الخلايا النهائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| اسم | تسلسل 5'-3' | الغرض / الاستخدام | ||
| Primer_Guide1F | دليل1 + gttttagagctagaaatagc | استنساخ البلازميد | ||
| Primer_Guide1R | دليل 1-RC + AGATCTGTGGTCTCATACAG | |||
| Primer_Guide 2F | دليل 2 + gttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_Guide 2R | دليل 2-RC + GTTTCGTCCTTCCTCCACAAG | |||
| Primer_XmaI F | TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT | استنساخ البلازميدات والسيطرة على المستعمرات | ||
| Primer_BlpI آر | CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC | |||
| Primer_KillerF | AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc | استنساخ p_Killer البلازميد | ||
| Primer_KillerR | TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG | |||
| Primer_mCherryF | GAACAGTACGAACGGCGCCGAgttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_mCherryR | TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG | |||
| Primer_RYR1exonF | GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc | استنساخ p_guides_RyR1 البلازميد | ||
| Primer_RYR1exonR | CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG | |||
| Primer_RYR1intronF | TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_RYR1intronR | AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG | |||
| Primer_BeforeRYR1cut | AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT | اختيار استنساخ ل RYR1 KO | ||
| Primer_AfterRYR1cut | CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC | |||
الجدول 1: قائمة الاشعال . الاشعال المستخدمة لاستنساخ البلازميد والسيطرة على المستعمرة، فضلا عن تلك المستخدمة لاختيار استنساخ.
| اسم | تسلسل الدليل | ام | تكملة عكسية بدون PAM | ||
| الدليل 1: RYR1exon | GCTCGTATTCGTCACCCGCG | جي جي جي | CGCGGGTGACGAATACGAGC | ||
| الدليل 2: RYR1intron | TAAGTCAGTTCATAGGCGCT | CGG | AGCGCCTATGAACTGACTTA | ||
| دليل القاتل كاس9 | TGGACAAGAAGTACTCCATT | جي جي جي | AATGGAGTACTTCTTGTCCA | ||
| دليل mCherry القاتل | GAACAGTACGAACGGCGCCGA | جي جي جي | TCGGCGCGTTCGTACTGTTC | ||
الجدول 2: الأدلة المستخدمة لإنشاء p_guides البلازميد p_Killer. يتم عرض التسلسلات المستخدمة لتطوير استنساخ RyR1-KO في هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتمثل إحدى الخطوات الرئيسية على الطريق إلى توصيف الجينات ذات الوظيفة غير المعروفة المشاركة في الأمراض في تطوير نماذج خلوية ذات صلة لدراسة وظيفة هذه الجينات. يعد استخدام تحرير الجينات باستخدام CRISPR / Cas9 مجالا بحثيا متناميا بشكل كبير ، ويعد تطوير نماذج خروج المغلوب كما هو موضح هنا من بين أكثر تطبيقاته استخداما. في هذا السياق ، نقترح هنا بروتوكولا متعدد الاستخدامات لتطوير خط خلية بشرية في أي جين ذي أهمية ، مما يسمح بتوصيف هذا الجين في نموذج خلية بشرية ذي صلة. يمكن استخدام البروتوكول المعروض هنا في الأرومات العضلية المخلدة وكذلك في iPSC ، وبالتالي يمكن أن يؤدي فعليا إلى إنتاج أي نموذج خلية بشرية KO في الجين محل الاهتمام.
القيد هو أنه ينبغي تطبيق هذا البروتوكول على الخلايا المخلدة ، حيث أن هناك حاجة إلى عدة أسابيع من الزراعة وكذلك استنساخ الخلايا إلى جانب العديد من التضخيمات المتتالية. بدلا من ذلك ، يجب استخدام الخلايا ، التي يمكن تضخيمها والحفاظ عليها لبضعة أسابيع أو أشهر. باستخدام هذا الإجراء ، تم إنتاج خط خلية العضلات المخلد البشري KO للجين محل الاهتمام (هنا جين RYR1 ) في حوالي 3-4 أشهر (باستثناء التوصيف الوظيفي للخلايا).
هذه الاستراتيجية مناسبة للخلايا التي يصعب نقلها ، مثل خلايا العضلات ، لأنها تعتمد على استخدام lentivirus لإدخال جميع الأدوات في الخلايا المستهدفة ، وبالتالي فهي أقوى من الطرق الأخرى مثل النقل أو الكهروبوراتيون. عيبه الرئيسي هو التكامل في الجينوم المضيف ، والبديل المحتمل لتجنب الاندماج الضار للفيروس lentivirus في الجينوم المضيف هو الاستخدام على lentivirus17 غير التكاملي ، ولكن يجب أن تكون كفاءة هذه الجسيمات غير التكاملية lentivirus مكافئة على الأقل ل lentivirus العادية.
من المحتمل أن يؤثر موقع التكامل على مستوى تعبير Cas9 ، ولكن هذا على الأرجح غير مسؤول عن الكمية الصغيرة من Cas9 في Cl-KOR 2. من المرجح أن تكون الكمية الصغيرة من Cas9 مرتبطة بنقل هذا الاستنساخ المحدد مع LV-Killer ، والذي كان يمكن أن يكون أقل من المستنسخ الآخر ، أو بدلا من ذلك ، كان من الممكن أن يكون عدد LV-Cas9 أعلى.
لا ينصح بالتعبير عن Cas9 وحده بدون gRNA لفترة طويلة (مثل تطوير استنساخ Cas9) ، حيث تم وصف ذلك لزيادة الأهداف ، وقد يزيد أيضا من وفيات الخلايا.
لقد اخترنا استخدام SpCas9 كنوكليز ، لأنه يستخدم على نطاق واسع ، ويحتوي على PAM قصير ، وبالتالي يقدم العديد من الخيارات لاختيار الحمض النووي الريبي الدليلي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن حجمه متوافق مع إنتاج ناقلات الفيروسات الخبيثة. يمكن استخدام نوكلياز أخرى إذا كان لا بد من استهداف PAM معين (مثل SaCas9 أو Cpf1)18.
يمكن إنتاج فيروسات lentivirus المختلفة في غرفة استزراع BSL2 العادية19 أو شراؤها من منشأة لإنتاج الفيروسات أو شركة. شرط تنفيذ هذا البروتوكول هو الخبرة في البيولوجيا الجزيئية والاستنساخ الجزيئي ، وفي زراعة نموذج الخلية المختارة.
تقوم فيروسات lentiviruses التي تشفر الأدلة المختلفة أيضا بتشفير البروتين الفلوري ، mCherry. يمكن أن يكون هذا البروتين الفلوري مفيدا ، مما يسمح بالفرز الآلي للخلايا والاستنساخ بواسطة FACS بدلا من استنساخ خلية واحدة ، وفي هذه الحالة ، لا ينبغي قمع التعبير عن mCherry باستخدام قاتل LV . إذا كان يجب الحفاظ على mCherry ، فلا ينبغي استنساخ الدليل الثاني ضد mCherry في p-killer (الخطوة 2.7). بالنسبة لجين RYR1 ، نظرا لأن التوصيف الوظيفي يستخدم مجسات الفلورسنت ، وقد يتطلب الاستخدام المستقبلي لهذا الخط الخلوي أيضا وضع علامات مناعية بالأجسام المضادة الفلورية ، فقد اخترنا قمع تعبير mCherry. في قاتل LV ، تم وضع gRNA الذي يستهدف Cas9 تحت محرك H1 قوي بدلا من promotor 7SK الضعيف الموجود في البداية في البلازميد الأصلي ، لضمان كفاءة مماثلة للنوكليز على جميع gRNAs المختارة ، وزيادة الانقسام Cas9 بمجرد إضافة قاتل LV إلى الخلايا.
الخطوة الأطول والأكثر صعوبة هي استنساخ خلية واحدة. في إجراءنا ، أظهرت خلايا العضلات نموا منخفضا بعد نقل الفيروس العدسي مع Cas9 وتعافت بعد بضعة أسابيع. إذا تم إجراء استنساخ الخلية الواحدة في وقت مبكر جدا بعد عمليات النقل الفيروسي ، ربما بسبب موت الخلايا الهائل ، فلن تحتوي سوى آبار قليلة من صفيحة 96 بئرا على خلايا متنامية. وبالتالي ، من الأفضل تضخيم الخلايا قبل الاستنساخ ، والانتظار لمدة 2-3 انقسام على الأقل. من الممكن أيضا استنساخ الخلايا في 10 خلايا / بئر إذا لم تنمو بشكل جيد كخلايا مفردة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب دائما استزراع الأرومات العضلية عند التقاء أقل من 50٪ من أجل الحفاظ على قدرة تمايز جيدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية لمكافحة اعتلال العضلات (AFM-Téléthon) ومن Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).
