Summary
该协议描述了如何使用CRISPR / Cas9生成敲除肌母细胞，从引导RNA的设计到细胞克隆和敲除克隆的表征。
Abstract
簇状调节间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas 9的一个重要应用是敲除细胞系的开发，专门用于研究在基因诊断期间鉴定的与疾病相关的新基因/蛋白质的功能。对于这种细胞系的开发，必须解开两个主要问题：将CRISPR工具（Cas9和引导RNA）高效插入所选细胞中，以及将Cas9活性限制在所选基因的特定缺失上。这里描述的方案专门用于将CRISPR工具插入难以转染的细胞中，例如肌肉细胞。该协议基于使用慢病毒，用公开可用的质粒生产，其所有克隆步骤都被描述为靶向目的基因。Cas9活性的控制是使用先前描述的称为KamiCas9的系统进行的，其中用编码靶向Cas9的引导RNA的慢病毒转导细胞允许逐步消除Cas9表达。该方案已应用于 RYR1-敲除人肌肉细胞系的开发，该细胞系已在蛋白质和功能水平上进一步表征，以确认参与肌肉细胞内钙释放和激发 - 收缩耦合的这种重要钙通道的敲除。这里描述的过程可以很容易地应用于肌肉细胞或其他难以转染的细胞中的其他基因，并产生有价值的工具来研究人类细胞中的这些基因。
Introduction
随着基因测序的进展和特定组织中未知功能基因突变的鉴定，开发相关细胞模型以了解新靶基因的功能并确认其参与相关病理生理学机制构成了必不可少的工具。此外，这些模型对未来的治疗发展1，2具有重要意义，并且构成了与国际上关于减少在实验中使用动物的建议直线开发敲除动物模型的有趣替代方案。使用CRISPR / Cas9进行基因编辑是目前最强大的工具之一，它允许开发许多敲除/敲入模型，并且使用CRISPR / Cas9进行靶向基因验证是CRISPR / Cas93使用最广泛的应用之一。基因编辑的成功依赖于在靶细胞模型中引入CRISPR工具（引导RNA和核酸酶Cas9）的能力，这在许多难以转染的细胞（如肌肉细胞4）中可能是一个挑战。这种挑战可以通过使用病毒（通常是慢病毒）来克服，其具有有效转译许多细胞类型并递送其转基因的巨大优势。但它的主要缺点是转基因在宿主细胞基因组中的整合，导致定位在整合位点的基因的潜在改变和转基因的永久表达，这在核酸酶Cas9的情况下会导致破坏性后果5。Merienne及其同事6提出了一种智能解决方案，其中包括将靶向Cas9基因本身的引导RNA引入细胞，导致Cas9失活。本文将这种策略的适应性作为用户友好和多功能的方案提出，允许敲除难以转染的细胞中的几乎任何基因。
这里提出的方案的目标是诱导永生化肌肉细胞中目的基因的失活。它可用于敲除不同类型的永生化细胞中的任何目的基因。这里描述的方案包含设计指导RNA并将其克隆成慢病毒质粒的步骤，在慢病毒载体中生产CRISPR工具，用不同的慢病毒转导细胞，以及克隆细胞以产生均匀的编辑细胞系的步骤。
使用该协议，已经开发了永生化的人骨骼肌细胞，并删除了1型ryanodine受体（RyR1），这是一种参与细胞内钙释放和肌肉收缩的必需钙通道7。该基因的敲除（KO）已使用蛋白质印迹在蛋白质水平上得到证实，并且在功能水平上使用钙成像得到证实。
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Protocol
肌肉活检是根据欧洲建议和法国立法从研究组织银行（Myobank，欧盟网络EuroBioBank的合作伙伴，法国巴黎）获得的。已获得所有人的书面知情同意。永生化成肌母细胞由V. Mouly博士（法国巴黎Myology Institute）友好地制作，并且协议由Myology Institute伦理委员会（MESRI，n AC-2019-3502）批准。
1. 防鲜膜导轨设计
- 确定要删除的基因区域。使用基因组浏览器工具（如 ensembl.org 或 genome.ucsc.edu）搜索其基因组序列，并确定两个区域的染色体坐标，以查找要删除的区域两侧的引导RNA（gRNA）。
- 对于这里使用的基因，获取 RYR1 基因的FASTA序列和外显子101的序列，如下所示。在ensembl中，在人类基因组的最新版本中搜索 RYR1 ，选择第一个条目，然后单击蛋白质编码序列的转录本。然后，单击 外显子 以重定向到该基因的外显子列表。
- 单击 “下载序列 ”并选择“ 仅基因组序列” 以下载整个基因的完整共识序列。向下滚动基因的外显子和内含子列表，然后选择靶向的外显子和内含子。
- 在基因中找到相应的核苷酸序列。选择要删除的外显子的上游和下游的内含子的核苷酸序列，这些序列将用于搜索gRNA。
- 使用在线工具（如 Crispor.tefor.net 8）在步骤1.1中确定的区域（要删除的区域上游和下游的内含子）中设计两个gRNA，此处称为引导1和引导2。选择由几百个碱基对（bp）分隔的两个gRNA，每个gRNA的序列正好是20个核苷酸长，没有原间隔相邻基序（PAM）。选择可用的最佳指南以限制脱靶。有关导轨设计的示例，请参见 图 1 。
- 预计两个导引物之间的序列将被删除，并导致目的基因的敲除，因此选择两个导联体的位置，使其删除目的基因中的必需序列或必需外显子。确保删除的序列/外显子不是仅存在于基因的替代转录本中和/或它编码蛋白质的重要部分，因此其缺失将导致功能性敲除。
注意：尽管Cas9裂解位点预计发生在原间隔相邻基序（PAM）上游3 bp处，但也可能发生较大距离的裂解，因此一个好的解决方案是不依赖于裂解位点的精确定位，例如内含子中的裂解。
- 预计两个导引物之间的序列将被删除，并导致目的基因的敲除，因此选择两个导联体的位置，使其删除目的基因中的必需序列或必需外显子。确保删除的序列/外显子不是仅存在于基因的替代转录本中和/或它编码蛋白质的重要部分，因此其缺失将导致功能性敲除。
- 在没有PAM的情况下确定每个gRNA的反向补体（RC）序列，以便具有以下序列：指南1和指南1-RC，指南2和指南2-RC。
- 订购 表1 中介绍的引物进行质粒的克隆。在整个方案中，在无菌H2O中使用浓度为10 nM的引物。
注意：添加到这些引物中的gRNA的序列（粗体和下划线）分别对应于引导蛋白，启动子和反式激活 - Crispr RNA（tracrRNA）之前和之后的质粒序列，并且不应进行修改以确保引物和质粒之间的良好重叠。
2. 质粒克隆
注意：在此步骤中，gRNA将入质粒骨架中以产生慢病毒。编码两种gRNA的盒首先通过连续聚合酶链反应（PCR）使用重叠的引物产生。然后将新盒插入慢病毒骨架质粒#87919中。
- 获得以下质粒：质粒 #87919，编码慢病毒载体中的 CRISPR 引导 RNA，以及编码慢病毒载体中 SpCas9 序列的质粒 #87904。
- 盒式结构
注：克隆协议摘要如下： 图2.- 运行PCR（A）反应，使用2μL质粒#87919，2μL primer_XmaIF，2μL primer_Guide1R，25μL聚合酶混合物和19μLH2O.运行以下PCR程序（程序1）：在98°C下初始变性5分钟，然后在98°C下30次循环：30 s， 在60°C下30秒，在72°C下1分钟45秒，在72°C下最终伸长7分钟。 步骤1.4中描述的引物的Tm为60°C。
注意：虽然程序1中的伸长时间看起来很长，但选择这个伸长时间是为了确保生产足够多的合适尺寸的材料。事实上，由于质粒中的重复序列（RNA导体后tracrRNA的序列在质粒#87919中重复三次），预期DNA的PCR扩增很困难，并且在连续的PCR中产生额外的更小的条带。因此，由于不同PCR产物之间的竞争，要么延长了伸长时间（有利于最长的一个并在末端有足够的纯化材料），要么对长片段使用了接触式PCR（程序2）（例如步骤2.2.6中描述的PCR（最终）。 - 在Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液（TBE）中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物，切除并纯化300 bp片段。按照制造商的说明使用专用试剂盒进行纯化，洗脱最终体积为20μL。直接使用纯化的片段或储存在-20°C进行步骤2.2.5。
- 使用PCR程序1，使用2μL质粒#87919，2μL primer_Guide1F，2μL primer_Guide2R，25μL聚合酶混合物和19μLH2O进行PCR（B）反应。在TBE中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物，在20μL洗脱缓冲液中切除并纯化400 bp片段。直接使用纯化的片段或储存在-20°C进行步骤2.2.5。
- 使用PCR程序1，使用2μL质粒#87919，2μL primer_Guide2F，2μL primer_BlpIR，25μL聚合酶混合物和19μLH2O进行PCR（C）反应。在TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。在20μL洗脱缓冲液中切除并纯化600 bp片段。直接使用纯化的片段或储存在-20°C进行步骤2.2.6。
注意：由于引物在质粒中重复区域上的引物杂交，900 bp处的另一个片段可能是可见的，如步骤2.2.1的注释中所述。如果存在，应丢弃此条带。 - 运行PCR（D）反应，用2μL洗脱PCR A（从步骤2.2.2开始），2μL洗脱PCR B（从步骤2.2.3开始），2μL primer_XmaIF，2μL primer_Guide2R，25μL聚合酶混合物和19μLH2O，使用PCR程序1。在TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物;在20μL洗脱缓冲液中切除并纯化700 bp片段。直接使用纯化的片段或储存在-20°C进行步骤2.2.6。
注意：由于引物在重复区域的杂交，其他条带可能在>1，000 bp，400 bp和300 bp处可见，应丢弃。 - 运行PCR（最终）反应，用4μL洗脱PCR C（从步骤2.2.4开始），4μL洗脱PCR D（从步骤2.2.5开始），4μL primer_XmaIF，4μL primer_BlpIR，50μL聚合酶混合物和34μLH2O。使用的程序如下（PCR程序2）：在98°C下初始变性5分钟;六个循环：98°C下30秒，66°C下30秒（每个循环杂交温度降低1°C），72°C下1分钟45;35个循环：98°C下30 s，60°C下30 s，72°C下1分钟45，72°C下最终伸长5分钟。
注意：这种最终扩增的PCR程序是一种向下的PCR，与前一个不同，因为最终扩增的尺寸很大，在每个导引物之后包含两个重复的tracrRNA序列。 - 在TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物;切除并纯化最终的盒，其在20μL洗脱缓冲液中以约1，300 bp的速度迁移。量化洗脱产物。直接使用纯化的片段或储存在步骤2.3.2.1的-20°C。这是将插入慢病毒质粒中的最终产物。
注意：其他片段在>1000 bp，400 bp和300 bp时可见，对应于应丢弃的不完全PCR片段。
- 运行PCR（A）反应，使用2μL质粒#87919，2μL primer_XmaIF，2μL primer_Guide1R，25μL聚合酶混合物和19μLH2O.运行以下PCR程序（程序1）：在98°C下初始变性5分钟，然后在98°C下30次循环：30 s， 在60°C下30秒，在72°C下1分钟45秒，在72°C下最终伸长7分钟。 步骤1.4中描述的引物的Tm为60°C。
- 将gRNA盒插入慢病毒质粒骨架中。
- 通过用限制性内切酶XmaI和BlpI对质粒#87919进行双重消化来线性化质粒。
- 用15μL推荐缓冲液，15μL质粒（1μg/ μL），7.5μLBlbI酶（10 U / μL），7.5μLXmaI酶（10 U / μL）和112.5μL H2O制备反应。 将总量上样于1%琼脂糖凝胶上，切出并用适当的试剂盒纯化〜10 kb质粒。在20μL缓冲液中进行洗脱，并使用光密度测量定量洗脱产物。
注意：对大型DNA片段使用适当的纯化方案，例如Sun和coll 9描述的方案。
- 用15μL推荐缓冲液，15μL质粒（1μg/ μL），7.5μLBlbI酶（10 U / μL），7.5μLXmaI酶（10 U / μL）和112.5μL H2O制备反应。 将总量上样于1%琼脂糖凝胶上，切出并用适当的试剂盒纯化〜10 kb质粒。在20μL缓冲液中进行洗脱，并使用光密度测量定量洗脱产物。
- 连接gRNA盒和质粒。用步骤2.2.7中的gRNA盒和步骤2.3.1.1中的线性化质粒制备反应混合物，加入2μL酶和H 2 O以具有10μL的最终体积 p_guides。
注意：DNA盒量应在50-100ng之间，质粒量应在100-200ng之间，摩尔比为2：1。
- 通过用限制性内切酶XmaI和BlpI对质粒#87919进行双重消化来线性化质粒。
- 使用2μL新鲜制备的质粒转化具有化学性质 的大肠杆菌 ，例如Stbl3（50μL）或XL10-Gold，并在37°C下生长1小时后，在没有抗生素的情况下用100μg/ mL氨苄西林铺展在LB琼脂平板上。在37°C孵育过夜。选择几个菌落，并按照制造商的说明使用商业套件进行小型准备。
- 使用PCR程序1对具有Primer_XmaI的微量prep DNA进行PCR扩增，并使用PCR程序1 Primer_BlpR（见 图2）。在TBE缓冲液中的1%琼脂糖凝胶上分离PCR产物。选择几个菌落（~5），其条带的预期大小约为1300 bp。
- 使用Primer_XmaI或Primer_BlpR对选定的菌落进行DNA测序，以确认gRNA盒的正确插入。
注意：其中一个序列验证的菌落在研究中进一步使用，质粒称为p_guides。 - 从步骤2.2（盒式结构）用引物 - 杀手F和R以及引物 - mCherry F和R重复。质粒称为p_Killer。
3. 慢病毒的产生
- 按照制造商的说明，使用不含内毒素的 maxi-prep 试剂盒生产和纯化大量所需的所有质粒。以2μg/ μL制备等分试样，在-20°C下储存
- 细胞制备（第1天）
- 准备18块145厘米的平板，每块板上接种1×106 HEK293细胞，在16 mL由Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）高葡萄糖丙酮酸盐组成的培养基中，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。在37°C下扩增细胞，在5%CO2 培养箱中培养3天。
注意：慢病毒的产生必须在生物安全2级实验室中谨慎进行，使用经过调整的保护装备，包括一次性防护服，防护帽和手套。所有实验必须在带过滤尖端的层流罩（BSLII安全柜）下进行。所有含有慢病毒的溶液和所有使用的塑料/玻璃废物必须用70%乙醇或其他病毒灭活剂灭活。
- 准备18块145厘米的平板，每块板上接种1×106 HEK293细胞，在16 mL由Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）高葡萄糖丙酮酸盐组成的培养基中，补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。在37°C下扩增细胞，在5%CO2 培养箱中培养3天。
- 细胞转染（第4天）
- 检查细胞的汇合度，确保它们已达到60%-65%汇合。
- 制备含有每个板的转染溶液：20.8μg目标质粒（p-导体，或p-Killer，或pCas9 #87904），4.8μg编码包膜的质粒（VSV-G，#8454），20.8μg质粒psPAX2（#12260）用于慢病毒包装，136μL磷酸钙并用H2O调节至最终体积1，000μL。滴加该溶液并在搅拌下加入1mL2x HEPES缓冲盐水（HBS）。
注意：不要同时为所有板准备混合物，以确保试剂的最佳制备;同时为六个板准备混合物，例如，对于18个板，为六个板准备三次混合。 - 在室温（RT）下孵育至少10分钟，并向细胞中滴加2mL溶液。将转染试剂匀浆，轻轻搅拌板后，向前，向上和向下搅拌，在37°C，5%CO2 下孵育至少5小时。
注意：从现在开始，直到慢病毒生产结束，请佩戴额外的保护装备，包括第二副手套，保护套和一次性塑料。 - 转染后五小时，从平板上取出培养基，并用PBS冲洗以除去转染试剂。加入12mL新鲜培养基，并在37°C，5%CO2下孵育48小时。
- 收集病毒颗粒（第6天）
- 从所有盘子中收集并池化培养基。在4°C下以800× g 离心5分钟，以沉淀细胞碎片。使用0.45μm过滤器过滤上清液（需要多个过滤器）。
- 在摆动的桶形转子中以68，300× g 在4°C下离心2小时。除去上清液，让试管在纸上的安全柜下倒置5-10分钟以除去尽可能多的液体，然后每个沉淀加入100μLHEK增殖培养基。在4°C下至少2小时后，通过上下移液重悬沉淀。将所有重悬的颗粒池化。
注意：在等分之前，颗粒可以在4°C下在培养基中放置过夜。 - 在10μL或25μL样品量（取决于用途）中等分慢病毒，并用液氮速冻。储存在-80°C。 不要冷冻已经解冻的等分试样。
- 对其他感兴趣的质粒重复步骤3.2至3.4，以产生LV-导体，LV-Killer和LV-Cas9。
注意：作为替代方案，慢病毒可以从公司或病毒设施购买。
4. 慢病毒滴定
注意：病毒滴定在HEK293细胞上进行。滴定在后续步骤中为每个细胞（无论慢病毒的批次如何）加入精确数量的慢病毒对于感兴趣的细胞非常重要。有效转导细胞的病毒颗粒的数量称为感染的多重性（MOI）：因此MOI 10对应于每个细胞引入10个病毒颗粒。由于冷冻/解冻循环影响慢病毒的存活率，因此使用冷冻的慢病毒等分试样进行滴定，并且每个后续实验将用同一池的新等分试样进行。这里描述了一种滴定方法，但也可以使用其他方法。
- 在第1天，将每块板1 x 105 个细胞接种在五个35 mm的平板中，底部有玻璃盖玻片，两个35mm的板没有盖玻片。
- 在第2天，从没有盖玻片的两个平板中，收集并计数胰蛋白酶消化后的细胞数量，并确定每块板（N）的平均细胞量。
- 在增殖培养基中制备100μL以1/10稀释的慢病毒。用不同体积的稀释病毒转导五个培养板，从1到50μL稀释的病毒。对于该方案，使用以下体积转导五个板：1μL，5μL，10μL，20μL，50μL。在37°C下在5%CO2中孵育48小时。
- 在第4天，通过将盖玻片在室温下孵育20至30分钟在4%多聚甲醛中来固定细胞。对于LV-Cas9，在室温下用0.1%Triton X100在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中透化细胞10分钟，在PBS-0.1%Triton X100-2%山羊血清 - 0.5%牛血清白蛋白（BSA）中饱和20分钟，在RT下用一抗抗V5（稀释1/400）标记45分钟，然后在室室用荧光二抗孵育30分钟。用Hoescht（PBS中的10μg/ mL）在室温下标记细胞核10分钟。
- 将盖玻片安装在载玻片上，并使用配备20倍物镜的荧光显微镜进行观察。对于左心室导引和左心室杀手，固定后直接进入细胞核标记并安装盖玻片。对于每个盖玻片，计算视野中的细胞核总数（细胞总数）和标记的细胞数（用V5或mCherry），并确定为每个盖玻片标记的细胞比例。
- 选择盖玻片，其中转导细胞的比例至少为10%且不超过50%。确定该盖玻片的转导效率（X），并注意用于获得该转导效率的稀释病毒（V，以μL为单位）的体积。
- 根据以下公式确定病毒的滴度（在感染性颗粒中，表示为ip / mL）：
稀释因子是在步骤4.3中执行的慢病毒的稀释。我们常规获得LV-Cas9的最终滴度为1 x 109 ip / mL，LV-guide的最终滴度为1 x 10 10 ip / mL，在HEK细胞中测定。
5. 肌母细胞转导
注意：永生化成肌母细胞与先前产生的三种慢病毒连续转导。它们在由补充了20%FBS，2%青霉素/链霉素，2%Ultroser G的Ham's F10组成的增殖培养基中保持在低于50%的密度，并在37°C，5%CO2下培养。
- 根据以下公式，确定用LV-Cas9的MOI 10和LV-guides以及LV-killer的MOI 20治疗所选细胞数量的慢病毒体积：
注意：在一项平行实验中，已经使用对照慢病毒（lenti-GFP）比较了成肌细胞和HEK的转导效率，并且我们已经确定，与HEK细胞相比，需要五倍的慢病毒来有效地转导成肌母细胞。因此，在HEK上测量的MOI 10对应于每个成肌细胞的两个病毒颗粒。此处使用的 MOI 是在 HEK 单元上计算的。 - 在第1天，在每孔100μL增殖培养基中用10，000个细胞接种96孔板。在第2天，通过添加步骤5.1中计算的适当体积的LV-导轨和LV-Cas9来转导安全柜下的细胞。将细胞放回培养箱，直到第7天。
注意：使用高于25的MOI，特别是对于LV-Cas9，可能不会改善编辑细胞的数量，因为在高浓度的慢病毒下细胞死亡率较高。 - 在第7天，进行胰蛋白酶消化并计数细胞。将细胞以40%至50%的汇合度接种在新板中，并将细胞返回到培养箱中。五小时后，以20的MOI（在步骤5.1中计算的体积）用左心室杀伤细胞转导细胞。转染后将细胞扩增5至10天，至少两次传代，并始终将它们保持在<50%的低汇合度。当细胞的生长恢复正常（由分裂时间估计）时，细胞已准备好进行下一步，即细胞克隆。
注意：转导后的增殖可能会慢一些。在此实验程序之前，可以通过估计细胞的分裂时间来确定正常的细胞生长。
6. 细胞克隆
注意：由于肌母细胞转导很困难，并且永远不会达到100%的效率，即使使用慢病毒，也需要细胞克隆才能获得完全校正的细胞系。这仅适用于永生化细胞，或可以在几周/几个月内培养和扩增的细胞。
- 胰蛋白酶消化并计数细胞。在10个细胞/ mL的增殖培养基中稀释细胞，并将细胞以1个细胞/孔接种在含有100μL/孔培养基的96孔板中。
注意：要播种的板的数量取决于预期基因编辑的概率，常规使用2至10个板。 - 监测细胞的生长，并在较大的板中逐渐扩增每个孔，直到达到至少35mm板，同时将成肌细胞的汇合度保持在50%以下。该步骤可持续2-6周，具体取决于所使用的细胞及其在孔中分离后生长的能力。
7. 克隆选择
注：执行此步骤是为了确定哪些不断增长的克隆已得到适当修改。
- 设计一组引物，由位于第一导引物（Primer_BeforeGuide1F）之前的引物和位于第二导联线（Primer_AfterGuide2R）之后的另一引物组成，以扩增包含假定修饰序列的区域。参见 表1 ，了解此处使用的引物。
- 从每个克隆中收集细胞，保留至少300，000个细胞以供将来扩增，并使用其余细胞上的任何标准方案提取基因组DNA。
- 如果大量克隆正在生长，要丢弃未编辑的克隆，请通过在同一管中汇集来自五个克隆的细胞来执行快速测试，以从该池中提取DNA并用PCR进行测试。根据需要重复尽可能多的克隆。然后，进一步分离包含编辑单元格的池以执行单独的分析。
- 按如下方式控制PCR的编辑。用1μL Primer_BeforeGuide1F，1μL Primer_AfterGuide2R，12.5μL聚合酶混合物，3μL基因组DNA和7.5μL H2O制备PCR反应。在1%琼脂糖凝胶上电泳以鉴定编辑的克隆。
- 通过排序控制编辑，如下所示。对所选克隆执行 Sanger 测序，以确认删除并确定在每个克隆中如何执行编辑。保留多个经过编辑的克隆，以确保只有靶基因被修饰，并负责观察到的生理效应，并保留一个未编辑的克隆，该克隆将在随后的实验中用作对照克隆（CTRL）。
- 展开选定的克隆。一旦每个克隆的汇合度达到约50%，胰蛋白酶消化细胞并将细胞接种在更大的培养皿中，直到产生足够的细胞来执行生化和功能表征（通常每个克隆超过1 x 106 ），并储存每个克隆的冷冻等分试样以备将来使用。
8. 编辑克隆的表征
注意：一旦通过DNA测序挑选并确认了几个克隆，就可以使用蛋白质印迹在蛋白质水平上确认靶向基因的缺失，如果该基因有功能性细胞测定，则可以在功能水平上确认靶基因的缺失。在 RYR1-KO的情况下，由于RyR1是钙通道，因此已在培养的细胞上使用钙成像进行功能表征。
- 编辑克隆中的蛋白质表达
注意：RyR1仅以分化的肌管10表示。已使用蛋白质印迹在肌管中评估其表达，以确认RyR1蛋白水平的缺失以及Cas9蛋白的缺失。- 在约1.76厘米2的表面上，在涂有层粘连蛋白的35毫米板上（表面对应于200μL层粘连蛋白滴在PBS中以10mg / mL的钙）的增殖培养基（如上所述，步骤5）中的板200 ，000个细胞。一旦细胞在37°C，5%CO 2下孵育2-3小时后粘附在板上，将培养基转移到由DMEM低葡萄糖+ 10%马血清+ 1%青霉素/链霉素组成的分化培养基上，并将细胞返回到培养箱中6天。
- 分化6天后，收集并用200μL补充蛋白酶抑制剂的RIPA裂解细胞。使用Folin Lowry方法测定蛋白质浓度11。
- 在Laemmli变性缓冲液中室室变性30分钟后，在5%-15%梯度丙烯酰胺凝胶上加载15μg蛋白质。电泳分离后，将蛋白质在0.8 V下转移到Immobilon P上4小时11。
- 在含有0.1%吐温20和5%脱脂奶粉的PBS中在RT下将膜饱和30分钟后，将膜与在同一缓冲液中稀释的一抗一抗一起在室温下孵育2小时或在4°C下过夜，用PBS-0.1%吐温20洗涤膜5分钟，并在室温下用二抗孵育膜1小时。使用的一抗是：针对V5标签（稀释度：1/5000）检测Cas9的抗体，抗GAPDH（稀释度：1/1000）作为负载对照，抗RyR1抗体12，13 （稀释：1/10.000），针对DHPR的α1亚基的抗体（稀释：1/1000）和针对肌球蛋白重链MF20的抗体（稀释：1/1000）。
- 用PBS-0.1%吐温20洗涤膜5分钟，干燥多余的液体并加入化学发光底物。按照底物提供者的建议进行检测化学发光信号。
- 编辑克隆的功能表征
注意：使用钙成像评估RyR1在由CTRL或KO克隆14产生的分化肌管中的功能。- 在涂有层粘连蛋白的35mm培养皿中心的0.2cm2 表面上板50，000个细胞（表面由50μL层粘连蛋白滴覆盖，在PBS中用钙以10mg / mL覆盖），并诱导分化6天，如步骤8.1.1所述。每次刺激准备三块板，进行生物一式三份。
- 用50μL氟4-直接，在分化培养基中稀释1：1稀释并在37°C下孵育30分钟。 用KREBS缓冲液以1mg / mL的速度用葡萄糖冲洗细胞两次。
- 使用倒置荧光显微镜或使用10倍物镜的共聚焦显微镜测量荧光变化。将板安装在显微镜的载物台上，并以每秒1帧的速度开始采集，持续90秒。
- 通过加入2mL KCl进行膜去极化（140mM终浓度）或2mL 4 CmC（500μM终浓度）用于RyR1直接刺激，除去剩余的KREB并在第25帧处刺激细胞。确保记录的现场至少存在10个肌管。
- 使用专用软件量化每个肌管中的荧光变化。选择每道菜至少10个肌管（理想情况下每个培养皿20-30个肌管）进行分析，在每个肌管的长轴上绘制一条线（或感兴趣区域（ROI）），并沿着这条线收集所有帧的荧光F。
- 确定初始荧光值 F0，对应于第 1 帧到第 24 帧。绘制荧光变化 （F-F0）/F0 作为 0 到 90 秒时间的函数。重复实验三次，以获得来自三种不同培养物的至少90个肌管的荧光变异。汇总90个肌管的所有结果，并计算每个时间范围内（F-F0）/F0的平均±SEM。量化每个刺激和每个克隆的钙释放峰值幅度。
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Representative Results
该协议应用于来自健康受试者15 的永生化成肌母细胞（所谓的HM细胞，用于人类成肌细胞），其中RyR1先前已被表征为16，以敲除编码 RyR1 蛋白的RYR1基因。指南RNA的设计是为了删除包含基因外显子101和内含子101部分的序列。预计删除部分外显子101将导致阅读框的中断。此外，外显子101编码蛋白质的孔，因此需要产生功能性钙通道。许多患有严重RyR1相关肌病的患者在基因7的这个区域都有突变。选择使用Crispr软件预测的最佳指南，以便尽可能少地偏离目标，同时保持最佳效率。我们选择在同一病毒载体中同时使用两个导联，以确保细胞的主要部分将被敲除，并简化使用PCR在编辑克隆中检测缺失。两个选定的导线（参见 表2 和 图1）分别定位在外显子101的末端和内含子101的开头，导致326 bp的缺失和随后的帧移位。这可确保编辑的单元格将是 RYR1-KO。
靶向SpCas9的gRNA是由Merienne及其同事6 已经设计的，并且存在于弱启动子7SK下的质粒#87919中。由于其靶向SpCas9序列的效率已经在他们的研究6中得到证实，因此它已被用于创建质粒p_Killer，但在强启动子H1的控制下。质粒p_Killer中的第二个指南旨在靶向启动子U6下的mCherry序列。这将允许删除mCherry，这可能会在新创建的细胞系的一些后续实验中令人不安。
p_guides和p_killer的质粒被创造出来，所有必需的慢病毒都在专用的BSL2培养室中产生。在成肌细胞转导后，将细胞培养2周直到生长恢复，并使用PCR进行分析以确认编辑细胞的存在。对于细胞克隆，将两个96孔板以每孔1个细胞接种处理过的细胞。在32%的培养孔中观察到细胞生长。然后从克隆中提取基因组DNA并进行PCR分析，直到鉴定出两个校正的克隆（所谓的Cl-KOR-1和Cl-KOR-2），见 图3。 RYR1 靶向部分的缺失通过Sanger测序得到证实。已经使用了其他对照细胞，例如初始HM细胞，或用完全相同的程序处理的HM细胞，但未经PCR和测序（Cl-CTRL）确认的编辑。然后将选定的克隆扩增并在蛋白质水平和功能水平上进一步表征。
为了验证RyR1和Cas9在蛋白质水平上的完全消光，进行了蛋白质印迹分析。结果如图 4所示。在HM细胞中不存在的Cas9蛋白在用LV-Cas9（HM + LV-Cas9）转导细胞5天后被检测到，并且正如预期的那样，其表达在Cl-CTRL和编辑的Cl-KOR-1和Cl-KOR-2中被废除，尽管在Cl-KOR-2中仍然检测到少量Cas9（图3A）。由于靶向Cas9的gRNA仍然表达，剩余的Cas9的量预计将逐渐消失。还使用蛋白质印迹法评估了其他重要蛋白质的表达：RyR1，以确认蛋白质的完全缺失，DHPR的α1亚基是RyR1参与激发 - 收缩偶联的功能伴侣，以及肌球蛋白重链作为分化的标志，因为RyR1和DHPR仅在分化肌管中表达（图3B).DHPR和MYHC不应该被修改。尽管蛋白质印迹证实了两个RyR1-KO克隆（Cl-KOR-1和Cl-KOR-2）中RyR1的完全缺失，但Cl-KOR-2中可能发生了Cas9或克隆程序引起的其他修饰，此外还存在DHPR缺失和肌球蛋白重链（MHC）减少。由于这两种蛋白质仅在分化的肌管中表达，因此它们的缺失很可能反映了分化的改变，这可能源于与细胞局部过度生长相关的漫长的单细胞克隆过程，导致其肌源潜力的丧失。因此，只有Cl-KOR-1在功能层面上得到了进一步的特征。这表明选择大量已编辑的克隆对于能够与最佳克隆一起使用非常重要。
使用钙成像进行功能表征。作为时间函数的平均荧光变化如图 5所示，在每个基因型的至少180个肌管上，使用4-CMC的直接RyR1刺激或通过KCl膜去极化刺激钙释放复合物（与RyR1相关的DHPR）。
这些实验表明，非修饰的Cl-CTRL具有与初始细胞群（HM细胞）相当的行为，并且通过其激活剂4-CmC和通过膜去极化刺激钙释放复合物来响应RyR1的直接刺激。相比之下，编辑的Cl-KOR-1无法对刺激（4-CmC和KCl去极化）做出反应，正如RyR1-KO所预期的那样。
总的来说，蛋白质印迹和功能表征证实了Cl-KOR-1细胞系是 RyR1-KO肌肉细胞系。该协议可以应用于骨骼肌中表达的任何其他基因，或其它细胞类型（如诱导多能干细胞-iPSC）。完整的协议如图 6 所示。
图1：导链RNA的定位和设计。 （A）为创建 RYR1-KO细胞系而设计的指南的示意图定位。指南1靶向RYR1基因中外显子 101 的末端，导则2靶向内含子101，产生326 bp的缺失和帧移位。引导杀手在SpCas9的序列中靶向起始密码子，引导mCherry靶向mCherry序列的末端。（B）指南1，指南2，指南杀手和指南mCherry的基因组序列中的指南的定位。每个指南的顺序（长度为20 bp）以彩色显示，每个指南的PAM以粗体和下划线显示。 请点击此处查看此图的大图。
图2：用于生产盒的克隆程序。 执行不同PCR以产生带有导流的盒的示意图，以将其插入慢病毒主链质粒中。PCR A、PCR B、PCR C 和 PCR D 通过右上图所示的程序 1 实现，PCR 最终通过右下图所示的 PCR 程序 2 实现。 请点击此处查看此图的大图。
图3：使用PCR选择克隆（A）PCR扩增的1，200 bp区域的示意图，该区域包括导轨，正向和反向引物由灰色箭头表示。两个导引物处的DNA切割预计将导致PCR片段的大小减小326 bp，如剪刀下方的虚线绿色垂直线所示。（B）将HM细胞，Cl-CTRL，Cl-KOR-1和Cl-KOR-2产生的PCR产物加载到1%琼脂糖凝胶上。HM和Cl-CTRL的DNA看起来是非修饰的（全长），而Cl-KOR-1和Cl-KOR-2的DNA比对照组短，正如预期的那样（切割）。请点击此处查看此图的大图。
（A）蛋白质印迹分析HM细胞中使用V5标签的Cas 9蛋白的存在，用LV-Cas9，Cl-CTRL，Cl-KOR-1和Cl-KOR-2转导的HM细胞。Cas9在用LV-Cas9转导的HM细胞中被清楚地检测到，而其表达已被LV-Killer完全废除（在Cl-CTRL和Cl-KOR-1中）或几乎完全（在Cl-KOR-2中）。（B）RyR1，肌球蛋白重链（MYHC），DHPR的α1亚基和GAPDH在Cl-CTRL，Cl-KOR-1和Cl-KOR-2中作为负载对照的表达。请点击此处查看此图的大图。
图5：细胞的功能表征。 Fluo-4钙成像在由HM细胞，Cl-CTRL和Cl-KOR-1产生的肌管上进行。这些曲线表示HM肌管（黑色曲线），Cl-CTRL肌管（灰色曲线）或Cl-KOR-1（绿色曲线）的荧光变化。所有值均表示为 n 个肌管的均值±标准误 （SEM）。在每种情况下，已经分析了n = 180至256个肌管，来自至少三个不同的实验（每个曲线指示的确切数字）。使用4 CmC（500μM）在2mM外部钙存在下直接刺激RyR1。在2 mM外部钙的存在下诱导KCl去极化（140 mM）。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：整个协议的示意图。 介绍了方案的不同步骤，从 计算机 设计到 体外 分子克隆和最终的细胞选择。 请点击此处查看此图的大图。
| 名字 | 序列 5'-3' | 目的/用途 | ||
| Primer_Guide1F | Guide1 + gttttagagctagaaatagc | 质粒克隆 | ||
| Primer_Guide1R | 指南 1-RC +AGATCTGTGTTCTCATACAG | |||
| Primer_Guide 2F | Guide 2 + gttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_Guide 2R | 指南 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG | |||
| Primer_XmaI F | TAGTGGATCCCCCGAAAATTCAAAATTTT | 质粒克隆和菌落控制 | ||
| Primer_BlpI R | CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC | |||
| Primer_KillerF | AATGGAGTACTTCTTCCAgttttagagctagaaatagc | 克隆质粒p_Killer | ||
| Primer_KillerR | TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG | |||
| Primer_mCherryF | GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_mCherryR | TCGGCGCGTTCGTGTGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG | |||
| Primer_RYR1exonF | GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc | 克隆质粒p_guides_RyR1 | ||
| Primer_RYR1exonR | CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG | |||
| Primer_RYR1intronF | TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc | |||
| Primer_RYR1intronR | AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCTCCTTTCCACAAG | |||
| Primer_BeforeRYR1cut | AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT | RYR1 KO 的克隆选择 | ||
| Primer_AfterRYR1cut | CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC | |||
表1：引物列表。 用于质粒克隆和菌落控制的引物，以及用于克隆选择的引物。
| 名字 | 指南序列 | 帕姆 | 不含 PAM 的反向补体 | ||
| 指南 1：RYR1exon | GCTCGTATTCGTCACCCGCG | 断续器 | CGCGGGTGACGAATACGAGC | ||
| 指南2：RYR1intron | TAAGTCAGTTCATAGGCGCT | 断续器 | AGCGCCTATGAACTGACTTA | ||
| 指南杀手Cas9 | TGGACAAGAAGTACTCCATT | 断续器 | AATGGAGTACTTCTTGTCCA | ||
| 指南 m 樱桃杀手 | GAACAGTACGAACGCGCCGA | 断续器 | 断续器 | ||
表2：用于创建质粒p_guides和p_Killer的导轨。 用于开发RyR1-KO克隆的序列在此表中列出。
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Discussion
在表征涉及病理学的未知功能基因的道路上，一个重要的步骤是开发相关的细胞模型来研究这些基因的功能。使用CRISPR / Cas9进行基因编辑是一个呈指数级增长的研究领域，这里介绍的敲除模型的开发是其使用最广泛的应用之一。在这种情况下，我们在这里提出了一种多功能方案，可以在任何感兴趣的基因中开发一种人类细胞系敲除，从而允许在相关的人类细胞模型中表征该基因。这里介绍的方案可用于永生化肌母细胞以及iPSC，因此实际上可以导致在目的基因中产生任何人类细胞模型KO。
局限性在于，该方案应应用于永生化细胞，因为需要数周的培养以及细胞克隆以及许多连续的扩增。或者，应使用可以扩增并维持数周或数月的细胞。使用该程序，用于目的基因（此处为 RYR1 基因）的人类永生化肌肉细胞系KO已在约3-4个月内产生（不包括细胞的功能表征）。
该策略适用于难以转染的细胞，例如肌肉细胞，因为它依赖于使用慢病毒将所有工具引入靶细胞，因此它比转染或电穿孔等其他方法更强大。它的主要缺点是整合到宿主基因组中，避免破坏性地将慢病毒整合到宿主基因组中的可能替代方法是用于非整合性慢病毒17，但这些非整合慢病毒颗粒的效率应至少等同于常规慢病毒。
整合位点可能会影响Cas9的表达水平，但这很可能不是Cl-KOR 2中Cas9含量少的原因。少量的Cas9很可能与该特定克隆与LV-Killer的转导有关，后者可能低于另一个克隆，或者LV-Cas9的数量可能更高。
不建议长时间单独表达没有gRNA的Cas9（例如用于Cas9克隆的开发），因为这已经被描述为增加脱靶，并且还可能增加细胞的死亡率。
我们选择使用SpCas9作为核酸酶，因为它被广泛使用，它具有较短的PAM，因此为指南RNA的选择提供了几种选择。此外，其尺寸与慢病毒载体的生产相容。如果必须靶向特定的PAM（例如SaCas9或Cpf1）18，则可以使用其他核酸酶。
不同的慢病毒可以在常规的BSL2培养室19 中生产，也可以从病毒生产设施或公司购买。实施该协议的要求是分子生物学和分子克隆以及所选细胞模型培养的专业知识。
编码不同导线的慢病毒也编码荧光蛋白mCherry。这种荧光蛋白可能是有用的，允许通过FACS而不是单细胞克隆来自动分选细胞和克隆，在这种情况下，mCherry的表达不应该被左心室杀手抑制。如果要维护mCherry，那么针对mCherry的第二个指南不应该克隆到p杀手中（步骤2.7）。对于 RYR1 基因，由于功能表征使用荧光探针，并且该细胞系的未来使用也可能需要用荧光抗体进行免疫标记，因此我们选择抑制mCherry表达。在左心室杀伤者中，靶向Cas9的gRNA被放置在强启动子H1下，而不是最初存在于原始质粒中的弱启动子7SK，以确保所有选定的gRNA上核酸酶的相似效率，并在将左心室杀伤蛋白添加到细胞中后增加Cas9切割。
最长和最费力的步骤是单细胞克隆。在我们的手术中，肌肉细胞在用Cas9进行慢病毒转导后显示出生长减少，并在几周后恢复。如果在病毒转导后过早地进行单细胞克隆，可能是因为大量细胞死亡，那么96孔板中只有几个孔将包含生长中的细胞。因此，最好在克隆前扩增细胞，并等待至少2-3次分裂。如果它们不能很好地生长为单细胞，也可以以10个细胞/孔克隆细胞。此外，成肌细胞应始终在低于50%的汇合度下培养，以保持良好的分化能力。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作由法国肌病协会（AFM-Téléthon）和奥弗涅-罗纳阿尔卑斯大区（AURA）的赠款资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
References
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