Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Het protocol beschrijft hoe knock-out myoblasten kunnen worden gegenereerd met CRISPR / Cas9, van het ontwerp van guide-RNA's tot het cellulair klonen en karakteriseren van de knock-out klonen.

Abstract

Een belangrijke toepassing van clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is de ontwikkeling van knock-out cellijnen, specifiek om de functie van nieuwe genen/eiwitten geassocieerd met een ziekte te bestuderen, geïdentificeerd tijdens de genetische diagnose. Voor de ontwikkeling van dergelijke cellijnen moeten twee belangrijke kwesties worden ontward: het inbrengen van de CRISPR-tools (het Cas9 en het gids-RNA) met een hoge efficiëntie in de gekozen cellen en beperking van de Cas9-activiteit tot de specifieke deletie van het gekozen gen. Het hier beschreven protocol is gewijd aan het inbrengen van de CRISPR-tools in moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van lentivirussen, geproduceerd met plasmiden die openbaar beschikbaar zijn, waarvoor alle kloonstappen worden beschreven om zich te richten op een gen van belang. De controle van Cas9-activiteit is uitgevoerd met behulp van een aanpassing van een eerder beschreven systeem genaamd KamiCas9, waarbij de transductie van de cellen met een lentivirus dat codeert voor een gids-RNA gericht op de Cas9 de geleidelijke afschaffing van Cas9-expressie mogelijk maakt. Dit protocol is toegepast op de ontwikkeling van een RYR1-knock-out menselijke spiercellijn, die verder is gekarakteriseerd op eiwit- en functioneel niveau, om de knock-out van dit belangrijke calciumkanaal te bevestigen dat betrokken is bij de intracellulaire calciumafgifte van de spieren en bij excitatie-contractiekoppeling. De hier beschreven procedure kan gemakkelijk worden toegepast op andere genen in spiercellen of in andere moeilijk te transfecteren cellen en waardevolle hulpmiddelen produceren om deze genen in menselijke cellen te bestuderen.

Introduction

Met de voortgang van gensequencing en de identificatie van mutaties in genen met onbekende functies in een specifiek weefsel, vormt de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van een nieuw doelgen te begrijpen en de betrokkenheid ervan bij de gerelateerde pathofysiologische mechanismen te bevestigen een essentieel hulpmiddel. Daarnaast zijn deze modellen van groot belang voor toekomstige therapeutische ontwikkelingen 1,2, en vormen ze een interessant alternatief voor de ontwikkeling van knock-out diermodellen in rechte lijn met de internationale aanbevelingen voor vermindering van het gebruik van dieren bij experimenten. Genbewerking met CRISPR/Cas9 is een van de krachtigste tools die momenteel beschikbaar zijn, waardoor veel knock-out/knock-in modellen zijn ontwikkeld, en gerichte genvalidatie met CRISPR/Cas9 behoort tot de meest gebruikte toepassingen van CRISPR/Cas93. Het succes van genbewerking is afhankelijk van het vermogen om de CRISPR-tools (de gids RNA's en de nuclease Cas9) in het doelcelmodel te introduceren, wat een uitdaging kan zijn in veel moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen4. Deze uitdaging kan worden overwonnen met het gebruik van virus, meestal lentivirus, dat het grote voordeel heeft om veel celtypen efficiënt te transduceren en zijn transgen te leveren. Maar het belangrijkste nadeel is de integratie van het transgen in het genoom van de gastheercel, wat leidt tot mogelijke verandering van genen gelokaliseerd op de integratieplaats en tot de permanente expressie van het transgen, wat in het geval van het nuclease Cas9 zou leiden tot schadelijke gevolgen5. Merienne en collega's6 hebben een slimme oplossing voorgesteld, die bestaat uit de introductie in de cellen van een gids-RNA gericht op het Cas9-gen zelf, wat leidt tot Cas9-inactivatie. Een aanpassing van deze strategie wordt hier gepresenteerd als een gebruiksvriendelijk en veelzijdig protocol dat het mogelijk maakt om vrijwel elk gen in moeilijk te transfecteren cellen uit te schakelen.

Het doel van het hier gepresenteerde protocol is om de inactivatie van een gen van belang in vereeuwigde spiercellen te induceren. Het kan worden gebruikt om elk gen van belang uit te schakelen, in verschillende soorten onsterfelijke cellen. Het hier beschreven protocol bevat stappen om de gids RNA's en hun klonen in lentivirale plasmiden te ontwerpen, om de CRISPR-tools in lentivirale vectoren te produceren, om de cellen met de verschillende lentivirussen te transduceren en om de cellen te klonen om een homogene bewerkte cellijn te produceren.

Met behulp van dit protocol zijn onsterfelijk gemaakte menselijke skeletspiercellen ontwikkeld met deletie van de type 1 ryanodinereceptor (RyR1), een essentieel calciumkanaal dat betrokken is bij intracellulaire calciumafgifte en spiercontractie7. De knock-out (KO) van het gen is bevestigd op eiwitniveau met behulp van Western blot en op functioneel niveau met behulp van calciumbeeldvorming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Spierbiopten werden verkregen van de Bank of Tissues for Research (Myobank, een partner in het EU-netwerk EuroBioBank, Parijs, Frankrijk) in overeenstemming met Europese aanbevelingen en Franse wetgeving. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle personen. Onsterfelijke myoblasten werden vriendelijk geproduceerd door Dr. V. Mouly (Myology Institute, Parijs, Frankrijk), en de protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Myology Institute (MESRI, n AC-2019-3502).

1. CRISPR-gidsontwerp

  1. Identificeer het gebied van het gen dat moet worden verwijderd. Zoek naar de genomische sequentie met behulp van genoombrowsertools zoals ensembl.org of genome.ucsc.edu en bepaal de chromosomische coördinaten van de twee regio's om te zoeken naar het gids-RNA (gRNA), aan beide zijden van het gebied dat moet worden verwijderd.
    1. Voor het hier gebruikte gen verkrijgt u als volgt de FASTA-sequentie van het RYR1-gen en de sequentie van het exon 101. Zoek in ensembl op RYR1 in de meest recente versie van het menselijk genoom, selecteer het eerste item en klik op het transcript van de eiwitcoderende sequentie. Klik vervolgens op Exons om door te verwijzen naar de lijst met exonen van het gen.
    2. Klik op Download sequence en selecteer Only Genomic Sequence om de volledige consensussequentie van het hele gen te downloaden. Scroll naar beneden in de lijst met exonen en introns van het gen en selecteer de beoogde gen(en).
    3. Zoek de overeenkomstige nucleotidesequentie in het gen. Selecteer de nucleotidesequenties van de introns onmiddellijk stroomopwaarts en stroomafwaarts van het te verwijderen exon, dat zal worden gebruikt om naar de gRNA's te zoeken.
  2. Ontwerp de twee gRNA's, hier gids 1 en gids 2 genoemd, in de regio's die in stap 1.1 zijn geïdentificeerd (introns stroomopwaarts en stroomafwaarts de regio die moet worden verwijderd) met behulp van online tools zoals Crispor.tefor.net8. Kies de twee gRNA's gescheiden door een paar honderd basenparen (bp), waarbij de volgorde van elk gRNA precies 20 nucleotiden lang is zonder het protospacer adjacent motief (PAM). Kies de beste beschikbare gidsen om off-target te beperken. Zie figuur 1 voor een voorbeeld van het ontwerp van de gids.
    1. De sequentie tussen de twee gidsen zal naar verwachting worden verwijderd en resulteren in de knock-out van het gen van belang, dus kies de positie van de twee gidsen zodanig dat het een essentiële sequentie of een essentieel exon in het gen van belang verwijdert. Zorg ervoor dat de verwijderde sequentie/exon niet uitsluitend aanwezig is in een alternatief transcript van het gen en/of dat het codeert voor een belangrijk deel van het eiwit, zodat de deletie ervan zal resulteren in een functionele knock-out.
      OPMERKING: Hoewel de Cas9-splitsingsplaats 3 bp stroomopwaarts van het protospacer-aangrenzende motief (PAM) wordt voorspeld, kan splitsing op grotere afstand ook voorkomen, dus een goede oplossing is om niet afhankelijk te zijn van de precieze lokalisatie van de splitsingsplaats, zoals splitsing in intron.
  3. Bepaal de reverse complement (RC) sequentie voor elk gRNA, zonder de PAM, om de volgende sequenties te hebben: Guide 1 en Guide 1-RC, Guide 2 en Guide 2-RC.
  4. Bestel de primers in tabel 1 om het klonen van de plasmiden uit te voeren. Gebruik gedurende het hele protocol primers in een concentratie van 10 nM in steriel H2O.
    OPMERKING: De sequenties die aan de gRNA's in deze primers worden toegevoegd (vetgedrukt en onderstreept) komen overeen met de volgorde van het plasmide voor en na respectievelijk het guide, promotor en trans-activating-Crispr RNA (tracrRNA) en mogen niet worden gewijzigd om een goede overlap tussen de primers en het plasmide te garanderen.

2. Plasmide klonen

OPMERKING: In deze stap worden de gRNA's in de plasmide-ruggengraat ingebracht voor de productie van lentivirussen. Een cassette die de twee gRNA's codeert, wordt eerst geproduceerd door opeenvolgende polymerasekettingreacties (PCR), met behulp van de overlappende primers. De nieuwe cassette wordt vervolgens ingebracht in het lentivirale ruggengraatplasmide #87919.

  1. Verkrijg de volgende plasmiden: plasmide #87919, codering voor CRISPR-gids RNA's in een lentivirale vector en plasmide #87904 codering voor de SpCas9-sequentie in een lentivirale vector.
  2. Cassette constructie
    OPMERKING: Het kloonprotocol is samengevat in Figuur 2.
    1. Voer een PCR (A) reactie uit, met 2 μL plasmide #87919, 2 μL primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide1R, 25 μL polymerasemengsel en 19 μL H2O. Voer het volgende PCR-programma uit (programma 1): initiële denaturatie 5 min bij 98 °C, gevolgd door 30 cycli van: 30 s bij 98 °C, 30 s bij 60 °C, 1 min 45 s bij 72 °C en een laatste rek van 7 min bij 72 °C. De Tm van de in stap 1.4 beschreven primers is 60 °C.
      OPMERKING: Hoewel de verlengingstijd in programma 1 vrij lang lijkt, is deze verlengingstijd gekozen om de productie van voldoende materiaal van de juiste grootte te garanderen. Inderdaad, vanwege de herhaalde sequenties in het plasmide (de sequentie van tracrRNA na RNA-gidsen wordt drie keer herhaald in het plasmide #87919) is de PCR-amplificatie van het verwachte DNA moeilijk en worden extra kleinere banden geproduceerd in de opeenvolgende PCR's. Vanwege de concurrentie tussen de verschillende PCR-producten is dus ofwel de verlengingstijd verhoogd (om de langste te bevoordelen en aan het einde voldoende gezuiverd materiaal te hebben), of is een touch-down PCR (programma 2) gebruikt voor het lange fragment (zoals beschreven voor de PCR (finale) in stap 2.2.6).
    2. Scheid de PCR-producten op een 1% agarose-gel in Tris-Borate-EDTA-buffer (TBE), accijns en zuiver het 300 bp-fragment. Voer de zuivering uit met behulp van een speciale kit volgens de instructies van de fabrikant, met elutie in een eindvolume van 20 μL. Gebruik het gezuiverde fragment rechtstreeks of bewaar het bij -20 °C voor stap 2.2.5.
    3. Voer een PCR (B) reactie uit, met 2 μL plasmide #87919, 2 μL primer_Guide1F, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymerasemengsel en 19 μL H2O met behulp van het PCR-programma 1. Scheid de PCR-producten op een 1% agarose-gel in TBE, snijd en zuiver het 400 bp-fragment in 20 μL el el elutiebuffer. Gebruik het gezuiverde fragment direct of bewaar het bij -20 °C voor stap 2.2.5.
    4. Voer een PCR (C) reactie uit, met 2 μL plasmide #87919, 2 μL primer_Guide2F, 2 μL primer_BlpIR, 25 μL polymerasemengsel en 19 μL H2O met PCR-programma 1. Scheid de PCR-producten op een 1% agarose gel in TBE-buffer. Accijns en zuiver het 600 bp fragment in 20 μL el el elutiebuffer. Gebruik het gezuiverde fragment rechtstreeks of bewaar het bij -20 °C voor stap 2.2.6.
      OPMERKING: Een ander fragment bij 900 bp kan zichtbaar zijn, als gevolg van hybridisatie van de primer op de herhaalde gebieden in het plasmide, zoals beschreven in de NOTITIE van stap 2.2.1. Indien aanwezig, moet deze band worden weggegooid.
    5. Voer een PCR (D)-reactie uit, met 2 μL elutie PCR A (uit stap 2.2.2), 2 μL el elUTIE PCR B (uit stap 2.2.3), 2 μl primer_XmaIF, 2 μL primer_Guide2R, 25 μL polymerasemengsel en 19 μL H2O, met PCR-programma 1. Scheid de PCR-producten op een 1% agarose-gel in TBE-buffer; accijns en zuiver het 700 bp fragment in 20 μL el el elutiebuffer. Gebruik het gezuiverde fragment rechtstreeks of bewaar het bij -20 °C voor stap 2.2.6.
      OPMERKING: Andere banden kunnen zichtbaar zijn bij > 1.000 bp, 400 bp en 300 bp, als gevolg van hybridisatie van de primers op de herhaalde regio's en moeten worden weggegooid.
    6. Voer een PCR (eind)reactie uit, met 4 μL el elutie PCR C (uit stap 2.2.4), 4 μL el el PCR D (uit stap 2.2.5), 4 μl primer_XmaIF, 4 μl primer_BlpIR, 50 μl polymerasemengsel en 34 μL H2O. Het gebruikte programma is het volgende (PCR-programma 2): initiële denaturatie gedurende 5 minuten bij 98 °C; zes cycli van: 30 s bij 98 °C, 30 s bij 66 °C (verlaging van de hybridisatietemperatuur met 1 °C per cyclus), 1 min 45 bij 72 °C; 35 cycli van: 30 s bij 98 °C, 30 s bij 60 °C, 1 min 45 bij 72 °C en een laatste rek van 5 minuten bij 72 °C.
      OPMERKING: Het PCR-programma voor deze laatste versterking is een touch-down PCR, anders dan de vorige, vanwege de grote omvang van de uiteindelijke amplificatie die twee herhaalde tracrRNA-sequenties bevat net na elke gids.
    7. Scheid de PCR-producten op een 1% agarose-gel in TBE-buffer; accijns en zuiver de uiteindelijke cassette, die migreert bij ongeveer 1.300 bp in 20 μL el elutiebuffer. Kwantificeer het geëlueerde product. Gebruik het gezuiverde fragment rechtstreeks of bewaar het bij -20 °C voor stap 2.3.2.1. Dit is het eindproduct dat in het lentivirale plasmide zal worden ingebracht.
      OPMERKING: Andere fragmenten kunnen zichtbaar zijn bij >1000 bp, 400 bp en 300 bp, wat overeenkomt met onvolledige PCR-fragmenten die moeten worden weggegooid.
  3. Inbrengen van de gRNA-cassette in de lentivirale plasmide-ruggengraat.
    1. Lineariseer het plasmide door dubbele vergisting van het plasmide #87919 met de restrictie-enzymen XmaI en BlpI.
      1. Bereid de reactie voor met 15 μL aanbevolen buffer, 15 μL plasmide (1μg/μL), 7,5 μL BlpI-enzym (bij 10 U/μL), 7,5 μL XmaI-enzym (bij 10 U/μL) en 112,5 μL H2O. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en vervolgens gedurende 20 minuten bij 65 °C. Laad de totale hoeveelheid op een 1% agarose gel, knip uit en zuiver de ~ 10 kb plasmide met een geschikte kit. Elutie wordt uitgevoerd in 20 μL buffer en het geëlueerde product wordt gekwantificeerd met behulp van optische dichtheidsmeting.
        OPMERKING: Gebruik een geschikt zuiveringsprotocol voor grote DNA-fragmenten, zoals het protocol beschreven door Sun en coll9.
    2. Ligate de gRNA-cassette en het plasmide. Bereid het reactiemengsel voor met gRNA-cassette uit stap 2.2.7 en het gelineariseerde plasmide uit stap 2.3.1.1, voeg 2 μL enzym en H2O toe tot een eindvolume van 10 μL. Incubeer gedurende 15 minuten bij 50 °C om het uiteindelijke plasmide te produceren dat p_guides wordt genoemd.
      OPMERKING: De hoeveelheid DNA-cassette moet tussen 50-100 ng liggen en de plasmidehoeveelheid tussen 100-200 ng, met een molaire verhouding van 2:1.
  4. Gebruik 2 μL van het vers bereide plasmide om chemisch competente E.Coli zoals Stbl3 (50 μL) of XL10-Gold te transformeren en verspreid op LB agarplaat met 100 μg/ml ampicilline na 1 uur groei bij 37 °C zonder antibioticum. Incubeer bij 37 °C 's nachts. Kies een paar kolonies en voer een minivoorbereiding uit met behulp van een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
  5. Voer een PCR-amplificatie uit op het miniprep-DNA met Primer_XmaI en Primer_BlpR met PCR-programma 1 (zie figuur 2). Scheid de PCR-producten op een 1% agarose gel in TBE-buffer. Selecteer een paar kolonies (~ 5) met een band met de verwachte grootte van ongeveer 1300 bp.
  6. Voer DNA-sequencing van de geselecteerde kolonies uit, met behulp van de Primer_XmaI of Primer_BlpR, om het juiste inbrengen van de gRNA-cassette te bevestigen.
    OPMERKING: Een van de sequentie-geverifieerde kolonie wordt verder gebruikt in de studie en het plasmide wordt de p_guides genoemd.
  7. Herhaal stap 2.2 (cassetteconstructie) met de Primers-Killer F en R en de Primers-mCherry F en R. Gebruik één sequentie-geverifieerde kolonie voor verdere analyse. Het plasmide wordt p_Killer genoemd.

3. Productie van lentivirussen

  1. Produceer en zuiver een grote hoeveelheid van alle benodigde plasmiden met behulp van een endotoxinevrije maxi-prep-kit volgens de instructies van de fabrikant. Bereid aliquots bij 2 μg/μL. Bewaren bij -20 °C
  2. Voorbereiding van cellen (dag 1)
    1. Bereid 18 platen van 145 cm gezaaid met 1 x 106 HEK293-cellen per plaat in 16 ml medium bestaande uit Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) hoogglucosylamaat, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Versterk de cellen bij 37 °C, in een 5% CO2-incubator gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: De productie van lentivirus moet met voorzichtigheid worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2, met behulp van aangepaste beschermingsmiddelen, waaronder wegwerpbeschermingspak, beschermkap en handschoenen. Alle experimenten moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stromingskap (BSLII veiligheidskast) met filtertips. Alle oplossing die lentivirussen bevat en al het gebruikte plastic/glasafval moet worden geïnactiveerd met ethanol 70% of een andere virusinactivator.
  3. Transfectie van cellen (Dag 4)
    1. Controleer de samenvloeiing van de cellen om er zeker van te zijn dat ze 60% -65% samenvloeiing hebben bereikt.
    2. Bereid de transfectieoplossing met voor elke plaat: 20,8 μg van het plasmide van belang (p-gidsen, of p-Killer, of pCas9 #87904), 4,8 μg van het plasmide dat codeert voor de envelop (VSV-G, #8454), 20,8 μg van het plasmide psPAX2 (#12260) voor lentivirale verpakking, 136 μL calciumfosfaat en pas met H2O aan tot een eindvolume van 1.000 μL. Voeg deze oplossing druppelsgewijs en onder agitatie toe aan 1 ml 2x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS).
      OPMERKING: Bereid geen mengsel voor alle platen tegelijkertijd om een optimale bereiding van reagentia te garanderen; bereid een mix voor zes borden tegelijkertijd, bijvoorbeeld voor 18 borden, bereid drie keer een mix voor zes borden.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 10 minuten en voeg druppelsgewijs 2 ml oplossing toe aan de cellen. Homogeniseer het transfectieregens met zachte beweging van de plaat naar achteren, naar voren, naar boven en naar beneden, incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ten minste 5 uur.
      OPMERKING: Draag vanaf dit punt en tot het einde van de productie van lentivirus extra beschermingsmiddelen, waaronder een tweede paar handschoenen, beschermhoezen en een wegwerpplastron.
    4. Verwijder vijf uur na de transfectie het medium uit de platen en spoel af met PBS om transfectiereagentia te verwijderen. Voeg 12 ml vers medium toe en incubeer 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  4. Verzameling van de virale deeltjes (dag 6)
    1. Verzamel en pool het medium van alle platen. Centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, tot pelletcellulair vuil. Filter het supernatant met een filter van 0,45 μm (meerdere filters vereist).
    2. Centrifugeer bij 68.300 x g gedurende 2 uur bij 4 °C in een zwenkbakrotor. Verwijder het supernatant en laat de buisjes ondersteboven onder de veiligheidskast op een papier gedurende 5-10 minuten om zoveel mogelijk vloeistof te verwijderen en voeg vervolgens 100 μL HEK-proliferatiemedium per pellet toe. Resuspenseer de pellets na ten minste 2 uur bij 4 °C door op en neer te pipetteren. Pool alle geresuspendeerde pellets.
      OPMERKING: Pellets kunnen een nacht bij 4 °C in het medium worden achtergelaten voordat ze worden gealiquoteerd.
    3. Aliquot lentivirus in 10 μL of 25 μL steekproefgrootte (afhankelijk van het gebruik) en snap-freeze met vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C. Vries een ontdooid aliquot niet in.
  5. Herhaal stap 3.2 tot en met 3.4 met andere plasmiden van belang om LV-geleiders, LV-Killer en LV-Cas9 te produceren.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen de lentivirussen worden gekocht bij een bedrijf of een virusfaciliteit.

4. Lentivirus titratie

OPMERKING: De virustitratie wordt uitgevoerd op HEK293-cellen. De titratie is belangrijk om in de volgende stappen een nauwkeurig aantal lentivirussen per cel op te nemen (ongeacht de partij lentivirus), voor de cellen van belang. Het aantal virale deeltjes dat een cel efficiënt transduceert, wordt de multiplicity of infection (MOI) genoemd: MOI 10 komt dus overeen met de introductie van 10 virale deeltjes per cel. Aangezien de vries-/ontdooicyclus de levensvatbaarheid van het lentivirus beïnvloedt, wordt de titratie uitgevoerd met een bevroren lentivirus-aliquot en elk volgend experiment zal worden uitgevoerd met een nieuwe aliquot van dezelfde pool. Eén titratiemethode wordt hier beschreven, maar andere methoden kunnen worden gebruikt.

  1. Zaai op dag 1 x 105 cellen per plaat in vijf platen van 35 mm met glazen afdekplaten aan de onderkant en twee platen van 35 mm zonder afdekplaten.
  2. Verzamel en tel op dag 2 van de twee platen zonder coverslips het aantal cellen na trypsinisatie en bepaal de gemiddelde hoeveelheid cellen per plaat (N).
  3. Bereid 100 μL lentivirus verdund op 1/10 in proliferatiemedium. Transduceer de vijf gekweekte platen met verschillende volumes verdund virus, van 1 tot 50 μL verdund virus. Gebruik voor dit protocol de volgende volumes om de vijf platen te transduceren: 1 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C, in een CO2 van 5%.
  4. Op dag 4 fixeren de cellen door incubatie van de coverslips bij RT gedurende 20 tot 30 minuten in 4% paraformaldehyde. Voor de LV-Cas9, permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X100 in Fosfaatbuffer Zoutoplossing (PBS) gedurende 10 minuten bij RT, verzadig in PBS-0,1% Triton X100-2% Geitenserum- 0,5% Bovine Serum Albumine (BSA) gedurende 20 minuten bij RT, en label gedurende 45 minuten bij RT met primair antilichaam anti-V5 (verdunning 1/400) gevolgd door 30 minuten incubatie bij RT met fluorescerend secundair antilichaam. Label de kernen met Hoescht (10 μg/ml in PBS) gedurende 10 minuten op RT.
  5. Monteer de coverslips op een dia en observeer met behulp van een fluorescerende microscoop uitgerust met een 20x objectief. Voor LV-geleiders en LV-Killer gaat u na fixatie direct naar de kernetikettering en monteert u de coverslips. Tel voor elke coverslip het totale aantal kernen (totaal aantal cellen) in het gezichtsveld en het aantal cellen gelabeld (met V5 of mCherry) en bepaal de verhouding van cellen die voor elke coverslip zijn gelabeld.
  6. Selecteer een coverslip waarin de verhouding van getransduceerde cellen ten minste 10% en niet meer dan 50% bedraagt. Bepaal de transductie-efficiëntie (X) voor deze coverslip en noteer het volume verdund virus (V, in μL) dat wordt gebruikt om deze transductie-efficiëntie te verkrijgen.
    Equation 1
  7. Bepaal de titer (in infectieuze deeltjes, weergegeven als ip / ml) van het virus volgens de volgende formule:
    Equation 2
    De verdunningsfactor is de verdunning van het lentivirus uitgevoerd in stap 4.3. We verkregen routinematig een eindtiter van 1 x 109 ip/ml voor LV-Cas9 en 1 x 1010 ip/ml voor LV-gids, bepaald in HEK-cellen.

5. Myoblast transductie

OPMERKING: De vereeuwigde myoblasten worden achtereenvolgens getransduceerd met de drie eerder geproduceerde lentivirussen. Ze worden gehandhaafd op een dichtheid van minder dan 50% in een proliferatiemedium dat bestaat uit Ham's F10 aangevuld met 20% FBS, 2% penicilline / streptomycine, 2% Ultroser G en gekweekt bij 37 ° C, 5% CO2.

  1. Bepaal het volume lentivirus dat nodig is om het gekozen aantal cellen te behandelen met MOI 10 voor LV-Cas9 en LV-gidsen en MOI 20 voor LV-killer, volgens de volgende formule:
    Equation 3
    OPMERKING: In een parallel experiment is de transductie-efficiëntie vergeleken op myoblasten en HEK, met behulp van een controle lentivirus (lenti-GFP), en we hebben vastgesteld dat vijf keer meer lentivirussen nodig zijn om een myoblast efficiënt te transduceren in vergelijking met een HEK-cel. MOI 10 gemeten op HEK komt dus overeen met twee virale deeltjes per myoblast. De HIER gebruikte MOI worden berekend op HEK-cellen.
  2. Zaai op dag 1 96-well platen met 10.000 cellen in 100 μL proliferatiemedium per put. Transduceer op dag 2 de cellen onder de veiligheidskast door het juiste volume LV-geleiders en LV-Cas9 toe te voegen, berekend in stap 5.1. Breng de cellen terug naar de couveuse tot dag 7.
    OPMERKING: Het gebruik van MOI hoger dan 25, vooral voor LV-Cas9, kan het aantal bewerkte cellen niet verbeteren als gevolg van een hogere celdood bij een hoge concentratie lentivirus.
  3. Voer op dag 7 trypsinisatie uit en tel de cellen. Zaai de cellen op een samenvloeiing van 40% tot 50% in een nieuwe plaat en breng de cellen terug naar de incubator. Vijf uur later transduceren de cellen met LV-Killer bij een MOI van 20 (volume berekend in stap 5.1). Versterk de cellen gedurende 5 tot 10 dagen na transfectie, gedurende ten minste twee passages, en houd ze altijd op een lage samenvloeiing van <50%. De cellen zijn klaar voor de volgende stap, cellulair klonen, wanneer hun groei weer normaal is (geschat door de delingtijd).
    OPMERKING: De proliferatie kan na de transductie iets langzamer zijn. De normale celgroei kan vóór deze experimentele procedure worden bepaald door de delingtijd van de cellen te schatten.

6. Cellulair klonen

OPMERKING: Omdat myoblasttransductie moeilijk is en nooit 100% efficiëntie bereikt, zelfs bij gebruik van lentivirus, is cellulair klonen vereist om een volledig gecorrigeerde cellijn te krijgen. Dit is alleen mogelijk met vereeuwigde cellen, of cellen die gedurende enkele weken/maanden gekweekt en versterkt kunnen worden.

  1. Trypsinize en tel de cellen. Verdun de cellen in proliferatiemedium bij 10 cellen/ml en zaai de cellen op 1 cel/put in 96-putplaten met 100 μL/put medium.
    OPMERKING: Het aantal platen dat moet worden gezaaid, hangt af van de waarschijnlijkheid van de verwachte genbewerking, 2 tot 10 platen worden routinematig gebruikt.
  2. Controleer de cellen op groei en versterk geleidelijk elke put in een grotere plaat totdat ze ten minste een plaat van 35 mm bereiken, terwijl de samenvloeiing van de myoblasten onder de 50% blijft. Deze stap kan 2-6 weken duren, afhankelijk van de gebruikte cellen en hun vermogen om te groeien eenmaal geïsoleerd in een put.

7. Kloon selectie

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om te bepalen welke van de groeiende klonen op de juiste manier zijn gewijzigd.

  1. Ontwerp een set primers bestaande uit een primer vóór de eerste geleider (Primer_BeforeGuide1F) en een andere primer na de tweede geleider (Primer_AfterGuide2R) om het gebied dat de vermeende gewijzigde reeks omsluit te versterken. Zie tabel 1 voor de hier gebruikte primers.
  2. Verzamel cellen van elke kloon, bewaar ten minste 300.000 cellen voor toekomstige amplificatie en extraheer genomisch DNA met behulp van een standaardprotocol op de resterende cellen.
    1. Als er een groot aantal klonen groeit, voer dan een snelle test uit door cellen van vijf klonen in dezelfde buis te poolen om het DNA uit deze pool te halen en te testen met PCR. Herhaal dit met zoveel klonen als nodig is. Scheid vervolgens de pools die bewerkte cellen bevatten verder om individuele analyses uit te voeren.
  3. Bedien de bewerking door PCR als volgt. Bereid de PCR-reactie voor met 1 μL Primer_BeforeGuide1F, 1 μL Primer_AfterGuide2R, 12,5 μL polymerasemengsel, 3 μL genomisch DNA en 7,5 μL H2O. Amplify in een thermocycler volgens de instructies van de fabrikant en primersparameters. Voer uit op een 1% agarose gel om de bewerkte klonen te identificeren.
  4. Bedien de bewerking door de volgorde als volgt te rangschikken. Voer Sanger-sequencing van de geselecteerde klonen uit om de verwijdering te bevestigen en om te bepalen hoe de bewerking in elke kloon is uitgevoerd. Houd meer dan één bewerkte kloon om ervoor te zorgen dat alleen het beoogde gen is gewijzigd en verantwoordelijk is voor het waargenomen fysiologische effect en houd een niet-bewerkte kloon die in de volgende experimenten als controlekloon (CTRL) zal worden gebruikt.
  5. Vouw de geselecteerde klonen uit. Zodra de samenvloeiing van elke kloon ongeveer 50% heeft bereikt, trypsiniseert u de cellen en plaatst u de cellen in een groter schaal, totdat er voldoende cellen zijn geproduceerd om de biochemische en functionele karakteriseringen uit te voeren (meestal meer dan 1 x 106 per kloon) en bevroren aliquots van elke kloon op te slaan voor toekomstig gebruik.

8. Karakterisering van bewerkte klonen

OPMERKING: Zodra een paar klonen zijn geplukt en bevestigd door DNA-sequencing, kan de deletie van het beoogde gen worden bevestigd op eiwitniveau met behulp van Western blot en op functioneel niveau als een functionele cellulaire test beschikbaar is voor dit gen. In het geval van RYR1-KO, aangezien RyR1 een calciumkanaal is, is de functionele karakterisering uitgevoerd met behulp van calciumbeeldvorming op gekweekte cellen.

  1. Eiwitexpressie in bewerkte klonen
    OPMERKING: RyR1 wordt alleen uitgedrukt in gedifferentieerde myotubes10. De expressie ervan is geëvalueerd in myotubes met behulp van Western blot, om de deletie op eiwitniveau van RyR1 te bevestigen, evenals de deletie van het Cas9-eiwit.
    1. Plaat 200.000 cellen in proliferatiemedium (hierboven beschreven, stap 5) op een oppervlak van ongeveer 1,76 cm2 in een 35 mm plaat bedekt met laminine (oppervlak overeenkomend met een 200 μL druppel laminine bij 10 mg / ml in PBS met calcium). Zodra de cellen aan de plaat zijn geplakt na 2-3 uur geïncubeerd te zijn bij 37 °C, 5% CO2, verschuift u het kweekmedium naar een differentiatiemedium dat bestaat uit DMEM-lage glucose + 10% paardenserum + 1% penicilline / streptomycine en brengt u de cellen gedurende 6 dagen terug naar de incubator.
    2. Verzamel en lyseer na 6 dagen differentiatie de cellen met 200 μL RIPA aangevuld met proteaseremmers. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de Folin Lowry-methode11.
    3. Laad 15 μg eiwit, na denaturatie gedurende 30 minuten bij RT in Laemmli denaturatiebuffer, op een 5%-15% gradiënt acrylamidegel. Breng na elektroforetische scheiding de eiwitten over op Immobilon P bij 0,8 V gedurende 4 uur11.
    4. Na verzadiging van het membraan gedurende 30 minuten bij RT in PBS met 0,1% Tween 20 en 5% niet-vette droge melk, incubeer het membraan met de primaire antilichamen verdund in dezelfde buffer gedurende 2 uur bij RT of een nacht bij 4 °C, was het membraan 5x gedurende 5 minuten met PBS-0,1% Tween 20 en incubeer het membraan met de secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij RT. De primaire antilichamen die worden gebruikt zijn: antilichamen tegen V5-tag (verdunning: 1/5000) om Cas9 te detecteren, anti-GAPDH (verdunning: 1/1000) als belastingscontrole, anti-RyR1-antilichaam12,13 (verdunning: 1/10.000), antilichaam tegen de alfa 1-subeenheid van DHPR (verdunning: 1/1000) en antilichaam tegen de myosine zware keten MF20 (verdunning: 1/1000).
    5. Was het membraan 5x gedurende 5 minuten met PBS-0,1% Tween 20, droog het teveel aan vloeistof en voeg het chemiluminescente substraat toe. Ga verder zoals aanbevolen door de substraatleverancier om het chemiluminescentiesignaal te detecteren.
  2. Functionele karakterisering van bewerkte klonen
    OPMERKING: De functie van RyR1 werd beoordeeld met behulp van calciumbeeldvorming in gedifferentieerde myotubes, geproduceerd uit CTRL- of KO-klonen14.
    1. Plaat 50.000 cellen op een 0,2 cm2 oppervlak in het midden van 35 mm schotels bedekt met laminine (oppervlak bedekt met een lamininedruppel van 50 μL, bij 10 mg / ml in PBS met calcium) en induceer differentiatie gedurende 6 dagen zoals beschreven in stap 8.1.1. Bereid drie platen voor elke stimulatie voor, om een biologisch drievoud te hebben.
    2. Laad de myotubes met 50 μL fluo 4-direct, 1:1 verdund in differentiatiemedium en gedurende 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. Spoel de cellen tweemaal met KREBS-buffer aangevuld met glucose van 1 mg/ml.
    3. Meet de fluorescentievariaties met een omgekeerde fluorescerende microscoop of een confocale microscoop met behulp van een 10x objectief. Installeer de plaat op het podium van de microscoop en start de acquisitie met 1 frame per seconde gedurende 90 s.
    4. Verwijder de resterende KREBS en stimuleer de cellen in frame 25 door toevoeging van 2 ml KCl voor membraandepolarisatie (140 mM eindconcentratie) of 2 ml 4 CmC (500 μM eindconcentratie) voor RyR1 directe stimulatie. Zorg ervoor dat er ten minste 10 myotubes aanwezig zijn in het geregistreerde veld.
    5. Kwantificeer de fluorescentievariatie in elke myotube met behulp van speciale software. Selecteer voor analyse ten minste 10 myotubes per gerecht (idealiter 20-30 myotubes per gerecht), teken een lijn (of een Regio van Belang (ROI)) op de lange as van elke myotube en verzamel de fluorescentie F langs deze lijn voor alle frames.
    6. Bepaal de initiële fluorescerende waarde, F0, die overeenkomt met de frames 1 tot en met 24. Plot de fluorescerende variatie (F-F0)/F0 als functie van de tijd van 0 tot 90 s. Herhaal het experiment drie keer om de fluorescentievariatie te verkrijgen van ten minste 90 myotubes uit drie verschillende culturen. Verzamel alle resultaten voor de 90 myotubes en bereken de gemiddelde ± SEM van (F-F0)/F0 op elk tijdsbestek. Kwantificeer de piekamplitude van calciumafgifte voor elke stimulatie en elke kloon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol werd toegepast op vereeuwigde myoblasten van een gezonde proefpersoon15 (zogenaamde HM-cellen, voor menselijke myoblasten), waarin de RyR1 eerder is gekarakteriseerd16, om het RYR1-gen dat codeert voor het RyR1-eiwit uit te schakelen. Het ontwerp van het geleidings-RNA werd gemaakt om de sequentie te verwijderen die een deel van exon 101 en intron 101 van het gen omvat. Het schrappen van een deel van exon 101 zal naar verwachting leiden tot verstoring van het leeskader. Bovendien codeert exon 101 voor de porie van het eiwit en is dus nodig om een functioneel calciumkanaal te produceren. Veel patiënten met een ernstige RyR1-gerelateerde myopathie hebben een mutatie in dit gebied van het gen7. De beste gidsen voorspeld met Crispor-software werden geselecteerd om zo min mogelijk off-targets te hebben, met behoud van de beste efficiëntie. We hebben ervoor gekozen om twee gidsen tegelijkertijd in dezelfde virale vector te gebruiken, om ervoor te zorgen dat een groot deel van de cellen knock-out wordt en om de detectie van de deletie in bewerkte klonen met PCR te vergemakkelijken. De twee geselecteerde gidsen (zie tabel 2 en figuur 1) zijn respectievelijk gelokaliseerd aan het einde van exon 101 en aan het begin van intron 101, wat resulteert in een deletie van 326 bp en een daaropvolgende frameshift. Dit zorgt ervoor dat de bewerkte cellen RYR1-KO zijn.

Het gRNA gericht op de SpCas9 was het gRNA dat al was ontworpen door Merienne en collega's6 en aanwezig was in het plasmide #87919 onder de zwakke promotor 7SK. Omdat de efficiëntie om de SpCas9-sequentie te targeten al is aangetoond in hun studie6, is het gebruikt om het plasmide te maken p_Killer, maar onder de controle van de sterke promotor H1. De tweede gids in de p_Killer plasmide is ontworpen om de mCherry-sequentie onder de promotor U6 te richten. Dit zal de verwijdering van mCherry mogelijk maken, wat storend kan zijn in sommige latere experimenten met de nieuw gecreëerde cellijn.

Plasmiden p_guides en p_killer werden gemaakt en alle benodigde lentivirussen werden geproduceerd in de speciale BSL2-kweekruimte. Na myoblasttransductie werden de cellen gedurende 2 weken gekweekt tot groeiherstel en geanalyseerd met behulp van PCR om de aanwezigheid van bewerkte cellen te bevestigen. Voor cellulair klonen werden twee 96-well platen gezaaid met behandelde cellen met 1 cel per put. Celgroei werd waargenomen in 32% van de gekweekte putten. Genomisch DNA werd vervolgens uit de klonen geëxtraheerd en PCR-analyse werd uitgevoerd totdat twee gecorrigeerde klonen werden geïdentificeerd (zogenaamde Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2), zie figuur 3. De verwijdering van het beoogde deel van RYR1 werd bevestigd door Sanger sequencing. Er zijn extra controlecellen gebruikt, zoals de initiële HM-cellen, of HM-cellen die met dezelfde procedure zijn behandeld, maar niet zijn bewerkt zoals bevestigd door PCR en sequencing (Cl-CTRL). Geselecteerde klonen werden vervolgens versterkt en verder gekarakteriseerd op eiwitniveau en functioneel niveau.

Om de volledige extinctie van RyR1 en Cas9 op eiwitniveau te valideren, werd Western blot-analyse uitgevoerd. De resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Het Cas9-eiwit, afwezig in de HM-cellen, werd 5 dagen na de transductie van de cellen met LV-Cas9 (HM + LV-Cas9) gedetecteerd en zoals verwacht werd de expressie ervan afgeschaft in de Cl-CTRL en in de bewerkte Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2, hoewel een kleine hoeveelheid Cas9 nog steeds werd gedetecteerd in Cl-KOR-2 (figuur 3A). Aangezien het gRNA dat zich richt op Cas9 nog steeds wordt uitgedrukt, zal de hoeveelheid resterende Cas9 naar verwachting geleidelijk verdwijnen. De expressie van andere belangrijke eiwitten werd ook beoordeeld met behulp van Western blot: RyR1, om de volledige deletie van het eiwit te bevestigen, de alfa1-subeenheid van DHPR, de functionele partner van RyR1 die betrokken is bij excitatie-contractiekoppeling, en de myosine-zware keten als een marker van differentiatie, omdat RyR1 en DHPR alleen tot expressie komen in gedifferentieerde myotubes (figuur 3B ). DHPR en MYHC mogen niet worden aangepast. Hoewel de Western blot de volledige verwijdering van RyR1 in de twee RyR1-KO-klonen (Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2) bevestigde, kunnen aanvullende wijzigingen - als gevolg van Cas9 of van de kloonprocedure - zijn opgetreden in de Cl-KOR-2, die bovendien een afwezigheid van DHPR en een vermindering van myosine zware keten (MHC) vertoonde. Aangezien beide eiwitten alleen tot expressie komen in gedifferentieerde myotubes, weerspiegelt hun afwezigheid hoogstwaarschijnlijk een verandering in differentiatie, die mogelijk zou kunnen voortvloeien uit de lange eencellige kloonprocedure geassocieerd met een lokale overgroei van de cellen die leidt tot het verlies in hun myogene potentieel. Zo is alleen Cl-KOR-1 verder gekarakteriseerd op functioneel niveau. Dit toont aan dat selectie van talrijke bewerkte klonen belangrijk is om met de beste te kunnen werken.

De functionele karakterisering werd uitgevoerd met behulp van calciumbeeldvorming. De gemiddelde fluorescentievariatie als functie van de tijd wordt weergegeven op figuur 5, op ten minste 180 myotubes van elk genotype, met behulp van een directe RyR1-stimulatie door 4-CMC of stimulatie van het calciumafgiftecomplex (DHPR geassocieerd met RyR1) door KCl-membraandepolarisatie.

Deze experimenten toonden aan dat de niet-gemodificeerde Cl-CTRL een gedrag vertoonde dat vergelijkbaar was met de initiële celpopulatie (HM-cellen) en reageerde op directe RyR1-stimulatie door zijn activator 4-CmC en door stimulatie van het calciumafgiftecomplex door membraandepolarisatie. Daarentegen was de bewerkte Cl-KOR-1 niet in staat om te reageren op beide stimulatie (4-CmC en KCl depolarisatie), zoals verwacht voor een RyR1-KO.

Al met al bevestigden de Western blot en de functionele karakterisering dat de Cl-KOR-1 cellijn een RyR1-KO spiercellijn is. Dit protocol kan worden toegepast op elk ander gen dat tot expressie komt in de skeletspieren of een ander celtype (zoals geïnduceerde pluripotente stamcellen - iPSC). Het volledige protocol is geïllustreerd in figuur 6.

Figure 1
Figuur 1: Lokalisatie en ontwerp van het geleidings-RNA. (A) Schematische lokalisatie van de geleiders die zijn ontworpen voor het maken van de RYR1-KO cellijn. Gids 1 richt zich op het einde van exon 101 in het RYR1-gen , Gids 2 richt zich op de intron 101, waardoor een deletie van 326 bp en een frameshift ontstaat. Guide Killer richt zich op het initiatiecodon in de volgorde van de SpCas9, Guide mCherry richt zich op het einde van de mCherry-reeks. (B) Lokalisatie van de gidsen in de genomische sequenties voor de eerder beschreven Guide 1, Guide 2, Guide killer en Guide mCherry. De volgorde van elke gids (20 bp lang) wordt in kleur weergegeven en de PAM voor elke gids is vetgedrukt en onderstreept. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Kloonprocedure voor de productie van de cassette. Schematische presentatie van de verschillende PCR uitgevoerd om de cassettes met de geleiders te produceren, in te brengen in het lentivirus backbone plasmide. PCR A, PCR B, PCR C en PCR D worden gerealiseerd met programma 1 rechtsboven afgebeeld, en PCR definitief met het PCR-programma 2, rechtsonder geïllustreerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Selectie van de klonen met behulp van PCR. (A) Schematische presentatie van de PCR-versterking van een 1.200 bp-gebied dat de geleiders omvat, met voorwaartse en omgekeerde primers weergegeven door de grijze pijlen. Dna-splitsing aan beide gidsen zal naar verwachting resulteren in een vermindering van 326 bp in de grootte van het PCR-fragment, zoals weergegeven door de gestippelde groene verticale lijnen onder de schaar. (B) PCR-producten geproduceerd uit HM-cellen, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2 werden geladen op een 1% agarose-gel. Het DNA van HM en Cl-CTRL lijkt niet-gemodificeerd (volledige lengte), terwijl het DNA van Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2 korter is dan de controle, zoals verwacht (gesplitst). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Karakterisering van de cellen op eiwitniveau. (A) Western blot analyse voor de aanwezigheid van Cas 9 eiwit met behulp van de V5-tag in HM cellen, HM cellen getransduceerd met LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2. Cas9 wordt duidelijk gedetecteerd in de HM-cellen die met LV-Cas9 zijn overgeschakeld, terwijl de expressie ervan volledig is afgeschaft (in Cl-CTRL en Cl-KOR-1) of bijna volledig (in Cl-KOR-2) door LV-Killer. (B) Expressie van RyR1, Myosine heavy chain (MYHC), alpha1 subunit van DHPR en GAPDH als een belastingscontrole in Cl-CTRL, Cl-KOR-1 en Cl-KOR-2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Functionele karakterisering van de cellen. Fluo-4 calcium beeldvorming uitgevoerd op myotubes geproduceerd uit HM cellen, Cl-CTRL en Cl-KOR-1. De curven vertegenwoordigen de fluorescentievariatie in HM-myotubes (zwarte curven), Cl-CTRL-myotubes (grijze curven) of Cl-KOR-1 (groene curven). Alle waarden worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van n myotubes. In elke toestand zijn n = 180 tot 256 myotubes geanalyseerd, uit ten minste drie verschillende experimenten (exact aantal aangegeven voor elke curve). 4 CmC (500 μM) werd gebruikt om RyR1 direct te stimuleren in aanwezigheid van 2 mM extern calcium. KCl-depolarisatie (140 mM) werd geïnduceerd in aanwezigheid van 2 mM extern calcium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Schematische presentatie van het gehele protocol. De verschillende stappen van het protocol worden gepresenteerd, van het in silico ontwerp tot het in vitro moleculair klonen en de uiteindelijke celselectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam Reeks 5'-3' Doel/Gebruik
Primer_Guide1F Gids1 + gttttagagctagaaatagc Plasmide klonen
Primer_Guide1R Gids 1-RC + AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Gids 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Gids 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI F TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Plasmiden klonen en kolonies controle
Primer_BlpI R CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc Klonen plasmide p_Killer
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc Klonen plasmide p_guides_RyR1
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT Kloonselectie voor RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Tabel 1: Lijst van primers. Primers die worden gebruikt voor plasmideklonen en koloniecontrole, evenals die voor de kloonselectie.

Naam Gidsvolgorde Pam Reverse Complement zonder PAM
Gids 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCG GGG CGCGGGTGACGAATACGAGC
Gids 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT CGG AGCGCCTATGAACTGACTTA
Gids Killer Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT GGG AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Gids mCherry killer GAACAGTACGAACGCGCCGA GGG TCGGCGCGTTCGTACTGTTCTC

Tabel 2: Gidsen die worden gebruikt om de plasmide-p_guides en de p_Killer te maken. De sequenties die worden gebruikt voor de ontwikkeling van de RyR1-KO-klonen worden in deze tabel weergegeven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een belangrijke stap op weg naar de karakterisering van genen met een onbekende functie die betrokken zijn bij pathologieën is de ontwikkeling van relevante cellulaire modellen om de functie van deze genen te bestuderen. Het gebruik van genbewerking met CRISPR/Cas9 is een exponentieel groeiend onderzoeksgebied en de ontwikkeling van knock-outmodellen zoals hier gepresenteerd is een van de meest gebruikte toepassingen. In deze context stellen we hier een veelzijdig protocol voor om een menselijke cellijn knock-out te ontwikkelen in elk gen van belang, waardoor de karakterisering van dit gen in een relevant menselijk celmodel mogelijk wordt. Het hier gepresenteerde protocol kan zowel in onsterfelijke myoblasten als in iPSC worden gebruikt en zou dus vrijwel kunnen resulteren in de productie van elk menselijk celmodel KO in het gen van belang.

De beperking is dat dit protocol moet worden toegepast op vereeuwigde cellen, omdat vele weken van kweken en een cellulair klonen vereist zijn, samen met tal van opeenvolgende versterkingen. Als alternatief moeten cellen worden gebruikt die kunnen worden versterkt en gedurende enkele weken of maanden kunnen worden onderhouden. Met behulp van deze procedure is de menselijke vereeuwigde spiercellijn KO voor het gen van belang (hier het RYR1-gen ) geproduceerd in ongeveer 3-4 maanden (exclusief de functionele karakterisering van de cellen).

Deze strategie is geschikt voor moeilijk te transfecteren cellen, zoals spiercellen, omdat het afhankelijk is van het gebruik van lentivirus om alle hulpmiddelen in de doelcellen te introduceren, en het is dus krachtiger dan andere methoden zoals transfectie of elektroporatie. Het belangrijkste nadeel is integratie in het gastheergenoom, en een mogelijk alternatief om schadelijke integratie van lentivirus in het gastheergenoom te voorkomen, is het gebruik van niet-integratief lentivirus17, maar de efficiëntie van deze niet-integratieve lentivirale deeltjes moet ten minste gelijkwaardig zijn aan het reguliere lentivirus.

De integratiesite zou waarschijnlijk het expressieniveau van Cas9 kunnen beïnvloeden, maar dit is hoogstwaarschijnlijk niet verantwoordelijk voor de kleine hoeveelheid Cas9 in Cl-KOR 2. De kleine hoeveelheid Cas9 is hoogstwaarschijnlijk gerelateerd aan de transductie van deze specifieke kloon met de LV-Killer, die lager had kunnen zijn dan in de andere kloon, of als alternatief had het aantal LV-Cas9 hoger kunnen zijn.

Het wordt niet aanbevolen om Cas9 alleen zonder gRNA gedurende een lange tijd tot expressie te brengen (zoals voor de ontwikkeling van een Cas9-kloon), omdat dit is beschreven om de off-targets te verhogen, en het kan ook de mortaliteit van de cellen verhogen.

We hebben ervoor gekozen om de SpCas9 als nuclease te gebruiken, omdat het veel wordt gebruikt, het heeft een korte PAM en biedt daarom verschillende opties voor de keuze van gids-RNA's. Bovendien is de grootte ervan compatibel met de productie van lentivirale vectoren. Andere nucleasen kunnen worden gebruikt als een specifieke PAM moet worden gericht (zoals SaCas9 of Cpf1)18.

De verschillende lentivirussen kunnen worden geproduceerd in een reguliere BSL2-kweekruimte19 of worden gekocht bij een virusproductiefaciliteit of een bedrijf. De vereiste om dit protocol te implementeren is expertise in moleculaire biologie en moleculair klonen, en in het kweken van het gekozen celmodel.

De lentivirussen die coderen voor de verschillende gidsen coderen ook voor het fluorescerende eiwit mCherry. Dit fluorescerende eiwit kan nuttig zijn, waardoor geautomatiseerde sortering van de cellen en klonen door FACS mogelijk is in plaats van single cell cloning, en in dit geval mag de expressie van mCherry niet worden onderdrukt met de LV-killer. Als mCherry moet worden gehandhaafd, moet de tweede gids tegen mCherry niet worden gekloond in de p-killer (stap 2.7). Voor het RYR1-gen , omdat de functionele karakterisering gebruik maakt van fluorescerende sondes en het toekomstige gebruik van deze cellijn ook immunolabeling met fluorescerende antilichamen zou kunnen vereisen, hebben we ervoor gekozen om mCherry-expressie te onderdrukken. In de LV-killer is het gRNA gericht op Cas9 onder een sterke promotor H1 geplaatst in plaats van de zwakke promotor 7SK die aanvankelijk aanwezig was in het oorspronkelijke plasmide, om een vergelijkbare efficiëntie van het nuclease op alle geselecteerde gRNA's te garanderen en om de Cas9-splitsing te vergroten zodra de LV-killer aan de cellen is toegevoegd.

De langste en meest inspannende stap is het klonen van één cel. In onze procedure vertoonden de spiercellen een verminderde groei na lentivirale transductie met Cas9 en herstelden na een paar weken. Als het klonen van één cel te vroeg na de virale transducties wordt uitgevoerd, waarschijnlijk vanwege massale celdood, zullen slechts een paar putten van een 96-well-plaat groeiende cellen bevatten. Het is dus beter om de cellen te versterken voordat ze worden gekloond en te wachten op ten minste 2-3-splitsing. Het is ook mogelijk om de cellen op 10 cellen /put te klonen als ze niet goed groeien als afzonderlijke cellen. Bovendien moeten de myoblasten altijd worden gekweekt bij een samenvloeiing onder de 50% om een goed differentiatievermogen te behouden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) en van Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
  2. Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
  3. Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
  4. Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
  5. Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
  6. Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
  7. Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
  8. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  9. Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
  10. Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
  11. Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry--Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
  12. Garibaldi, M., et al. Dusty core disease' (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
  13. Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
  14. Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
  15. Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
  16. Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
  17. Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
  18. Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
  19. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , Chapter 4, Unit 4.21 (2006).

Tags

Genetica Nummer 184
Ontwikkeling van knock-out spiercellijnen met behulp van Lentivirus-gemedieerde CRISPR / Cas9-genbewerking
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter