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Genetics

Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64114
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1University Grenoble Alpes, INSERM, U1216, CHU Grenoble Alpes, Grenoble Institut Neurosciences, 2Genome Center, University of California, Davis

Summary

Le protocole décrit comment générer des myoblastes knock-out à l’aide de CRISPR/Cas9, de la conception des ARN guides au clonage cellulaire et à la caractérisation des clones knock-out.

Abstract

Une application importante des courtes répétitions palindromiques régulatrices groupées (CRISPR) / Cas 9 est le développement de lignées cellulaires knock-out, en particulier pour étudier la fonction de nouveaux gènes / protéines associés à une maladie, identifiés lors du diagnostic génétique. Pour le développement de telles lignées cellulaires, deux questions majeures doivent être démêlées : l’insertion des outils CRISPR (le Cas9 et l’ARN guide) avec une grande efficacité dans les cellules choisies, et la restriction de l’activité Cas9 à la délétion spécifique du gène choisi. Le protocole décrit ici est dédié à l’insertion des outils CRISPR dans des cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires. Ce protocole est basé sur l’utilisation de lentivirus, produits avec des plasmides accessibles au public, pour lesquels toutes les étapes de clonage sont décrites pour cibler un gène d’intérêt. Le contrôle de l’activité de Cas9 a été réalisé à l’aide d’une adaptation d’un système précédemment décrit appelé KamiCas9, dans lequel la transduction des cellules avec un lentivirus codant pour un ARN guide ciblant le Cas9 permet l’abolition progressive de l’expression de Cas9. Ce protocole a été appliqué au développement d’une lignée cellulaire musculaire humaine RYR1-knock-out, qui a été caractérisée au niveau protéique et fonctionnel, pour confirmer l’élimination de cet important canal calcique impliqué dans la libération de calcium intracellulaire musculaire et dans le couplage excitation-contraction. La procédure décrite ici peut facilement être appliquée à d’autres gènes dans les cellules musculaires ou dans d’autres cellules difficiles à transfecter et produire des outils précieux pour étudier ces gènes dans les cellules humaines.

Introduction

Avec les progrès du séquençage des gènes et l’identification de mutations dans les gènes de fonctions inconnues dans un tissu spécifique, le développement de modèles cellulaires pertinents pour comprendre la fonction d’un nouveau gène cible et confirmer son implication dans les mécanismes physiopathologiques connexes constitue un outil essentiel. En outre, ces modèles sont d’une importance majeure pour les développements thérapeutiques futurs 1,2 et constituent une alternative intéressante au développement de modèles animaux knock-out en ligne droite avec les recommandations internationales pour la réduction de l’utilisation d’animaux dans l’expérimentation. L’édition de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’un des outils les plus puissants actuellement disponibles, ce qui a permis le développement de nombreux modèles knock-out/knock-in, et la validation ciblée de gènes à l’aide de CRISPR/Cas9 est l’une des applications les plus utilisées de CRISPR/Cas93. Le succès de l’édition de gènes repose sur la capacité d’introduire les outils CRISPR (les ARN guides et la nucléase Cas9) dans le modèle cellulaire cible, ce qui peut être un défi dans de nombreuses cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires4. Ce défi peut être surmonté avec l’utilisation de virus, généralement le lentivirus, qui a le grand avantage de transduire efficacement de nombreux types de cellules et de délivrer son transgène. Mais son inconvénient majeur est l’intégration du transgène dans le génome de la cellule hôte, conduisant à une altération potentielle des gènes localisés sur le site d’intégration et à l’expression permanente du transgène, ce qui, dans le cas de la nucléase Cas9, entraînerait des conséquences dommageables5. Une solution intelligente a été proposée par Merienne et ses collègues6, qui consiste à introduire dans les cellules un ARN-guide ciblant le gène Cas9 lui-même, conduisant à l’inactivation de Cas9. Une adaptation de cette stratégie est présentée ici comme un protocole convivial et polyvalent permettant d’éliminer pratiquement n’importe quel gène dans les cellules difficiles à transfecter.

Le but du protocole présenté ici est d’induire l’inactivation d’un gène d’intérêt dans les cellules musculaires immortalisées. Il peut être utilisé pour éliminer n’importe quel gène d’intérêt, dans différents types de cellules immortalisées. Le protocole décrit ici contient des étapes pour concevoir les ARN guides et leur clonage en plasmides lentiviraux, pour produire les outils CRISPR dans des vecteurs lentiviraux, pour transduire les cellules avec les différents lentivirus et pour cloner les cellules pour produire une lignée cellulaire modifiée homogène.

En utilisant ce protocole, des cellules musculaires squelettiques humaines immortalisées ont été développées avec délétion du récepteur de la ryanodine de type 1 (RyR1), un canal calcique essentiel impliqué dans la libération intracellulaire du calcium et la contraction musculaire7. L’élimination (KO) du gène a été confirmée au niveau de la protéine à l’aide du transfert Western et au niveau fonctionnel à l’aide de l’imagerie calcique.

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Protocol

Les biopsies musculaires ont été obtenues auprès de la Banque des tissus pour la recherche (Myobank, partenaire du réseau européen EuroBioBank, Paris, France) conformément aux recommandations européennes et à la législation Français. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de toutes les personnes. Les myoblastes immortalisés ont été aimablement produits par le Dr V. Mouly (Institut de myologie, Paris, France), et les protocoles ont été approuvés par le comité d’éthique de l’Institut de myologie (MESRI, n AC-2019-3502).

1. Conception du guide CRISPR

  1. Identifier la région du gène à supprimer. Recherchez sa séquence génomique à l’aide d’outils de navigateur de génome tels que ensembl.org ou genome.ucsc.edu et déterminez les coordonnées chromosomiques des deux régions pour rechercher l’ARN guide (ARNg), des deux côtés de la région à supprimer.
    1. Pour le gène utilisé ici, obtenez la séquence FASTA du gène RYR1 et la séquence de l’exon 101 comme suit. Dans ensembl, recherchez RYR1 dans la version la plus récente du génome humain, sélectionnez la première entrée et cliquez sur la transcription de la séquence codante de la protéine. Ensuite, cliquez sur Exons pour rediriger vers la liste des exons du gène.
    2. Cliquez sur Télécharger la séquence et sélectionnez Uniquement la séquence génomique pour télécharger la séquence de consensus complète de l’ensemble du gène. Faites défiler la liste des exons et des introns du gène et sélectionnez le ou les cibles.
    3. Trouvez la séquence nucléotidique correspondante dans le gène. Sélectionnez les séquences nucléotidiques des introns immédiatement en amont et en aval de l’exon à supprimer, qui seront utilisées pour rechercher les ARNg.
  2. Concevez les deux ARNg, appelés guide 1 et guide 2 ici, dans les régions identifiées à l’étape 1.1 (introns en amont et en aval de la région à supprimer) à l’aide d’outils en ligne tels que Crispor.tefor.net8. Choisissez les deux ARNg séparés par quelques centaines de paires de bases (pb), la séquence de chaque ARNg étant exactement de 20 nucléotides de long sans le motif adjacent du protospaceur (PAM). Choisissez les meilleurs guides disponibles afin de limiter les hors-cibles. Voir la figure 1 pour un exemple de conception de guide.
    1. La séquence entre les deux guides devrait être supprimée, et pour entraîner l’élimination du gène d’intérêt, donc choisir la position des deux guides de telle sorte qu’elle supprime une séquence essentielle ou un exon essentiel dans le gène d’intérêt. Assurez-vous que la séquence/exon supprimé n’est pas présent exclusivement dans une transcription alternative du gène et/ou qu’il code pour une partie importante de la protéine, de sorte que sa délétion entraînera un knock-out fonctionnel.
      REMARQUE: Bien que le site de clivage Cas9 soit prévu à 3 bp en amont du motif adjacent de protospacer (PAM), un clivage à une plus grande distance peut également se produire, donc une bonne solution ne doit pas dépendre de la localisation précise du site de clivage, comme le clivage en intron.
  3. Déterminez la séquence du complément inverse (RC) pour chaque ARNg, sans le PAM, afin d’avoir les séquences suivantes : Guide 1 et Guide 1-RC, Guide 2 et Guide 2-RC.
  4. Ordonner aux amorces présentées dans le tableau 1 d’effectuer le clonage des plasmides. Tout au long du protocole, utiliser des amorces à une concentration de 10 nM dans H2O stérile.
    REMARQUE: Les séquences ajoutées aux ARNg dans ces amorces (en gras et soulignées) correspondent à la séquence du plasmide avant et après l’ARN guide, promoteur et trans-activateur-Crispr (tracrRNA), respectivement et ne doivent pas être modifiées afin d’assurer un bon chevauchement entre les amorces et le plasmide.

2. Clonage de plasmides

REMARQUE: Dans cette étape, les ARNg seront insérés dans l’épine dorsale plasmidique pour la production de lentivirus. Une cassette codant les deux ARNg est d’abord produite par des réactions en chaîne successives par polymérase (PCR), en utilisant les amorces qui se chevauchent. La nouvelle cassette est ensuite insérée dans le plasmide dorsal lentiviral #87919.

  1. Obtenez les plasmides suivants : plasmide #87919, codant pour les ARN guides CRISPR dans un vecteur lentiviral et plasmide #87904 codant pour la séquence SpCas9 dans un vecteur lentiviral.
  2. Construction de cassettes
    Remarque : Le protocole de clonage est résumé dans Graphique 2.
    1. Exécuter une réaction pcR (A), avec 2 μL de plasmide #87919, 2 μL de primer_XmaIF, 2 μL de primer_Guide1R, 25 μL de mélange de polymérase et 19 μL deH2O. Exécutez le programme de PCR suivant (programme 1) : dénaturation initiale 5 min à 98 °C, suivie de 30 cycles de : 30 s à 98 °C, 30 s à 60 °C, 1 min 45 s à 72 °C et un allongement final de 7 min à 72 °C. La Tm des amorces décrites à l’étape 1.4 est de 60 °C.
      REMARQUE: Bien que le temps d’allongement dans le programme 1 semble assez long, ce temps d’allongement a été choisi pour assurer la production d’un matériau suffisant de la bonne taille. En effet, en raison des séquences répétées dans le plasmide (la séquence de tracrRNA après guides d’ARN est répétée trois fois dans le plasmide #87919) l’amplification PCR de l’ADN attendu est difficile, et des bandes supplémentaires plus petites sont produites dans les PCR successives. Ainsi, en raison de la concurrence entre les différents produits de PCR, soit le temps d’allongement a été augmenté (pour favoriser le plus long et avoir suffisamment de matière purifiée à la fin), soit une PCR tactile (programme 2) a été utilisée pour le long fragment (tel que décrit pour la PCR (finale) à l’étape 2.2.6).
    2. Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon Tris-Borate-EDTA (TBE), exciser et purifier le fragment de 300 pb. Effectuer la purification à l’aide d’un kit dédié suivant les instructions du fabricant, avec élution dans un volume final de 20 μL. Utilisez directement le fragment purifié ou conservez-le à -20 °C pour l’étape 2.2.5.
    3. Exécutez une réaction de PCR (B), avec 2 μL de plasmide #87919, 2 μL de primer_Guide1F, 2 μL de primer_Guide2R, 25 μL de mélange de polymérase et 19 μL deH2O à l’aide du programme de PCR 1. Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans l’encéphalopathie, exciser et purifier le fragment de 400 bp dans 20 μL de tampon d’élution. Utilisez directement le fragment purifié ou conservez-le à -20 °C pour l’étape 2.2.5.
    4. Exécutez une réaction de PCR (C), avec 2 μL de plasmide #87919, 2 μL de primer_Guide2F, 2 μL de primer_BlpIR, 25 μL de mélange de polymérase et 19 μL deH2O à l’aide du programme de PCR 1. Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TBE. Exciser et purifier le fragment de 600 bp dans 20 μL de tampon d’élution. Utilisez le fragment purifié directement ou conservez-le à -20 °C pour l’étape 2.2.6.
      REMARQUE: Un autre fragment à 900 bp peut être visible, en raison de l’hybridation de l’amorce sur les régions répétées du plasmide, comme décrit dans la NOTE de l’étape 2.2.1. Le cas échéant, cette bande doit être jetée.
    5. Exécutez une réaction PCR (D), avec 2 μL de PCR d’élution A (à partir de l’étape 2.2.2), 2 μL de PCR d’élution B (à partir de l’étape 2.2.3), 2 μL de primer_XmaIF, 2 μL de primer_Guide2R, 25 μL de mélange de polymérase et 19 μL de H2O, avec le programme de PCR 1. Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TBE; exciser et purifier le fragment de 700 bp dans 20 μL de tampon d’élution. Utilisez le fragment purifié directement ou conservez-le à -20 °C pour l’étape 2.2.6.
      REMARQUE: D’autres bandes peuvent être visibles à >1 000 pb, 400 pb et 300 pb, en raison de l’hybridation des amorces sur les régions répétées et doivent être jetées.
    6. Exécuter une réaction PCR (finale), avec 4 μL de PCR d’élution C (à partir de l’étape 2.2.4), 4 μL de PCR D d’élution (à partir de l’étape 2.2.5), 4 μL de primer_XmaIF, 4 μL de primer_BlpIR, 50 μL de mélange de polymérase et 34 μL deH2O. Le programme utilisé est le suivant (programme PCR 2) : dénaturation initiale pendant 5 min à 98 °C ; six cycles de: 30 s à 98 °C, 30 s à 66 °C (réduction de la température d’hybridation de 1 °C par cycle), 1 min 45 à 72 °C; 35 cycles de: 30 s à 98 °C, 30 s à 60 °C, 1 min 45 à 72 °C et un allongement final de 5 min à 72 °C.
      REMARQUE: Le programme de PCR pour cette amplification finale est une PCR tactile, différente de la précédente, en raison de la grande taille de l’amplification finale qui contient deux séquences répétées d’ARNrtrac juste après chaque guide.
    7. Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TBE; exciser et purifier la cassette finale, qui migre à environ 1 300 bp dans 20 μL de tampon d’élution. Quantifier le produit élué. Utilisez le fragment purifié directement ou conservez-le à -20 °C pour l’étape 2.3.2.1. C’est le produit final qui sera inséré dans le plasmide lentiviral.
      REMARQUE: D’autres fragments peuvent être visibles à >1000 pb, 400 pb et 300 pb, ce qui correspond à des fragments de PCR incomplets qui doivent être jetés.
  3. Insertion de la cassette d’ARNg dans l’épine dorsale plasmidique lentivirale.
    1. Linéariser le plasmide par double digestion du plasmide #87919 avec les enzymes de restriction XmaI et BlpI.
      1. Préparer la réaction avec 15 μL de tampon recommandé, 15 μL de plasmide (1μg/μL), 7,5 μL d’enzyme BlpI (à 10 U/μL), 7,5 μL d’enzyme XmaI (à 10 U/μL) et 112,5 μL deH2O. Incuber pendant 1 h à 37 °C, puis pendant 20 min à 65 °C. Chargez la quantité totale sur un gel d’agarose à 1%, découpez et purifiez le plasmide d’environ 10 kb avec un kit approprié. L’élution est réalisée dans 20 μL de tampon et le produit élué est quantifié à l’aide d’une mesure de densité optique.
        REMARQUE: Utilisez un protocole de purification approprié pour les gros fragments d’ADN, tel que le protocole décrit par Sun et coll9.
    2. Ligaturez la cassette d’ARNg et le plasmide. Préparer le mélange réactionnel avec la cassette d’ARNg de l’étape 2.2.7 et le plasmide linéarisé de l’étape 2.3.1.1, ajouter 2 μL d’enzyme etH2O pour obtenir un volume final de 10 μL. Incuber pendant 15 min à 50 °C pour produire le plasmide final appelé p_guides.
      REMARQUE: La quantité de cassette d’ADN doit être comprise entre 50-100 ng et la quantité de plasmide entre 100-200 ng, avec un rapport molaire de 2: 1.
  4. Utilisez 2 μL du plasmide fraîchement préparé pour transformer E. Coli chimiquement compétent tel que Stbl3 (50 μL) ou XL10-Gold et étalez-le sur une plaque de gélose LB avec 100 μg/mL d’ampicilline après 1 h de croissance à 37 °C sans antibiotique. Incuber à 37 °C pendant la nuit. Choisissez quelques colonies et effectuez une mini préparation à l’aide d’un kit commercial en suivant les instructions du fabricant.
  5. Effectuez une amplification PCR sur l’ADN miniprep avec Primer_XmaI et Primer_BlpR à l’aide du programme PCR 1 (voir Figure 2). Séparer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% dans un tampon TBE. Sélectionnez quelques colonies (~5) avec une bande à la taille prévue d’environ 1300 pb.
  6. Effectuer le séquençage de l’ADN des colonies sélectionnées, en utilisant le Primer_XmaI ou Primer_BlpR, pour confirmer l’insertion correcte de la cassette d’ARNg.
    REMARQUE: L’une des colonies vérifiées par la séquence est également utilisée dans l’étude, et le plasmide est appelé le p_guides.
  7. Répétez l’étape 2.2 (construction de la cassette) avec les Primers-Killer F et R, et les Primers-mCherry F et R. Utilisez une colonie vérifiée par séquence pour une analyse plus approfondie. Le plasmide est appelé p_Killer.

3. Production de lentivirus

  1. Produire et purifier une grande quantité de tous les plasmides requis à l’aide d’un kit de préparation maxi sans endotoxine en suivant les instructions du fabricant. Préparer les aliquotes à 2 μg/μL. Conserver à -20 °C
  2. Préparation des cellules (Jour 1)
    1. Préparer 18 plaques de 145 cm ensemencées avec 1 x 106 cellules HEK293 par plaque dans 16 mL de milieu composé de pyruvate de glucose élevé en milieu aigle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline/streptomycine. Amplifier les cellules à 37 °C, dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 3 jours.
      REMARQUE: La production de lentivirus doit être effectuée avec prudence dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2, en utilisant des équipements de protection adaptés, y compris une combinaison de protection jetable, un capuchon de protection et des gants. Toutes les expériences doivent se faire sous une hotte à écoulement laminaire (armoire de sécurité BSLII) avec embouts filtrants. Toute la solution contenant des lentivirus et tous les déchets plastiques/verres usagés doivent être inactivés avec de l’éthanol à 70 % ou un autre activateur de virus.
  3. Transfection des cellules (Jour 4)
    1. Vérifiez la confluence des cellules, pour vous assurer qu’elles ont atteint 60% à 65% de confluence.
    2. Préparer la solution de transfection contenant pour chaque plaque : 20,8 μg du plasmide d’intérêt (p-guides, ou p-Killer, ou pCas9 #87904), 4,8 μg du plasmide codant pour l’enveloppe (VSV-G, #8454), 20,8 μg du plasmide psPAX2 (#12260) pour l’emballage lentiviral, 136 μL de phosphate de calcium et ajuster avecH2O jusqu’à un volume final de 1 000 μL. Ajouter cette solution goutte à goutte et sous agitation à 1 mL de solution saline tamponnée HEPES (HBS).
      NOTE: Ne pas préparer un mélange pour toutes les plaques en même temps pour assurer une préparation optimale des réactifs; préparer un mélange pour six assiettes en même temps, par exemple, pour 18 assiettes, préparer trois fois un mélange pour six assiettes.
    3. Incuber à température ambiante (RT) pendant au moins 10 min et ajouter 2 mL de solution goutte à goutte aux cellules. Homogénéiser le réactif de transfection avec une légère agitation de la plaque vers l’arrière, vers l’avant, vers le haut et vers le bas, incuber à 37 °C, 5% de CO2 pendant au moins 5 h.
      REMARQUE: À partir de ce moment et jusqu’à la fin de la production de lentivirus, portez un équipement de protection supplémentaire, y compris une deuxième paire de gants, des manchons de protection et un plastron jetable.
    4. Cinq heures après la transfection, retirez le milieu des plaques et rincez avec du PBS pour vous débarrasser des réactifs de transfection. Ajouter 12 mL de milieu frais et incuber 48 h à 37 °C, 5 % de CO2.
  4. Collecte des particules virales (Jour 6)
    1. Collectez et mettez en commun le support de toutes les assiettes. Centrifuger à 800 x g pendant 5 min à 4 °C, pour granuler les débris cellulaires. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm (plusieurs filtres requis).
    2. Centrifuger à 68 300 x g pendant 2 h à 4 °C dans un rotor à godet oscillant. Retirez le surnageant et laissez les tubes à l’envers sous l’armoire de sécurité sur un papier pendant 5 à 10 minutes pour éliminer autant de liquide que possible, puis ajoutez 100 μL de milieu de prolifération HEK par pastille. Après au moins 2 h à 4 °C, remettre en suspension les granulés en les faisant pipeter de haut en bas. Mettez en commun tous les granulés remis en suspension.
      REMARQUE: Les granulés peuvent être laissés dans le milieu pendant la nuit à 4 ° C avant d’aliquoter.
    3. Lentivirus aliquote dans un échantillon de 10 μL ou 25 μL (selon l’utilisation) et congeler avec de l’azote liquide. Conserver à -80 °C. Ne pas congeler une aliquote qui a été décongelée.
  5. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 avec d’autres plasmides d’intérêt afin de produire des guides LV, LV-Killer et LV-Cas9.
    REMARQUE: Comme alternative, les lentivirus peuvent être achetés auprès d’une entreprise ou d’une installation de virus.

4. Titrage du lentivirus

REMARQUE: Le titrage du virus est effectué sur les cellules HEK293. Le titrage est important pour incorporer dans les étapes suivantes un nombre précis de lentivirus par cellule (quel que soit le lot de lentivirus), pour les cellules d’intérêt. Le nombre de particules virales qui transduisent efficacement une cellule est appelé la multiplicité d’infection (MOI) : MOI 10 correspond donc à l’introduction de 10 particules virales par cellule. Comme le cycle de congélation/décongélation affecte la viabilité du lentivirus, le titrage est effectué avec une aliquote de lentivirus congelée, et chaque expérience ultérieure sera effectuée avec une nouvelle aliquote du même pool. Une méthode de titrage est décrite ici, mais d’autres méthodes peuvent être utilisées.

  1. Le jour 1, semez 1 x 105 cellules par plaque dans cinq plaques de 35 mm avec des couvercles en verre sur le fond et deux plaques de 35 mm sans couvercles.
  2. Le jour 2, à partir des deux plaques sans couvercles, collectez et comptez le nombre de cellules après la trypsinisation et déterminez la quantité moyenne de cellules par plaque (N).
  3. Préparer 100 μL de lentivirus dilué à 1/10 dans un milieu de prolifération. Transduire les cinq plaques cultivées avec différents volumes de virus dilué, de 1 à 50 μL de virus dilué. Pour ce protocole, utilisez les volumes suivants pour transduire les cinq plaques : 1 μL, 5 μL, 10 μL, 20 μL, 50 μL. Incuber pendant 48 h à 37 °C, dans un CO2 à 5 %.
  4. Le jour 4, fixer les cellules par incubation des couvercles à TA pendant 20 à 30 min dans du paraformaldéhyde à 4%. Pour le LV-Cas9, perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton X100 dans une solution saline tampon phosphate (PBS) pendant 10 min à RT, saturer en PBS-0,1 % Triton X100-2 % de sérum de chèvre - 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 20 min à RT, et étiqueter pendant 45 min à RT avec anticorps primaire anti-V5 (dilution 1/400) suivi de 30 min d’incubation à RT avec anticorps secondaire fluorescent. Marquer les noyaux avec Hoescht (10 μg/mL dans PBS) pendant 10 min à RT.
  5. Montez les couvercles sur une lame et observez à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un objectif 20x. Pour les guides LV et LV-Killer, après fixation, passez directement à l’étiquetage des noyaux et montez les couvercles. Pour chaque coverslip, comptez le nombre total de noyaux (nombre total de cellules) dans le champ de vision et le nombre de cellules marquées (avec V5 ou mCherry), et déterminez le rapport des cellules marquées pour chaque coverslip.
  6. Choisissez un couvercle dans lequel le rapport des cellules transduites est d’au moins 10% et ne dépasse pas 50%. Déterminer l’efficacité de transduction (X) pour ce couvercle et noter le volume de virus dilué (V, en μL) utilisé pour obtenir cette efficacité de transduction.
    Equation 1
  7. Déterminer le titre (en particules infectieuses, représenté par ip/mL) du virus selon la formule suivante :
    Equation 2
    Le facteur de dilution est la dilution du lentivirus effectuée à l’étape 4.3. Nous avons systématiquement obtenu un titre final de 1 x 109 ip/mL pour LV-Cas9 et de 1 x 1010 ip/mL pour LV-guide, déterminé dans des cellules HEK.

5. Transduction des myoblastes

NOTE : Les myoblastes immortalisés sont successivement transduites avec les trois lentivirus précédemment produits. Ils sont maintenus à une densité inférieure à 50% dans un milieu de prolifération composé de F10 de Ham complété par 20% de FBS, 2% de pénicilline /streptomycine, 2% d’Ultroser G, et cultivés à 37 °C, 5% de CO2.

  1. Déterminer le volume de lentivirus nécessaire pour traiter le nombre choisi de cellules avec MOI 10 pour LV-Cas9 et LV-guides et MOI 20 pour LV-killer, selon la formule suivante:
    Equation 3
    REMARQUE: Dans une expérience parallèle, l’efficacité de la transduction a été comparée sur les myoblastes et HEK, en utilisant un lentivirus témoin (lenti-GFP), et nous avons déterminé que cinq fois plus de lentivirus sont nécessaires pour transduire efficacement un myoblaste par rapport à une cellule HEK. Ainsi, moi 10 mesuré sur HEK correspond à deux particules virales par myoblaste. Les MOI utilisés ici sont calculés sur des cellules HEK.
  2. Le jour 1, ensemencez des plaques de 96 puits avec 10 000 cellules dans 100 μL de milieu de prolifération par puits. Le jour 2, transduire les cellules sous l’armoire de sécurité en ajoutant le volume approprié de guides BT et de LV-Cas9 calculé à l’étape 5.1. Renvoyer les cellules à l’incubateur jusqu’au jour 7.
    REMARQUE: L’utilisation de MOI supérieur à 25, en particulier pour LV-Cas9, peut ne pas améliorer le nombre de cellules modifiées en raison d’une mort cellulaire plus élevée à une concentration élevée de lentivirus.
  3. Le jour 7, effectuez une trypsinisation et comptez les cellules. Ensemencez les cellules à une confluence de 40% à 50% dans une nouvelle plaque et retournez les cellules à l’incubateur. Cinq heures plus tard, transduire les cellules avec LV-Killer à un MOI de 20 (volume calculé à l’étape 5.1). Amplifier les cellules pendant 5 à 10 jours après la transfection, pendant au moins deux passages, et toujours les maintenir à une faible confluence de <50%. Les cellules sont prêtes pour l’étape suivante, le clonage cellulaire, lorsque leur croissance est revenue à la normale (estimée par le temps de division).
    REMARQUE: La prolifération peut être un peu plus lente après la transduction. La croissance cellulaire normale peut être déterminée avant cette procédure expérimentale par estimation du temps de division des cellules.

6. Clonage cellulaire

REMARQUE: Comme la transduction des myoblastes est difficile et n’atteint jamais 100% d’efficacité, même en utilisant le lentivirus, le clonage cellulaire est nécessaire afin d’obtenir une lignée cellulaire entièrement corrigée. Cela n’est possible qu’avec des cellules immortalisées, ou des cellules qui peuvent être cultivées et amplifiées pendant quelques semaines/mois.

  1. Trypsiniser et compter les cellules. Diluer les cellules dans un milieu de prolifération à 10 cellules/mL et ensemencer les cellules à 1 cellule/puits dans des plaques de 96 puits contenant 100 μL/puits de milieu.
    REMARQUE: Le nombre de plaques à ensemencer dépend de la probabilité de l’édition de gènes attendue, 2 à 10 plaques sont couramment utilisées.
  2. Surveillez la croissance des cellules et amplifiez progressivement chaque puits dans une plaque plus grande jusqu’à atteindre au moins une plaque de 35 mm, tout en maintenant la confluence des myoblastes en dessous de 50%. Cette étape peut durer de 2 à 6 semaines, selon les cellules utilisées et leur capacité à se développer une fois isolées dans un puits.

7. Sélection du clone

REMARQUE : cette étape est effectuée pour identifier lesquels des clones en croissance ont été modifiés de manière appropriée.

  1. Concevez un ensemble d’amorces composé d’un apprêt situé avant le premier guide (Primer_BeforeGuide1F) et d’un autre apprêt situé après le deuxième guide (Primer_AfterGuide2R) afin d’amplifier la région entourant la séquence prétendument modifiée. Voir le tableau 1 pour les amorces utilisées ici.
  2. Prélevez des cellules de chaque clone, épargnez au moins 300 000 cellules pour une amplification future et extrayez l’ADN génomique en utilisant n’importe quel protocole standard sur les cellules restantes.
    1. Si un grand nombre de clones se développent, pour éliminer ceux qui ne sont pas modifiés, effectuez un test rapide en regroupant les cellules de cinq clones dans le même tube pour extraire l’ADN de ce pool et tester avec PCR. Répétez l’opération avec autant de clones que nécessaire. Ensuite, séparez davantage les pools qui contenaient des cellules modifiées pour effectuer une analyse individuelle.
  3. Contrôlez l’édition par PCR comme suit. Préparer la réaction pcR avec 1 μL de Primer_BeforeGuide1F, 1 μL de Primer_AfterGuide2R, 12,5 μL de mélange de polymérase, 3 μL d’ADN génomique et 7,5 μL deH2O. Amplifier dans un thermocycleur selon les instructions du fabricant et les paramètres des amorces. Exécuter sur un gel d’agarose à 1% pour identifier les clones modifiés.
  4. Contrôlez l’édition par séquençage comme suit. Effectuez le séquençage Sanger des clones sélectionnés pour confirmer la suppression et identifier comment l’édition a été effectuée dans chaque clone. Conservez plus d’un clone modifié pour vous assurer que seul le gène ciblé a été modifié et est responsable de l’effet physiologique observé et conservez un clone non modifié qui sera utilisé comme clone témoin (CTRL) dans les expériences ultérieures.
  5. Développez les clones sélectionnés. Une fois que la confluence de chaque clone a atteint environ 50%, essayez les cellules et plaquez les cellules dans un plat plus grand, jusqu’à ce que suffisamment de cellules aient été produites pour effectuer les caractérisations biochimiques et fonctionnelles (généralement plus de 1 x 106 par clone), et stockez les aliquotes congelées de chaque clone pour une utilisation future.

8. Caractérisation des clones édités

REMARQUE: Une fois que quelques clones ont été sélectionnés et confirmés par séquençage de l’ADN, la délétion du gène ciblé peut être confirmée au niveau de la protéine à l’aide du transfert Western, et au niveau fonctionnel si un test cellulaire fonctionnel est disponible pour ce gène. Dans le cas de RYR1-KO, comme RyR1 est un canal calcique, la caractérisation fonctionnelle a été réalisée à l’aide de l’imagerie calcique sur des cellules cultivées.

  1. Expression des protéines dans les clones modifiés
    REMARQUE: RyR1 est exprimé uniquement dans les myotubes différenciés10. Son expression a été évaluée dans les myotubes à l’aide du Transfert western, pour confirmer la délétion au niveau protéique de RyR1, ainsi que la délétion de la protéine Cas9.
    1. Plaque 200 000 cellules en milieu de prolifération (décrit ci-dessus, étape 5) sur une surface d’environ 1,76cm2 dans une plaque de 35 mm recouverte de laminine (surface correspondant à une chute de 200 μL de laminine à 10 mg/mL dans le PBS avec du calcium). Une fois que les cellules sont collées à la plaque après avoir été incubées pendant 2-3 h à 37 °C, 5% de CO2, déplacez le milieu de culture vers un milieu de différenciation composé de DMEM faible teneur en glucose + 10% de sérum de cheval + 1% de pénicilline / streptomycine, et retournez les cellules à l’incubateur pendant 6 jours.
    2. Après 6 jours de différenciation, prélever et lyser les cellules avec 200 μL de RIPA complété par des inhibiteurs de la protéase. Déterminer la concentration en protéines à l’aide de la méthode Folin Lowry11.
    3. Chargez 15 μg de protéines, après dénaturation pendant 30 min à RT dans un tampon de dénaturation Laemmli, sur un gel d’acrylamide à gradient de 5% à 15%. Après séparation électrophorétique, transférer les protéines sur Immobilon P à 0,8 V pendant 4 h11.
    4. Après saturation de la membrane pendant 30 min à RT dans du PBS contenant 0,1 % de lait sec Tween 20 et 5 % de lait sec non gras, incuber la membrane avec les anticorps primaires dilués dans le même tampon pendant 2 h à RT ou pendant la nuit à 4 °C, laver la membrane 5x pendant 5 min avec PBS-0,1 % Tween 20 et incuber la membrane avec les anticorps secondaires pendant 1 h à RT. Les principaux anticorps utilisés sont : les anticorps contre le marqueur V5 (dilution : 1/5000) pour détecter le Cas9, l’anti-GAPDH (dilution : 1/1000) comme contrôle de charge, l’anticorps anti-RyR112,13 (dilution : 1/10.000), l’anticorps contre la sous-unité alpha 1 du DHPR (dilution : 1/1000) et l’anticorps contre la chaîne lourde de la myosine MF20 (dilution : 1/1000).
    5. Lavez la membrane 5x pendant 5 min avec PBS-0.1% Tween 20, séchez l’excès de liquide et ajoutez le substrat chimiluminescent. Procédez comme recommandé par le fournisseur de substrat pour détecter le signal chimiluminescent.
  2. Caractérisation fonctionnelle des clones édités
    REMARQUE: La fonction de RyR1 a été évaluée à l’aide de l’imagerie calcique dans des myotubes différenciés, produits à partir de clones CTRL ou KO14.
    1. Plaquer 50 000 cellules sur une surface de 0,2 cm2 au centre de plats de 35 mm recouverts de laminine (surface recouverte d’une goutte de laminine de 50 μL, à 10 mg/mL dans le PBS avec du calcium) et induire une différenciation pendant 6 jours comme décrit à l’étape 8.1.1. Préparez trois plaques pour chaque stimulation, pour avoir un triplicate biologique.
    2. Charger les myotubes avec 50 μL de fluo 4-direct, dilués 1:1 dans un milieu de différenciation et incubés pendant 30 min à 37 °C. Rincez les cellules deux fois avec un tampon KREBS complété par du glucose à 1 mg/mL.
    3. Mesurez les variations de fluorescence avec un microscope fluorescent inversé ou un microscope confocal à l’aide d’un objectif 10x. Installez la plaque sur la scène du microscope et commencez l’acquisition à 1 image par seconde pendant 90 s.
    4. Retirer les KREBS restants et stimuler les cellules au cadre 25 en ajoutant 2 mL de KCl pour la dépolarisation membranaire (concentration finale de 140 mM) ou 2 mL de 4 CmC (concentration finale de 500 μM) pour la stimulation directe RyR1. Assurez-vous qu’au moins 10 myotubes sont présents sur le terrain enregistré.
    5. Quantifier la variation de fluorescence dans chaque myotube, à l’aide d’un logiciel dédié. Sélectionnez pour analyse au moins 10 myotubes par plat (idéalement 20-30 myotubes par plat), tracez une ligne (ou une région d’intérêt (ROI)) sur le long axe de chaque myotube et collectez la fluorescence F le long de cette ligne pour toutes les images.
    6. Déterminez la valeur fluorescente initiale, F0, correspondant aux images 1 à 24. Tracer la variation fluorescente (F-F0)/F0 en fonction du temps de 0 à 90 s. Répétez l’expérience trois fois pour obtenir la variation de fluorescence d’au moins 90 myotubes de trois cultures différentes. Regroupez tous les résultats pour les 90 myotubes et calculez la moyenne ± SEM de (F-F0)/F0 à chaque période. Quantifier l’amplitude maximale de la libération de calcium pour chaque stimulation et chaque clone.

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Representative Results

Ce protocole a été appliqué aux myoblastes immortalisés d’un sujet sain15 (cellules dites HM, pour les myoblastes humains), dans lequel le RyR1 a déjà été caractérisé16, afin d’éliminer le gène RYR1 codant pour la protéine RyR1. La conception de l’ARN guide a été faite pour supprimer la séquence englobant une partie de l’exon 101 et de l’intron 101 du gène. La suppression d’une partie de l’exon 101 devrait entraîner une perturbation du cadre de lecture. De plus, l’exon 101 code pour le pore de la protéine et est donc nécessaire pour produire un canal calcique fonctionnel. De nombreux patients atteints d’une myopathie sévère liée à RyR1 ont une mutation dans cette région du gène7. Les meilleurs guides prédits avec le logiciel Crispor ont été sélectionnés afin d’avoir le moins de hors-cibles possible, tout en gardant la meilleure efficacité. Nous avons choisi d’utiliser deux guides en même temps dans le même vecteur viral, pour nous assurer qu’une grande partie des cellules seront knock-out, et pour faciliter la détection de la délétion dans les clones édités en utilisant la PCR. Les deux repères sélectionnés (voir tableau 2 et figure 1) sont localisés, respectivement, à la fin de l’exon 101 et au début de l’intron 101, ce qui entraîne une suppression de 326 pb et un décalage de trame ultérieur. Cela garantit que les cellules modifiées seront RYR1-KO.

L’ARNg ciblant la SpCas9 était celui déjà conçu par Merienne et ses collègues6 et présent dans le plasmide #87919 sous le faible promoteur 7SK. Comme son efficacité à cibler la séquence SpCas9 a déjà été démontrée dans leur étude6, elle a été utilisée pour créer le plasmide p_Killer, mais sous le contrôle du puissant promoteur H1. Le deuxième guide du plasmide p_Killer est conçu pour cibler la séquence mCherry sous le promoteur U6. Cela permettra la suppression de mCherry, ce qui pourrait être dérangeant dans certaines expériences ultérieures avec la lignée cellulaire nouvellement créée.

Des plasmides p_guides et des p_killer ont été créés et tous les lentivirus requis ont été produits dans la salle de culture BSL2 dédiée. Après la transduction des myoblastes, les cellules ont été cultivées pendant 2 semaines jusqu’à la récupération de la croissance et analysées par PCR pour confirmer la présence de cellules modifiées. Pour le clonage cellulaire, deux plaques de 96 puits ont été ensemencées avec des cellules traitées à 1 cellule par puits. Une croissance cellulaire a été observée dans 32 % des puits de culture. L’ADN génomique a ensuite été extrait des clones et une analyse PCR a été effectuée jusqu’à ce que deux clones corrigés soient identifiés (appelés Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2), voir la figure 3. La suppression de la partie ciblée de RYR1 a été confirmée par séquençage de Sanger. Des cellules témoins supplémentaires ont été utilisées, telles que les cellules HM initiales, ou des cellules HM traitées avec la même procédure, mais non modifiées, comme le confirment la PCR et le séquençage (Cl-CTRL). Les clones sélectionnés ont ensuite été amplifiés et caractérisés au niveau des protéines et au niveau fonctionnel.

Pour valider l’extinction complète de RyR1 et de Cas9 au niveau des protéines, une analyse par transfert western a été effectuée. Les résultats sont présentés à la figure 4. La protéine Cas9, absente dans les cellules HM, a été détectée 5 jours après la transduction des cellules avec LV-Cas9 (HM+LV-Cas9), et comme prévu, son expression a été abolie dans le Cl-CTRL et dans les Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2 édités, bien qu’une petite quantité de Cas9 ait encore été détectée dans Cl-KOR-2 (Figure 3A). Comme l’ARNg ciblant Cas9 est toujours exprimé, la quantité de Cas9 restant devrait disparaître progressivement. L’expression d’autres protéines importantes a également été évaluée à l’aide du transfert western : RyR1, pour confirmer la délétion complète de la protéine, la sous-unité alpha1 de DHPR, qui est le partenaire fonctionnel de RyR1 impliqué dans le couplage excitation-contraction, et la chaîne lourde de myosine comme marqueur de différenciation, car RyR1 et DHPR ne sont exprimés que dans des myotubes différenciés (Figure 3B ). Le DHPR et le MYHC ne sont pas censés être modifiés. Bien que le transfert Western ait confirmé la suppression complète de RyR1 dans les deux clones RyR1-KO (Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2), des modifications supplémentaires - résultant de Cas9 ou de la procédure de clonage - peuvent s’être produites dans le Cl-KOR-2, ce qui a présenté en outre une absence de DHPR et une réduction de la chaîne lourde de myosine (CMH). Comme les deux protéines ne sont exprimées que dans des myotubes différenciés, leur absence reflète très probablement une altération de la différenciation, qui pourrait éventuellement provenir de la longue procédure de clonage unicellulaire associée à une prolifération locale des cellules conduisant à la perte de leur potentiel myogénique. Ainsi, seul Cl-KOR-1 a été caractérisé davantage au niveau fonctionnel. Cela démontre que la sélection de nombreux clones édités est importante pour pouvoir travailler avec le(s) meilleur(s).

La caractérisation fonctionnelle a été réalisée à l’aide de l’imagerie calcique. La variation moyenne de fluorescence en fonction du temps est représentée sur la figure 5, sur au moins 180 myotubes de chaque génotype, en utilisant soit une stimulation directe de RyR1 par 4-CMC, soit une stimulation du complexe de libération de calcium (DHPR associé à RyR1) par dépolarisation de la membrane KCl.

Ces expériences ont montré que le Cl-CTRL non modifié avait un comportement comparable à la population cellulaire initiale (cellules HM) et répondait à la stimulation directe de RyR1 par son activateur 4-CmC et par stimulation du complexe de libération de calcium par dépolarisation membranaire. En revanche, le Cl-KOR-1 édité était incapable de répondre à l’une ou l’autre stimulation (dépolarisation 4-CmC et KCl), comme prévu pour un RyR1-KO.

Dans l’ensemble, le transfert western et la caractérisation fonctionnelle ont confirmé que la lignée cellulaire Cl-KOR-1 est une lignée cellulaire musculaire RyR1-KO. Ce protocole peut être appliqué à tout autre gène exprimé dans le muscle squelettique ou à un autre type de cellule (comme les cellules souches pluripotentes induites - iPSC). Le protocole complet est illustré à la figure 6.

Figure 1
Figure 1 : Localisation et conception de l’ARN des guides. (A) Localisation schématique des guides conçus pour la création de la lignée cellulaire RYR1-KO. Le Guide 1 cible l’extrémité de l’exon 101 dans le gène RYR1, le Guide 2 cible l’intron 101, créant une délétion de 326 bp et un frameshift. Guide Killer cible le codon d’initiation dans la séquence du SpCas9, Guide mCherry cible la fin de la séquence mCherry. (B) Localisation des guides dans les séquences génomiques des guides décrits précédemment guide 1, guide 2, guide killer et Guide mCherry. La séquence de chaque guide (20 bp de longueur) est présentée en couleur et le PAM de chaque guide est en gras et souligné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Procédure de clonage pour la production de la cassette. Présentation schématique des différentes PCR réalisées pour produire les cassettes avec les guides, à insérer dans le plasmide dorsal du lentivirus. PCR A, PCR B, PCR C et PCR D sont réalisées avec le programme 1 illustré en haut à droite, et la PCR finale avec le programme PCR 2, illustré en bas à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Sélection des clones à l’aide de la PCR. (A) Présentation schématique de l’amplification pcR d’une région de 1 200 pb englobant les guides, avec des amorces avant et arrière représentées par les flèches grises. Le clivage de l’ADN aux deux guides devrait entraîner une réduction de 326 pb de la taille du fragment de PCR, comme le montrent les lignes verticales vertes pointillées sous les ciseaux. (B) Les produits de PCR fabriqués à partir de cellules HM, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2 ont été chargés sur un gel d’agarose à 1 %. L’ADN de HM et Cl-CTRL semble non modifié (pleine longueur), tandis que l’ADN de Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2 est plus court que le témoin, comme prévu (clivé). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Caractérisation des cellules au niveau des protéines. (A) Analyse par transfert western de la présence de la protéine Cas 9 à l’aide de la balise V5 dans les cellules HM, les cellules HM transduites avec LV-Cas9, Cl-CTRL, Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2. Cas9 est clairement détecté dans les cellules HM transduites avec LV-Cas9, alors que son expression a été complètement abolie (dans Cl-CTRL et Cl-KOR-1) ou presque complètement (dans Cl-KOR-2) par LV-Killer. (B) Expression de RyR1, chaîne lourde de myosine (MYHC), sous-unité alpha1 de DHPR et GAPDH comme contrôle de charge dans Cl-CTRL, Cl-KOR-1 et Cl-KOR-2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Caractérisation fonctionnelle des cellules. Imagerie calcique Fluo-4 réalisée sur des myotubes produits à partir de cellules HM, Cl-CTRL et Cl-KOR-1. Les courbes représentent la variation de fluorescence dans les myotubes HM (courbes noires), les myotubes Cl-CTRL (courbes grises) ou Cl-KOR-1 (courbes vertes). Toutes les valeurs sont présentées comme moyenne ±'erreur-type de moyenne (MEB) de n myotubes. Dans chaque condition, n = 180 à 256 myotubes ont été analysés, à partir d’au moins trois expériences différentes (nombre exact indiqué pour chaque courbe). 4 CmC (500 μM) ont été utilisés pour stimuler directement RyR1 en présence de calcium externe de 2 mM. La dépolarisation du KCl (140 mM) a été induite en présence de 2 mM de calcium externe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Présentation schématique de l’ensemble du protocole. Les différentes étapes du protocole sont présentées, de la conception in silico au clonage moléculaire in vitro et à la sélection cellulaire finale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom Séquence 5'-3' But/Utilisation
Primer_Guide1F Guide1 + gttttagagctagaaatagc Clonage de plasmides
Primer_Guide1R Guide 1-RC +AGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_Guide 2F Guide 2 + gttttagagctagaaatagc
Primer_Guide 2R Guide 2-RC + GTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_XmaI F TAGTGGATCCCCCGGGAAAATTCAAAATTTT Clonage des plasmides et contrôle des colonies
Primer_BlpI R CGCTTCCATTGCTCAGCTGGCCGCTGCCCC
Primer_KillerF AATGGAGTACTTCTTGTCCAgttttagagctagaaatagc Clonage de p_Killer plasmidiques
Primer_KillerR TGGACAAGAAGTACTCCATTAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_mCherryF GAACAGTACGAACGCGCCGAgttttagagctagaaatagc
Primer_mCherryR TCGGCGCGTTCGTACTGTTCGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_RYR1exonF GCTCGTATTCGTCACCCGCGgttttagagctagaaatagc Clonage de p_guides_RyR1 plasmidiques
Primer_RYR1exonR CGCGGGTGACGAATACGAGCAGATCTGTGGTCTCATACAG
Primer_RYR1intronF TAAGTCAGTTCATAGGCGCTgttttagagctagaaatagc
Primer_RYR1intronR AGCGCCTATGAACTGACTTAGTTTCGTCCTTTCCACAAG
Primer_BeforeRYR1cut AGTCGTTACCATGTCTTCAGCCCT Sélection de clone pour RYR1 KO
Primer_AfterRYR1cut CTGCCGATTCCACAGATGAAGCAC

Tableau 1 : Liste des amorces. Amorces utilisées pour le clonage de plasmides et le contrôle des colonies, ainsi que celles pour la sélection des clones.

Nom Séquence de guidage Pam Complément inversé sans PAM
Guide 1: RYR1exon GCTCGTATTCGTCACCCGCG Le CGCGGGTGACGAATACGAGC
Guide 2: RYR1intron TAAGTCAGTTCATAGGCGCT Le AGCGCCTATGAACTGACTTA
Guide Killer Cas9 TGGACAAGAAGTACTCCATT Le AATGGAGTACTTCTTGTCCA
Guide mCherry killer GAACAGTACGAACGCGCCGA Le TCGGCGCGTTCGTACTGTTC

Tableau 2 : Guides utilisés pour créer le p_guides plasmidique et le p_Killer. Les séquences utilisées pour le développement des clones RyR1-KO sont présentées dans ce tableau.

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Discussion

Une étape majeure sur la voie de la caractérisation des gènes de fonction inconnue impliqués dans les pathologies est le développement de modèles cellulaires pertinents pour étudier la fonction de ces gènes. L’utilisation de l’édition de gènes à l’aide de CRISPR / Cas9 est un domaine de recherche en croissance exponentielle, et le développement de modèles knock-out tels que présentés ici est l’une de ses applications les plus largement utilisées. Dans ce contexte, nous proposons ici un protocole polyvalent pour développer un knock-out de lignée cellulaire humaine dans n’importe quel gène d’intérêt, permettant la caractérisation de ce gène dans un modèle cellulaire humain pertinent. Le protocole présenté ici peut être utilisé dans les myoblastes immortalisés ainsi que dans l’iPSC, et pourrait donc pratiquement entraîner la production de n’importe quel modèle cellulaire humain KO dans le gène d’intérêt.

La limitation est que ce protocole doit être appliqué aux cellules immortalisées, car de nombreuses semaines de culture ainsi qu’un clonage cellulaire sont nécessaires ainsi que de nombreuses amplifications successives. Alternativement, des cellules, qui peuvent être amplifiées et maintenues pendant quelques semaines ou mois, doivent être utilisées. En utilisant cette procédure, la lignée cellulaire musculaire immortalisée humaine KO pour le gène d’intérêt (ici le gène RYR1 ) a été produite en environ 3-4 mois (à l’exclusion de la caractérisation fonctionnelle des cellules).

Cette stratégie est adaptée aux cellules difficiles à transfecter, telles que les cellules musculaires, car elle repose sur l’utilisation du lentivirus pour introduire tous les outils dans les cellules cibles, et elle est donc plus puissante que d’autres méthodes telles que la transfection ou l’électroporation. Son principal inconvénient est l’intégration dans le génome de l’hôte, et une alternative possible pour éviter l’intégration dommageable du lentivirus dans le génome de l’hôte est l’utilisation sur le lentivirus17 non intégratif, mais l’efficacité de ces particules lentivirales non intégratives devrait être au moins équivalente au lentivirus régulier.

Le site d’intégration pourrait probablement influencer le niveau d’expression de Cas9, mais cela n’est probablement pas responsable de la petite quantité de Cas9 dans Cl-KOR 2. La petite quantité de Cas9 est très probablement liée à la transduction de ce clone spécifique avec le LV-Killer, qui aurait pu être plus faible que dans l’autre clone, ou bien le nombre de LV-Cas9 aurait pu être plus élevé.

Il n’est pas recommandé d’exprimer Cas9 seul sans ARNg pendant une longue période (comme pour le développement d’un clone de Cas9), car cela a été décrit pour augmenter les hors-cibles, et cela peut également augmenter la mortalité des cellules.

Nous avons choisi d’utiliser la SpCas9 comme nucléase, car elle est largement utilisée, elle a un PAM court, et offre donc plusieurs options pour le choix des ARN guides. De plus, sa taille est compatible avec la production de vecteurs lentiviraux. D’autres nucléases peuvent être utilisées si un PAM spécifique doit être ciblé (comme SaCas9 ou Cpf1)18.

Les différents lentivirus peuvent être produits dans une salle de culture BSL2 ordinaire19 ou achetés auprès d’une installation de production de virus ou d’une entreprise. L’exigence pour mettre en œuvre ce protocole est l’expertise en biologie moléculaire et en clonage moléculaire, ainsi que dans la culture du modèle cellulaire choisi.

Les lentivirus codant pour les différents guides codent également la protéine fluorescente, mCherry. Cette protéine fluorescente peut être utile, permettant le tri automatisé des cellules et le clonage par FACS au lieu du clonage d’une seule cellule, et dans ce cas, l’expression de mCherry ne doit pas être supprimée avec le tueur de LV. Si mCherry doit être maintenu, le deuxième guide contre mCherry ne doit pas être cloné dans le p-killer (étape 2.7). Pour le gène RYR1 , comme la caractérisation fonctionnelle utilise des sondes fluorescentes, et que l’utilisation future de cette lignée cellulaire pourrait également nécessiter un immunomarquage avec des anticorps fluorescents, nous avons choisi de supprimer l’expression mCherry. Dans le LV-killer, l’ARNg ciblant Cas9 a été placé sous un puissant promoteur H1 au lieu du faible promoteur 7SK initialement présent dans le plasmide d’origine, afin d’assurer une efficacité similaire de la nucléase sur tous les ARNg sélectionnés, et d’augmenter le clivage Cas9 une fois que le LV-killer est ajouté aux cellules.

L’étape la plus longue et la plus pénible est le clonage d’une seule cellule. Dans notre procédure, les cellules musculaires ont montré une croissance réduite après transduction lentivirale avec Cas9 et se sont rétablies après quelques semaines. Si le clonage d’une seule cellule est effectué trop tôt après les transductions virales, probablement en raison de la mort cellulaire massive, seuls quelques puits d’une plaque de 96 puits contiendront des cellules en croissance. Ainsi, il est préférable d’amplifier les cellules avant le clonage et d’attendre au moins 2-3 fractionnements. Il est également possible de cloner les cellules à 10 cellules / puits si elles ne se développent pas bien en tant que cellules individuelles. De plus, les myoblastes doivent toujours être cultivés à une confluence inférieure à 50% afin de maintenir une bonne capacité de différenciation.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été financés par des subventions de l’Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) et d’Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CACNA1S antibody Sigma-Aldrich HPA048892 Primary antibody
Blp I NE BioLabs R0585S Restriction enzyme
CalPhos Mammalian Transfection Kit Takara 631312  Transfection kit
Easy blot anti Mouse IgG GeneTex GTX221667-01 HRP secondary antibody
Easy blot anti Rabbit IgG GeneTex GTX221666 HRP secondary antibody
Fluo-4 direct Molecular Probes F10472 Calcium imaging
GAPDH(14C10) Rabbit mAb  Cell Signaling Technology #2118 Primary antibody
HindIII Fermentas ER0501 Restriction enzyme
InFusion HD Precision Plus Takara 638920 Ligation kit
MasterMix Phusion High Fidelity with GC ThermoFisher Scientific F532L Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs
Myosin Heavy Chain antibody DHSB MF20 Primary antibody
NucleoBond Xtra Maxi EF Macherey-Nagel REF 740424 Maxipreparation kit for purification of plasmids
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Macherey-Nagel 740609 DNA purification
NucleoSpin Tissue Macherey-Nagel 740952 Kit for DNA extraction from cell
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli ThermoFisher Scientific C737303 Chemically competent cells
Plasmid #87904 Addgene 87904 Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9)
Plasmid #87919 Addgene 87919 Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target)
Plasmid #12260 Addgene 12260 Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL
Plasmid #8454 Addgene 8454 Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles
V5 Tag Monoclonal Antibody Invitrogene R96025  Primary antibody
XL10-Gold Ultracompetent Cells Agilent 200317 Chemically competent cells
Xma I NE BioLabs R0180S Restriction enzyme

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Génétique numéro 184
Développement de lignées cellulaires musculaires Knock-Out à l’aide de l’édition de gènes CRISPR/Cas9 médiée par le lentivirus
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Beaufils, M., Tourel, A., Petiot,… More

Beaufils, M., Tourel, A., Petiot, A., Halmai, N. B., Segal, D. J., Rendu, J., Marty, I. Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (184), e64114, doi:10.3791/64114 (2022).

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