Summary
Bu protokol, çeşitli rejeneratif tıp uygulamaları için kullanılabilecek mikro gözenekli tavlanmış parçacık iskelesi için mikrojel yapı taşlarını sentezlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) iskele platformu, granüler hidrojellerin bir alt sınıfıdır. İkincil bir ışık bazlı kimyasal çapraz bağlama adımını (yani tavlama) takiben in situ hücre ölçeğinde gözenekliliğe sahip yapısal olarak stabil bir iskele oluşturabilen enjekte edilebilir bir mikrojel bulamacından oluşur. MAP iskelesi, dermal yara iyileşmesi, vokal kıvrım büyütme ve kök hücre dağıtımı dahil olmak üzere çeşitli rejeneratif tıp uygulamalarında başarı göstermiştir. Bu yazıda, bir MAP iskelesi oluşturmak için yapı taşları olarak poli(etilen glikol) (PEG) mikrojellerin sentezi ve karakterizasyonu için yöntemler anlatılmaktadır. Bu yöntemler, özel bir tavlama makromerinin (MethMAL) sentezlenmesini, mikrojel öncü jelasyon kinetiğinin belirlenmesini, mikroakışkan cihaz üretimini, mikrojellerin mikroakışkan üretimini, mikrojel saflaştırmayı ve mikrojel boyutlandırma ve iskele tavlaması dahil olmak üzere temel iskele karakterizasyonunu içerir. Spesifik olarak, burada açıklanan yüksek verimli mikroakışkan yöntemler, özellikle rejeneratif tıp alanında, istenen herhangi bir uygulama için MAP iskeleleri üretmek için kullanılabilecek büyük miktarlarda mikrojeller üretebilir.
Introduction
MAP iskele platformu, tamamen hidrojel mikropartiküllerinden (mikrojeller) oluşan, birbirine çapraz bağlandığında hücre ölçeğinde mikro gözeneklilik sağlayan, bozulmadan bağımsız hücre göçü ve toplu doku entegrasyonuna izin veren enjekte edilebilir bir biyomalzemedir1. Konakçı doku ile hızlı bir şekilde bütünleşme kabiliyeti ve doğası gereği düşük immünojenisitesi nedeniyle, MAP iskele platformu, dermal yara iyileşmesini hızlandırmak da dahil olmak üzere çok çeşitli rejeneratif tıp tedavileri 2,3,4,5,6,7,8,9,10 için klinik öncesi uygulanabilirlik göstermiştir 1,3 ,11, beyin inme boşluğunu revaskülarizeetmek, mezenkimal kök hücreleri2 vermek ve glottik yetmezliği tedavi etmek için doku şişkinliği sağlamak6. MAP'nin ayrıca M2 makrofajlarının işe alınması yoluyla konakçı dokuya anti-enflamatuar etkileri ilettiği gösterilmiştir3 ve hatta bir Th2 "doku onarımı" bağışıklık tepkisini teşvik etmek için ayarlanabilir8. MAP iskele platformunun bu olumlu özellikleri, çok çeşitli klinik uygulamalara genişletilmesini sağlar.
MAP iskele oluşumu için mikrojel üretmek için daha önce yayınlanmış yöntemler, akış odaklı damlacık-mikroakışkanlar 1,4,7,9, elektropüskürtme 5,12 ve toplu emülsiyon 6,10 ile baş üstü eğirmeyi içeriyordu. Damlacık mikroakışkan yöntemi, yüksek monodispersiteye sahip parçacıklar üretebilir, ancak düşük partikül verimi (μL / s) üreten çok yavaş akış hızları kullanır. Alternatif olarak, elektropüskürtme ve toplu emülsiyon yöntemleri, yüksek partikül polidispersitesine sahip, yüksek hacimli parçacıklar üretebilir. Bu protokol, de Rutte ve ark.13'ün çalışmalarına dayanarak, monodispers popülasyonlu mikrojeller üretmek için yüksek verimli bir mikroakışkan yöntem kullanır. Bu yöntem, bir fotomaskeden bir polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihaz yapmak için yumuşak litografi tekniklerini kullanır ve daha sonra bir cam slayda bağlanır. Cihaz tasarımı, yüksek miktarda mikrojel partikülü (mL / s) üretmek için kademeli emülsifikasyona dayanır. Bu yöntemle elde edilebilecek monodispersite, diğer tekniklere kıyasla gözenekliliğin üstün kontrolünü sağlar, çünkü monodisperse mikrojeller daha düzgün gözenek boyutlarına sahip iskeleler oluşturabilir2.
MAP iskeleleri için yapı taşları olarak hareket edebilen bireysel mikrojelleri sentezleme ve karakterize etme yöntemleri, özellikle mikrojel jelasyonu için tiol işlevselleştirilmiş çapraz bağlayıcılarla verimli Michael tipi eklemeye kolayca katılan bir maleimid (MAL) grubuna sahip bir PEG omurgasından oluşan mikrojellerin oluşturulması açısından bu makalede özetlenmiştir. Mikrojel jelasyonunu MAP iskele tavlamasından ayırmak için, bu el yazması ayrıca heterofonksiyonel bir metakrilamid/maleimid 4 kollu PEG makromeri olan yayınlanmış14 özel tavlama makromeri MethMAL'ın nasıl sentezleneceğini de açıklamaktadır. Metakrilamit fonksiyonel grupları, serbest radikal fotopolimerizasyonuna (mikrojel tavlama için) kolayca katılırken, MAL fonksiyonel grupları için Michael tipi ilaveyi teşvik eden koşullara nispeten inert kalır.
Ek olarak, bu makale PDMS mikroakışkan cihazlarının oluşturulması, mikrojel jelasyon kinetik belirlenmesi ve mikrojel boyutunun karakterize edilmesi için protokolleri özetlemektedir. Makalenin son kısmı, mikrojellerin yüzeylerini kovalent olarak birbirine bağlayan ikincil, foto-başlatılmış çapraz bağlama adımı aracılığıyla in situ olarak toplu bir iskeleye dönüştürüldüğü MAP iskele tavlamasını detaylandırmaktadır. Daha önce tarif edildiği gibi, enzim aracılı tavlama gibi ışık bazlı kimyasallara dayanmayan MAP iskele sistemlerinde uygulanabilecek başka tavlama yöntemleri olduğunu belirtmek önemlidir1. Genel olarak, bu yöntemler doğrudan kullanılabilir veya herhangi bir uygulama için MAP iskeleleri oluşturmak üzere farklı hidrojel formülasyon kimyaları (örneğin, hyaluronik asit bazlı) ile kullanılabilir.
Protocol
1. MethMAL tavlama makromer sentezi
NOT: Bu protokol özellikle 1 g PEG-maleimid modifiye etmek içindir, ancak daha büyük partiler yapmak için ölçeklendirilebilir.
- Karıştırma çubuğuna sahip küçük bir cam beherde 10 mL 1x fosfat tamponlu saline (PBS, pH 7.4) 1 g 4 kollu 20 kDa PEG-maleimid ekleyin. PEG tamamen çözünene kadar (~ 30 dakika) çözeltiyi 300 rpm'de karıştırın.
- 300 rpm'de karıştırma ile reaksiyona 14.65 mg 2-aminoetantiol (maleimid [MAL] molar oranına 0.67: 1 tiol [SH]) ekleyin.
NOT: 2-aminoetanitol üzerindeki tiol grupları, Michael tipi ilaveyle PEG-MAL'ın yaklaşık üç koluna eklenecek ve amin uç grupları bırakılacaktır.- Eklenecek 2-aminoetantiol miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin:
NOT: Çok az miktarda ölçmekten kaçınmak için, 100 mg 2-aminoetantiol 1 mL 1x PBS (pH 7.4) içinde çözün ve bu çözeltinin 146.5 μL'sini reaksiyona ekleyin.
- Eklenecek 2-aminoetantiol miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin:
- Adım 1.2.'den sonra 1 saat ve 10 dakika bekleyin, ardından yeni bir cam beherde 5 mL 1x PBS'de (pH 7.4) 160.1 mg 4-(4,6-Dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinyum klorür (DMTMM, PEG'e 12:1 molar oran) ve 32,77 μL metakrilik asit (PEG'e 8:1 molar oran) karıştırın ve 300 rpm'de karıştırarak 50 dakika reaksiyona sokun.
NOT: Bu adımda, metakrilik asit, daha sonra PEG üzerindeki mevcut amin gruplarına bağlanabilen oldukça reaktif bir ester oluşturmak için DMTMM ile reaksiyona girer.- Eklenecek DMTMM miktarını hesaplamak için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin:
- Eklenecek metakrilik asit miktarını hesaplamak için aşağıdaki örnek hesaplamaya uyun:
- Eklenecek DMTMM miktarını hesaplamak için aşağıdaki örnek hesaplamaya dikkat edin:
- Metakrilik asit/DMTMM çözeltisini 20 kDa PEG-MAL/2-aminoetantiol çözeltisi ile beherin içine ekleyin.
- Beherin içine 53.56 μL trietilamin (metakrilik aside 1:1 molar oran) ekleyin ve 300 rpm'de karıştırarak gece boyunca reaksiyona girmesine izin verin. Toz ve diğer kirleticilerin beherin içine girmesini önlemek için beheri folyo ile örtün.
- Eklenecek trietilamin miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya uyun:
- Eklenecek trietilamin miktarı için aşağıdaki örnek hesaplamaya uyun:
- Reaksiyonu yılan derisi diyaliz tüpüne aktarın (moleküler ağırlık kesme: 3.500 Da).
- Diyaliz tüpünü, 300 rpm'de karıştırarak 3 gün boyunca deiyonize (DI) suya (hacim boruyu tamamen kaplamalıdır) 1 M NaCl içeren büyük bir beherin içine yerleştirin. Toplam altı yıkama için 1 M NaCl çözeltisini günde 2 kez değiştirin.
- DI suyunda 6 saat diyaliz. Toplam altı yıkama için DI suyunu her saat başı değiştirin.
- Reaksiyonu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve -80 ° C'de dondurun.
- Tüpü -70 °C başlangıç sıcaklığında ve 0 °C ila 0.01 °C / dak sıcaklık rampasında en az 72 saat boyunca liyofilize edin.
- 700 μL kloroform-d içinde 25 mg MethMAL'ı çözerek ve bir NMR tüpüne aktararak numuneyi 1H-NMR için hazırlayın.
- 1H-NMR spektrumunu edinin.
NOT: Bu protokoldeki spektrumlar, aşağıdaki parametrelere sahip 500 MHz'lik bir spektrometre kullanılarak elde edilmiştir: süpürme genişliği = 6.467,3 Hz, zaman gecikmesi = 13,1 s, edinme süresi = 5,1 s, darbe süresi = 5,1 μs ve tarama sayısı = 8. - Analiz için, maleimid zirvesini referans olarak entegre edin (~ 6.76 ppm) ve ardından iki metakrilamit zirvesini (~ 5.35 ppm ve 5.6 ppm) entegre edin. Metakrilamit pik alanlarının oranını, metakrilamit ile modifiye edilmiş kolların yüzdesini elde etmek için her üç zirvenin toplam alanına bölün.
NOT: Kabul edilebilir bir değişiklik,% 67-75 metakrilamit fonksiyonel grup ikamesidir. MethMAL için örnek 1 H-NMR spektrumu Şekil 1'de gösterilmiştir.- İkame denkleminin derecesi olarak denklem (1) kullanın:
(1)
- İkame denkleminin derecesi olarak denklem (1) kullanın:
(1)
Resim 1: MethMAL'ın kimyasal yapısı ve 1adet H-NMR spektrumu. (A) Kimyasal yapı: MethMAL tavlama makromeri, üç metakrilamit kolu ile modifiye edilmiş 20 kDa 4 kollu poli (etilen glikol) 'den oluşur. (B) Bu yapı, PEG-MAL spektrumlarında bulunmayan 5.36 ppm (3) ve 5.76 ppm'de (2) pikler ve 6.71 ppm'de (1) bir tepe oluşturan bir maleimide kolu üretir. Çözücü, kloroform, 7.26 ppm'de bir tepe noktası üretti ve bu numunedeki artık su, 2.2 ppm'de (spektrumlarda etiketlenmiş) bir tepe noktası oluşturdu. MethMAL spektrumlarında, maleimide zirvesi 0.27'lik bir entegre alana sahipti ve metakrilatit zirve alanlarının toplamı 0.73 (0.37 + 0.36) idi. Metakrilamit yüzdesi modifikasyonu% 73 idi (0.73 / (0.27 + 0.73)). Bu rakam Pfaff ve ark.14'ten alınmıştır. Telif Hakkı (2021) Amerikan Kimya Derneği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
2. Mikrojel öncü jelasyon kinetiği
NOT: Jelasyon süresi, jel öncü bileşenlerini çözmek için kullanılan tamponun pH'ı ayarlanarak değiştirilebilir. PEG-maleimid hidrojelleri için, daha asidik bir pH tipik olarak daha yavaş jelasyon süresine karşılık gelir, çünkü tiyolat konsantrasyonu daha düşük pH15'te azalır.
- İstenilen polimer, çapraz bağlayıcı ve diğer jel öncü bileşenlerinin (yani peptitler, glikozaminoglikanlar) konsantrasyonlarını önceden belirleyin. PEG-MAL, RGD ve MethMAL'ı (PEG-omurga) 10x PBS'de (pH 1.5) ve MMP-2 çapraz bağlayıcıyı 1x PBS'de (pH 7.4) çözün.
NOT: Bu protokolde, jel öncü çözeltisi, 45.88 mg / mL 4 kollu PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg / mL RGD, 8.06 mg / mL MethMAL ve 4.62 mg / mL MMP-2 çapraz bağlayıcıdan (enzimatik olarak parçalanabilir çapraz bağlayıcı) oluşan yayınlanmış bir formülasyon3'tür. - 0,4 mm'lik bir boşluk boyutu, 1,0'lık bir kesme gerinimi, 1,0 Hz'lik bir frekans ve 10.800 s'lik bir süre kullanarak depolama ve kayıp modüllerini izlemek için bir viskozimetre veya eşdeğer bir cihaz hazırlayın.
- 35 mm plakalı rotor (P35/Ti) geometrisini takın. Nemlendirilmiş bir ortamı korumak için geometrinin etrafında nemlendirilmiş bir oda veya nemli bir sünger kullanın.
- PEG omurgasını ve MMP çapraz bağlayıcıyı 1:1 hacimsel oranda karıştırın.
- Pipet, viskozimetre aşamasının ortasına jel öncü çözeltisinin 400 μL'sidir.
- Geometriyi, önceden belirlenmiş 0,4 mm'lik boşluk boyutuna ulaşana kadar yavaşça sahneye indirin ve hemen oda sıcaklığında 6 saate kadar depolama (G') ve kayıp (G'') modüllerini izlemeye başlayın.
NOT: Jelasyonun, depolama modülü kayıp modülünden daha büyük hale geldiğinde başladığı ve jelasyonun depolama modülü platoları olduğunda tamamlandığı kabul edilir. Temsili bir jelasyon kinetik eğrisi Şekil 2'de gösterilmiştir.
Şekil 2: Bir viskozimetre tarafından belirlenen bir MAP jel öncü çözeltisinin (pH 4.5) jelasyon kinetiğinin temsili eğrisi. Jelasyon, depolama (G') modülündeki hızlı artışta başlar ve G' eğrisi platoları olduğunda jelleşme tamamlanır. G'' kayıp modülünü gösterir. Bu rakam Pruett ve ark.3'ten alınmıştır. Telif Hakkı (2021) Wiley-VCH GmBH. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
3. Mikroakışkan cihaz imalatı
NOT: Bu protokol, Şekil 3A'da görülebilen de Rutte ve ark.13'ten uyarlanmış bir mikroakışkan adım emülsifikasyon cihazı tasarımının cihaz üretimini açıklamaktadır. Bununla birlikte, bu protokol bir SU-8 gofrete kazınmış herhangi bir cihaz tasarımıyla kullanılabilir. Üretim için uygun temiz oda tesisleri mevcut olmadığı sürece, SU-8 silikon gofret ana imalatının dış kaynak kullanımı önerilir.
- SU-8 gofret fotomaskesinden ilk polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan cihazını oluşturun.
- Baz ve kürleme maddesini 10:1 w/w oranında karıştırarak ~200 g PDMS hazırlayın ( bkz.
- SU-8 gofreti, mikroakışkan tasarım yukarı bakacak şekilde bir kültür kabına yerleştirin (gofretin kenarlarını tabağa bantlayın).
- Gofret üzerinde 1-1,5 cm kalınlığında bir tabaka oluşturmak için PDMS'yi kabın içine dökün. Herhangi bir kabarcığı çıkarmak için çanağı vakum altına yerleştirin.
- PDMS'nin katılaşana kadar sertleşmesine izin verin (oda sıcaklığında 24 saat veya 60 ° C'de ~ 2 saat).
- PDMS kürlendikten sonra, PDMS boyunca bir dikdörtgeni kesmek için dikkatlice bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın, böylece gofret üzerindeki tasarımın etrafında 0,5-1 cm'lik bir boşluk vardır.
NOT: Çok fazla basınç kullanmayın ve gofrete zarar vermemek (ör. çatlama, çizilme) önlemek için çok nazik olun. - Bir spatula'yı kesiklerden birine sıkıştırın ve PDMS'yi gofretten ayırmak için kesimler boyunca kaydırın.
NOT: PDMS gofretten ayrıldıkça, PDMS'nin altında bir hava kabarcığı oluşmaya başlayacaktır ( bkz. Şekil 3B). - PDMS dikdörtgenini yavaşça çanaktan çıkarmak için spatulayı kullanın.
NOT: Gofret üzerindeki PDMS'de ortaya çıkan boşluk, mikroakışkan cihazların kalıbı olacaktır.
- SU-8 gofret fotomaskesinden sonraki PDMS mikroakışkan aygıtları oluşturun.
- Baz ve kürleme maddesini 10: 1 oranında karıştırarak kalıp başına ~ 15-20 g PDMS hazırlayın.
- Gofretin üzerinde 5 mm'lik bir PDMS tabakası oluşturmak için PDMS'yi kalıptaki dikdörtgen boşluğa dökün. Herhangi bir kabarcığı çıkarmak için kalıbı vakum altına alın.
- PDMS'nin tamamen katılaşana kadar sertleşmesine izin verin (oda sıcaklığında 24 saat veya 60 ° C'de 2 saat).
- PDMS kürlendikten sonra, PDMS'yi dikdörtgenin kenarlarından kesmek için bir tıraş bıçağı veya neşter kullanın.
NOT: Çok fazla basınç kullanmayın ve gofrete zarar vermemek (yani çatlamak) için çok nazik olun. - Bir spatula'yı kesiklerden birine sıkıştırın ve PDMS'yi gofretten ayırmak için kesimler boyunca kaydırın.
NOT: PDMS gofretten ayrıldıkça, PDMS altında bir hava kabarcığı oluşmaya başlayacaktır. - İki giriş ve çıkışta PDMS dikdörtgeni boyunca delikler oluşturmak için 1,5 mm'lik bir biyopsi zımba kullanın ( bkz. Şekil 3B).
- Tek bir gofret üzerinde birden fazla cihaz varsa, PDMS'yi her cihaz arasında hafifçe puanlamak için bir spatula veya tıraş bıçağı kullanın, ardından PDMS'yi puanlanan çizgiler boyunca yavaşça katlayın, böylece PDMS kendi başına çok temiz bir şekilde ayrılır.
- PDMS aygıtlarını tozsuz bir kapta saklayın.
- PDMS mikroakışkan cihazlarını cam slaytlara bağlayın.
- PDMS mikroakışkan cihazı başına bir cam slayt hazırlayın. Slayttaki tozları temizlemek için bant, filtrelenmiş hava veya izopropil alkol (IPA) yıkamaları kullanın. Bir sonraki adıma geçmeden önce slaytların tamamen kuru olduğundan emin olun.
- Küçük bir plastik tepsiye yan yana bir cam slayt ve bir PDMS cihazı yerleştirin (96 delikli bir plaka kapağı bunun için iyi çalışır) ve bir plazma temizleyiciye yerleştirin. Kapıyı ve hava akış valfini kapatın ve vakum pompasını açın. En az 30 saniye çalışmasına izin verin, ardından kapatın.
- Oksijen tankı gaz tüpünü hava akış valfine bağlayın. Plazma odasının 30 saniye boyunca oksijenle dolmasına izin verin, ardından oksijeni kapatın ve hava akış valfini kapatın.
- Vakum pompasını açın ve radyofrekans (RF) seviyesini yüksek olarak ayarlayın. Oda mor-pembe bir renge dönene kadar bekleyin ( Şekil 3B'ye bakın). 30 sn geçmesine izin verin.
- Zamanlayıcı söndüğünde, plazmayı kapatın ve vakumlayın. Ardından, vakumu serbest bırakmak için hava akış valfini yavaşça açın. Tepsiyi plazma temizleyiciden çıkarın.
- PDMS cihazını yapıştırmak için yavaşça cam kızağın üzerine çevirin. Yapıştırma gerçekleştikçe, PDMS'nin şeffaflığındaki küçük farkı gözlemleyin.
NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, yapıştırılmış cihazları kullanımdan hemen öncesine kadar 60 °C'de saklayın.
- PDMS mikroakışkan cihazlarının yüzey işlemesi
- Novec yağında PFOCTS (trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan) seyrelterek yüzey işlemini hazırlayın (1:50). 3-4 cihaz için 1 mL kullanın. Hacmi 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve 25 G'lik bir iğne takın.
NOT: Bu protokolde kullanılan iğneler eğimlidir, bu nedenle keskinlikleri kullanırken dikkatli olun. İstenirse künt iğneler de kullanılabilir. - Tedavi edilecek cihaz başına 10-12 cm'lik bir Tygon boru parçası kesin.
- ~ 7 cm uzunluğunda bir parça PEEK borusu kesin. İğnenin Tygon boru girişlerini delmesini önlemeye yardımcı olmak için Şekil 4A'da gösterildiği gibi Tygon borusunun ucuna birkaç milimetrelik PEEK borusu yerleştirin.
- Cihazları ısıtılmış odadan çıkarın ve Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu sulu giriş deliğine yerleştirin.
- Yüzey işleme şırıngasının iğnesini PEEK borusuna yerleştirin ve yağ odası çıkış deliğini örtün ( Şekil 3B'ye bakınız).
- Tedaviyi cihaza yavaşça enjekte edin ve kabarcıklar olmadan cihazı doldurduğundan emin olun. Önce sulu odaların dolmasını, ardından daha küçük kanalların ve ardından yağ odasının dolmasını bekleyin. Tygon borusunu cihazdan çıkarın. Cihaz doldurulduktan sonra, oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin.
- 5 mL'lik bir şırıngayı sadece yağ ile doldurun (silan içermez) ve 25 G'lik bir iğne takın.
- Yüzey işlemini cihazdan giriş ve çıkıştan aspire edin. Tygon borusunu sulu girişe yerleştirin, şırıngayı PEEK borusuna yağ ile yerleştirin ve her cihazı yağ ile yıkayın. Yağı cihazdan aspire edin.
- Yağı yıkayın. 2 kat daha tekrarlayın. Tygon borusunu çıkarın.
NOT: Cihaz kullanıma hazırdır.
- Novec yağında PFOCTS (trikloro(1H,1H,2H,2H-perflorooktil)silan) seyrelterek yüzey işlemini hazırlayın (1:50). 3-4 cihaz için 1 mL kullanın. Hacmi 1 mL'lik bir şırıngaya aktarın ve 25 G'lik bir iğne takın.
Resim 3: Mikroakışkan PDMS cihazı. (A) Mikroakışkan cihaz tasarımının bilgisayar destekli tasarım (AutoCAD) çizimi. Mikrojel damlacık oluşumu, büyütülmüş çıkıntıda görüldüğü gibi, yağ kanalının her iki tarafındaki kanallarda meydana gelir. (B) PDMS cihaz üretimine genel bakış. Kısaltma: PDMS = polidimetilsiloksan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
4. Mikrojellerin mikroakışkan üretimi
- İstenilen polimer, çapraz bağlayıcı ve diğer jel öncü bileşenlerinin (yani peptitler, glikozaminoglikanlar) konsantrasyonlarını önceden belirleyin. PEG-MAL, RGD ve MethMAL'ı (PEG-omurga) 10x PBS'de (pH 1.5) ve MMP-2 çapraz bağlayıcıyı 5 μM biyotin-maleimid ile birlikte 1x PBS'de (pH 7.4) çözün.
NOT: Bu protokolde, jel öncü çözeltisi, 45.88 mg / mL 4 kollu PEG-MAL (10 kDa), 0.82 mg / mL RGD, 8.06 mg / mL MethMAL ve 4.62 mg / mL MMP-2 çapraz bağlayıcıdan (enzimatik olarak parçalanabilir çapraz bağlayıcı) oluşan yayınlanmış bir formülasyon3'tür . Aşağıda özetlenen yöntemler ~ 3 mL mikrojel verecektir. - Novec yağında stok% 5 FloroSürfaktan en az% 1'e seyrelterek 6 mL yüzey aktif madde çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi 10 mL'lik bir şırıngaya ekleyin.
NOT: Florlu yüzey aktif madde su ile karışmaz, bu da saflaştırma adımındaki PBS yıkamaları sırasında jelin sulu faza geçişi sırasında kolayca çıkarılmasını sağlar. - Şırınga pompası yüksekliği için uygun uzunlukta üç parça Tygon borusu kesin.
- İki parça PEEK borusunu ~ 1 inç uzunluğunda kesin. İğnenin Tygon boru girişlerini delmesini önlemeye yardımcı olmak için, Şekil 4A'da gösterildiği gibi iki parça Tygon borusunun ucuna birkaç milimetrelik PEEK borusu yerleştirin.
- Tygon borusunun PEEK olmayan ucunu mikroakışkan cihazların girişlerine yerleştirin. Kalan Tygon boru parçasını (ucunda PEEK borusu olmadan) Şekil 4C'de gösterildiği gibi mikroakışkan cihaz çıkışına yerleştirin.
- 5 mL'lik plastik bir şırıngaya en az 3 mL yağ ekleyin ve 25 G'lik bir iğneye takın. İğneyi Tygon girişlerinden birindeki PEEK borusuna dikkatlice yerleştirin. Boruyu ve cihazı yavaşça yağla yıkayın. Yağı çıkıştan konik bir tüp içinde toplayın. Diğer Tygon girişindeki yağ yıkama işlemini tekrarlayın.
- Şırınga pompalarını istenen akış hızlarına ayarlayın.
NOT: Bu protokol, sulu akış hızı için 3 mL/s ve yağ akış hızı için 6 mL/s kullanır. İki ayrı şırınga pompası kullanılması gerekebilir. - Yüzey aktif maddeyi içeren şırıngayı 25 G'lik bir iğne ile yağ girişine bağlayın ( Şekil 4A'ya bakınız) ve mikroakışkan cihazın borusunu ve yağ kanalını astarlamak için yeterli yağı yavaşça dağıtın.
- Cihaz ve yağ girişleri ayarlandıktan sonra, jel öncüsünü içerecek yeni bir 5 mL şırıngaya 0,5 mL yağ ekleyin. Bu az miktarda yağın amacı, öncü çözeltinin mikrofuilidik cihazdan koşunun sonuna doğru yıkanmasına yardımcı olmaktır.
- Konik bir tüpte, 1,5 mL PEG-omurga çözeltisini ve 1,5 mL'lik çapraz bağlayıcı çözeltisini birleştirin. 30 s için vorteks yapın ve kombine jel öncü çözeltisini 5 mL şırıngaya hızlı bir şekilde aktarın.
- Şırıngayı jel öncü çözeltisi ile 25 G'lik bir iğne ile sulu girişe bağlayın. Boruyu ve sulu kanalı astarlamak için yeterli çözeltiyi yavaşça dağıtın.
- Şırıngaları ilgili şırınga pompalarına kelepçeleyin ve çalıştırmaya basın ( Şekil 4B'ye bakınız). Hem sulu hem de yağ kanallarından sıvı aktığından emin olun.
NOT: PDMS cihazında mikrojel oluşumunu görselleştirmek için mikroskop kullanılması önerilir. - Kanallardan düzgün boyutta parçacıklar arayın ( Şekil 4D'ye bakınız). Mikrojelleri prizden konik bir tüp içinde toplayın.
Şekil 4: Mikroakışkan kurulum . (A) PEEK borusunu (üstte) ve Tygon borusunu bir şırınga (altta) üzerindeki 25 G'lik bir iğneye bağlama yönteminin tasviri. (B) Şırınga pompaları, borular, cihaz ve mikroskop ile mikroakışkan kurulum. (C) İki giriş (sulu ve yağlı) ve bir çıkışlı mikroakışkan cihaz kurulumunun görüntüsü. (D) Mikroakışkan cihazın şeması ve bir adım emülsifikasyon cihazındaki kanallardan beklenen mikrojel oluşumunun temsili parlak alan görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
5. Mikrojellerin saflaştırılması ve sterilizasyonu
- Jelasyon tamamlandıktan sonra (jelasyon kinetiği karakterizasyonunda modül platosunun depolanma süresi olarak belirlenir), yağ fazını tüpün tabanından dikkatlice çıkarmak için bir pipet kullanın ( Şekil 5'e bakınız). Bunu florlu atıklar için uygun bir atık kabına koyun.
NOT: Jelleşme süresi, toplama tüpüne organik çözünür bir baz eklenerek hızlandırılabilir (örneğin, trietilamin), ancak güçlü bir bazın eklenmesinin reaksiyona girmemiş herhangi bir maleimidleri hidrolize edebileceğine dikkat etmek önemlidir. Mikrojellerin jelleşme sonrası aşırı maleimidler yoluyla işlevselleştirilmesi isteniyorsa, trietilamin ilavesini atlayın. - Mikrojel toplama tüpüne 1: 1 oranında daha fazla yağ ekleyin. Toplama tüpünü hafifçe ters çevirerek karıştırın. Girdap yapmayın.
- Fazların ayrılmasına izin vermek için toplama tüpünün ~ 5 dakika boyunca yerleşmesine izin verin. Alttaki yağ fazını ve üstteki sulu fazı (mikrojeller) arayın ( Şekil 5'e bakınız).
- Yağı tekrarlayın en az 2 kat daha fazla yıkayın.
- Jel ile 1:1 oranında daha fazla yağ ekleyin ve 4:1 PBS-jel oranına 1x PBS ekleyin. Birkaç kez karıştırmak için ters çevirin. Katmanları ayırmak için, tüpü ~ 30 s için ~ 2.000 x g'de santrifüj yapın. Tüpün altındaki yağ fazını, ortadaki jeli ve üstteki PBS'yi arayın ( Şekil 5'e bakınız).
- Yağ fazını bir pipetle çıkarın ve bir atık kabına atın.
NOT: PBS'yi çıkarmayın. Orijinal toplama tüpü 15 mL ise yıkamaya devam etmek için daha büyük bir konik tüp kullanın. - Yağı tekrarlayın ve PBS 2 kat daha fazla yıkar. Jelin, Şekil 5'te gösterildiği gibi, yüzey aktif maddenin çıkarıldığını ve jelin PBS fazında olduğunu gösteren son yıkamada opaktan temizlemeye geçmesini bekleyin.
- Tüm yağı çıkarın. PBS'yi konik tüpten çıkarmayın.
- Kimyasal bir davlumbazda, PBS'ye eşit hacimde tüpe hekzan eklemek için bir cam pipet kullanın. Konik tüpü 30 s veya iyice karışana kadar vorteksleyin. 5 dakika boyunca 4.696 x g'de santrifüj.
- Ayırmadan sonra, üst katmanda altıgenler, ortada PBS ve altta jel arayın ( Şekil 5'e bakınız). Hekzan tabakayı çıkarın ve organik atık için bir kaba atın. PBS'yi aspire edin.
- Hekzan tekrarlayın ve PBS en az 2 kat daha fazla veya jel neredeyse yarı saydam görünene kadar yıkar ( Şekil 5'e bakınız). Jeli PBS 1x ile daha fazla yıkayın, böylece kalan altıgenler çıkarılır. 5 dakika boyunca 4.696 x g'de santrifüj. PBS katmanını aspire edin. Jel peleti rahatsız etmemeye dikkat edin.
- Mikrojellerdeki reaksiyona girmemiş herhangi bir maleimidin kapatılması veya söndürülmesi için, 1x PBS'de 100 mM'lik bir N-asetil-L-sistein çözeltisi hazırlayın ve bu çözeltiyi jele ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de bir tüp rotatöre yerleştirin, ardından reaksiyona girmemiş N-asetil-L-sistein'i çıkarmak için PBS ile birçok yıkama yapın.
- Uzun süreli depolama için (1 yıla kadar), mikrojelleri% 70 IPA'da yeniden askıya alın ve mikrojeller üzerinde bakteri üremesini önlemeye yardımcı olmak için 4 ° C'de saklayın.
- Mikrojelleri sterilize etmek için, bir biyogüvenlik başlığında jele 4: 1 v / v oranında% 70 IPA ekleyin. Tüpü 30 sn boyunca vorteksleyin, ardından 5 dakika boyunca 4.696 × g'de santrifüj yapın. IPA süpernatantını bir biyogüvenlik başlığındaki jel peletten aspire edin. 2 kat daha fazla IPA yıkama ve ardından steril 1x PBS ile 3 kat yıkama gerçekleştirin.
NOT: Jeli hücrelerle veya hayvanlarla kullanmadan önce tüm IPA'lar çıkarılmalıdır.
Şekil 5: Mikrojel saflaştırma prosedürüne genel bakış. Kısaltmalar: PBS = fosfat tamponlu salin; IPA = izopropil alkol. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
6. Mikrojel boyutu karakterizasyonu
NOT: Mikrojel parçacıklarının, boyutlandırmadan önce son çaplarına şişmeleri için 37 ° C'de gece boyunca 1x PBS'de dengelenmesine izin verilmesi önerilir.
- Görüntü jel parçacıkları.
- MAP jelini 5 dakika boyunca 4.696 × g'de döndürün ve süpernatanı aspire edin.
- Pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak, jel peletinden 5 μL mikrojel çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpünde 1 mL PBS içinde seyreltin (1:200 seyreltme). Bu seyreltmeyi gerektiği gibi ayarlayın.
NOT: Jel öncü çözeltisinin formülasyonu sırasında, 5 μM biyotin-maleimid eklenebilir ve mikrojellerin bir florofor ile etiketlenmesine alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, 1:300 seyreltmede (1 mg / mL stoktan) bir streptavidin-florofor eklenebilir. Görüntülemeden önce streptavidin ile inkübasyona en az 15 dakika izin verin. - Pozitif yer değiştirmeli pipet kullanarak, seyreltilmiş mikrojellerin 100 μL'sini şeffaf bir 96 delikli plakanın kuyucuklarına aktarın.
- Mikrojelleri 10x hedefle görselleştirmek için geniş alan veya konfokal mikroskop kullanın. Analiz için mikrojellerin görüntülerini elde edin.
- Mikrojellerin temsili konfokal görüntüleri için Şekil 6'ya bakınız.
- ImageJ ile parçacıkları boyutlandırma
- Görüntü dosyalarını mikroskoptan ImageJ'de açın.
- | Analiz Et'i seçin Ölçekle'yi ayarlayın ve görüntü ölçeğini mikroskop hedefine göre ayarlayın.
- Görüntü | Tip | 8 bit.
- Görüntü | | ayarlama Eşik değerini belirleyin ve ardından açılır kutudan "Otsu" otomatik eşik seçeneğini belirleyin.
- | Analiz Et'e tıklayın Ölçümler'i ayarlayın ve Feret'in Çapı'nı seçin ve eşikle sınırlayın.
- | Analiz Et'e tıklayın Parçacıkları analiz edin ve mikrojeller için beklenen alan boyutu aralığını (piksel ^ 2 cinsinden) girin (küçük kalıntıların analiz edilmesini engellemek için). Döngüselliği 0,75-1,00 olarak değiştirin ve | göster'i seçin Ana hatlar. Ekran sonuçlarını işaretleyin ve kenarlarda hariç tutun.
NOT: Dairesellik şekli filtresi, görüntü kenarlığında yanlış çap ölçümü yapılmasına neden olabilecek mikrojelleri hariç tutar. - Parçacıkları Analiz Et modülünü çalıştırın.
- Her parçacığın Feret'in çapı olan çıktıyı bekleyin ve bu sonuçları bir elektronik tabloya aktarın.
- Bu protokolde, mikrojel boyutundaki heterojenliği belirlemek için polidispersite indeksini (PDI) hesaplayın. Bir popülasyonu tanımlamak için en az 100 mikrojeli analiz edin: 1.00-1.05'lik bir PDI aralığı monodispers bir popülasyonu tanımlar ve 1.05'ten büyük bir PDI polidispers popülasyonu tanımlar. Aşağıda açıklandığı gibi PDI'yı hesaplamak için denklem (2), denklem (3) ve denklem (4) kullanın.
(2)
(3)
(4)
(2)
(3)
(4)
Şekil 6: Mikrojellerin temsili görüntüleri. (A) Mikrojel popülasyonu A'nın floresan konfokal görüntüsü, (B) eşikli mikrojellerin görüntüsü ve (C) ImageJ analizinden sonra parçacık ana hatları. (D) Mikrojel popülasyonu B'nin floresan konfokal görüntüsü ve (E) mikrojellerin iletilen ışık görüntüsü (mikrojeller neredeyse yarı saydamdır). (F) Bu protokolde özetlenen ImageJ analizinden elde edilen temsili sonuçların tasviri. Her iki mikrojel popülasyonu da nispeten monodispers PDI'lara sahiptir. Her iki mikrojel popülasyonu da 3 mL / s sulu akış hızı ve 6 mL / s yağ akış hızı ile sentezlendi. Bununla birlikte, mikrojel boyutundaki fark, mikroakışkan cihaz adım boyutundaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Örneğin, mikrojel popülasyonu A, kanal adım boyutu 11 μm olan mikroakışkan bir cihazla sentezlendi ve mikrojel popülasyonu B, 40 μm adım boyutuna sahip bir cihazda sentezlendi. Ölçek çubukları = 100 μm. Kısaltma: PDI = polidispersite indeksi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
7. Mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) iskele tavlama
- 1x PBS'de (pH 7.4) 2 mM lityum fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat (LAP) stok çözeltisi oluşturun.
- LAP stok çözeltisini, jel hacmine eşdeğer 1x PBS hacminde 0,2 mM'ye kadar seyreltin. LAP fotobaşlatıcıyı hücre çalışmaları veya hayvan çalışmaları için kullanıyorsanız, kullanmadan önce çözeltiyi sterilize ettiğinizden emin olun.
- MAP jelini 5 dakika boyunca 4.696 × g'da döndürün ve süpernatanı aspire edin.
- Pozitif deplasmanlı pipet kullanarak, istenen miktarda jeli bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Jele 1:1 hacimsel oranda 0,2 mM LAP ekleyin (nihai LAP konsantrasyonu 0,1 mM'dir).
- Karışımı vorteks edin ve karanlıkta en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Jeli peletlemek için karışımı 18.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Süpernatantı jel peletinden dikkatlice çıkarın.
- MAP jelini pozitif deplasmanlı pipetle hedef konuma aktarın.
- İskeleyi tavlamak için numuneye 113 sn boyunca odaklanmış ışık (365 nm, 8,66mW/cm2) uygulayın.
NOT: 113 sn'lik tavlama süresi, daha önce yayınlandığı gibi 0,1 mM14'lük LAP konsantrasyonu için optimize edilmiştir, ancak farklı fotobaşlatıcı konsantrasyonları için ek optimizasyon gerekebilir.
Resim 7: MAP iskele tavlama. (A) MAP iskele tavlama şeması. Bir fotobaşlatıcıya ve ışığa maruz kaldığında, MethMAL makromeri üzerindeki metakrilatid fonksiyonel grupları, mikrojellerin yüzeylerini birbirine bağlayan bir tıklama fotopolimerizasyon reaksiyonuna uğrar. (B) Gözeneklerde dextran (kırmızı) ile 3D kalıp şeklinde bir araya getirilmiş MAP mikrojellerinin (yeşil) iki fotonlu mikroskop görüntüsünün 3D render'ının (Imaris) tasviri. (C) Floresan 70 kDa dekstran (kırmızı) ile perfüze edilmiş bir MAP iskelesinin gözenekliliğini gösteren iki fotonlu mikroskop görüntüsünün 3D görüntüsünün (Imaris) tasviri. Ölçek çubukları = (B) 100 μm, (C) 70 μm. Kısaltmalar: MAP = mikro gözenekli tavlanmış parçacık; MethMAL = özel tavlama makromeri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Representative Results
Bu protokolün amacı, bir MAP iskelesinde kullanılacak mikrojel yapı taşlarının sentezlenmesi için gerekli tüm adımları özetlemektir. MethMAL tavlama makromeri oldukça seçici ve verimlidir ve çoklu polimer omurgalarla uyumludur14. Yüksek tavlama verimliliği sağlamak için 20 kDa PEG-maleimidin en az% 67-75'inin metakrilamit fonksiyonel grupları ile modifiye edilmesi önemlidir. Yüzde modifikasyonu, Şekil 1'de gösterildiği gibi 1H-NMR spektrum zirvesini analiz ederek en kolay şekilde belirlenebilir. Bir viskozimetre ile belirlenen jelasyon kinetiği, her jel formülasyonu için dikkate alınması gereken önemli bir metriktir. Bu protokol, mikrojel jelasyonu için tiol işlevselleştirilmiş çapraz bağlayıcılarla verimli bir şekilde reaksiyona giren bir MAL grubuna sahip bir PEG omurgasından oluşan bir jel öncü çözeltisi kullanır. Bununla birlikte, burada açıklanan yüksek verimli mikroakışkan yöntemi ile mikrojelleri üretmek için birçok hidrojel kimyası kullanılabilir. Jelleşmenin başlama zamanı, mikroakışkan mikrojel üretiminin süresi hakkında fikir verecektir. 30 dakika (Şekil 2) ile 2 saat arasında jelleşmeyi başlatabilen bir jel öncüsü pH seçilmesi önerilir.
Jelleşme süresi çok hızlıysa, jel öncü çözeltisi mikroakışkan cihaz içinde polimerize olmaya başlayacak ve kanalları tıkayacaktır. Ek olarak, değişen tiyollenmiş ligand konsantrasyonlarının (örneğin, RGD) jelasyon sırasında ağ oluşumu üzerinde etkileri olabileceğini ve formülasyonun ayarlanmasıyla hesaba katılması gerekebileceğini belirtmek önemlidir. Mikroakışkan cihaz üretim adımları sıkıcı olabilir, ancak başarılı bir şekilde bağlanmış bir cihazın temsili sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu protokol, de Rutte ve ark.13 tarafından yapılan bir tasarımdan uyarlanan yüksek verimli, paralelleştirilmiş, kademeli emülsifikasyonlu bir mikroakışkan cihaz kullanır ve silikon gofret üretimi bir mikroakışkan teknoloji şirketine dış kaynak olarak sağlanmıştır. Bununla birlikte, bu protokolde özetlenen adımlar, SU-8 silikon gofret fotomaskesi üzerine kazınmış herhangi bir cihaz tasarımıyla kullanılabilir. Fotomaske üzerindeki kanalların adım boyutunun, mikrojel parçacıklarının boyutunu etkileyeceğinden, cihaz üretimi sırasında optimize edilmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
Mikrojellerin mikroakışkan üretimi için akış hızları, jelasyon süresi, istenen partikül boyutu ve mikroakışkan cihaz tasarımı gibi faktörlere dayanarak her jel formülasyonu için optimize edilmelidir. Yüksek verimli cihaz kullanılıyorsa, sulu faz için akış hızları 5 mL/s'ye kadar çıkabilir. Şekil 4B, bu protokolde kullanılan yüksek verimli cihazların kurulumunu gösterir. Cihaz doğru çalışıyorsa, mikrojel oluşumu Şekil 4D'de gösterilene benzer görünmelidir. Saflaştırmadan önce, mikrojeller opak olacaktır. Çeşitli yağ, PBS ve hekzan yıkamalarını tamamladıktan sonra, jel Şekil 5'teki temsili görüntü gibi net görünmelidir. Mikrojellere bir florofor dahil edilirse, saflaştırılmış ürün hafif renkli bir renk tonuna sahip olabilir, ancak yine de yarı saydamlığa yakın olmalıdır. Saflaştırma ve şişmeden sonra, mikrojeller boyut olarak çok düzgün olmalı ve Şekil 6'da gösterildiği gibi 1.00 ila 1.05 arasında bir PDI'ya sahip olmalıdır. MAP iskelelerinin fototavlanması için çeşitli foto-başlatıcılar kullanılabilir. Burada açıklanan LAP'a bir alternatif kullanılıyorsa, daha önce tarif edildiği gibi tavlama kinetiğibelirlenmelidir 14. Ek olarak, ışık kaynağı fotobaşlatıcıya karşılık geldiği sürece fototavlama için çeşitli ışık kaynakları kullanılabilir. Işık kaynağını kalibre ettiğinizden ve odakladığınızdan emin olunmalıdır. Tavlama süresi ve ışık yoğunluğunun, jel formülasyonuna ve fotobaşlatıcı konsantrasyonuna göre optimize edilmesi gerekebilir. Bu protokolde özetlenen tavlama yöntemi, in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılabilir. Tavlamadan sonra, mikrojeller iki foton mikroskobu ile görselleştirilebilen gözenekli bir iskele oluşturacaktır (Şekil 7B-C).
Discussion
Bu protokol, mikro gözenekli tavlanmış parçacık (MAP) iskeleleri için yapı taşları görevi gören mikrojellerin sentezlenmesi ve karakterize edilmesi için yöntemleri açıklar. Bu protokol, akış odaklı mikroakışkanlar 1,4,7,9 (yüksek monodisperisti, düşük verim), parti emülsiyonu 6,10 ve elektropüskürtme 5,12 gibi diğer yöntemlerle elde edilemeyen büyük miktarlarda tekdüze mikrojeller üretmek için yüksek verimli bir mikroakışkan yaklaşım kullanır. (düşük monodispersite, yüksek verim). Burada açıklanan yöntemlerle, monodisperse mikrojeller, çeşitli rejeneratif tıp uygulamaları (örneğin, hücre teslimi, yara iyileşmesi) için kullanılabilecek MAP iskelelerinde kullanılmak üzere yapılabilir.
Bu protokolün kritik bir adımı, PDMS mikroakışkan cihazlarının oluşturulmasıdır. Cihazlar doğru şekilde yapılmazsa, bunun mikrojel oluşumu ve monodispersite üzerinde olumsuz aşağı yönlü etkileri olabilir. Yükselmeden önce artefaktların (yani kabarcıkların, tozların) PDMS'ye girmesini önlemek önemlidir, çünkü bu kanalları tıkayabilir ve mikrojel oluşumunu önemli ölçüde etkileyebilir. Bunu mümkün olduğunca azaltmak için, herhangi bir tozu çıkarmak için bant kullanılmalı, cihazları tozsuz bir kapta saklamalı ve mümkünse tozsuz bir davlumbazda çalışmalıdır. Yüzey işleminde en iyi sonuçları elde etmek için cihazların 60 °C'de saklanması da önerilir.
PDMS cihazlarını dökerken, biyopsi zımbasının uzunluğuna eşit veya daha az olan düzgün bir kalınlığın korunması önemlidir. Cihaz çok kalınsa, biyopsi punch tüm yol boyunca nüfuz edemez. Biyopsi zımba ve / veya tüp yerleştirirken PDMS cihazı girişlerini / çıkışını yırtmamak da çok önemlidir. PDMS cihazındaki bir yırtılma, girişlerden/çıkıştan sızıntıya neden olur ve bu da jel öncü çözeltisinin kaybına neden olabilir. Bir PDMS cihazında sızıntı varsa, en iyi çözüm mümkün olan en kısa sürede yeni bir cihazla değiştirmektir.
Cihazı plazma ile işlemden geçirirken, 30 s için saf oksijen ve plazma muamelesi kullanımı, PDMS'yi cam kızağa yapıştırmak için en iyi sonuçları vermiştir. Cihaz doğru şekilde bağlanmazsa (yani, PDMS plazma işleminden sonra hala cam slayttan kaldırılabilir), plazma tedavi cihazının doğru çalıştığını ve cihazın ve slaytların iyice temizlenip temizlenmediğini iki kez kontrol etmelidir. Doğru silan yüzey işleminin kullanılması da önemlidir ve en iyi sonuç için PDMS cihazları kullanımdan hemen önce yüzey işlemine tabi tutulmalıdır. Kimyasal buhar biriktirme gibi diğer yüzey işleme yöntemleri de kullanılabilir.
Bir diğer önemli adım ise mikrojel oluşumu için PDMS mikroakışkan cihazlarının doğru kullanılmasıdır. En az 2: 1'lik bir akış hızı oranı kullanılması önerilir (bu protokol 6 mL / s yağ akış hızı ve 3 mL / s sulu akış hızı kullanır), ancak bu istenen mikrojel boyutunu elde etmek için ayarlanabilir. Mikrojel öncü çözeltisinin pH'ı, cihazın tıkanmasını önlemek için optimize edilmesi gereken önemli bir metriktir. Fosfat tamponlu salin (PBS), Michael tipi ilave kimyada tiyolat oluşumunu hızlandırır ve bu protokolde kullanılan PBS konsantrasyonları, mikroakışkan cihazlarda mikrojelasyon için en iyi sonuçları verir. Şırınga pompaları başlatıldıktan sonra, mikroakışkan kanallarda bazı kabarcıklar olabilir, ancak bu birkaç dakika sonra dengelenmelidir. Mikrojel oluşumunun mikroskopla izlenmesi önerilir. Akış bu videodakine benzemiyorsa ve / veya büyük parçacıklar üreten birkaç kanal varsa, bunun nedeni muhtemelen yüzey işleme adımındaki sorunlardan kaynaklanmaktadır. En iyi çözüm, cihazı taze yüzey işlemden geçirilmiş bir cihazla değiştirmektir.
Mikrojeller birleşiyor gibi görünüyorsa, bunun nedeni yetersiz FloroSürfaktan konsantrasyonu olabilir. Önerilen çözüm, yağ fazındaki yüzey aktif maddenin ağırlıkça% 'sini arttırmaktır. Bununla birlikte, yüksek konsantrasyonlarda yüzey aktif madde kullanmanın bir sınırlaması, saflaştırma adımı sırasında çıkarılmasının daha zor olabileceğidir. Mikroakışkan cihazların yalnızca bir kez kullanılması önerilir, ancak cihazdaki jelleşebilecek ve kanalları tıkayabilecek sulu çözeltileri gidermek için kullanımdan hemen sonra Novec yağı ile yıkanırsa cihazlar tekrar kullanılabilir. Bir mikroakışkan cihaz yüksek verimli bir mikrojel hacmi (mL / s) üretebilirken, bu üretim hızı paralel olarak birden fazla mikroakışkan cihaz kullanılarak ölçeklendirilebilir.
MAP iskele tertibatının tavlama adımı, radikal polimerizasyonun ışıkla aktive edilmiş bir fotobaşlatıcısının kullanımına dayanır ve fotobaşlatıcı, istenen uygulamaya göre seçilebilir. Örneğin, LAP fotobaşlatıcı, in vitro14 hücre canlılığı üzerinde minimum etkiye sahip olan uzun dalga UV ışığı kullanıldığında hızlı tavlama sürelerine (<30 s) sahiptir. Bununla birlikte, bu dalga boyu doku16 tarafından yüksek oranda emilir ve in vitro kadar in vivo tavlama etkinliğine sahip olmayabilir.
Eosin Y, görünür dalga boyları (505 nm) tarafından aktive edilen başka bir fotobaşlatıcıdır ve dokuya daha derin nüfuz eder, bu da MAP iskelesinin doku altında tavlanma yeteneğini arttırır. Bununla birlikte, Eozin Y tavlaması için gereken uzun ışığa maruz kalma süreleri, serbest radikallere hücre maruziyetini uzatabilir ve in vitro14 hücre canlılığını etkileyebilir. Bu yöntemlerin yüksek oranda homojen mikrojel yapı taşlarının yüksek verimli üretimi için kullanılması, MAP iskelesi odaklı araştırmaları hızlandıracak ve rejeneratif tıp için enjekte edilebilir gözenekli malzemeler alanındaki bilgileri ilerletecektir.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazarlar, Joe de Rutte'ye ve Los Angeles'taki Kaliforniya Üniversitesi'ndeki Di Carlo Laboratuvarı'na, rapor edilen cihazın geliştirildiği orijinal mikroakışkan cihaz tasarımına ve PDMS cihaz üretimi ve sorun giderme konusundaki erken rehberliklerine ilişkin yardımları için teşekkür etmek istiyor. Şekil şemaları Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
| 35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
| 4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
| 4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
| BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
| Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
| Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
| Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
| Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
| DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
| Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
| FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
| HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
| ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
| KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
| LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
| Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
| Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
| MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
| Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
| Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
| Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
| Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
| PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
| Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
| Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
| Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
| Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
| Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
| Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
| Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
| Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |
References
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Koh, J., et al. Enhanced in vivo delivery of stem cells using microporous annealed particle scaffolds. Small. 15 (39), 1903147 (2019).
- Pruett, L. J., Jenkins, C. H., Singh, N. S., Catallo, K. J., Griffin, D. R. Heparin microislands in microporous annealed particle scaffolds for accelerated diabetic wound healing. Advanced Functional Materials. 31 (35), 2104337 (2021).
- Darling, N. J., Sideris, E., Hamada, N., Carmichael, S. T., Segura, T. Injectable and spatially patterned microporous annealed particle (MAP) hydrogels for tissue repair applications. Advanced Science. 5 (11), 1801046 (2018).
- Isaac, A., et al. Microporous bio-orthogonally annealed particle hydrogels for tissue engineering and regenerative medicine. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (12), 6395-6404 (2019).
- Pruett, L., et al. Development of a microporous annealed particle hydrogel for long-term vocal fold augmentation. Laryngoscope. 130 (10), 2432-2441 (2020).
- Nih, L. R., Sideris, E., Carmichael, S. T., Segura, T. Injection of microporous annealing particle (MAP) hydrogels in the stroke cavity reduces gliosis and inflammation and promotes NPC migration to the lesion. Advanced Materials. 29 (32), (2017).
- Griffin, D. R., et al. Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing. Nature Materials. 20 (4), 560-569 (2021).
- Sideris, E., et al. Particle hydrogels based on hyaluronic acid building blocks. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (11), 2034-2041 (2016).
- Schaeffer, C., et al. Injectable microannealed porous scaffold for articular cartilage regeneration. Annals of Plastic Surgery. 84, 6S Suppl 5 446-450 (2020).
- Pruett, L., Ellis, R., McDermott, M., Roosa, C., Griffin, D. Spatially heterogeneous epidermal growth factor release from microporous annealed particle (MAP) hydrogel for improved wound closure. Journal of Materials Chemistry B. 9 (35), 7132-7139 (2021).
- Jivan, F., Alge, D. L. Bio-orthogonal, site-selective conjugation of recombinant proteins to microporous annealed particle hydrogels for tissue engineering. Advanced Therapeutics. 3 (1), 1900148 (2020).
- de Rutte, J. M., Koh, J., di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Pfaff, B. N., et al. Selective and improved photoannealing of microporous annealed particle (MAP) scaffolds. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (2), 422-427 (2021).
- Darling, N. J., Hung, Y. S., Sharma, S., Segura, T. Controlling the kinetics of thiol-maleimide Michael-type addition gelation kinetics for the generation of homogenous poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomaterials. 101, 199-206 (2016).
- Sandell, J. L., Zhu, T. C. A review of in-vivo optical properties of human tissues and its impact on PDT. Journal of Biophotonics. 4 (11-12), 773-787 (2011).
