Medicine

标准化大鼠冠状动脉环制备及实时记录血管直径动态张力变化

Published: June 16, 2022 doi: 10.3791/64121

Pengmei Guo*¹, Wenqiao An*², Ying Guo¹, Zhihao Sun², Xiaobo Wang^1,3, Sanyin Zhang^1,3

¹Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ²School of Basic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, ³Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Summary

本方案描述了用于测量大鼠冠状动脉血管反应性的线肌图技术。

Abstract

冠状动脉疾病（CAD）作为心血管系统疾病的重要事件，被广泛认为是动脉粥样硬化、心肌梗塞、心绞痛等严重威胁全世界人民生命和健康的罪魁祸首。然而，如何记录孤立血管的动态生物力学特征，长期以来一直困扰着人们。同时，精确定位和分离冠状动脉以测量体外动态血管张力变化已成为CAD药物开发的趋势。本方案描述了大鼠冠状动脉的宏观鉴定和微观分离。使用已建立的多肌图系统监测冠状动脉环沿血管直径的收缩和扩张功能。冠状动脉环张力测量的标准化和编程方案，从采样到数据采集，极大地提高了实验数据的可重复性，保证了生理、病理和药物干预后血管张力记录的真实性。

Introduction

冠状动脉疾病（CAD）已被广泛认为和关注为一种典型和具有代表性的心血管疾病，是发达国家和发展中国家的主要死因¹^，²。作为正常心脏生理功能的血液和氧气供应途径，循环血液通过心肌表面的两个主要冠状动脉和血血管网络³^，⁴进入并滋养心脏。冠状动脉中的胆固醇和脂肪沉积物切断了心脏的血液供应和血管系统的剧烈炎症反应，导致动脉粥样硬化，稳定型心绞痛，不稳定型心绞痛，心肌梗塞或心源性猝死⁵^，⁶。响应冠状动脉的病理性狭窄，代偿性加速生理心跳通过增加左心室⁷的输出来满足心脏本身或身体重要器官的血液供应。如果长时间的冠状动脉狭窄不能及时缓解，心脏的某些区域可能会出现广泛的新血管⁸。目前，CAD的临床治疗往往采用药物溶栓或手术机械溶栓和外源性仿生血管旁路，用药频繁，手术残疾很大⁹.因此，冠状动脉功能研究生理活动仍是心血管疾病¹⁰项的急需突破口。

除了无线遥测系统，没有可用的技术手段来检测冠状动脉生理活动，它可以动态记录体内冠状动脉压力，血管张力，血氧饱和度和pH值¹¹。因此，考虑到冠状动脉的质地隐秘性和复杂性，冠状动脉的准确识别和分离无疑是探索CAD 体外⁴多种机制的最佳选择。

一系列多肌图系统，特别是线材显微照片微血管张力检测仪（见 材料表），是一种非常成熟的市场化设备，用于记录小血管、淋巴管和支气管的体外组织张力变化，具有高精度和连续动态记录¹²的特点。该系统已被广泛用于记录直径为60μm至10mm的腔体结构的体外组织张力特性。线材显微照片平台的连续加热特性在很大程度上抵消了对不利外部环境的刺激。同时，气体混合物的恒定输入和pH值使我们能够在相似的生理状态下获得更准确的血管张力数据¹³。然而，考虑到大鼠冠状动脉解剖定位的复杂性（图1），其分离一直令人困惑，并限制了其对多样化心血管疾病和药物开发的机制的探索。因此，本方案详细介绍了大鼠冠状动脉的解剖位置和分离过程，随后在钢丝显微照片¹⁴的平台上进行张力测量。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

该动物方案由成都中医药大学管理委员会审查批准（备案号：2021-11）。雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（260-300g，8-10周龄）用于本研究。这些老鼠被关在动物室里，在实验期间可以自由饮水和进食。

1. 溶液制备

通过溶解118 mM的NaCl，4.7 mM的K ⁺，2.5 mM的CaCl₂，1.2 mM的KH₂PO₄，1.2 mM的MgCl₂∙6H₂O，25 mM的NaHCO₃，11 mM的D-葡萄糖和5 mM的HEPES来制备生理盐溶液（PSS）。
通过溶解58 mM的NaCl，60 mM的K ⁺，2.5 mM的CaCl₂，1.2 mM的KH₂PO4，1.2 mM的MgCl₂∙6H₂O，25 mM的NaHCO₃，11 mM的D-葡萄糖和5 mM的HEPES，制备高K ⁺盐溶液。
将上述两种溶液饱和，并用95%O 2和5_%CO ₂的混合气体产生气泡。同时，用2 mM NaOH将溶液的pH值保持在7.38和7.42之间。
注：有关溶液制备的详细信息，请参阅参考文献¹⁵。

2. 大鼠冠状动脉夹层

通过吸入2%异氟醚麻醉大鼠。通过脚趾捏紧确认深度麻醉，如果需要，给予额外的麻醉剂。然后立即打开胸腔，将心脏暴露在便携式手术台上，遵循先前发表的报告¹²。
解离并取出心脏后，用医用塑料镊子轻轻挤压，从所有心腔中排出残留的血液。在4°C下将预处理的心脏快速置于含有95%O₂ + 5%CO₂ 饱和PSS的培养皿中，pH值为7.40。
为了准确识别冠状动脉的解剖位置，根据示意图在光学显微镜下调整孤立心脏的姿势（图2A）。
注意：在额视图中，右耳廓和肺动脉分别位于左上角和右上。
1. 用手术剪刀和镊子从肺动脉根部沿着室间隔切除左心室和右心室腔（图2B）。
为了将左右冠状动脉与心肌组织分离，请在光学解剖显微镜下解剖右心室，以彻底暴露右冠状动脉分支。然后通过顺时针旋转心脏组织45°来确定左冠状动脉的位置（图2D）。
切除周围粘性心肌组织后，明确辨别脉动的左（约5毫米）和右（约5毫米）冠状动脉。立即分离中间的冠状动脉，并在4°C下完全浸入PSS中。通过用解剖剪刀垂直切割分离的动脉来记录不同刺激下的血管张力，从而获得约2mm的动脉环（图2E）。

3.动脉环的悬吊和固定

注：有关此步骤的详细信息，请参阅参考文献¹⁴。

准备两根2厘米的不锈钢丝（见 材料表），并在4°C PSS溶液中预浸泡，饱和95%O₂ + 5%CO₂。在光学解剖显微镜下，将两根导线沿着血管的方向平行穿过动脉环，并在血管腔的两端暴露相等长度的导线。
用前后钢丝将动脉环固定在充满冒泡PSS的电丝显微照片的浴槽中，其95%O₂ + 5%CO₂。旋转水平螺钉旋钮以获得适当的前后间距，使两根导线水平，动脉环处于自然松弛状态。
在恒温装置上安装DMT浴槽后，打开数据采集软件（见 材料表），确保记录到相应的路径信号。设置以下参数：目镜校准（毫米/分）：0.36;目标压力（千帕）： 13.3;IC1/IC100： 0.9;在线平均时间： 2 s;延迟时间：60 s。动脉环固定的步骤如图 3所示。

4. 大鼠动脉环血管张力的标准化

注意：对于不同的腔体样品，最佳的初始张力对于容器 在体外保持异常活性是必要的。有关详细信息，请参阅参考文献¹⁵。

通过沿血管直径施加合理的张力，实现动脉环的最佳初始张力。
注：根据先前的研究¹⁶，最大激动剂诱导的张力在因子k值为0.90时完成，初始拉伸张力为1.16±0.04 mN / mm（不同血管样品的参考值：k值，0.90-0.95;初始张力，1.16-1.52 mN / mm）。
此时，将显示的血管张力值设置为零。之后，通过旋转浴的螺旋轴将3mN拉动刺激施加到动脉环上。
在37°C，pH 7.40的氧饱和PSS缓冲液中孵育1小时后，在线材显微照片的张力控制面板上再次将张力值设置为0mN。动脉环初始张力的设定过程如图 4所示。

5. 冠状动脉环的反应性检测

使用线肌图技术¹⁴执行冠状动脉环的收缩活性，并通过用60mM的K ⁺ 溶液刺激每个10分钟在三个单独的操作中进行验证。
每次刺激后，用氧饱和PSS冲洗浴，直到血管张力恢复到其初始状态。
注意：只有当三个平行测量的张力波动小于10%，并且每次收缩的幅度大于1 mN / mm时，合格且高活性的动脉环才能用于进一步的实验。大鼠冠状动脉环的活性验证如图 5所示。

6. 术后治疗

手术后，按照机构批准的方案对动物实施安乐死。
注意：对于本研究，通过吸入过量的异氟醚对动物实施安乐死。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

解剖学上定位，大鼠冠状动脉分布并隐藏在心肌组织深处不容易识别。通过比较人（图1A）和大鼠的冠状动脉（图1B），根据图2中的采样过程进行大鼠冠状动脉的快速准确分离。在光学显微镜下从前部精确定位右耳廓，肺动脉和顶点后，沿着 图2A所示的实心黑线解剖心肌。冠状动脉脑室间分支的约5毫米明显暴露在我们的视野中。在室间隔动脉周围的粘性心肌精细分离后，使用2 cm的导线沿血管对齐方向穿过冠状动脉的2mm环。然后，分离的2毫米冠状动脉环立即牢固地固定在DMT浴槽中，如图 3所示。在对动脉环施加初始3 mN张力后（图4），通过平行施加60 mM K ⁺ 三次，其张力超过2 mN（图5）。因此，上述程序产生了具有出色生理活性的孤立冠状动脉环。

将累积K ⁺ （20，28，39，55，77和108mM）或U46619（0.01，0.03，0.1，0.3和1μM）加入DMT 620M浴中，导致体外血管张力的浓度依赖性增加。当血管收缩作用达到平台时，加入下一个浓度的K ⁺ 或U46619（血栓素A2（TP）受体激动剂）¹⁵。实验结果如图 6A、B所示。对于由K ⁺ （60mM）和U46619（0.3μM）收缩的孤立冠状动脉环，测试药物芹菜素（1，3，10，30和100μM）以令人惊讶的浓度依赖性方式引起血管舒张（图6C）。

图1：人大鼠冠状动脉的手绘图（A）从人心前视图呈现左右冠状动脉浅表分布的特征，肉眼容易识别。（B）显示大鼠心肌深处的左右冠状动脉及其分支的室间隔。缩写：RCA =右冠状动脉;LCA = 左冠状动脉;ISB = 室间隔分支。请点击此处查看此图的大图。

图2：大鼠冠状动脉分离图。（A）在光学显微镜下从前视图观察大鼠心脏的右耳廓、肺动脉、顶点、解剖线。 （B） 左心室和右心室腔从肺动脉根部沿鼻中隔切开。 （C） 左右冠状动脉及其室间隔分支的解剖位置。 （D） 动脉的 2 mm 环。 （E） 动脉环沿血管方向用电线固定。缩写：RA = 右耳廓;PA = 肺动脉;RCA = 右冠状动脉;ISB = 室间隔分支;LCA = 左冠状动脉。请点击此处查看此图的大图。

图3：动脉安装过程的示意图。将带有金属丝的动脉环转移到 （A） 并夹在DMT浴 （B）上。将钢丝固定并顺时针拧到左上角 （C） 和左下角 （D）上。 （E） 将钳口分开，以腾出空间，使第二根导线通过动脉环。 （F） 第二根导线平行穿过动脉环。将钢丝固定并顺时针拧到右上角 （G） 和右下 角（H）。。 （I） 将下颌分开，松紧拧紧，使动脉环处于自然状态。绿线代表导线，橙色圆柱体代表 2 mm 隔离动脉环。请点击此处查看此图的大图。

图4：动脉环的正常化程序。固定隔离动脉环张力恢复到0 mN后，一次对动脉环施加3 mN的拉力。5分钟后，血管张力降至2.5mN。通过将张力增加至3 mN并保持稳定5 min，将冠状动脉环的张力初始化为0 mN并休息1 h，用于后续研究不同刺激的血管张力。请点击此处查看此图的大图。

图5：血管反应性的测试。 60 mM K⁺ 的三次应用刺激分离冠状动脉环的张力超过2 mN，三次测量小于10%，表明血管活性优越。每次刺激后，用37°C氧饱和PSS溶液轻轻冲洗浴液，直到张力为0mN。请点击此处查看此图的大图。

图6：通过 K ⁺ 或U46619大鼠冠状动脉累积剂量收缩的代表性示踪剂。随着K⁺ （A） 和U46619 （B）剂量的增加，力的剂量依赖性增加。 （C） 是指芹菜素以浓度依赖性方式对60mM K⁺-和0.3μM U46619收缩动脉环的松弛剂作用。请点击此处查看此图的大图。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

冠状动脉微循环紊乱涉及广泛的CAD患者，已逐渐得到认可，并关注充分心肌灌注的基础。考虑到突发性冠心病和心血管疾病的严重并发症，及时药物预防和治疗对于CAD¹⁷的临床个体非常重要。不可避免地，冠状动脉解剖结构的保密性及其生理结构的复杂性严重制约了对CAD^18、19^、^20、21、22^、²³^、²⁴^、²⁵的药物和治疗效果的理性^和科学评价。.毫无疑问，活动性冠状动脉的准确定位和分离是促进CAD相关疾病病理机制探索和防治措施评估的前提。线材显微照片的平台适用于不间断地记录具有环形和腔体结构的体外组织张力，直径范围从60μm到10mm。冠状动脉环可以通过两根具有恒定温度和氧气控制的导线连接到腔室。将添加不同药物后的血管收缩和松弛数据通过张力传感器输入计算机，连续采集并记录数据¹⁴。

本文主要介绍大鼠冠状动脉的具体位置和分离过程。并通过丝网显微照片系统测量大鼠冠状动脉张力变化的动态过程。鉴于人类和大鼠物种的异质性，在寻找和隔离大鼠冠状动脉时，我们必须意识到这些差异。大鼠冠状动脉分为左动脉和右动脉，具有独立的室间隔分支。人冠状动脉在心脏表面，而大鼠冠状动脉稍深。当测量动脉环张力时，所有缓冲溶液饱和并在37°C，pH = 7.40下用95_%O 2 + 5%CO₂ 起泡。详细介绍了通过两根导线固定动脉环的过程。体内的动脉处于微收缩状态，而不是完全放松的状态。动脉的收缩功能在一定程度上与施加在它们的拉力密切相关。因此，有必要对动脉环进行标准化，使其处于最佳预载状态，以便在随后的实验中维持优越的血管生理活性。由于高K⁺ 条件（60 mM）可以去极化细胞膜并激活电压门控Ca^{2 +} 通道，这导致细胞外Ca^{2 +} 的流入和动脉收缩²⁶。

在血管收缩和扩张的试验中，研究了K ⁺ 或U46619对大鼠冠状动脉的收缩作用。在结果中，K ⁺ 或U46619可以通过作用于离子通道或特异性受体以浓度依赖性的方式稳定地收缩大鼠的冠状动脉。K⁺ 主要通过去极化细胞膜和打开L型Ca²⁺ 通道²⁷来收缩血管。同时，TXA2的类似物U46619主要通过激活圆形核苷酸门控通道和TXA2受体来收缩血管。芹菜素是一种类黄酮，广泛存在于水果，蔬菜和中药（植物精液和中国星果酱）²⁸。结果宣布，芹菜素可以浓度依赖性地扩张冠状动脉收缩60mM K ⁺ 和0.3μM U46619刺激。在实验结束时，通过添加60 mM K ⁺再次验证具有良好活性的冠状动脉环，引起与原始刺激相似的血管收缩。虽然该研究主要集中在冠状动脉上，但丝显微摄影系统也适用于其他极小的组织血管，淋巴管和支气管。总之，本文主要描述了大鼠冠状动脉的位置和隔离。同时，使用线材显微照片系统平台测量其张力变化，为CAD探索提供了准确且可重复的方法。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了四川省科技计划重点研发项目（2022YFS0438）、国家自然科学基金（82104533）、中国博士后科学基金（2020M683273）和四川省科技厅（2021YJ0175）的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apigenin	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	150731
CaCl₂	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A610219
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China	S3872
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100395
KH₂PO₄	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100781
LabChart Professional version 8.3	ADInstruments, Australia	—
MgCl₂·6H₂O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100288
Multi myograph system	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	620M
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100241
NaHCO₃	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China	A100865
Steel wires	Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark	400447
U46619	Sigma, USA	D8174