Summary
本プロトコールは、ラット冠状動脈の血管反応性を測定するためのワイヤー筋電計技術を記載する。
Abstract
心血管系疾患の重要な事象として、冠状動脈疾患(CAD)は、世界中の人々の生命と健康を深刻に脅かしているアテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、狭心症の主因として広く考えられています。しかし、単離された血管の動的な生体力学的特性を記録する方法は、長い間人々を困惑させてきた。一方、 インビトロで 動的血管張力変化を測定する冠状動脈の正確な位置決めと隔離は、CAD医薬品開発のトレンドとなっている。本プロトコールは、ラット冠状動脈の巨視的同定および顕微鏡的分離を記載する。血管径に沿った冠状動脈リングの収縮および拡張機能を、確立されたマルチ筋計システムを用いてモニターした。サンプリングからデータ取得までの冠状動脈リング張力測定の標準化およびプログラムされたプロトコルは、実験データの再現性を大幅に向上させ、生理学的、病理学的、および薬物介入後の血管張力記録の信頼性を保証する。
Introduction
冠状動脈疾患(CAD)は、先進国と発展途上国の両方で主要な死因である、典型的かつ代表的な心血管疾患として広く認識され、懸念されています1,2。正常な心臓生理機能のための血液および酸素供給経路として、循環血液は、心筋3,4の表面上の2つの主要な冠状動脈および血液血管網を介して心臓に入り、栄養を与える。冠状動脈のコレステロールおよび脂肪沈着は、心臓の血液供給および血管系の激しい炎症反応を遮断し、アテローム性動脈硬化症、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞、または突然の心臓死を引き起こす5,6。冠状動脈の病理学的狭窄に応答して、代償促進された生理学的心拍は、左心室7の出力を増加させることによって心臓自体または身体の重要な器官の血液供給を満たす。長期の冠状動脈狭窄が時間内に緩和されない場合、心臓の特定の領域において広範な新しい血管が発達し得る8。現在、CADの臨床治療は、しばしば薬物血栓溶解または外科的機械的血栓溶解および頻繁な投薬および大きな外科的障害を伴う外因性バイオニック血管バイパスを採用する9。したがって、冠状動脈の生理活性の機能的調査は、心血管疾患10にとって依然として緊急のブレークスルーである。
冠状動脈生理学的活性を検出するための利用可能な技術的手段は、 インビボ冠 状動脈圧、血管張力、血中酸素飽和度、およびpH値11を動的に記録できるワイヤレステレメトリシステムを除いて存在しない。したがって、冠状動脈のテクスチャーの秘密性と複雑さを考慮すると、冠状動脈の正確な同定と単離は、間違いなくin vitro4のCADの複数のメカニズムを探索するための最良の選択です。
一連のマルチミオグラフシステム、特にワイヤー顕微鏡写真微小血管張力検出器(材料表参照)は、高精度かつ連続的な動的記録12の特性を有する小さな血管、リンパ管、および気管支管のインビトロ組織張力変化を記録するための非常に成熟した市場性のある装置である。このシステムは、直径60μm〜10mmのキャビティ構造のインビトロ組織張力特性を記録するために広く採用されている。ワイヤ顕微鏡写真のプラットフォームの連続加熱機能は、有害な外部環境の刺激を大幅に相殺します。一方、混合ガスの一定の入力およびpH値により、同様の生理学的状態13においてより正確な血管張力データを得ることができる。しかし、ラット冠状動脈の解剖学的局在化の複雑さを考慮すると(図1)、その単離は当惑し、多様化した心血管疾患および医薬品開発のメカニズムの探索を制限してきた。したがって、本プロトコールは、ラット冠状動脈の解剖学的位置および分離プロセスを詳細に導入し、続いてワイヤー顕微鏡写真14のプラットホーム上での張力測定を行う。
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Protocol
動物プロトコルは、成都漢方医学大学の管理委員会によってレビューされ、承認されました(記録番号2021-11)。雄のスプレイグ・ドーリー(SD)ラット(260〜300g、8〜10週齢)を本研究に使用した。ラットは動物室に飼育され、実験中は自由に飲食できた。
1. 溶液調製
- 118 mM の NaCl、4.7 mM の K+、2.5 mM の CaCl 2、1.2 mM のKH 2PO4、1.2 mM の MgCl2∙6H2 O、25mM の NaHCO3、11 mM の D-グルコース、および 5 mM の HEPES(材料表を参照)を溶解して生理塩溶液(PSS)を調製する(材料表を参照)。
- 58 mM の NaCl、60 mM の K+ 、2.5 mM の CaCl 2、1.2 mM の KH 2 PO4、1.2 mM の MgCl 2∙6H2 O、25 mM の NaHCO3、11 mM の D-グルコース、および 5 mM の HEPES を溶解して、高 K+ 塩溶液を調製します。
- 上記の2つの溶液を飽和させ、95%O2および5%CO2 の混合ガスで気泡とする。一方、2 mM NaOHで溶液のpH値を7.38〜7.42に維持する。
注: ソリューションの準備の詳細については、リファレンス15 を参照してください。
2. ラット冠状動脈郭清
- 2%イソフルランの吸入によってラットを麻酔する。つま先のピンチで深い麻酔を確認し、必要に応じて追加の麻酔薬を投与します。次いで、直ちに胸腔を開き、以前に公表された報告12に続いて携帯手術台上に心臓を露出させた。
- 心臓を解離して除去した後、医療用プラスチック鉗子で軽く絞ることによって、すべての心臓室から残留血液を排出する。40のpH値を有する95%O2 +5%CO2 飽和PSSを含むペトリ皿に前処理された心臓を素早く置く。
- 冠状動脈の解剖学的位置を正確に特定するために、模式図に従って光学顕微鏡下で孤立した心臓の姿勢を調整する(図2A)。
注:正面図では、右耳介と肺動脈はそれぞれ左上と右上にあった。- 肺動脈の根元から脳室間中隔に沿った左右の心室腔を外科用ハサミとピンセットで切断する(図2B)。
- 心筋組織から左右の冠動脈を解離させるには、光学解剖学的顕微鏡下で右心室を解剖し、右冠動脈枝を十分に露出させる。次に、心臓組織を時計回りに45°回転させることによって、左冠状動脈の位置を特定する(図2D)。
- 周囲の粘着性心筋組織を除去した後、脈動する左(約5mm)および右(約5mm)冠状動脈を明示的に識別する。直ちに真ん中の冠状動脈を分離し、4°CでPSSに完全に浸漬する。 解剖学的はさみで剥離した動脈を垂直に切断して約2mmの動脈輪を獲得し、異なる刺激下での血管張力を記録する(図2E)。
3.動脈リングの中断と固定
注: このステップの詳細については、リファレンス14 を参照してください。
- 2cmのステンレス鋼線を2本用意し( 材料表を参照)、95%O2+5%CO2 で飽和した4°CのPSS溶液に予め浸漬する。光学解剖学的顕微鏡下で血管の方向に沿って動脈リングに平行に両方のワイヤを通し、血管腔の両端に等しい長さのワイヤを露出させる。
- 95%O2+5%CO2 でバブリングPSSを充填したワイヤー顕微鏡写真の浴中に鋼線を前後に付して動脈リングを固定する。水平スクリューノブを回転させて、2本のワイヤが水平になり、動脈リングが自然なリラクゼーション状態になるように、適切な前後の間隔を空けます。
- DMTバスを恒温装置に設置した後、データ収集ソフトウェア( 材料表を参照)を開き、対応するパス信号が記録されていることを確認します。次のパラメータを設定します:接眼レンズキャリブレーション(mm / div):0.36;目標圧力 (kPa): 13.3;IC1/IC100: 0.9;オンライン平均化時間:2秒。遅延時間:60秒。動脈輪固定の工程を 図3に示す。
4. ラット動脈輪における血管張力の標準化
注:異なる空洞サンプルの場合、容器が インビトロで優れた活性を維持するためには、最適な初期張力が必要でした。詳しくは参考文献15をご覧ください。
- 血管の直径に沿って妥当な張力を加えることによって動脈リングの最適な初期張力を達成する。
注:以前の研究16に基づいて、最大アゴニスト誘発張力は因子k値0.90で達成され、初期ストレッチ張力は1.16±0.04mN/mmであった(異なる血管サンプルの基準値:k値、0.90-0.95;初期張力、1.16-1.52mN/mm)。 - この時点で、表示された血管張力値をゼロに設定する。その後、浴の螺旋軸を回転させて動脈リングに3mNのプル刺激を加える。
- 40、ワイヤー顕微鏡写真の張力制御盤上で再度pH7.40の酸素飽和PSS緩衝液中で1時間インキュベートした後、張力値を0 mNに設定した。動脈リングの初期張力の設定処理を 図4に示す。
5. 冠動脈輪の反応性検出
- ワイヤー筋電計測技術14を用いて冠状動脈リングの収縮活動を行い、60mMのK+溶液でそれぞれ10分間刺激することにより3つの別々の操作で検証した。
- 各刺激の後、血管緊張が初期状態に戻るまで、酸素飽和PSSで浴を洗い流す。
注:3つの並列測定の張力変動が10%未満であり、各収縮の振幅が1mN/mmを超える場合にのみ、適格で活性の高い動脈リングをさらなる実験に使用することができる。ラット冠動脈輪の活性検証を 図5に示す。
6. 術後治療
- 手術後、施設で承認されたプロトコルに従って動物を安楽死させます。
注:本研究のために、動物を過剰のイソフルランを吸入することによって安楽死させた。
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Representative Results
解剖学的に配置され、ラット冠状動脈は心筋組織の深部に分布し、隠されていたが、容易には認識されなかった。ヒト(図1A)とラット(図1B)の冠動脈を比較することにより、 図2のサンプリングプロセスに従ってラット冠状動脈の迅速かつ正確な分離を行った。光学顕微鏡下で右耳介、肺動脈、及び頂点を正面から正確に位置決めした後、 図2Aに示す黒一本の実線に沿って心筋を解剖した。冠状動脈の脳室間枝の約5mmが明らかに我々の視界に露出していた。心室中隔動脈を取り囲む粘着性心筋を細かく分離した後、2cmワイヤーを用いて冠状動脈の2mmループを血管整列の方向に横断した。その後、 図3に示すように、剥離した2mm冠状動脈リングがDMT浴中に即座に健全に固定された。動脈リングに最初の3mNの張力を加えた後(図4)、60mM K+ を3回連続して印加することにより、その張力は2mN以上を超えました(図5)。したがって、上記の手順は、優れた生理活性を有する単離された冠状動脈環をもたらした。
累積K+ (20、28、39、55、77、および108mM)またはU46619(0.01、0.03、0.1、0.3、および1μM)をDMT 620Mの浴に添加し、 インビトロ 血管緊張の濃度依存的な増加をもたらした。次の濃度のK+ またはU46619(トロンボキサンA2(TP)受容体アゴニスト)15は、血管収縮効果がプラトーに達したときに添加した。実験結果を 図6A、Bに示す。K+ (60 mM)およびU46619(0.3 μM)によってくびれた単離された冠状動脈リングについて、試験薬アピゲニン(1、3、10、30、および100 μM)は、驚くほど濃度依存的に血管拡張を引き起こした(図6C)。
図1:ヒトとラットの冠状動脈のフリーハンド図面。(A)は、左右の冠状動脈の表面分布の特徴を人間の心臓の正面から見て提示し、肉眼で容易に認識できる。(b)は、ラットの心筋深部における左右冠状動脈およびそれらの分岐した脳室間中隔を実証する。略語: RCA = 右冠状動脈;LCA = 左冠状動脈;ISB = 脳室間中隔枝。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ラットにおける冠動脈分離の図。(a)ラット心臓の右耳介、肺動脈、頂点、及び解剖学的線を、光学顕微鏡下で正面図から観察した。(b)左右の心室内腔を肺動脈の根元から中隔に沿って切開した。(c)左右の冠状動脈およびそれらの脳室間中隔枝の解剖学的位置。(D)動脈の2mmのリング。(e)動脈リングは、血管の方向に沿ってワイヤーによって固定される。略語: RA = 右耳介;PA = 肺動脈;RCA = 右冠状動脈;ISB = 脳室間中隔枝;LCA=左冠状動脈。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:動脈装着手順の概略図。 ワイヤー付き動脈リングを( A )に移し、DMTバス (B)にクランプした。鋼線を固定し、左上 (C) と左下 (D)に時計回りに螺合させた。 (E) 顎を離してねじ込み、第2のワイヤーが動脈リングを通過することを可能にするためのスペースを作った。 (f) 第2のワイヤは動脈リングを通って平行であった。鋼線を固定し、右上 (G) と右下 (H)に時計回りにねじ込んだ。 (I) 顎を緩くねじ込み、動脈輪を自然な状態のままにした。緑色の線はワイヤを表し、オレンジ色の円柱は2mmの孤立した動脈リングを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:動脈リングの正規化手順。 固定された孤立動脈リングの張力が0mNに戻った後、動脈リングに一度に3mNの引っ張り力が加えられた。5分後、血管張力は2.5mNに低下した。張力を3mNに高め、5分間安定に保持することにより、冠状動脈リングの張力を0mNに初期化し、異なる刺激の血管張力に関するその後の研究のために1時間休止した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:血管反応性の試験。 60mM K+ の3つの適用は、単離された冠状動脈リングの張力を2mN以上に刺激し、3つの測定値は10%未満であり、優れた血管活性を示唆した。各刺激の後、チャントを、張力が0mNになるまで37°Cの酸素飽和PSS溶液で穏やかに洗い流した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:K+またはU46619を介したラット冠状動脈の累積用量収縮の代表的なトレーサー。 K+(A)およびU46619(B)の線量が増加するにつれて、力は線量依存的に増加した。(c)60 mM K+-および0.3 μM U46619収縮動脈環に対するアピゲニンの弛緩効果を濃度依存的に言及した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
広範囲のCAD患者が関与する冠状動脈微小循環の障害は、徐々に認識され、適切な心筋灌流の基礎を懸念している。突然の冠状動脈性心疾患および心血管疾患の重篤な合併症を考慮すると、タイムリーな薬物予防および治療は、CAD17を有する臨床個人にとって極めて重要である。必然的に、冠状動脈解剖学の秘密とその生理学的構造の複雑さは、CAD18、19、20、21、22、23、24、25に対する薬物および治療の有効性の合理的かつ科学的評価をひどく制限している。.活動性冠動脈の正確な局在化・単離は、CAD関連疾患の病態メカニズムの探索や予防・治療策の評価を進めるための前提条件であることは間違いありません。ワイヤ顕微鏡写真のプラットフォームは、直径60μm〜10mmの範囲の環状および空洞構造でインビトロ組織張力を無限に記録するのに適しています。冠状動脈リングは、一定の温度および酸素制御を備えた2本のワイヤによってチャンバに取り付けることができる。異なる薬物を添加した後の血管収縮および弛緩のデータは、張力センサを介してコンピュータに入力され、データは連続的に取得され、文書化される14。
この記事では、主にラット冠状動脈の具体的な位置と分離プロセスについて説明します。ラットの冠状動脈緊張変化の動的過程をワイヤー顕微鏡写真システムにより測定した。ヒトとラットの種の不均一性を考えると、ラット冠状動脈を探して単離する際には、これらの違いに注意する必要があります。ラット冠状動脈は、独立した脳室間中隔枝を有する左右の動脈に分割される。ヒト冠状動脈は心臓の表面にあり、ラット冠状動脈はわずかに深い。動脈輪張力を測定する場合、全ての緩衝溶液を飽和させ、37°C、pH=7.40で95%O2+5%CO2でバブリングした。2本のワイヤーによる動脈リングの固定プロセスを詳細に紹介した。体内の動脈は、完全な弛緩状態ではなく、微小狭窄の状態にある。そして、動脈の収縮機能は、それらに加えられる引っ張り力とある程度密接に関連しています。そのため、その後の実験において優れた血管生理活性を維持するのに最適なプリロード状態となるように動脈輪を標準化する必要がある。高K+条件(60mM)は細胞膜を脱分極し、電位依存性Ca2+チャネルを活性化することができるので、これは細胞外Ca2+の流入および動脈収縮26を引き起こす。
血管収縮および拡張の試験において、ラット冠状動脈に対するK +またはU46619の収縮効果を調査した。その結果、K+またはU46619は、イオンチャネルまたは特異的受容体に作用することによって、ラットの冠状動脈を濃度依存的に着実に狭窄させることができる。K+は、主に細胞膜を脱分極して血管を収縮させ、L型Ca2+チャネル27を開口する。一方、TXA2の類似体であるU46619は、主に環状ヌクレオチド依存性チャネルおよびTXA2受容体を活性化することによって血管を収縮させる。フラボノイドの一種であるアピゲニンは、果物、野菜、伝統的な漢方薬(精液プランタギニスと中国のスタージャスミン)に広く存在します28。結果は、アピゲニンが60mM K+および0.3μM U46619刺激のために冠状動脈の収縮を濃度依存的に拡張することができると宣言した。実験の終わりに、良好な活性を有する冠状動脈環を60mM K+添加することによって再び検証し、元の刺激と同様の血管収縮を引き起こした。この研究は主に冠状動脈に焦点を当てていましたが、ワイヤー顕微鏡写真システムは、他の非常に小さな組織血管、リンパ管、気管支にも適用できました。結論として、この記事では主にラット冠状動脈の位置と隔離について説明しました。一方、その張力変化はワイヤー顕微鏡写真システムプラットフォームを使用して測定され、CAD探査のための正確で再現可能な方法論を提供しました。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、四川省科学技術計画(2022YFS0438)、中国国家自然科学財団(82104533)、中国ポスドク科学財団(2020M683273)、四川省科学技術部(2021YJ0175)の主要研究開発プロジェクトによって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Apigenin | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | 150731 | |
| CaCl2 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A501330 | |
| D-glucose | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A610219 | |
| HEPES | Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, China | S3872 | |
| KCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100395 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100781 | |
| LabChart Professional version 8.3 | ADInstruments, Australia | — | |
| MgCl2·6H2O | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100288 | |
| Multi myograph system | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 620M | |
| NaCl | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100241 | |
| NaHCO3 | Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, China | A100865 | |
| Steel wires | Danish Myo Technology, Aarhus, Denmark | 400447 | |
| U46619 | Sigma, USA | D8174 |
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