Summary
Hier ontwikkelden we een menselijk aorta gladde spiercel orgaan-op-een-chip model om de in vivo biomechanische stam van gladde spiercellen in de menselijke aortawand te repliceren.
Abstract
Conventionele tweedimensionale celkweektechnieken en diermodellen zijn gebruikt bij de studie van humaan thoracale aorta-aneurysma en dissectie (TAAD). Menselijke TAAD kan echter soms niet worden gekarakteriseerd door diermodellen. Er is een duidelijke soortkloof tussen klinische menselijke studies en dierproeven die de ontdekking van therapeutische geneesmiddelen kunnen belemmeren. Het conventionele celkweekmodel is daarentegen niet in staat om in vivo biomechanische stimuli te simuleren. Hiertoe hebben microfabricage en microfluïdische technieken zich de afgelopen jaren sterk ontwikkeld en nieuwe technieken opgeleverd voor het opzetten van organoïden-op-een-chip-modellen die de biomechanische micro-omgeving repliceren. In deze studie werd een humaan aorta glad spiercelorgaan-op-een-chip (HASMC-OOC) model ontwikkeld om de pathofysiologische parameters van de aortabiomechanica te simuleren, inclusief de amplitude en frequentie van cyclische spanning ervaren door menselijke aorta gladde spiercellen (HASMC's) die een vitale rol spelen in TAAD. In dit model werd de morfologie van HASMC's langwerpig van vorm, loodrecht op de stamrichting uitgelijnd en presenteerde een meer contractiel fenotype onder spanningsomstandigheden dan onder statische conventionele omstandigheden. Dit kwam overeen met de celoriëntatie en het fenotype in inheemse menselijke aortawanden. Bovendien hebben we, met behulp van bicuspid aortaklep-gerelateerde TAAD (BAV-TAAD) en tricuspidalis aortaklep-gerelateerde TAAD (TAV-TAAD) patiënt-afgeleide primaire HASMC's, BAV-TAAD en TAV-TAAD ziektemodellen opgesteld, die HASMC-kenmerken in TAAD repliceren. Het HASMC-OOC-model biedt een nieuw in vitro platform dat complementair is aan diermodellen voor het verder onderzoeken van de pathogenese van TAAD en het ontdekken van therapeutische doelen.
Introduction
Thoracale aorta-aneurysma en dissectie (TAAD) is een gelokaliseerde dilatatie of delaminatie van de aortawand die geassocieerd is met hoge morbiditeit en mortaliteit1. Menselijke aorta gladde spiercellen (HASMC's) spelen een vitale rol in de pathogenese van TAAD. HASMC's zijn geen terminaal gedifferentieerde cellen en HASMC's behouden een hoge plasticiteit, waardoor ze van fenotype kunnen wisselen als reactie op verschillende stimuli2. HASMC's worden voornamelijk onderworpen aan ritmische trekspanning in vivo, en dit is een van de belangrijkste factoren die de morfologische veranderingen, differentiatie en fysiologische functies van gladde spieren reguleren 3,4. Daarom kan de rol van cyclische spanning in de studie van HASMC's niet worden genegeerd. Conventionele 2D-celculturen kunnen echter niet de biomechanische stimulatie van cyclische stam repliceren die hasmc's in vivo ervaren. Bovendien is de constructie van een dierlijk TAAD-model niet geschikt voor sommige soorten TAAD, zoals bicuspide aortaklep (BAV)-gerelateerde TAAD. Bovendien kan de soortenkloof tussen klinische menselijke studies en dierproeven niet worden genegeerd. Het belemmert farmaceutische vertaling in de klinische praktijk. Er is dus dringend behoefte aan complexere en fysiologische systemen om de in vivo biomechanische omgeving te simuleren in het onderzoek naar aortaziekten.
Dierproeven die worden gebruikt in biomedisch onderzoek en medicijnontwikkeling zijn kostbaar, tijdrovend en ethisch twijfelachtig. Bovendien voorspellen de resultaten van dierstudies vaak niet de resultaten die zijn verkregen in klinische onderzoeken bij mensen 5,6. Het gebrek aan menselijke preklinische modellen en het hoge faalpercentage in klinische onderzoeken hebben geresulteerd in weinig effectieve geneesmiddelen voor de kliniek, waardoor de kosten van de gezondheidszorg zijngestegen 7. Het is dus dringend noodzakelijk om andere experimentele modellen te vinden als aanvulling op diermodellen. Microfabricage en microfluïdische technieken hebben zich de afgelopen jaren sterk ontwikkeld en bieden nieuwe technieken voor het opzetten van organoïden-op-een-chip-modellen die de nadelen van traditionele 2D-celkweektechnieken verhelpen en een realistischer, goedkoper en efficiënter in vitro model opstellen voor fysiologische studies en medicijnontwikkeling. Met behulp van microfluïdische apparaten worden organen-op-chips opgericht om levende cellen te kweken in kamers van micrometerformaat met verschillende stimuli om de belangrijkste functies van een weefsel of orgaan te repliceren. Het systeem bestaat uit enkele of meerdere microfluïdische microkanalen, met ofwel één soort cel gekweekt in een doordrenkte kamer die functies van één weefseltype repliceert of verschillende celtypen gekweekt op poreuze membranen om interfaces tussen verschillende weefsels te recreëren. Microfluïdische organoïden in combinatie met van de patiënt afgeleide cellen hebben het unieke voordeel dat ze het grote soortverschil tussen muis- en menselijke ziektemodellen overbruggen en de nadelen van traditionele 2D-celcultuur voor onderzoek naar ziektemechanismen en medicijnontdekking overwinnen. Met de snelle ontwikkeling van microfluïdica in de afgelopen jaren, hebben onderzoekers het nut gerealiseerd van in vitro organ-on-a-chip (OOC) modellen die complexe in vivo biologische parameters repliceren8. Deze microfluïdische organoïden simuleren in vitro biomechanische omgevingen, zoals cyclische spanning, schuifspanning en vloeistofdruk, en bieden een driedimensionale (3D) celkweekomgeving. Tot op heden zijn verschillende OOC-modellen opgesteld om biomechanische stimuli in organen zoals long9, nier10, lever 11, darm12 en hart13 te simuleren, maar deze zijn niet op grote schaal toegepast op de studie van menselijke aortaziekte.
In deze studie presenteren we een menselijk aorta gladde spiercel orgaan-op-een-chip (HASMC-OOC) model dat de biomimetische mechanische krachten en ritmes kan regelen die worden toegepast op TAAD-patiënt-afgeleide primaire HASMC's. De chip bestaat uit drielaagse dikke platen polydimethylsiloxaan (PDMS) geëtst met kanalen en twee gecommercialiseerde zeer flexibele PDMS-membranen. HASMC's worden gekweekt op de PDMS-membranen. Het kanaal in het midden van de chip is gevuld met een kweekmedium voor celkweek. De bovenste en onderste kanalen van de chip zijn verbonden met een vacuümdruktoevoersysteem dat het ritme en de frequentie van de mechanische trekspanning van de PDMS-membranen kan regelen. Ritmische spanning ervaren door HASMC's kan worden gesimuleerd in HASMC-OOC, waarbij de biomechanische micro-omgeving van weefsel of orgaan wordt gerepliceerd die niet functioneel haalbaar is met conventionele 2D-kweeksystemen. Met het voordeel van hoge resolutie, real-time beeldvorming en biomechanische micro-omgeving, kunnen de biochemische, genetische en metabole activiteiten van levende cellen worden bestudeerd voor weefselontwikkeling, orgaanfysiologie, ziekte-etiologie, moleculaire mechanismen en biomarkeridentificatie, hart- en vaatziekten en aortaziekte. In combinatie met weefselspecifieke en patiëntcellen kan dit systeem worden gebruikt voor geneesmiddelenscreening, gepersonaliseerde geneeskunde en toxiciteitstests. Dit HASMC-OOC-model biedt een nieuw in vitro platform voor het bestuderen van de pathogenese van de aortaziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Menselijke aortamonsters werden gebruikt voor primaire HASMC-isolatie onder de goedkeuring van Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortamonsters werden verzameld van patiënten die een opgaande aorta-operatie ondergingen in het Zhongshan Hospital, Fudan University. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten vóór deelname.
1. Primaire menselijke aorta gladde spiercel isolatie
- Was het rechter laterale gebied van de opgaande aorta met steriele PBS, 1x-2x.
- Verwijder de intima- en adventitia-lagen van het weefsel met twee oogheelkundige tangen en behoud de medialaag om de cellen te oogsten.
- Leg de medialaag op een kweekschaal van 10 cm en snijd deze met een schaar in kleine stukjes (2-3 mm). Voeg 5 ml gladde spiercelkweekmedium (SMCM) toe dat 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bevat.
- Verplaats het kleine weefsel in de kweekfles met een steriele druppelaar en verspreid het weefsel gelijkmatig. Gooi het kweekmedium zoveel mogelijk weg en keer de fles dan ondersteboven om.
- Voeg 2 ml SMCM toe aan de omgekeerde kweekfles en plaats deze in de incubator (5% CO2) bij 37 °C gedurende 1-2 uur, draai hem vervolgens langzaam naar rechts en voeg nog eens 2 ml SMCM toe.
- Na 5-7 dagen incubatie, wissel de SMCM met 4 ml verse SMCM. Over het algemeen klimmen sporadische gladde spiercellen in ongeveer 2 weken uit.
- Gooi de SMCM langzaam weg en voeg deze langzaam toe bij het vervangen van het medium. Transporteer de kweekfles langzaam wanneer u naar een microscoopstation gaat; anders zullen de weefsels drijven en zullen de cellen langzaam groeien.
- Wanneer de cellen ongeveer 80% samenvloeiing bereiken, wast u met 2 ml PBS, verteert u met 2 ml 0,25% trypsine en verdeelt u ze in twee nieuwe kweekflessen met 4 ml verse SMCM.
- Identificeer de cellen door middel van een immunofluorescentieanalyse van vier verschillende specifieke markers voor gladde spiercellen (CNN1, SM22)14.
2. Voorbereiding van PDMS-chip
- Om PDMS te polymeriseren, voegt u uithardingsmiddel (B-component) toe aan base (A-component) met een gewichtsverhouding van A: B = 10:1 w / w en mengt u het complex volledig gedurende 5 minuten; het volume is afhankelijk van de behoefte aan het onderzoek.
- Plaats de bereide PDMS-gel gedurende 30-60 minuten in een vacuümafzuigtank en houd de druk onder -0,8 mPa.
OPMERKING: Hoge druk zal leiden tot onvoldoende extractie van kleine bubbels in de PDMS-gel die de volgende stap van chipfabricage zullen beïnvloeden. - Ontwerp de matrijs met behulp van cad-software (computerondersteund ontwerp) met een 100 mm × 40 mm × 8 mm externe framestructuur en een 70 mm × 6 mm × 4 mm kanaal.
- Maak de mallen van de drie lagen op maat met behulp van een zeer nauwkeurige computer numerieke controle graveermachine. Snijd het frame van de mallen en de microkanalen uit met behulp van polymethylmethacrylaat (PMMA) -platen en lijm ze vervolgens op een andere PMMA-plaat.
- Giet de voorbereide PDMS-gel op een mal met een 100 mm × 40 mm × 6 mm buitenframe en 70 mm × 6 mm × kanaal van 4 mm en vervolgens cross-link bij 70 °C gedurende 1-2 uur.
- Verwijder de verknoopte PDMS-platen van de mal en snijd de gecommercialiseerde PDMS-membranen in secties van 100 mm × 40 mm.
- Behandel de drie voorbereide PDMS-platen en twee PDMS-membranen met zuurstofplasma gedurende 5 minuten voor PDMS-oppervlakteactivering. Pas de volgende specifieke instellingen toe: ruimtelucht als procesgas; druk ingesteld op -100 kPa; huidige ingesteld op 180--200 Ma; spanning ingesteld op 200 V; procestijd tot 5 min.
- Pons gaten op de drie PDMS-platen met behulp van een 1 mm-perforator om de in- en uitlaat van lucht en middelgrote microkanalen op de PDMS-chip te maken.
- Verlijm drie PDMS-platen en twee PDMS-membranen samen in de volgorde: luchtkanaal PDMS-plaat (toplaag) - PDMS-membraan - mediumkanaal PDMS-plaat (middenlaag) - PDMS-membraan- luchtkanaal PDMS-plaat (onderste laag). Voer deze stap uit onder een stereoscopische microscoop op 4x om de luchtmicrokanalen volledig te overlappen met de middelgrote microkanalen.
- Plaats de geassembleerde PDMS-chip gedurende 1 uur in een incubator van 70 °C.
- Bereid verschillende latexslangen met een binnendiameter van 1 mm en een lengte van 3 cm voor. Steek een buitendiameter van 1 mm en een roestvrijstalen naald van 1 cm in het ene uiteinde van de voorbereide slang en steek vervolgens een Luer in het andere uiteinde van de slang om de buis te maken die is aangesloten op de lucht- en mediummicrokanalen van de PDMS-chip.
- Plaats de voorbereide buizen in de uitlaten en inlaten van de lucht en middelgrote microkanalen op de PDMS-chip.
3. PDMS-chipoppervlakbehandeling en sterilisatie
- Injecteer 2 ml 80 mg/ml muiscollageen in het medium microkanaal van de PDMS-chip met behulp van een spuit van 2 ml en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder na incubatie het collageen uit het kanaal en herinner het zich met een spuit van 2 ml. Plaats de met collageen gecoate PDMS-chips 's nachts in een incubator van 60 °C.
- Plaats de PDMS-chips langer dan 1 uur in een UV-sterilisator. Plaats de gesteriliseerde PDMS-chips op een ultraschone bank ter voorbereiding op het celexperiment.
4. Cell seeding op de PDMS-chip en het celrekproces
- Kweek 4 x 105 primaire menselijke gladde spiercellen (HASMC's) van patiënten die smooth muscle cell medium (SMCM) gebruiken dat 2% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bevat in een 5% CO2-incubator bij 37 °C.
- Wanneer de HASMC-dichtheid 80% bereikt, gooit u de SMCM weg en wast u de cellen met 2 ml PBS.
- Vergist de cellen met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 2 min en centrifugeer bij 100 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 1 ml verse SMCM. Gebruik 8 ml SMCM om de cellen op een kweekschaal van 10 cm te kweken.
- Bereken het celnummer met behulp van een cytometer en gebruik de cellen in een eindconcentratie van 2 x 105 cellen / ml.
- Giet langzaam 2 ml PBS in het collageen gecoate en gesteriliseerde PDMS-chipmediummicrokanaal en gooi het later weg met een spuit van 2 ml.
- Giet langzaam een totaal van 2 ml van 2 x 105 cellen / ml HASMC-suspensie in het medium microkanaal van de PDMS-chip met behulp van een spuit van 2 ml. Sluit vervolgens de Luer bij de in- en uitgang van de PDMS-chip. Plaats de PDMS-chip in een incubator (5% CO2) bij 37 °C gedurende 1 dag.
- Nadat de cellen zijn bevestigd aan het PDMS-membraan in de PDMS-chip, bijna na 24 uur, sluit u de uitlaat van het luchtmicrokanaal op de PDMS-chip aan op het vacuümcontrollersysteem. Wanneer de cel is bevestigd, kan een langwerpige, normale cellulaire vorm worden gezien onder de microscoop, in contrast met de zwevende ronde cellen.
- Schakel de magneetklep en de vacuümpomp in. Open de vacuümregelaar en stel het drukniveau in op 10 kPa voor 7,18 ± 0,44% spanning en 15 kPa voor 17,28 ± 0,91% belasting.
- Nadat de parameters van het besturingssysteem zijn ingesteld, plaatst u de PDMS-chips in een incubator (5% CO2) bij 37 °C en strekt u gedurende 24 uur uit.
5. Voorbereiding van het mechanische besturingssysteem
- Bereid verschillende magneetventielen, vacuümfilters, vacuümregelaars, een vacuümpomp, een peristaltische pomp en een programmeerbare logische controller (PLC) voor die de magneetklep bestuurt.
- Programmeer de PLC-controller en stel het aan/uit-tijdsinterval in op 1 Hz. Sluit de magneetventielen aan op de geprogrammeerde controller.
- Sluit de inlaat van de vacuümpomp aan op de vacuümfilters en sluit vervolgens de uitlaat van de vacuümfilters aan op de vacuümregelaars. Sluit de uitlaat van de vacuümregelaars aan op magneetventielen en sluit ten slotte de uitlaat van de magneetventielen aan op de uitgangen van de luchtmicrokanalen van de PDMS-chips.
- Sluit de uitlaat van de peristaltische pomp aan op de inlaat van het medium microkanaal van de PDMS-chip en de inlaat van de peristaltische pomp op de uitlaat van de medium microkanaal PDMS-chip voor vervanging van kweekmedium en medicijnbehandeling.
- Pas de amplitude van de spanning aan door de regelaar en de spanningsfrequentie door de microcontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het HASMC-OOC-model bestaat uit een vacuümbesturingssysteem, een circulatiesysteem en PDMS-chips en het schematische ontwerp van het HASMC-OOC-model (figuur 1). Het vacuümbesturingssysteem bestaat uit een vacuümpomp, magneetventielen en een PLC-besturing. Om als circulatiesysteem te fungeren, werd een peristaltische pomp gebruikt om het celkweekmedium te vernieuwen en medicijnen toe te voegen. De PDMS-chip bestond uit twee vacuümkamers en een middelste kamer gevuld met SMCM voor celgroei. Volgens het ontwerp van de spaanstructuur werd de PMMA-mal voorbereid en werden de drie PDMS-platen bereid door in mallen te gieten en gedurende 2 uur bij 70 ° C te verknopen. Na behandeling met plasma werden de drie PDMS-platen en twee PDMS-membranen aan elkaar gebonden (figuur 2). Toen de PDMS-chips werden bereid, werden de HASMC's gekweekt op het PDMS-membraan in de chip en werden de PDMS-chips aangesloten op het vacuümbesturingssysteem en het circulatiesysteem. Een schema van het gehele systeem is weergegeven in aanvullende figuur 1. De PDMS-chipparameters worden weergegeven in figuur 3A en de mechanische eigenschappen van het PDMS-membraan worden weergegeven in figuur 3B. Om de trekspanningen van het PDMS-membraan te kwantificeren, hebben we de real-time vervormingen van de PDMS-membranen vastgelegd vanuit een dwarsdoorsnede van het microfluïdische model, met vacuümdrukken van 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa en 30 kPa. We hebben ook de veranderingen in lengte gemeten om de stamgrootte van het PDMS-membraan te evalueren in verschillende kweekkanaalbreedtes van 2 mm, 4 mm en 6 mm (figuur 3C-E). Microkanalen met een breedte van 6 mm werden gebruikt in de PDMS-chip. De resultaten toonden aan dat een vacuümdruk van 10 kPa 7,18 ± 0,44% spanning en 15 kPa geïnduceerde 17,28 ± 0,91% spanning (figuur 3E).
Om de levensvatbaarheid van de CEL VAN DE HASMC-cellijn (CRL1999) in de PDMS-chip te verifiëren, werd een LIVE/DEAD-test uitgevoerd op dag 3 en 5 nadat de cellen waren gekweekt. De resultaten toonden aan dat de levensvatbaarheid van de cel hoger was dan 90% op dag 3 en dag 5 (figuur 4A). Cytoskelet (F-actine) kleuring van CRL1999 in de PDMS-chip toonde normale celmorfologie en cellen die loodrecht op de stam stonden na rek gedurende 24 uur (figuur 4B-C). Immunofluorescentiekleuring van de contractiele markers SM22 en CNN1 werd uitgevoerd met HASMC-OOC na 24 uur ritmische spanning (figuur 4D-E). Om te beginnen werd 2 ml PBS langzaam in het kanaal gegoten en weggegooid met een spuit van 2 ml. Vervolgens werd 2 ml 4% (v/v) paraformaldehyde in het kanaal gegoten en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Hierna werd 2 ml van 0,2% (v / v) Triton X-100 in het kanaal gegoten door een spuit van 2 ml en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Dit werd gevolgd door 2 ml PBS die langzaam in het kanaal werd gegoten en na het wassen van de cellen door een spuit van 2 ml werd weggegooid. Vervolgens werd 2 ml runderserumalbumine van 5% (w / v) langzaam in het kanaal gegoten en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werd 1 ml SM22- of CNN1-antilichaam langzaam in het kanaal gegoten en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C. Na incubatie werd 1 ml secundair anti-konijn antilichaam van geiten langzaam in het kanaal gegoten en gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ten slotte werd 1 ml DAPI-oplossing langzaam in het kanaal gegoten en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De resultaten toonden aan dat de fluorescentie-intensiteit van SM22 en CNN1 onder spanningsomstandigheden hoger was dan die onder statische omstandigheden (figuur 4F). Vergeleken met statische omstandigheden werden de SM22- en CNN1-genen in HASMC's geupreguleerd in stamomstandigheden (figuur 4G). Deze gegevens suggereerden dat CRL1999 loodrecht op de stamrichting stond en dat een contractiel fenotype meer uitgesproken was onder stamomstandigheden dan onder conventionele celkweek onder statische omstandigheden.
Met behulp van bicuspide aortaklep-gerelateerde TAAD (BAV-TAAD) en tricuspidalis aortaklep-gerelateerde TAAD (TAV-TAAD) patiënt-afgeleide primaire HASMC's, hebben we BAV-TAAD en TAV-TAAD ziektemodellen opgesteld. De resultaten van F-actinekleuring van BAV-TAAD en TAV-TAAD patiënt-afgeleide primaire HASMC's toonden normale celmorfologie en cellen loodrecht op de stamrichting uitgelijnd na rek gedurende 24 uur (figuur 5A-B). Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat SM22- en CNN1-expressie in BAV-TAAD en TAV-TAAD-patiënt-afgeleide primaire HASMC's hoger was onder stamomstandigheden dan onder statische omstandigheden (figuur 5C-G,I). De genexpressieniveaus van SM22 en CNN1 in BAV-TAAD en TAV-TAAD patiënt-afgeleide primaire HASMC's werden onder stamomstandigheden verhoogd in tegenstelling tot statische omstandigheden (figuur 5H,J). Deze resultaten in BAV-TAAD en TAV-TAAD patiënt-afgeleide primaire HASMC's in de PDMS-chip waren consistent met de resultaten van HASMC-cellijn CRL1999, wat aangeeft dat de combinatie van patiënt-afgeleide primaire HASMC's en het HASMC-OOC-model HASMC-kenmerken repliceren in TAAD, wat een BAV-TAAD en TAV-TAAD in vitro ziektemodel biedt voor verder onderzoek van de moleculaire mechanismen van de ziekte en medicijnscreening.
Figuur 1: Schematisch ontwerp van het HASMC-OOC systeem. Het systeem bestaat uit een vacuümbesturingssysteem, een circulatiesysteem en PDMS-chips. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: PDMS-chipvoorbereidingsprocedure. De PDMS-gel werd in een PMMA-mal gegoten en gedurende 1-2 uur bij 70 °C verknoopt. Vervolgens werden de drie PDMS-platen en twee PDMS-membranen gedurende 5 minuten behandeld met plasma en aan elkaar gebonden. Ten slotte werden de bereide PDMS-chips gesteriliseerd en werd een concentratie van 2 x 105 cellen / ml HASMC-suspensie langzaam in het middelgrote microkanaal van de PDMS-chip gegoten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: De gedetailleerde parameters en mechanische eigenschappen van de PDMS-chip. (A) De gedetailleerde parameters van de PDMS-chip. De PDMS-plaatgrootte was 100 mm × 40 mm × 6 mm en de microkanaalgrootte was 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) De parameters van het commerciële PDMS-membraan. De berekende rekamplitude van het PDMS-membraan bij verschillende vacuümdrukken voor microkanaalbreedtes van 2 mm (C), 4 mm (D) en 6 mm (E). De gegevens tonen de gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Celmorfologie, oriëntatie en fenotypeverandering van HASMC's onder cyclische spanningsomstandigheden. (A) Representatief beeld van de LIVE/DEAD-test op dag 3 en dag 5 na hasmc-cellijn (CRL1999) die op een PDMS-chip is gekweekt. B) F-actinekleuring van CRL1999 onder statische en rekomstandigheden. (C) De celoriëntatie van CRL1999 onder statische en rekomstandigheden. Representatief beeld van de immunofluorescentiekleuring van SM22 (D) en CNN1 (E) in CRL1999 onder statische en rekomstandigheden. (F) De relatieve intensiteit van immunofluorescentiekleuring van SM22 en CNN1. (G) SM22 - en CNN1-mRNA-expressie in CRL1999 onder statische en rekomstandigheden. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tweezijdige Student's t-tests werden gebruikt om de twee groepen te vergelijken. De gegevens tonen gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Celmorfologie en fenotypische veranderingen in BAV-TAAD en TAV-TAAD patiënt-afgeleide HASMC-OOC. Representatief beeld van F-actinekleuring van BAV-TAAD (A)-afgeleide primaire HASMC's en TAV-TAAD (B)-afgeleide primaire HASMC's onder statische en rekomstandigheden. SM22 immunofluorescentiekleuring in BAV-TAAD (C)-afgeleide primaire HASMC's en TAV-TAAD (D)-afgeleide primaire HASMC's onder statische en rekomstandigheden. Representatief beeld van de immunofluorescentiekleuring van CNN1 in BAV-TAAD (E)-afgeleide primaire HASMC's en TAV-TAAD (F)-afgeleide primaire HASMC's onder statische en rekomstandigheden. (G) De relatieve intensiteit van SM22- en CNN1-immunofluorescentiekleuring in bav-taad-afgeleide primaire HASMC's. H) SM22 - en CNN1-mRNA-expressie in bav-taad-afgeleide primaire HASMC's onder statische en rekomstandigheden. (I) De relatieve intensiteit van SM22- en CNN1-immunofluorescentiekleuring in tav-taad-afgeleide primaire HASMC's. J) SM22 - en CNN1-mRNA-expressie in tav-taad-afgeleide primaire HASMC's onder statische en rekomstandigheden. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tweezijdige Student's t-tests werden gebruikt om de twee groepen te vergelijken. De gegevens tonen gemiddelde ± SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Schematische instructie van de voorbereiding van apparatuur. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de snelle ontwikkeling van microfluïdische technologie zijn de afgelopen jaren OOC-modellen ontstaan die de biologische functie en structuur van een of meer organen in vitro kunnen repliceren voor toepassingen in de biologie, geneeskunde en farmacologie15. OOC kan sleutelfuncties van de menselijke fysiologische micro-omgeving simuleren, essentieel voor het verkennen van ziektemechanismen en het bevorderen van preklinische geneesmiddelvertaling 8,16. Hoewel OOC zich nog in de beginfase bevindt en er meer input nodig is om het ontwerp van OOC te optimaliseren, is er de afgelopen jaren veel vooruitgang geboekt17,18. In tegenstelling tot andere driedimensionale celkweekmodellen kan OOC de biomechanische parameters van het menselijk lichaam nabootsen die essentieel zijn voor weefselontwikkeling en onderhoud van de orgaanfunctie. Organen en weefsels van het cardiovasculaire systeem worden voortdurend onderworpen aan vloeistofstroom-geïnduceerde afschuiving en cyclische spanning in vivo. Daarom moeten in vitro cellulaire experimenten van het cardiovasculaire systeem worden uitgevoerd in een experimenteel platform dat dergelijke biomechanische parameters biedt om realistische experimentele resultaten te verkrijgen die vergelijkbaar zijn met die verkregen uit in vivo studies.
In deze studie hebben we een HASMC-OOC opgezet die de parameters van de biomechanische stam waaraan HASMC's worden blootgesteld nauwkeurig kan regelen. Het is mogelijk om de vloeistofsnelheid en vloeistofafschuiving waaraan de cellen worden blootgesteld te regelen, evenals om de amplitude, frequentie en het ritme van verschillende patronen van cyclische spanning nauwkeurig te regelen. Van de vele materialen die op het gebied van OOC zijn gebruikt, is PDMS een van de meest gebruikte 19,20,21. PDMS is transparant, flexibel, biocompatibel en ademend, en deze eigenschappen dragen bij aan het brede gebruik ervan op het gebied van microfluïdische chips19. Toegepaste drukveranderingen kunnen PDMS vervormen om de mechanische kracht van contractie en ontspanning te bereiken, en de permeabiliteit van PDMS zorgt ervoor dat de celkweekomgeving op de chip consistent kan zijn met de incubatieomstandigheden van 5% CO2 bij 37 ° C in de incubator. Daarom biedt PDMS niet alleen gecontroleerde mechanische kracht aan de cellen, maar biedt het ook een kweekomgeving die geschikt is voor normale celgroei. Onze experimentele resultaten tonen aan dat de morfologie en activiteit van cellen gekweekt in de PDMS-chip consistent zijn met 2D-kweekomstandigheden, wat aangeeft dat PDMS biocompatibel is.
Onder biomimetische in vivo fysiologische omstandigheden worden HASMC's in de aortawand onderworpen aan de cyclische stam van ongeveer 9%22. In pathologische omstandigheden, zoals hypertensie, aortadilatatie en aorta-aneurysma, worden HASMC's onderworpen aan cyclische spanning van meer dan 16%23. We hebben de trekeigenschappen van de PDMS-chip gekarakteriseerd en de experimentele resultaten tonen aan dat een vacuümdruk van 10 kPa 7,18 ± 0,44% spanning en 15 kPa geïnduceerde 17,28 ± 0,91% spanning. Bovendien kan de frequentie van de spanning en vloeistofschuifspanning worden geregeld door dit PDMS-chipsysteem. Met behulp van BAV-TAAD en TAV-TAAD patiënt-afgeleide primaire HASMC's, kunnen de moleculaire mechanismen en medicijnscreening van deze aortaziekten worden uitgevoerd met behulp van dit HASMC-OOC in vitro model, dat de pathogenese van de ziekte van verschillende aortaziekten kan repliceren. Met behulp van dit systeem hebben we een ziektemodel opgesteld om de pathogenese van BAV-TAAD te bestuderen en onthuld dat mitochondriale fusieactivator de mitochondriale disfunctie in zieke cellen gedeeltelijk zou kunnen redden24.
De HASMC-OOC is ontworpen op basis van de inspiratie en referentie van lung-on-a-chip uit Ingber's werk9. Hun apparaat repliceerde fysiologische ademhalingsbewegingen van de longblaasjes in de long en de chip bestond uit drie lagen: bovenste en onderste mediumkanalen, een poreus PDMS-membraan en twee zijvacuümkamers. Zijvacuümkamers kunnen alleen worden gemaakt in gespecialiseerde laboratoria met geavanceerde microfluïdische apparatuur. Om montage in meer algemene laboratoriumomstandigheden mogelijk te maken, plaatsten we de vacuümkamers aan de boven- en onderkant van de chip. Beide stretching-benaderingen hebben vergelijkbare functies, zodat de chipstructuur kan worden gekozen op basis van de laboratoriumomstandigheden en de onderzoeksbehoeften, zodat die optie is. Om de buisvormige structuur van de menselijke aorta structureel vast te stellen en meer biologische monsters van de cellen te verkrijgen voor het uitvoeren van verdere complexe biologische analyse en experimentele testen, hebben we bovendien een vijflaagse PDMS-chip met grotere kanalen vastgesteld, die bestond uit een middenmediumkanaal, twee PDMS-membranen en bovenste en onderste vacuümkamers. Twee PDMS-membranen en de grote kanalen van de PDMS-chip vergrootten het celkweekgebied tot 8,4 cm2, waardoor voldoende monsters voor eiwitanalyse werden verkregen. De eerder gemelde platforms richtten zich voornamelijk op het onderzoeken van kleine slagaderziekten, zoals een hersenslagader, perifeer vat of andere arteriële ziekten25,26. De aorta is een groot vat met een diameter van 25-35 mm en de tunicamedia van de aorta bestaan voornamelijk uit gladde spiercellen die onderhevig zijn aan hoge trekspanning. De pathologie van aortopathie wordt geassocieerd met remodellering van de aortawand, gladde spiercelapoptose en fenotypische omschakeling, die allemaal kunnen worden gereguleerd door mechanische stress. Van de patiënt afgeleide HASMC's en trekspanning zijn dus essentiële componenten voor het succes van HASMC-OOC. Er zijn echter enkele beperkingen aan deze studie. HASMC-OOC maakte geen gebruik van gecocultureerde vasculaire cellen, waaronder HASMC's, aorta-endotheelcellen en fibroblasten, die de in vivo micro-omgeving van de menselijke aorta beter kunnen simuleren en kunnen worden gebruikt om de interactie tussen deze cellen te bestuderen. Hoewel HASMC's ritmische spanning ervaren, worden de cellen nog steeds gekweekt op een plat PDMS-membraan dat de extracellulaire matrix niet nabootst. In toekomstige studies zullen we deze beperkingen overwinnen door microfluïdische chips te combineren met 3D-bioprinttechnologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dat dit werk werd ondersteund door subsidies van de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (20ZR1411700), de National Natural Science Foundation of China (81771971) en het Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
