Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/64122
* These authors contributed equally

Summary

Ici, nous avons développé un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour reproduire la souche biomécanique in vivo des cellules musculaires lisses dans la paroi aortique humaine.

Abstract

Des techniques conventionnelles de culture cellulaire bidimensionnelle et des modèles animaux ont été utilisés dans l’étude de l’anévrisme et de la dissection de l’aorte thoracique humaine (TAAD). Cependant, le TAAD humain ne peut parfois pas être caractérisé par des modèles animaux. Il existe un écart apparent entre les études cliniques sur les humains et les expériences sur les animaux qui peut entraver la découverte de médicaments thérapeutiques. En revanche, le modèle de culture cellulaire conventionnel est incapable de simuler des stimuli biomécaniques in vivo . À cette fin, les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui reproduisent le microenvironnement biomécanique. Dans cette étude, un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-on-a-Chip) a été développé pour simuler les paramètres physiopathologiques de la biomécanique aortique, y compris l’amplitude et la fréquence de la déformation cyclique subie par les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) qui jouent un rôle vital dans TAAD. Dans ce modèle, la morphologie des HASMC est devenue allongée, alignée perpendiculairement à la direction de la déformation et présentait un phénotype plus contractile dans des conditions de déformation que dans des conditions conventionnelles statiques. Cela était cohérent avec l’orientation cellulaire et le phénotype dans les parois aortiques humaines natives. De plus, en utilisant des TAAD liés à la valve aortique bicuspide (BAV-TAAD) et des HASMC primaires dérivés des patients liés à la valve aortique tricuspide (TAV-TAAD), nous avons établi des modèles de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD, qui reproduisent les caractéristiques HASMC dans TAAD. Le modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro complémentaire aux modèles animaux pour explorer davantage la pathogenèse du TAAD et découvrir des cibles thérapeutiques.

Introduction

L’anévrisme et la dissection de l’aorte thoracique (TAAD) sont une dilatation ou une délamination localisée de la paroi aortique associée à une morbidité et une mortalité élevées1. Les cellules musculaires lisses aortiques humaines (HASMC) jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse du TAAD. Les HASMC ne sont pas des cellules différenciées en phase terminale, et les HASMC conservent une plasticité élevée, ce qui leur permet de changer de phénotype en réponse à différents stimuli2. Les HASMC sont principalement soumis à une contrainte de traction rythmique in vivo, et c’est l’un des facteurs clés régulant les changements morphologiques des muscles lisses, la différenciation et les fonctions physiologiques 3,4. Par conséquent, le rôle de la déformation cyclique dans l’étude des HASMC ne peut être ignoré. Cependant, les cultures cellulaires 2D conventionnelles ne peuvent pas reproduire la stimulation biomécanique de la souche cyclique subie par les HASMC in vivo. De plus, la construction d’un modèle TAAD animal ne convient pas à certains types de TAAD, tels que le TAAD lié à la valve aortique bicuspide (BAV). De plus, l’écart entre les études cliniques sur l’homme et l’expérimentation animale ne peut être ignoré. Elle entrave la traduction pharmaceutique dans la pratique clinique. Ainsi, il existe un besoin urgent de systèmes physiologiques plus complexes pour simuler l’environnement biomécanique in vivo dans la recherche sur les maladies de l’aorte.

Les expériences sur les animaux utilisées dans la recherche biomédicale et le développement de médicaments sont coûteuses, longues et éthiquement discutables. En outre, les résultats des études animales ne permettent souvent pas de prédire les résultats obtenus dans les essais cliniques chez l’homme 5,6. L’absence de modèles précliniques humains et le taux élevé d’échec dans les essais cliniques ont entraîné peu de médicaments efficaces pour la clinique, ce qui a augmenté les coûts des soins de santé7. Il est donc urgent de trouver d’autres modèles expérimentaux pour compléter les modèles animaux. Les techniques de microfabrication et de microfluidique se sont considérablement développées ces dernières années, fournissant de nouvelles techniques pour établir des modèles organoïdes sur puce qui remédient aux inconvénients des techniques traditionnelles de culture cellulaire 2D et établissent un modèle in vitro plus réaliste, peu coûteux et efficace pour les études physiologiques et le développement de médicaments. À l’aide de dispositifs microfluidiques, des organes sur puce sont établis pour cultiver des cellules vivantes dans des chambres de taille micrométrique avec différents stimuli pour reproduire les fonctions clés d’un tissu ou d’un organe. Le système se compose d’un ou de plusieurs microcanaux microfluidiques, avec soit un type de cellule cultivée dans une chambre perfusée répliquant des fonctions d’un type de tissu, soit différents types de cellules cultivées sur des membranes poreuses pour recréer des interfaces entre différents tissus. Les organoïdes microfluidiques combinés à des cellules dérivées de patients ont l’avantage unique de combler la grande différence d’espèces entre les modèles de maladies de souris et d’humains et de surmonter les inconvénients de la culture cellulaire 2D traditionnelle pour la recherche sur le mécanisme de la maladie et la découverte de médicaments. Avec le développement rapide de la microfluidique au cours des dernières années, les chercheurs ont réalisé l’utilité des modèles in vitro d’organes sur puce (OOC) répliquant des paramètres biologiques complexes in vivo 8. Ces organoïdes microfluidiques simulent des environnements biomécaniques in vitro, tels que la déformation cyclique, la contrainte de cisaillement et la pression du liquide, fournissant un environnement de culture cellulaire tridimensionnel (3D). À ce jour, plusieurs modèles OOC ont été établis pour simuler des stimuli biomécaniques dans des organes tels que le poumon9, le rein 10, le foie11, l’intestin 12 et le cœur 13, mais ceux-ci n’ont pas été largement appliqués à l’étude de la maladie aortique humaine.

Dans cette étude, nous présentons un modèle HASMC-OOC (Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ On-A-Chip) qui peut contrôler les forces et les rythmes mécaniques biomimétiques appliqués aux HASMC primaires dérivés du patient TAAD. La puce se compose de plaques épaisses à trois couches de polydiméthylsiloxane (PDMS) gravées avec des canaux et de deux membranes PDMS hautement flexibles commercialisées. Les HASMC sont cultivés sur les membranes PDMS. Le canal au milieu de la puce est rempli d’un milieu de culture pour la culture cellulaire. Les canaux supérieur et inférieur de la puce sont connectés à un système d’alimentation en pression sous vide qui peut contrôler le rythme et la fréquence de la déformation mécanique de traction des membranes PDMS. La contrainte rythmique subie par les HASMC peut être simulée dans HASMC-OOC, reproduisant le microenvironnement biomécanique des tissus ou des organes qui n’est pas fonctionnellement réalisable avec les systèmes de culture 2D conventionnels. Avec l’avantage de l’imagerie en temps réel à haute résolution et du microenvironnement biomécanique, les activités biochimiques, génétiques et métaboliques des cellules vivantes peuvent être étudiées pour le développement tissulaire, la physiologie des organes, l’étiologie de la maladie, les mécanismes moléculaires et l’identification des biomarqueurs, les maladies cardiovasculaires et les maladies aortiques. Combiné avec des cellules spécifiques aux tissus et aux patients, ce système peut être utilisé pour le dépistage de médicaments, la médecine personnalisée et les tests de toxicité. Ce modèle HASMC-OOC fournit une nouvelle plateforme in vitro pour étudier la pathogenèse de la maladie aortique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Des échantillons aortiques humains ont été utilisés pour l’isolement primaire HASMC sous l’approbation du comité d’éthique de l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan (NO. B2020-158). Des échantillons aortiques ont été prélevés chez des patients ayant subi une chirurgie de l’aorte ascendante à l’hôpital Zhongshan de l’Université Fudan. Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients avant la participation.

1. Isolement primaire des cellules musculaires lisses aortiques humaines

  1. Lavez la région latérale droite de l’aorte ascendante avec du PBS stérile, 1x-2x.
  2. Retirez les couches d’intima et d’adventice du tissu à l’aide de deux pinces ophtalmiques et conservez la couche de média pour prélever les cellules.
  3. Placez la couche de média sur un plat de culture de 10 cm et coupez-la en petits morceaux (2-3 mm) avec des ciseaux. Ajouter 5 mL de milieu de culture de cellules musculaires lisses (CMSM) contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine.
  4. Déplacez le petit tissu dans le flacon de culture avec un compte-gouttes stérile, en répartissant le tissu uniformément. Jetez le milieu de culture autant que possible, puis retournez la bouteille à l’envers.
  5. Ajouter 2 mL de SMCM dans le flacon de culture inversé et le placer dans l’incubateur (5% CO 2) à 37 °C pendant 1-2 h, puis tourner lentement vers le haut et ajouter encore2 mL de SMCM.
  6. Après 5 à 7 jours d’incubation, remplacez le CMMS par 4 ml de CMMS frais. Généralement, les cellules musculaires lisses sporadiques disparaissent en environ 2 semaines.
  7. Jetez lentement le SMCM et ajoutez-le lentement lorsque vous changez le support. Transporter le flacon de culture lentement lorsque vous vous déplacez vers une station de microscope; Sinon, les tissus flotteront et les cellules se développeront lentement.
  8. Lorsque les cellules atteignent une confluence d’environ 80 %, laver avec 2 mL de PBS, digérer avec 2 mL de trypsine à 0,25 % et les diviser en deux nouvelles bouteilles de culture contenant 4 mL de SMCM frais.
  9. Identifier les cellules par une analyse d’immunofluorescence de quatre marqueurs spécifiques différents pour les cellules musculaires lisses (CNN1, SM22)14.

2. Préparation de la puce PDMS

  1. Pour polymériser PDMS, ajouter un agent de durcissement (composant B) à la base (composant A) à un rapport pondéral de A: B = 10: 1 p / p et mélanger complètement le complexe pendant 5 min; Le volume dépend de la nécessité de l’étude.
  2. Placez le gel PDMS préparé dans un réservoir d’extraction sous vide pendant 30-60 min et maintenez la pression en dessous de -0,8 mPa.
    REMARQUE: Une pression élevée entraînera une extraction insuffisante des petites bulles à l’intérieur du gel PDMS, ce qui affectera la prochaine étape de la fabrication de la puce.
  3. À l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO), concevoir le moule avec une structure de cadre externe de 100 mm × 40 mm × 8 mm et un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm.
  4. Fabriquez sur mesure les moules des trois couches à l’aide d’une machine de gravure à commande numérique par ordinateur de haute précision. Sculptez le cadre des moules et des microcanaux à l’aide de plaques de polyméthacrylate de méthyle (PMMA), puis collez-les sur une autre plaque de PMMA.
  5. Versez le gel PDMS préparé sur un moule avec un cadre extérieur de 100 mm × 40 mm × 6 mm et 70 mm × 6 mm × canal de 4 mm, puis réticulez à 70 °C pendant 1-2 h.
  6. Décollez les dalles PDMS réticulées du moule et coupez les membranes PDMS commercialisées en sections de 100 mm × 40 mm.
  7. Traiter les trois dalles PDMS préparées et les deux membranes PDMS avec du plasma d’oxygène pendant 5 minutes pour l’activation de surface PDMS. Appliquer les paramètres spécifiques suivants: air ambiant comme gaz de procédé; pression réglée à -100 kPa; courant réglé à 180--200 Ma; tension réglée à 200 V; Temps de traitement jusqu’à 5 min.
  8. Perforez les trous sur les trois dalles PDMS à l’aide d’un perforateur de trou de 1 mm pour faire l’entrée et la sortie d’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.
  9. Lier trois dalles PDMS et deux membranes PDMS ensemble dans l’ordre: dalle PDMS canal d’air (couche supérieure) - membrane PDMS - dalle PDMS canal moyen (couche intermédiaire) - membrane PDMS - dalle PDMS canal (couche inférieure). Effectuez cette étape au microscope stéréoscopique à 4x pour chevaucher complètement les microcanaux d’air avec les microcanaux moyens.
  10. Placez la puce PDMS assemblée dans un incubateur à 70 °C pendant 1 h.
  11. Préparez plusieurs tuyaux en latex de 1 mm de diamètre intérieur et 3 cm de longueur. Insérez une aiguille en acier inoxydable de 1 mm de diamètre extérieur et 1 cm de long dans une extrémité du tuyau préparé, puis insérez un Luer dans l’autre extrémité du tuyau pour créer le tube connecté aux microcanaux d’air et de milieu de la puce PDMS.
  12. Insérez les tubes préparés dans les sorties et les entrées de l’air et les microcanaux moyens sur la puce PDMS.

3. Traitement de surface et stérilisation des puces PDMS

  1. Infuser 2 mL de collagène de souris à 80 mg/mL dans le microcanal moyen de la puce PDMS à l’aide d’une seringue de 2 mL et incuber à température ambiante pendant 30 min.
  2. Après l’incubation, retirez le collagène du canal et recueillez-le avec une seringue de 2 mL. Placez les puces PDMS enrobées de collagène dans un incubateur à 60 °C pendant la nuit.
  3. Placez les puces PDMS dans un stérilisateur UV pendant plus de 1 h. Placez les puces PDMS stérilisées sur un banc ultrapropre en préparation de l’expérience cellulaire.

4. Ensemencement cellulaire sur la puce PDMS et processus d’étirement cellulaire

  1. Culture de 4 x 10 5 cellules musculaires lisses humaines primaires (HASMC) de patients utilisant un milieu de cellules musculaires lisses (SMCM) contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine dans un incubateur à5 % de CO2 à 37 °C.
  2. Lorsque la densité HASMC atteint 80%, jetez le SMCM et lavez les cellules avec 2 mL de PBS.
  3. Digérer les cellules en utilisant 1 mL de trypsine à 0,25% pendant 2 min et centrifuger à 100 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 1 mL de SMCM frais. Utilisez 8 mL de SMCM pour cultiver les cellules sur une boîte de culture de 10 cm.
  4. Calculer le nombre de cellules à l’aide d’un cytomètre et utiliser les cellules à une concentration finale de 2 x 105 cellules/mL.
  5. Verser lentement 2 mL de PBS dans le microcanal moyen de puce PDMS recouvert de collagène et stérilisé, puis jeter à l’aide d’une seringue de 2 mL.
  6. Verser lentement un total de 2 mL de suspension HASMC de 2 x 105 cellules/mL dans le microcanal moyen de la puce PDMS à l’aide d’une seringue de 2 mL. Ensuite, fermez le Luer à l’entrée et à la sortie de la puce PDMS. Placez la puce PDMS dans un incubateur (5% CO2) à 37 °C pendant 1 jour.
  7. Une fois les cellules fixées à la membrane PDMS dans la puce PDMS, près de 24 heures, connectez la sortie du microcanal d’air sur la puce PDMS au système de contrôleur de vide. Lorsque la cellule est attachée, une forme cellulaire allongée et normale peut être vue au microscope, contrastant avec les cellules rondes en suspension.
  8. Allumez l’électrovanne et la pompe à vide. Ouvrez le régulateur de vide et réglez le niveau de pression à 10 kPa pour une déformation de 7,18 ± 0,44 % et à 15 kPa pour une déformation de 17,28 ± 0,91 %.
  9. Une fois les paramètres du système de contrôle définis, placez les puces PDMS dans un incubateur (5% CO2) à 37 °C et étirez-les pendant 24 h.

5. Préparation du système de commande mécanique

  1. Préparez plusieurs électrovannes, filtres à vide, régulateurs de vide, une pompe à vide, une pompe péristaltique et un contrôleur logique programmable (PLC) contrôlant l’électrovanne.
  2. Programmez le contrôleur PLC et réglez l’intervalle de temps marche/arrêt sur 1 Hz. Connectez les électrovannes au contrôleur programmé.
  3. Connectez l’entrée de la pompe à vide aux filtres à vide, puis connectez la sortie des filtres à vide aux régulateurs de vide. Connectez la sortie des régulateurs de vide aux électrovannes et, enfin, connectez la sortie des électrovannes aux sorties des microcanaux d’air des puces PDMS.
  4. Connectez la sortie de la pompe péristaltique à l’entrée du microcanal moyen de la puce PDMS et l’entrée de la pompe péristaltique à la sortie de la puce PDMS à microcanal moyen pour le remplacement du milieu de culture et la manipulation des médicaments.
  5. Ajustez l’amplitude de la déformation par le régulateur et la fréquence de déformation par le microcontrôleur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le modèle HASMC-OOC se compose d’un système de contrôle du vide, d’un système de circulation et de puces PDMS, ainsi que de la conception schématique du modèle HASMC-OOC (Figure 1). Le système de contrôle du vide se compose d’une pompe à vide, d’électrovannes et d’un contrôleur PLC. Pour agir comme système circulant, une pompe péristaltique a été utilisée pour rafraîchir le milieu de culture cellulaire et ajouter des médicaments. La puce PDMS était composée de deux chambres à vide et d’une chambre centrale remplie de SMCM pour la croissance cellulaire. Selon la conception de la structure de la puce, le moule en PMMA a été préparé et les trois dalles PDMS ont été préparées en les coulant dans des moules et en réticulant à 70 °C pendant 2 h. Après traitement au plasma, les trois dalles PDMS et les deux membranes PDMS ont été collées ensemble (Figure 2). Lorsque les puces PDMS ont été préparées, les HASMC ont été cultivées sur la membrane PDMS de la puce, et les puces PDMS ont été connectées au système de contrôle du vide et au système de circulation. Un schéma de l’ensemble du système est présenté à la figure supplémentaire 1. Les paramètres de la puce PDMS sont illustrés à la figure 3A, et les propriétés mécaniques de la membrane PDMS sont illustrées à la figure 3B. Pour quantifier les déformations de traction de la membrane PDMS, nous avons capturé les déformations en temps réel des membranes PDMS à partir d’une vue en coupe transversale du modèle microfluidique, avec des pressions de vide de 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa et 30 kPa. Nous avons également mesuré les changements de longueur pour évaluer l’amplitude de la déformation de la membrane PDMS dans différentes largeurs de canaux de culture de 2 mm, 4 mm et 6 mm (Figure 3C-E). Des microcanaux de 6 mm de largeur ont été utilisés dans la puce PDMS. Les résultats ont montré qu’une pression de vide de 10 kPa induisait une déformation de 7,18 ± 0,44 % et de 15 kPa induisait une déformation de 17,28 ± 0,91 % (figure 3E).

Pour vérifier la viabilité cellulaire de la lignée cellulaire HASMC (CRL1999) dans la puce PDMS, un test LIVE/DEAD a été effectué les jours 3 et 5 après la culture des cellules. Les résultats ont montré que la viabilité cellulaire était supérieure à 90% au jour 3 et au jour 5 (Figure 4A). La coloration du cytosquelette (F-actine) de CRL1999 dans la puce PDMS a montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la souche après un étirement de 24 heures (Figure 4B-C). La coloration par immunofluorescence des marqueurs contractiles SM22 et CNN1 a été réalisée par HASMC-OOC après 24 h de déformation rythmique (Figure 4D-E). Pour commencer, 2 mL de PBS ont été lentement versés dans le canal et jetés avec une seringue de 2 mL. Par la suite, 2 mL de paraformaldéhyde à 4 % (v/v) ont été versés dans le canal et incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Après cela, 2 mL de Triton X-100 à 0,2% (v/v) ont été versés dans le canal par une seringue de 2 ml et incubés pendant 15 minutes à température ambiante. Cela a été suivi par 2 mL de PBS versés lentement dans le canal et jetés par une seringue de 2 mL après le lavage des cellules. Ensuite, 2 mL d’albumine sérique bovine à 5 % (p/v) ont été lentement versés dans le canal et incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Par la suite, 1 mL d’anticorps SM22 ou CNN1 a été lentement versé dans le canal et incubé pendant une nuit à 4 °C. Après l’incubation, 1 mL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre a été lentement versé dans le canal et incubé pendant 1 h à température ambiante. Enfin, 1 mL de solution DAPI a été versé lentement dans le canal et incubé pendant 10 min à température ambiante. Les résultats ont montré que l’intensité de fluorescence de SM22 et CNN1 dans des conditions de déformation était supérieure à celle dans des conditions statiques (Figure 4F). Par rapport aux conditions statiques, les gènes SM22 et CNN1 dans les HASMC ont été régulés à la hausse dans des conditions de souche (Figure 4G). Ces données suggèrent que CRL1999 s’alignait perpendiculairement à la direction de la souche et qu’un phénotype contractile était plus prononcé dans des conditions de souche que dans des conditions de culture cellulaire conventionnelle dans des conditions statiques.

À l’aide de TAAD (BAV-TAAD) liés à la valve aortique bicuspide et de HAAD primaires dérivés du patient liés à la valve aortique tricuspide, nous avons établi des modèles de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD. Les résultats de la coloration par F-actine des HASMC primaires dérivés du patient BAV-TAAD et TAV-TAAD ont montré une morphologie cellulaire normale et des cellules alignées perpendiculairement à la direction de la souche après un étirement de 24 heures (Figure 5A-B). La coloration par immunofluorescence a montré que l’expression de SM22 et de CNN1 dans les HASMC primaires dérivés des patients BAV-TAAD et TAV-TAAD était plus élevée dans des conditions de souche que dans des conditions statiques (Figure 5C-G,I). Les niveaux d’expression génique de SM22 et CNN1 dans les HASMC primaires dérivés des patients BAV-TAAD et TAV-TAAD ont été régulés à la hausse dans des conditions de souche contrairement aux conditions statiques (Figure 5H,J). Ces résultats dans les HASMC primaires dérivés des patients BAV-TAAD et TAV-TAAD dans la puce PDMS étaient cohérents avec les résultats de la lignée cellulaire HASMC CRL1999, indiquant que la combinaison des HASMC primaires dérivés du patient et du modèle HASMC-OOC réplique les caractéristiques HASMC dans TAAD, qui fournit un modèle de maladie BAV-TAAD et TAV-TAAD in vitro pour une étude plus approfondie des mécanismes moléculaires de la maladie et le dépistage de médicaments.

Figure 1
Figure 1 : Conception schématique du système HASMC-OOC. Le système se compose d’un système de contrôle du vide, d’un système de circulation et de puces PDMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Procédure de préparation de la puce PDMS. Le gel PDMS a été versé dans un moule en PMMA et réticulé à 70 °C pendant 1-2 h. Ensuite, les trois dalles PDMS et les deux membranes PDMS ont été traitées avec du plasma pendant 5 minutes et collées ensemble. Enfin, les puces PDMS préparées ont été stérilisées et une concentration de 2 x 105 cellules/mL de suspension HASMC a été lentement versée dans le microcanal moyen de la puce PDMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Paramètres détaillés et propriétés mécaniques de la puce PDMS. (A) Les paramètres détaillés de la puce PDMS. La taille de la dalle PDMS était de 100 mm × 40 mm × 6 mm, et la taille du microcanal était de 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Les paramètres de la membrane PDMS commerciale. L’amplitude d’étirement calculée de la membrane PDMS à différentes pressions de vide pour des largeurs de microcanaux de 2 mm (C), 4 mm (D) et 6 mm (E). Les données montrent l’écart type moyen ± (ET). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Morphologie, orientation et altération phénotypique des HASMC dans des conditions de déformation cyclique. (A) Image représentative du test LIVE/DEAD au jour 3 et au jour 5 après la culture de la lignée cellulaire HASMC (CRL1999) sur une puce PDMS. (B) Coloration à la F-actine de la CRL1999 dans des conditions statiques et de déformation. (C) L’orientation des cellules de CRL1999 dans des conditions statiques et de déformation. Image représentative de la coloration par immunofluorescence de SM22 (D) et CNN1 (E) dans CRL1999 dans des conditions statiques et de déformation. (F) L’intensité relative de la coloration par immunofluorescence du SM22 et du CNN1. (G) Expression de l’ARNm SM22 et CNN1 dans CRL1999 dans des conditions statiques et de déformation. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, les tests t bilatéraux. Les données montrent ± moyenne ET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Morphologie cellulaire et altérations phénotypiques dans les HASMC-OOC dérivés du patient BAV-TAAD et TAV-TAAD. Image représentative de la coloration par F-actine des HASMC primaires dérivés de BAV-TAAD (A) et des HASMC primaires dérivés de TAV-TAAD (B) dans des conditions statiques et de déformation. Coloration par immunofluorescence SM22 dans les HASMC primaires dérivés de BAV-TAAD (C) et les HASMC primaires dérivés de TAV-TAAD (D) dans des conditions statiques et de déformation. Image représentative de la coloration par immunofluorescence de CNN1 dans les HASMC primaires dérivés de BAV-TAAD (E) et les HASMC primaires dérivés de TAV-TAAD (F) dans des conditions statiques et de déformation. (G) L’intensité relative de la coloration par immunofluorescence SM22 et CNN1 dans les HASMC primaires dérivés de BAV-TAAD. (H) Expression de l’ARNm SM22 et CNN1 dans les HASMC primaires dérivés de BAV-TAAD dans des conditions statiques et de déformation. (I) L’intensité relative de la coloration par immunofluorescence SM22 et CNN1 dans les HASMC primaires dérivés du TAV-TAAD. (J) Expression de l’ARNm SM22 et CNN1 dans les HASMC primaires dérivés de TAV-TAAD dans des conditions statiques et de déformation. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, les tests t bilatéraux. Les données montrent ± moyenne ET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Instruction schématique de la préparation de l’équipement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Avec le développement rapide de la technologie microfluidique, des modèles OOC capables de reproduire la fonction biologique et la structure d’un ou plusieurs organes in vitro ont émergé ces dernières années pour des applications en biologie, médecine et pharmacologie15. OOC peut simuler des fonctions clés du microenvironnement physiologique humain, essentiel pour explorer les mécanismes de la maladie et promouvoir la traduction précliniquedes médicaments 8,16. Bien que le COO en soit encore à ses débuts et que davantage de contributions soient nécessaires pour optimiser la conception du COO, de nombreux progrès ont été réalisés ces dernières années17,18. Contrairement à d’autres modèles de culture cellulaire tridimensionnelle, OOC peut imiter les paramètres biomécaniques du corps humain qui sont essentiels au développement des tissus et au maintien de la fonction des organes. Les organes et les tissus du système cardiovasculaire sont constamment soumis in vivo à un cisaillement induit par l’écoulement de fluide et à une tension cyclique. Par conséquent, les expériences cellulaires in vitro du système cardiovasculaire doivent être réalisées dans une plate-forme expérimentale qui fournit de tels paramètres biomécaniques pour obtenir des résultats expérimentaux réalistes comparables à ceux obtenus à partir d’études in vivo.

Dans cette étude, nous avons établi un HASMC-OOC qui peut contrôler avec précision les paramètres de la déformation biomécanique à laquelle les HASMC sont soumis. Il est possible de contrôler la vitesse du fluide et le cisaillement du fluide auxquels les cellules sont soumises, ainsi que de contrôler avec précision l’amplitude, la fréquence et le rythme de différents modèles de déformation cyclique. Parmi les nombreux matériaux qui ont été utilisés dans le domaine de l’OOC, PDMS est l’un des plus largement adoptés 19,20,21. Le PDMS est transparent, flexible, biocompatible et respirant, et ces propriétés contribuent à sa large utilisation dans le domaine des puces microfluidiques19. Les changements de pression appliqués peuvent déformer le PDMS pour obtenir la force mécanique de contraction et de relaxation, et la perméabilité du PDMS garantit que l’environnement de culture cellulaire sur la puce peut être compatible avec les conditions d’incubation de 5% de CO2 à 37 ° C dans l’incubateur. Par conséquent, PDMS fournit non seulement une force mécanique contrôlée aux cellules, mais fournit également un environnement de culture adapté à la croissance cellulaire normale. Nos résultats expérimentaux montrent que la morphologie et l’activité des cellules cultivées dans la puce PDMS sont cohérentes avec les conditions de culture 2D, indiquant que PDMS est biocompatible.

Dans des conditions physiologiques biomimétiques in vivo , les HASMC de la paroi aortique sont soumis à une déformation cyclique d’environ 9 %22. Dans des conditions pathologiques, telles que l’hypertension, la dilatation aortique et l’anévrisme de l’aorte, les HASMC sont soumis à une contrainte cyclique supérieure à 16%23. Nous avons caractérisé les propriétés de traction de la puce PDMS, et les résultats expérimentaux montrent qu’une pression de vide de 10 kPa induit une déformation de 7,18 ± 0,44% et de 15 kPa induisait une déformation de 17,28 ± 0,91%. De plus, la fréquence de la contrainte de déformation et de cisaillement du fluide peut être contrôlée par ce système de puce PDMS. En utilisant les HASMC primaires dérivés des patients BAV-TAAD et TAV-TAAD, les mécanismes moléculaires et le criblage médicamenteux de ces maladies aortiques peuvent être effectués à l’aide de ce modèle in vitro HASMC-OOC, qui peut reproduire la pathogenèse de différentes maladies aortiques. En utilisant ce système, nous avons établi un modèle de maladie pour étudier la pathogenèse de BAV-TAAD et révélé que l’activateur de fusion mitochondriale pourrait partiellement sauver le dysfonctionnement mitochondrial dans les cellules malades24.

Le HASMC-OOC a été conçu sur la base de l’inspiration et de la référence du poumon sur puce du travail d’Ingber9. Leur dispositif reproduisait les mouvements respiratoires physiologiques des alvéoles dans les poumons, et la puce se composait de trois couches: des canaux moyens supérieurs et inférieurs, une membrane PDMS poreuse et deux chambres à vide latérales. Les chambres à vide latérales ne peuvent être fabriquées que dans des laboratoires spécialisés dotés d’équipements microfluidiques avancés. Pour permettre l’assemblage dans des conditions de laboratoire plus générales, nous avons placé les chambres à vide en haut et en bas de la puce. Les deux approches d’étirement ont des fonctions similaires, de sorte que la structure de la puce peut être choisie en fonction des conditions de laboratoire et des besoins de recherche afin qu’elle soit sélectionnée. En outre, pour établir structurellement la structure tubulaire de l’aorte humaine et obtenir plus d’échantillons biologiques des cellules pour effectuer d’autres analyses biologiques complexes et des essais expérimentaux, nous avons établi une puce PDMS à cinq couches avec des canaux plus grands, qui se composaient d’un canal moyen moyen, de deux membranes PDMS et de chambres à vide supérieures et inférieures. Deux membranes PDMS et les grands canaux de la puce PDMS ont augmenté la zone de culture cellulaire jusqu’à 8,4 cm2, fournissant suffisamment d’échantillons pour l’analyse des protéines. Les plateformes précédemment signalées se concentraient principalement sur l’étude des maladies artérielles mineures, telles qu’une artère cérébrale, un vaisseau périphérique ou d’autres maladies artérielles25,26. L’aorte est un grand vaisseau d’un diamètre de 25 à 35 mm et la tunique média de l’aorte est principalement composée de cellules musculaires lisses soumises à une forte tension de traction. La pathologie de l’aortopathie est associée au remodelage de la paroi aortique, à l’apoptose des cellules musculaires lisses et à la commutation phénotypique, qui peuvent tous être régulés par un stress mécanique. Ainsi, les HASMC dérivés du patient et la déformation de traction sont des composants essentiels pour le succès de HASMC-OOC. Cependant, il y a certaines limites à cette étude. HASMC-OOC n’a pas utilisé de cellules vasculaires en coculture, y compris les HASMC, les cellules endothéliales aortiques et les fibroblastes, qui pourraient mieux simuler le microenvironnement in vivo de l’aorte humaine et peuvent être utilisés pour étudier l’interaction entre ces cellules. Bien que les HASMC subissent une contrainte rythmique, les cellules sont toujours cultivées sur une membrane PDMS plate qui ne parvient pas à imiter la matrice extracellulaire. Dans les études futures, nous surmonterons ces limites en combinant des puces microfluidiques avec la technologie de bio-impression 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent que ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission des sciences et de la technologie de la municipalité de Shanghai (20ZR1411700), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81771971) et du programme de voile de Shanghai (22YF1406600).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% paraformaldehyde Beyotime P0099-100ml Used for cell immobilization
Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0408 Antibodies used for immunostaining
Bovine serum albumin Beyotime ST025-20g
Calcium AM/PI Invitrogen L3224
Cell culture flask  Corning 430639
CNN1 Abcam  Ab46794
Commercial flexible
PDMS membrane
Hangzhou Bald Advanced Materials KYQ-200
F-actin Invitrogen R415
FBS Sigma M8318
Hoses Runze Fluid 96410 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com
Human aortic smooth
muscle cell line CRL1999
ATCC Lot Number:70019189
Image J Imagej.net/fiji/downloads Free Download: https://fiji.sc Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity
Incubator Thermo Fisher Scientific Ensures that the temperature,
humidity, and light exposure is
exactly the same throughout
experiment.
Luer Runze Fluid RH-M016 Official website address: https://www.runzefluidsystem.com.
Microscope Olympus
mouse collagen Sigma C7661
Oxygen plasma  Changzhou Hongming Instrument HM-Plasma5L
Pasteur pipette Biologix 30-0138A1
PBS Beyotime C0221A
Pen-Strep Sigma P4458-100ml Antibiodics used to prevent bacterial
contamination of cells during culture.
peristaltic pump Kamoer F01A-STP-B046
Petri dish Corning 430167
PLC controller Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory BR010-11T8X2M The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net
polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning Sylgard 184
SM22 Abcam  ab14106
SMCM ScienCell Cat 1101
solenoid valve SMC (China) VQZ300
Syringe Becton,Dickinson and Company 300841
Triton-X 100 Beyotime ST795 To penetrate cell membranes
Trizol Invitrogen 10296010 Used for RNA extraction
trypsin Sigma 15400054
vacuum filter SMC (China) ZFC5-6 Official website address: https://www.smc.com.cn
vacuum pump Kamoer KVP15-KL-S
vacuum regulator AirTAC GVR-200-06
Primers
Primer Name Forward (5’ to 3’) Reverse (5’ to 3’)
SM22 CCGTGGAGATCCCAACTGG CCATCTGAAGGCCAATGACAT
CNN1 CTCCATTGACTCGAACGACTC CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
  2. van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
  3. Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
  4. Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
  5. Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
  6. Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
  7. Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
  8. Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
  9. Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
  10. Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
  11. Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
  12. Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
  13. Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
  14. Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
  15. Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
  16. Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
  17. Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
  18. Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
  19. Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
  20. Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
  21. Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
  22. Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
  23. Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
  24. Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
  25. Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
  26. Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).

Tags

Bioengineering numéro 185 organe sur puce aortopathie cellules musculaires lisses de l’aorte humaine souche cyclique phénotype cellulaire
Construction d’un modèle d’organe sur puce de cellules musculaires lisses de l’aorte humaine pour récapituler la contrainte biomécanique dans la paroi aortique
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abudupataer, M., Yin, X., Xiang, B., More

Abudupataer, M., Yin, X., Xiang, B., Chen, N., Yan, S., Zhu, S., Ming, Y., Liu, G., Zhou, X., Lai, H., Wang, C., Zhu, K., Li, J. Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall. J. Vis. Exp. (185), e64122, doi:10.3791/64122 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter