Summary
Здесь мы разработали модель гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека для репликации биомеханического штамма гладкомышечных клеток в стенке аорты человека in vivo .
Abstract
Обычные двухмерные методы культивирования клеток и животные модели были использованы при изучении аневризмы и расслоения грудной аорты человека (TAAD). Однако человеческий TAAD иногда не может быть охарактеризован животными моделями. Существует очевидный видовой разрыв между клиническими исследованиями на людях и экспериментами на животных, которые могут препятствовать открытию терапевтических препаратов. Напротив, обычная модель клеточной культуры не может имитировать биомеханические стимулы in vivo . С этой целью в последние годы значительно развились микрофабрикационные и микрофлюидные методы, обеспечивающие новые методы создания моделей органоидов на чипе, которые воспроизводят биомеханическую микросреду. В этом исследовании была разработана модель гладкомышечных клеток аорты человека (HASMC-OOC) для моделирования патофизиологических параметров биомеханики аорты, включая амплитуду и частоту циклического напряжения, испытываемого гладкомышечными клетками аорты человека (HASMC), которые играют жизненно важную роль в TAAD. В этой модели морфология HASMC стала вытянутой по форме, выровненной перпендикулярно направлению деформации и представляла собой более сократительный фенотип в условиях деформации, чем в статических обычных условиях. Это соответствовало ориентации клеток и фенотипу в стенках аорты человека. Кроме того, используя двустворчатые TAAD, связанные с аортальным клапаном (BAV-TAAD) и TRICUSPID Aortic Valve, связанные с TAAD (TAV-TAAD), полученные от пациентов, мы создали модели заболеваний BAV-TAAD и TAV-TAAD, которые воспроизводят характеристики HASMC в TAAD. Модель HASMC-OOC предоставляет новую платформу in vitro , которая дополняет животные модели для дальнейшего изучения патогенеза TAAD и обнаружения терапевтических мишеней.
Introduction
Аневризма и расслоение грудной аорты (TAAD) представляет собой локализованную дилатацию или расслоение стенки аорты, что связано с высокой заболеваемостью и смертностью1. Гладкомышечные клетки аорты человека (HASMC) играют жизненно важную роль в патогенезе TAAD. HASMC не являются терминально дифференцированными клетками, и HASMC сохраняют высокую пластичность, что позволяет им переключать фенотипы в ответ на различные стимулы2. ХАСМК в основном подвергаются ритмическому растягиванию in vivo, и это один из ключевых факторов, регулирующих морфологические изменения гладкой мускулатуры, дифференцировку и физиологические функции 3,4. Поэтому роль циклического штамма в изучении HASMC нельзя игнорировать. Однако обычные 2D-клеточные культуры не могут воспроизводить биомеханическую стимуляцию циклического штамма, испытываемую HASMC in vivo. Кроме того, конструкция модели TAAD животного не подходит для некоторых типов TAAD, таких как TAAD, связанный с двустворчатым аортальным клапаном (BAV). Более того, нельзя игнорировать видовой разрыв между клиническими исследованиями на людях и экспериментами на животных. Это препятствует фармацевтическому переводу в клинической практике. Таким образом, существует острая необходимость в более сложных и физиологических системах для моделирования биомеханической среды in vivo при исследовании заболеваний аорты.
Эксперименты на животных, используемые в биомедицинских исследованиях и разработке лекарств, являются дорогостоящими, трудоемкими и этически сомнительными. Кроме того, результаты исследований на животных часто не могут предсказать результаты, полученные в клинических испытаниях на людях 5,6. Отсутствие доклинических моделей на людях и высокая частота неудач в клинических испытаниях привели к тому, что в клинике было мало эффективных лекарств, что увеличило расходы на здравоохранение7. Таким образом, необходимо срочно найти другие экспериментальные модели, дополняющие животные модели. Микрофабрикация и микрофлюидные методы значительно развились в последние годы, предоставляя новые методы для создания моделей органоидов на чипе, которые устраняют недостатки традиционных методов 2D-культивирования клеток и создают более реалистичную, недорогую и эффективную модель in vitro для физиологических исследований и разработки лекарств. Используя микрофлюидные устройства, органы на чипах устанавливаются для культивирования живых клеток в камерах размером с микрометр с различными стимулами для воспроизведения ключевых функций ткани или органа. Система состоит из одного или нескольких микрофлюидных микроканалов, причем либо один вид клеток культивируется в перфузированной камере, реплицирующих функции одного типа ткани, либо различные типы клеток, культивируемые на пористых мембранах для воссоздания интерфейсов между различными тканями. Органоиды на основе микрофлюидов в сочетании с клетками, полученными от пациента, имеют уникальное преимущество, заключающееся в преодолении большой видовой разницы между моделями заболеваний мыши и человека и преодолении недостатков традиционной 2D-клеточной культуры для исследования механизма заболевания и открытия лекарств. С быстрым развитием микрофлюидики в последние несколько лет исследователи осознали полезность моделей in vitro organ-on-a-chip (OOC), воспроизводящих сложные биологические параметры in vivo 8. Эти микрофлюидные органоиды имитируют биомеханические среды in vitro, такие как циклическая деформация, напряжение сдвига и давление жидкости, обеспечивая трехмерную (3D) среду клеточной культуры. На сегодняшний день было создано несколько моделей OOC для моделирования биомеханических стимулов в таких органах, как легкие9, почки10, печень11, кишечник12 и сердце13, но они не были широко применены для изучения заболеваний аорты человека.
В этом исследовании мы представляем модель гладкомышечных клеток гладкой мускулатуры человека (HASMC-OOC), которая может контролировать биомиметические механические силы и ритмы, применяемые к первичным HASMC, полученным от пациента TAAD. Чип состоит из трехслойных толстых пластин полидиметилсилоксана (PDMS), вытравленных каналами, и двух коммерциализированных высокогибких мембран PDMS. HASMC культивируются на мембранах PDMS. Канал в середине чипа заполнен питательной средой для клеточной культуры. Верхний и нижний каналы чипа соединены с вакуумной системой подачи давления, которая может контролировать ритм и частоту механической растягивающей деформации мембран PDMS. Ритмическое напряжение, испытываемое HASMC, может быть смоделировано в HASMC-OOC, воспроизводя биомеханическое микроокружение ткани или органа, функционально не достижимое с помощью обычных систем 2D-культур. Благодаря преимуществу визуализации в режиме реального времени и биомеханической микросреды биохимическая, генетическая и метаболическая активность живых клеток может быть изучена для развития тканей, физиологии органов, этиологии заболеваний, молекулярных механизмов и идентификации биомаркеров, сердечно-сосудистых заболеваний и заболеваний аорты. В сочетании с тканеспецифическими клетками и клетками пациента эта система может использоваться для скрининга лекарств, персонализированной медицины и тестирования токсичности. Эта модель HASMC-OOC предоставляет новую платформу in vitro для изучения патогенеза заболевания аорты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Образцы аорты человека использовались для первичной изоляции HASMC с одобрения больницы Чжуншань Комитета по этике Фуданьского университета (NO. В2020-158). Образцы аорты были собраны у пациентов, перенесших операцию на восходящей аорте в больнице Чжуншань, Фуданьский университет. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов перед участием.
1. Первичная изоляция гладкомышечных клеток аорты человека
- Промыть правую боковую область восходящей аорты стерильным PBS, 1x-2x.
- Удалите слои интимы и адвентиции ткани двумя офтальмологическими щипцами и сохраните слой среды для сбора клеток.
- Выложить слой носителя на 10 см культуральную посуду и нарезать ножницами на мелкие кусочки (2-3 мм). Добавьте 5 мл культуральной среды гладкомышечных клеток (SMCM), содержащей 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина.
- Переместите мелкую ткань во флакон для культивирования стерильной капельницей, равномерно распределив ткань. Выбросьте культуральную среду как можно больше, затем переверните бутылку вверх ногами.
- Добавьте 2 мл SMCM в перевернутую бутылку для культивирования и поместите его в инкубатор (5% CO2) при 37 °C в течение 1-2 ч, затем медленно переверните его правой стороной вверх и добавьте еще 2 мл SMCM.
- После 5-7 дней инкубации замените SMCM на 4 мл свежего SMCM. Как правило, спорадические гладкомышечные клетки вылезают примерно через 2 недели.
- Медленно отбрасывайте SMCM и медленно добавляйте его при смене среды. Медленно транспортировать бутылку культуры при перемещении на микроскопическую станцию; в противном случае ткани будут плавать, и клетки будут расти медленно.
- Когда клетки достигнут примерно 80% слияния, промыть 2 мл PBS, переварить с 2 мл 0,25% трипсина и разделить их на две новые бутылочки для культивирования с 4 мл свежего SMCM.
- Идентификация клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа четырех различных специфических маркеров гладкомышечных клеток (CNN1, SM22)14.
2. Подготовка чипа PDMS
- Для полимеризации PDMS добавляют отверждающий агент (компонент B) к основанию (компонент A) при весовом соотношении A: B = 10:1 w/w и полностью перемешивают комплекс в течение 5 мин; объем зависит от необходимости исследования.
- Поместите приготовленный гель PDMS в вакуумный экстракционный резервуар на 30-60 мин и поддерживайте давление ниже -0,8 мПа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокое давление приведет к недостаточному извлечению мелких пузырьков внутри геля PDMS, что повлияет на следующий этап изготовления чипа. - Используя программное обеспечение автоматизированного проектирования (CAD), спроектируйте пресс-форму с × 100 мм × внешней рамной конструкцией 8 мм и 70 мм × 6 мм × каналом 4 мм.
- Изготовленные на заказ формы из трех слоев с помощью высокоточной компьютерной гравировальной машины с числовым программным управлением. Вырежьте каркас пресс-форм и микроканалов с помощью пластин из полиметилметакрилата (ПММА), а затем приклейте их на другую пластину из ПММА.
- Вылейте приготовленный гель PDMS на форму со 100 мм × 40 мм × наружной рамой 6 мм и 70 мм × 6 мм × канале 4 мм, а затем поперечным соединением при 70 °C в течение 1-2 ч.
- Отклейте сшитые плиты PDMS от пресс-формы и разрежьте коммерческие мембраны PDMS на 100 мм × 40 мм секций.
- Обработайте три подготовленные плиты PDMS и две мембраны PDMS кислородной плазмой в течение 5 мин для поверхностной активации PDMS. Применяйте следующие специфические настройки: комнатный воздух в качестве технологического газа; давление установлено до -100 кПа; текущий установлен на 180--200 Ма; напряжение установлено до 200 В; время обработки до 5 мин.
- Пробивайте отверстия на трех плитах PDMS с помощью перфоратора с отверстием 1 мм, чтобы сделать вход и выход воздуха и средние микроканалы на чипе PDMS.
- Свяжите три плиты PDMS и две мембраны PDMS вместе в порядке: воздушная канальная pdms плита (верхний слой) - мембрана PDMS - средняя канальная PDMS плита (средний слой) - pdms мембрана - воздушный канал PDMS сляб (нижний слой). Выполните этот шаг под стереоскопическим микроскопом в 4 раза, чтобы полностью перекрыть воздушные микроканалы средними микроканалами.
- Поместите собранный чип PDMS в инкубатор с температурой 70 °C на 1 ч.
- Подготовьте несколько латексных шлангов внутреннего диаметра 1 мм и длиной 3 см. Вставьте внешний диаметр 1 мм и иглу из нержавеющей стали длиной 1 см в один конец подготовленного шланга, а затем вставьте Luer в другой конец шланга, чтобы создать трубку, соединенную с воздушными и средними микроканалами чипа PDMS.
- Вставьте подготовленные трубки в выпускные и входные отверстия воздушных и средних микроканалов на чипе PDMS.
3. Обработка и стерилизация поверхности чипа PDMS
- Влейте 2 мл коллагена мыши 80 мг/мл в средний микроканал чипа PDMS с помощью шприца 2 мл и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 мин.
- После инкубации извлеките коллаген из канала и вспомните шприцем объемом 2 мл. Поместите покрытые коллагеном чипы PDMS в инкубатор при температуре 60 °C на ночь.
- Поместите чипы PDMS в УФ-стерилизатор более чем на 1 ч. Поместите стерилизованные чипы PDMS на сверхчистый стенд в рамках подготовки к клеточному эксперименту.
4. Посев клеток на чип PDMS и процесс растяжения клеток
- Культивирование 4 x 105 первичных гладкомышечных клеток человека (HASMC) от пациентов, использующих гладкомышечную среду (SMCM), содержащую 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицин в инкубаторе 5% CO2 при 37 °C.
- Когда плотность HASMC достигнет 80%, выбросьте SMCM и промыть ячейки 2 мл PBS.
- Переварить клетки с помощью 1 мл 0,25% трипсина в течение 2 мин и центрифуги по 100 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл свежего SMCM. Используйте 8 мл SMCM для культивирования клеток на 10-сантиметровой чашке для культивирования.
- Рассчитайте количество клеток с помощью цитометра и используйте ячейки в конечной концентрации 2 х 105 клеток/мл.
- Медленно налейте 2 мл PBS в покрытый коллагеном и стерилизованный микроканал PDMS чипа, а затем выбросьте с помощью шприца 2 мл.
- Медленно влейте в общей сложности 2 мл 2 x 105 ячеек / мл суспензии HASMC в средний микроканал чипа PDMS с помощью шприца 2 мл. Затем закройте Luer на входе и выходе чипа PDMS. Поместите чип PDMS в инкубатор (5% CO2) при 37 °C в течение 1 дня.
- После того, как ячейки прикреплены к мембране PDMS в чипе PDMS, почти через 24 часа подключите выходной микроканал воздуха на чипе PDMS к системе вакуумного контроллера. Когда клетка прикреплена, под микроскопом можно увидеть вытянутую, нормальную клеточную форму, контрастирующую с взвешенными круглыми клетками.
- Включите электромагнитный клапан и вакуумный насос. Откройте вакуумный регулятор и отрегулируйте уровень давления до 10 кПа для 7,18 ± деформации 0,44% и 15 кПа для 17,28 ± 0,91% деформации.
- После того, как параметры системы управления установлены, поместите чипы PDMS в инкубатор (5% CO2) при 37 °C и растяните в течение 24 часов.
5. Подготовка системы механического управления
- Подготовьте несколько электромагнитных клапанов, вакуумные фильтры, вакуумные регуляторы, вакуумный насос, перистальтический насос и программируемый логический контроллер (ПЛК), управляющий электромагнитным клапаном.
- Запрограммируйте контроллер ПЛК и установите интервал времени включения/выключения равным 1 Гц. Подключите электромагнитные клапаны к программируемому контроллеру.
- Подключите входное отверстие вакуумного насоса к вакуумным фильтрам, а затем подключите выходное отверстие вакуумных фильтров к вакуумным регуляторам. Подключите выходное отверстие вакуумных регуляторов к электромагнитным клапанам и, наконец, подключите выходное отверстие электромагнитных клапанов к выходам воздушных микроканалов чипов PDMS.
- Подключите выходное отверстие перистальтического насоса к входу среднего микроканала микроканала чипа PDMS и входное отверстие перистальтического насоса к выходу среднего микроканального чипа PDMS для замены питательной среды и обработки лекарственного средства.
- Отрегулируйте амплитуду деформации с помощью регулятора и частоту деформации с помощью микроконтроллера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Модель HASMC-OOC состоит из вакуумной системы управления, циркулирующей системы и микросхем PDMS, а также схематической конструкции модели HASMC-OOC (рисунок 1). Система управления вакуумом состоит из вакуумного насоса, электромагнитных клапанов и контроллера ПЛК. Чтобы действовать как циркулирующая система, перистальтический насос использовался для обновления клеточной культуральной среды и добавления лекарств. Чип PDMS состоял из двух вакуумных камер и средней камеры, заполненной SMCM для роста клеток. В соответствии с конструкцией структуры стружки была подготовлена форма ПММА, а три плиты PDMS были подготовлены путем заливки в формы и сшивки при 70 °C в течение 2 часов. После обработки плазмой три плиты PDMS и две мембраны PDMS были связаны вместе (рисунок 2). Когда чипы PDMS были подготовлены, HASMC культивировались на мембране PDMS в чипе, а чипы PDMS были подключены к вакуумной системе управления и циркулирующей системе. Схема всей системы показана на дополнительном рисунке 1. Параметры микросхемы PDMS показаны на рисунке 3A, а механические свойства мембраны PDMS показаны на рисунке 3B. Для количественной оценки растягивающих деформаций мембраны PDMS мы зафиксировали деформации мембран PDMS в реальном времени с поперечного сечения микрофлюидной модели с вакуумными давлениями 0 кПа, 10 кПа, 15 кПа, 20 кПа, 25 кПа и 30 кПа. Мы также измерили изменения длины, чтобы оценить величину деформации мембраны PDMS в различных каналах культивирования шириной 2 мм, 4 мм и 6 мм (рисунок 3C-E). В чипе PDMS использовались микроканалы шириной 6 мм. Результаты показали, что вакуумное давление 10 кПа индуцировало 7,18 ± 0,44% деформации, а 15 кПа индуцировало 17,28 ± 0,91% деформации (рисунок 3E).
Чтобы проверить жизнеспособность клеточной линии HASMC (CRL1999) в чипе PDMS, анализ LIVE/DEAD проводился на 3 и 5 день после культивирования клеток. Результаты показали, что жизнеспособность клеток была выше 90% на 3-й и 5-й день (рисунок 4А). Окрашивание цитоскелетом (F-актином) CRL1999 в чипе PDMS показало нормальную морфологию клеток и клетки, выровненные перпендикулярно штамму после растяжения в течение 24 ч (рисунок 4B-C). Иммунофлуоресцентное окрашивание сократительных маркеров SM22 и CNN1 проводили с использованием HASMC-OOC после 24 ч ритмического напряжения (рисунок 4D-E). Для начала 2 мл PBS медленно выливали в канал и выбрасывали шприцем объемом 2 мл. Впоследствии 2 мл 4% (v/v) параформальдегида заливали в канал и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого 2 мл 0,2% (v/v) Triton X-100 заливали в канал шприцем 2 мл и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре. За этим последовало 2 мл PBS, которые медленно выливались в канал и выбрасывались шприцем 2 мл после промывки клеток. Затем 2 мл 5% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина медленно вливали в канал и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого 1 мл антитела SM22 или CNN1 медленно выливали в канал и инкубировали в течение ночи при 4 °C. После инкубации 1 мл козьего анти-кроликовского вторичного антитела медленно выливали в канал и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Наконец, 1 мл раствора DAPI медленно заливали в канал и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Результаты показали, что интенсивность флуоресценции SM22 и CNN1 в условиях деформации была выше, чем в статических условиях (рисунок 4F). По сравнению со статическими условиями гены SM22 и CNN1 в HASMC были повышены в условиях штамма (рисунок 4G). Эти данные свидетельствуют о том, что CRL1999 выровнен перпендикулярно направлению деформации и что сократительный фенотип был более выражен в условиях деформации, чем при обычном культивировании клеток в статических условиях.
Используя двустворчатые TAAD, связанные с аортальным клапаном (BAV-TAAD) и TRICUSPID Aortic Valve, связанные с TAAD (TAV-TAAD), полученные от пациентов, мы создали модели заболеваний BAV-TAAD и TAV-TAAD. Результаты окрашивания F-актином первичных HASMC BAV-TAAD и TAV-TAAD показали нормальную морфологию клеток и клетки, выровненные перпендикулярно направлению деформации после растяжения в течение 24 ч (рисунок 5A-B). Иммунофлуоресцентное окрашивание показало, что экспрессия SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных от пациентов BAV-TAAD и TAV-TAAD, была выше в условиях деформации, чем в статических условиях (рисунок 5C-G, I). Уровни экспрессии генов SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных от пациентов BAV-TAAD и TAV-TAAD, были повышены в условиях деформации в отличие от статических условий (рисунок 5H, J). Эти результаты в первичных HASMC, полученных от пациента BAV-TAAD и TAV-TAAD в чипе PDMS, соответствовали результатам клеточной линии HASMC CRL1999, что указывает на то, что комбинация первичных HASMC, полученных от пациента, и модель HASMC-OOC воспроизводят характеристики HASMC в TAAD, что обеспечивает модель заболевания BAV-TAAD и TAV-TAAD in vitro для дальнейшего исследования молекулярных механизмов заболевания и скрининга лекарств.
Рисунок 1: Схематическое проектирование системы HASMC-OOC. Система состоит из вакуумной системы управления, циркуляционной системы и микросхем PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедура подготовки чипа PDMS. Гель PDMS заливали в форму ПММА и сшивали при 70 °C в течение 1-2 ч. Затем три плиты PDMS и две мембраны PDMS обрабатывали плазмой в течение 5 мин и связывали вместе. Наконец, подготовленные чипы PDMS стерилизовали, и концентрация 2 х 105 ячеек/мл суспензии HASMC медленно заливали в средний микроканал чипа PDMS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Подробные параметры и механические свойства чипа PDMS. (A) Подробные параметры чипа PDMS. Размер плиты PDMS составлял 100 мм × 40 мм × 6 мм, а размер микроканала составлял 70 мм × 6 мм × 4 мм. (B) Параметры коммерческой мембраны PDMS. Расчетная амплитуда растяжения мембраны PDMS при различных вакуумных давлениях для микроканалов шириной 2 мм (C), 4 мм (D) и 6 мм (E). Данные показывают среднее ± стандартного отклонения (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Морфология клеток, ориентация и изменение фенотипа HASMC в условиях циклической деформации. (A) Репрезентативное изображение анализа LIVE/DEAD на 3-й и 5-й день после культивирования клеточной линии HASMC (CRL1999) на чипе PDMS. (B) Окрашивание F-актином CRL1999 в статических и деформационных условиях. (C) Ориентация клеток CRL1999 в статических и деформационных условиях. Репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного окрашивания SM22 (D) и CNN1 (E) в CRL1999 в статических и деформационных условиях. (F) Относительная интенсивность иммунофлуоресцентного окрашивания SM22 и CNN1. (G) Экспрессия мРНК SM22 и CNN1 в CRL1999 в статических и деформационных условиях. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, для сравнения двух групп использовались t-тесты двуххвостого студента. Данные показывают среднее ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Морфология клеток и фенотипические изменения в BAV-TAAD и TAV-TAAD, полученные от пациента HASMC-OOC. Репрезентативное изображение окрашивания F-актином первичных HASMC, полученных из BAV-TAAD (A), и первичных HASMC, полученных из TAV-TAAD (B), в статических и деформационных условиях. Иммунофлуоресцентное окрашивание SM22 в первичных HASMC, полученных из BAV-TAAD (C), и первичных HASMC, полученных из TAV-TAAD (D), в статических и штаммовых условиях. Репрезентативное изображение иммунофлуоресцентного окрашивания CNN1 в первичных HASMC, полученных из BAV-TAAD (E), и первичных HASMC, полученных из TAV-TAAD (F), в статических и штаммовых условиях. (G) Относительная интенсивность иммунофлуоресцентного окрашивания SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных из BAV-TAAD. (H) Экспрессия мРНК SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных из BAV-TAAD, в статических и деформационных условиях. (I) Относительная интенсивность иммунофлуоресцентного окрашивания SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных из TAV-TAAD. (J) Экспрессия мРНК SM22 и CNN1 в первичных HASMC, полученных из TAV-TAAD, в статических и деформационных условиях. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, для сравнения двух групп использовались t-тесты двуххвостого студента. Данные показывают среднее ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Схематическая инструкция по подготовке оборудования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С быстрым развитием микрофлюидной технологии в последние годы появились модели OOC, которые могут воспроизводить биологическую функцию и структуру одного или нескольких органов in vitro для применения в биологии, медицине и фармакологии15. OOC может моделировать ключевые функции физиологической микросреды человека, необходимые для изучения механизмов заболевания и содействия доклиническому переводу лекарств 8,16. Хотя ООК все еще находится на ранних стадиях и для оптимизации структуры ООК требуется дополнительный вклад, в последние годы был достигнут значительный прогресс(17,18). В отличие от других трехмерных моделей клеточных культур, OOC может имитировать биомеханические параметры человеческого организма, которые необходимы для развития тканей и поддержания функции органа. Органы и ткани сердечно-сосудистой системы постоянно подвергаются вызванному потоком жидкости сдвигу и циклическому напряжению in vivo. Поэтому клеточные эксперименты сердечно-сосудистой системы in vitro необходимо проводить на экспериментальной платформе, обеспечивающей такие биомеханические параметры для получения реалистичных экспериментальных результатов, сопоставимых с полученными из исследований in vivo.
В этом исследовании мы установили HASMC-OOC, который может точно контролировать параметры биомеханического штамма, которому подвергаются HASMC. Можно контролировать скорость жидкости и сдвиг жидкости, которым подвергаются клетки, а также точно контролировать амплитуду, частоту и ритм различных паттернов циклического напряжения. Из многих материалов, которые были использованы в области OOC, PDMS является одним из наиболее широко принятых 19,20,21. PDMS является прозрачной, гибкой, биосовместимой и дышащей, и эти свойства способствуют ее широкому использованию в области микрофлюидных чипов19. Применяемые изменения давления могут деформировать PDMS для достижения механической силы сжатия и релаксации, а проницаемость PDMS гарантирует, что среда клеточной культуры на чипе может соответствовать условиям инкубации 5% CO2 при 37 °C в инкубаторе. Таким образом, PDMS не только обеспечивает контролируемую механическую силу для клеток, но и обеспечивает культуральную среду, подходящую для нормального роста клеток. Наши экспериментальные результаты показывают, что морфология и активность клеток, культивируемых в чипе PDMS, согласуются с условиями 2D-культуры, что указывает на то, что PDMS является биосовместимой.
В биомиметических физиологических условиях in vivo HASMC в стенке аорты подвергаются циклическому штамму приблизительно 9%22. При патологических состояниях, таких как гипертония, дилатация аорты и аневризма аорты, HASMC подвергаются циклическому напряжению более 16%23. Мы охарактеризовали растягивающие свойства чипа PDMS, и экспериментальные результаты показывают, что вакуумное давление 10 кПа индуцировало 7,18 ± 0,44% деформации и 15 кПа, индуцировало 17,28 ± 0,91% деформации. Кроме того, частота деформации и напряжения сдвига жидкости может контролироваться этой системой микросхем PDMS. Используя первичные HASMC, полученные от пациентов BAV-TAAD и TAV-TAAD, молекулярные механизмы и лекарственный скрининг этих заболеваний аорты могут быть проведены с использованием этой модели HASMC-OOC in vitro , которая может воспроизводить патогенез заболеваний различных заболеваний аорты. Используя эту систему, мы установили модель заболевания для изучения патогенеза BAV-TAAD и показали, что активатор митохондриального слияния может частично спасти митохондриальную дисфункцию в больных клетках24.
HASMC-OOC был разработан на основе вдохновения и ссылки на lung-on-a-chip из работы Ингбера9. Их устройство воспроизводило физиологические дыхательные движения альвеол в легких, а чип состоял из трех слоев: верхнего и нижнего среднего каналов, пористой мембраны PDMS и двух боковых вакуумных камер. Боковые вакуумные камеры могут быть изготовлены только в специализированных лабораториях с передовым микрофлюидным оборудованием. Чтобы обеспечить сборку в более общих лабораторных условиях, мы разместили вакуумные камеры в верхней и нижней части чипа. Оба подхода к растяжению имеют сходные функции, поэтому структура чипа может быть выбрана в соответствии с лабораторными условиями и потребностями исследования, чтобы выбрать. Кроме того, чтобы структурно установить трубчатую структуру аорты человека и получить больше биологических образцов из клеток для проведения дальнейшего сложного биологического анализа и экспериментальных анализов, мы установили пятислойный чип PDMS с более крупными каналами, который состоял из среднего среднего канала, двух мембран PDMS, а также верхней и нижней вакуумных камер. Две мембраны PDMS и большие каналы чипа PDMS увеличили площадь клеточной культуры до 8,4см2, обеспечив достаточное количество образцов для анализа белка. Ранее сообщалось о платформах, в основном сосредоточенных на исследовании заболеваний малых артерий, таких как мозговая артерия, периферический сосуд или другие артериальные заболевания25,26. Аорта представляет собой крупный сосуд диаметром 25-35 мм, а оболочка аорты в основном состоит из гладкомышечных клеток, подверженных высокорастяжимому напряжению. Патология аортопатии связана с ремоделированием стенки аорты, апоптозом гладкомышечных клеток и фенотипическим переключением, все из которых могут регулироваться механическим воздействием. Таким образом, полученные от пациента HASMC и растягивающие деформации являются важными компонентами успеха HASMC-OOC. Тем не менее, есть некоторые ограничения для этого исследования. HASMC-OOC не использовал кокультурированные сосудистые клетки, включая HASMC, эндотелиальные клетки аорты и фибробласты, которые могли бы лучше имитировать микросреду аорты человека in vivo и могут быть использованы для изучения взаимодействия между этими клетками. Хотя HASMC испытывают ритмическое напряжение, клетки все еще культивируются на плоской мембране PDMS, которая не может имитировать внеклеточный матрикс. В будущих исследованиях мы преодолеем эти ограничения, объединив микрофлюидные чипы с технологией 3D-биопечати.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы признают, что эта работа была поддержана грантами Комиссии по науке и технике муниципалитета Шанхая (20ZR1411700), Национального фонда естественных наук Китая (81771971) и Шанхайской парусной программы (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
