Summary
Aquí, desarrollamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para replicar la tensión biomecánica in vivo de las células del músculo liso en la pared aórtica humana.
Abstract
Las técnicas convencionales de cultivo celular bidimensional y los modelos animales se han utilizado en el estudio del aneurisma y la disección de la aorta torácica humana (TAAD). Sin embargo, el TAAD humano a veces no puede ser caracterizado por modelos animales. Existe una aparente brecha de especies entre los estudios clínicos en humanos y los experimentos con animales que pueden dificultar el descubrimiento de medicamentos terapéuticos. Por el contrario, el modelo de cultivo celular convencional es incapaz de simular estímulos biomecánicos in vivo . Con este fin, la microfabricación y las técnicas microfluídicas se han desarrollado enormemente en los últimos años, proporcionando técnicas novedosas para establecer modelos de organoides en un chip que replican el microambiente biomecánico. En este estudio, se desarrolló un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana (HASMC-OOC) para simular los parámetros fisiopatológicos de la biomecánica aórtica, incluida la amplitud y la frecuencia de la tensión cíclica experimentada por las células del músculo liso aórtico humano (HASMC) que desempeñan un papel vital en la TAAD. En este modelo, la morfología de los HASMC se hizo de forma alargada, alineada perpendicularmente a la dirección de la deformación y presentó un fenotipo más contráctil en condiciones de deformación que en condiciones convencionales estáticas. Esto fue consistente con la orientación celular y el fenotipo en las paredes aórticas humanas nativas. Además, utilizando TAAD relacionado con la válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) y HASMC primario derivado de pacientes con TAAD RELACIONADO CON LA VÁLVULA AÓRTICA TRICÚSPIDE (TAV-TAAD), establecimos modelos de enfermedad BAV-TAAD y TAV-TAAD, que replican las características de HASMC en TAAD. El modelo HASMC-OOC proporciona una novedosa plataforma in vitro que es complementaria a los modelos animales para explorar más a fondo la patogénesis de TAAD y descubrir objetivos terapéuticos.
Introduction
El aneurisma y disección aórtica torácica (TAAD) es una dilatación o delaminación localizada de la pared aórtica que se asocia con alta morbilidad y mortalidad1. Las células del músculo liso aórtico humano (HASMC) desempeñan un papel vital en la patogénesis de TAAD. Las HASMC no son células terminalmente diferenciadas, y las HASMC conservan una alta plasticidad, lo que les permite cambiar fenotipos en respuesta a diferentes estímulos2. Los HASMC se someten principalmente a tensión rítmica in vivo, y este es uno de los factores clave que regulan los cambios morfológicos del músculo liso, la diferenciación y las funciones fisiológicas 3,4. Por lo tanto, no se puede ignorar el papel de la deformación cíclica en el estudio de los HASMC. Sin embargo, los cultivos celulares 2D convencionales no pueden replicar la estimulación biomecánica de la cepa cíclica experimentada por los HASMC in vivo. Además, la construcción de un modelo animal de TAAD no es adecuada para algunos tipos de TAAD, como la TAAD relacionada con la válvula aórtica bicúspide (BAV). Además, no se puede ignorar la brecha entre los estudios clínicos en humanos y los experimentos con animales. Dificulta la traducción farmacéutica en la práctica clínica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de sistemas más complejos y fisiológicos para simular el entorno biomecánico in vivo en la investigación de enfermedades aórticas.
Los experimentos con animales utilizados en la investigación biomédica y el desarrollo de fármacos son costosos, lentos y éticamente cuestionables. Además, los resultados de los estudios en animales con frecuencia no logran predecir los resultados obtenidos en los ensayos clínicos en humanos 5,6. La falta de modelos preclínicos humanos y la alta tasa de fracaso en los ensayos clínicos han resultado en pocos medicamentos efectivos para la clínica, lo que ha aumentado los costos de atención a la salud7. Por lo tanto, es urgente encontrar otros modelos experimentales para complementar los modelos animales. La microfabricación y las técnicas microfluídicas se han desarrollado enormemente en los últimos años, proporcionando técnicas novedosas para establecer modelos de organoides en un chip que remedian los inconvenientes de las técnicas tradicionales de cultivo celular 2D y establecen un modelo in vitro más realista, de bajo costo y eficiente para estudios fisiológicos y desarrollo de fármacos. Usando dispositivos microfluídicos, se establecen órganos en chips para cultivar células vivas en cámaras de tamaño micrométrico con diferentes estímulos para replicar las funciones clave de un tejido u órgano. El sistema consiste en microcanales microfluídicos únicos o múltiples, con un tipo de célula cultivada en una cámara perfundida que replica funciones de un tipo de tejido o diferentes tipos de células cultivadas en membranas porosas para recrear interfaces entre diferentes tejidos. Los organoides basados en microfluídicos combinados con células derivadas de pacientes tienen la ventaja única de salvar la gran diferencia de especies entre los modelos de enfermedades de ratones y humanos y superar las desventajas del cultivo celular 2D tradicional para la investigación de mecanismos de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Con el rápido desarrollo de la microfluídica en los últimos años, los investigadores se han dado cuenta de la utilidad de los modelos in vitro de órganos en un chip (OOC) que replican parámetros biológicos complejos in vivo 8. Estos organoides microfluídicos simulan entornos biomecánicos in vitro, como la tensión cíclica, el esfuerzo cortante y la presión del líquido, proporcionando un entorno de cultivo celular tridimensional (3D). Hasta la fecha, se han establecido varios modelos OOC para simular estímulos biomecánicos en órganos como el pulmón9, riñón 10, hígado 11, intestino12 y corazón 13, pero estos no se han aplicado ampliamente al estudio de la enfermedad aórtica humana.
En este estudio, presentamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana (HASMC-OOC) que puede controlar las fuerzas y ritmos mecánicos biomiméticos aplicados a los HASMC primarios derivados de pacientes con TAAD. El chip consiste en placas gruesas de tres capas de polidimetilsiloxano (PDMS) grabadas con canales y dos membranas PDMS altamente flexibles comercializadas. Los HASMC se cultivan en las membranas PDMS. El canal en el centro del chip se llena con un medio de cultivo para cultivo celular. Los canales superior e inferior del chip están conectados a un sistema de suministro de presión de vacío que puede controlar el ritmo y la frecuencia de la tensión mecánica de tracción de las membranas PDMS. La tensión rítmica experimentada por los HASMC se puede simular en HASMC-OOC, replicando el microambiente biomecánico de tejido u órgano no funcionalmente alcanzable con los sistemas de cultivo 2D convencionales. Con la ventaja de alta resolución, imágenes en tiempo real y microambiente biomecánico, las actividades bioquímicas, genéticas y metabólicas de las células vivas se pueden estudiar para el desarrollo de tejidos, fisiología de órganos, etiología de enfermedades, mecanismos moleculares e identificación de biomarcadores, enfermedades cardiovasculares y enfermedades aórticas. Combinado con células específicas de tejido y del paciente, este sistema se puede utilizar para la detección de drogas, la medicina personalizada y las pruebas de toxicidad. Este modelo HASMC-OOC proporciona una novedosa plataforma in vitro para estudiar la patogénesis de la enfermedad aórtica.
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Protocol
Las muestras aórticas humanas se utilizaron para el aislamiento primario de HASMC bajo la aprobación del Hospital Zhongshan, Comité de Ética de la Universidad de Fudan (NO. B2020-158). Se recolectaron muestras aórticas de pacientes que se sometieron a cirugía de aorta ascendente en el Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de participar.
1. Aislamiento primario de células del músculo liso aórtico humano
- Lave la región lateral derecha de la aorta ascendente con PBS estéril, 1x-2x.
- Retire las capas íntima y adventicia del tejido con dos pinzas oftálmicas y retenga la capa de medios para cosechar las células.
- Coloque la capa de medios en una fuente de cultivo de 10 cm y córtela en trozos pequeños (2-3 mm) con tijeras. Agregue 5 ml de medio de cultivo de células musculares lisas (SMCM) que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.
- Mueva el tejido pequeño al frasco de cultivo con un gotero estéril, extendiendo el tejido uniformemente. Deseche el medio de cultivo tanto como sea posible, luego invierta la botella boca abajo.
- Añadir 2 ml de SMCM en el frasco de cultivo invertido y colocarlo en la incubadora (5%CO2) a 37 °C durante 1-2 h, luego girarlo lentamente hacia arriba y añadir otros 2 ml de SMCM.
- Después de 5-7 días de incubación, cambie el SMCM con 4 ml de SMCM fresco. Generalmente, las células esporádicas del músculo liso salen en aproximadamente 2 semanas.
- Deseche lentamente el SMCM y agréguelo lentamente al cambiar el medio. Transporte la botella de cultivo lentamente cuando se mueva a una estación de microscopio; De lo contrario, los tejidos flotarán y las células crecerán lentamente.
- Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, lavar con 2 ml de PBS, digerir con 2 ml de tripsina al 0,25% y dividirlas en dos nuevos frascos de cultivo con 4 ml de SMCM fresco.
- Identificar las células a través de un análisis de inmunofluorescencia de cuatro marcadores específicos diferentes para las células del músculo liso (CNN1, SM22)14.
2. Preparación del chip PDMS
- Para polimerizar PDMS, agregue el agente de curado (componente B) a la base (componente A) en una relación de peso de A: B = 10: 1 w / w / w y mezcle el complejo completamente durante 5 min; El volumen depende de la necesidad del estudio.
- Coloque el gel PDMS preparado en un tanque de extracción al vacío durante 30-60 min y mantenga la presión por debajo de -0.8 mPa.
NOTA: La alta presión conducirá a una extracción insuficiente de pequeñas burbujas dentro del gel PDMS que afectarán el siguiente paso de la fabricación de chips. - Utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD), diseñe el molde con una estructura de marco externo de 100 mm × 40 mm × 8 mm y un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm.
- Haga a medida los moldes de las tres capas utilizando una máquina de grabado de control numérico computarizado de alta precisión. Talle el marco de los moldes y los microcanales utilizando placas de polimetacrilato de metilo (PMMA) y luego péguelos en otra placa de PMMA.
- Vierta el gel PDMS preparado en un molde con un marco exterior de 100 mm × 40 mm × 6 mm y un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm, y luego reticulación a 70 °C durante 1-2 h.
- Despegue las losas PDMS reticuladas del molde y corte las membranas PDMS comercializadas en secciones de 100 mm × 40 mm.
- Tratar las tres losas de PDMS preparadas y dos membranas de PDMS con plasma de oxígeno durante 5 min para la activación de la superficie de PDMS. Aplique los siguientes ajustes específicos: aire ambiente como gas de proceso; presión ajustada a -100 kPa; corriente establecida en 180--200 Ma; voltaje ajustado a 200 V; Tiempo de proceso a 5 min.
- Perfore agujeros en las tres losas PDMS utilizando un perforador de orificios de 1 mm para hacer la entrada y salida de aire y microcanales medios en el chip PDMS.
- Unir tres losas PDMS y dos membranas PDMS juntas en el orden: canal de aire PDMS slab (capa superior) - membrana PDMS - placa PDMS de canal medio (capa media) - membrana PDMS- canal de aire PDMS slab (capa inferior). Realice este paso bajo un microscopio estereoscópico a 4x para superponer completamente los microcanales de aire con los microcanales medios.
- Coloque el chip PDMS ensamblado en una incubadora a 70 °C durante 1 h.
- Prepare varias mangueras de látex de 1 mm de diámetro interior y 3 cm de longitud. Inserte una aguja de acero inoxidable de 1 mm de diámetro exterior y 1 cm de largo en un extremo de la manguera preparada, y luego inserte un Luer en el otro extremo de la manguera para crear el tubo conectado a los microcanales de aire y medio del chip PDMS.
- Inserte los tubos preparados en las salidas y entradas de los microcanales de aire y medio en el chip PDMS.
3. Tratamiento y esterilización de la superficie del chip PDMS
- Infundir 2 ml de colágeno de ratón de 80 mg/ml en el microcanal medio del chip PDMS usando una jeringa de 2 ml e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
- Después de la incubación, retire el colágeno del canal y recoja con una jeringa de 2 ml. Coloque los chips PDMS recubiertos de colágeno en una incubadora a 60 °C durante la noche.
- Coloque los chips PDMS en un esterilizador UV durante más de 1 h. Coloque los chips PDMS esterilizados en un banco ultralimpio en preparación para el experimento celular.
4. Siembra de células en el chip PDMS y proceso de estiramiento de células
- Cultivo 4 x 10 5 células musculares lisas humanas primarias (HASMC) de pacientes que utilizan medio de células musculares lisas (SMCM) que contienen 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora deCO2 al5% a 37 °C.
- Cuando la densidad de HASMC alcance el 80%, deseche el SMCM y lave las células con 2 mL de PBS.
- Digerir las células usando 1 mL de tripsina al 0,25% durante 2 min y centrifugar a 100 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de SMCM fresco. Use 8 ml de SMCM para cultivar las células en una placa de cultivo de 10 cm.
- Calcular el número de células utilizando un citómetro y utilizar las células a una concentración final de 2 x 105 células/ml.
- Vierta lentamente 2 ml de PBS en el microcanal medio del chip PDMS recubierto de colágeno y esterilizado y luego deséchelo con una jeringa de 2 ml.
- Vierta lentamente un total de 2 ml de 2 x 105 células /ml de suspensión HASMC en el microcanal medio del chip PDMS utilizando una jeringa de 2 ml. A continuación, cierre el Luer en la entrada y salida del chip PDMS. Colocar el chip PDMS en una incubadora (5%CO2) a 37 °C durante 1 día.
- Después de que las células se unen a la membrana PDMS en el chip PDMS, casi después de 24 h, conecte la salida del microcanal de aire en el chip PDMS al sistema de control de vacío. Cuando la célula está unida, se puede ver una forma celular alargada y normal bajo el microscopio, contrastando con las células redondas suspendidas.
- Encienda la válvula solenoide y la bomba de vacío. Abra el regulador de vacío y ajuste el nivel de presión a 10 kPa para una deformación de 7,18 ± 0,44 % y 15 kPa para una deformación de 17,28 ± 0,91 %.
- Una vez ajustados los parámetros del sistema de control, colocar los chips PDMS en una incubadora (5%CO2) a 37 °C y estirar durante 24 h.
5. Preparación del sistema de control mecánico
- Prepare varias válvulas solenoides, filtros de vacío, reguladores de vacío, una bomba de vacío, una bomba peristáltica y un controlador lógico programable (PLC) que controle la válvula solenoide.
- Programe el controlador PLC y ajuste el intervalo de tiempo de encendido / apagado a 1 Hz. Conecte las válvulas solenoides al controlador programado.
- Conecte la entrada de la bomba de vacío a los filtros de vacío y, a continuación, conecte la salida de los filtros de vacío a los reguladores de vacío. Conecte la salida de los reguladores de vacío a las válvulas solenoides y, finalmente, conecte la salida de las válvulas solenoides a las salidas de los microcanales de aire de los chips PDMS.
- Conecte la salida de la bomba peristáltica a la entrada del microcanal medio del chip PDMS y la entrada de la bomba peristáltica a la salida del chip PDMS de microcanal medio para el reemplazo del medio de cultivo y el manejo de fármacos.
- Ajuste la amplitud de la deformación por el regulador y la frecuencia de deformación por el microcontrolador.
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Representative Results
El modelo HASMC-OOC consiste en un sistema de control de vacío, un sistema de circulación y chips PDMS, y el diseño esquemático del modelo HASMC-OOC (Figura 1). El sistema de control de vacío consiste en una bomba de vacío, válvulas solenoides y un controlador PLC. Para actuar como sistema circulante, se utilizó una bomba peristáltica para refrescar el medio de cultivo celular y agregar medicamentos. El chip PDMS estaba compuesto por dos cámaras de vacío y una cámara central llena de SMCM para el crecimiento celular. De acuerdo con el diseño de la estructura del chip, se preparó el molde de PMMA, y las tres losas PDMS se prepararon vertiendo en moldes y reticulando a 70 ° C durante 2 h. Después del tratamiento con plasma, las tres losas de PDMS y dos membranas de PDMS se unieron entre sí (Figura 2). Cuando se prepararon los chips PDMS, los HASMC se cultivaron en la membrana PDMS en el chip, y los chips PDMS se conectaron al sistema de control de vacío y al sistema de circulación. En la Figura suplementaria 1 se muestra un esquema de todo el sistema. Los parámetros del chip PDMS se muestran en la Figura 3A, y las propiedades mecánicas de la membrana PDMS se muestran en la Figura 3B. Para cuantificar las deformaciones de tracción de la membrana PDMS, capturamos las deformaciones en tiempo real de las membranas PDMS desde una vista transversal del modelo microfluídico, con presiones de vacío de 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa y 30 kPa. También medimos los cambios en la longitud para evaluar la magnitud de la deformación de la membrana PDMS en diferentes anchos de canal de cultivo de 2 mm, 4 mm y 6 mm (Figura 3C-E). Se utilizaron microcanales de 6 mm de ancho en el chip PDMS. Los resultados mostraron que una presión de vacío de 10 kPa indujo una deformación de 7,18 ± 0,44% y una deformación inducida de 15 kPa de 17,28 ± 0,91% (Figura 3E).
Para verificar la viabilidad celular de la línea celular HASMC (CRL1999) en el chip PDMS, se realizó un ensayo LIVE/DEAD en los días 3 y 5 después de que se cultivaron las células. Los resultados mostraron que la viabilidad celular fue superior al 90% en el día 3 y el día 5 (Figura 4A). La tinción del citoesqueleto (actina F) de CRL1999 en el chip PDMS mostró una morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la cepa después de estirar durante 24 h (Figura 4B-C). La tinción por inmunofluorescencia de los marcadores contráctiles SM22 y CNN1 se realizó mediante HASMC-OOC después de 24 h de esfuerzo rítmico (Figura 4D-E). Para comenzar, se vertieron lentamente 2 ml de PBS en el canal y se desecharon con una jeringa de 2 ml. Posteriormente, se vertieron 2 mL de paraformaldehído al 4% (v/v) en el canal y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Después de esto, se vertieron 2 ml de Triton X-100 al 0,2% (v / v) en el canal mediante una jeringa de 2 ml y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Esto fue seguido por 2 ml de PBS que se vertieron lentamente en el canal y se desecharon con una jeringa de 2 ml después de lavar las células. A continuación, se vertieron lentamente 2 ml de albúmina sérica bovina al 5% (p/v) en el canal y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después, 1 ml de anticuerpo SM22 o CNN1 se vertió lentamente en el canal y se incubó durante la noche a 4 ° C. Después de la incubación, se vertió lentamente 1 ml de anticuerpo secundario anticonejo de cabra en el canal y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, 1 ml de solución DAPI se vertió lentamente en el canal y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Los resultados mostraron que la intensidad de fluorescencia de SM22 y CNN1 en condiciones de deformación fue mayor que en condiciones estáticas (Figura 4F). En comparación con las condiciones estáticas, los genes SM22 y CNN1 en HASMC se regularon al alza en condiciones de cepa (Figura 4G). Estos datos sugirieron que CRL1999 se alineó perpendicularmente a la dirección de la deformación y que un fenotipo contráctil fue más pronunciado en condiciones de deformación que en el cultivo celular convencional en condiciones estáticas.
Mediante el uso de TAAD relacionado con la válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) y TAAD primario derivado de pacientes con TAAD RELACIONADO CON LA VÁLVULA AÓRTICA TRICÚSPIDE (TAV-TAAD), establecimos modelos de enfermedad BAV-TAAD y TAV-TAAD. Los resultados de la tinción de actina F de los HASMC primarios derivados de pacientes BAV-TAAD y TAV-TAAD mostraron una morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la dirección de la deformación después de estirar durante 24 h (Figura 5A-B). La tinción de inmunofluorescencia mostró que la expresión de SM22 y CNN1 en los HASMC primarios derivados de pacientes BAV-TAAD y TAV-TAAD fue mayor en condiciones de deformación que en condiciones estáticas (Figura 5C-G, I). Los niveles de expresión génica de SM22 y CNN1 en los HASMC primarios derivados de pacientes BAV-TAAD y TAV-TAAD se regularon al alza en condiciones de deformación en contraste con las condiciones estáticas (Figura 5H, J). Estos resultados en HASMC primarios derivados de pacientes BAV-TAAD y TAV-TAAD en el chip PDMS fueron consistentes con los resultados de la línea celular HASMC CRL1999, lo que indica que la combinación de HASMC primarios derivados del paciente y el modelo HASMC-OOC replican las características de HASMC en TAAD, que proporciona un modelo de enfermedad in vitro BAV-TAAD y TAV-TAAD para una mayor investigación de los mecanismos moleculares de la enfermedad y la detección de fármacos.
Figura 1: Diseño esquemático del sistema HASMC-OOC. El sistema consiste en un sistema de control de vacío, un sistema de circulación y chips PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento de preparación del chip PDMS. El gel PDMS se vertió en un molde de PMMA y se reticuló a 70 °C durante 1-2 h. Luego, las tres losas PDMS y dos membranas PDMS se trataron con plasma durante 5 minutos y se unieron. Finalmente, los chips PDMS preparados se esterilizaron y se vertió lentamente una concentración de 2 x10 5 células /ml de suspensión HASMC en el microcanal medio del chip PDMS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los parámetros detallados y las propiedades mecánicas del chip PDMS. (A) Los parámetros detallados del chip PDMS. El tamaño de la losa PDMS fue de 100 mm × 40 mm × 6 mm, y el tamaño del microcanal fue de 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Los parámetros de la membrana PDMS comercial. La amplitud de estiramiento calculada de la membrana PDMS a diferentes presiones de vacío para anchos de microcanal de 2 mm (C), 4 mm (D) y 6 mm (E). Los datos muestran la media ± la desviación estándar (DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología celular, orientación y alteración fenotípica de HASMCs en condiciones de deformación cíclica. (A) Imagen representativa del ensayo LIVE/DEAD en el día 3 y el día 5 después del cultivo de la línea celular HASMC (CRL1999) en un chip PDMS. (B) tinción de actina F de CRL1999 en condiciones estáticas y de deformación. (C) La orientación celular de CRL1999 en condiciones estáticas y de deformación. Imagen representativa de la tinción por inmunofluorescencia de SM22 (D) y CNN1 (E) en CRL1999 en condiciones estáticas y de deformación. (F) La intensidad relativa de la tinción de inmunofluorescencia de SM22 y CNN1. (G) Expresión de ARNm de SM22 y CNN1 en CRL1999 en condiciones estáticas y de deformación. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas para comparar los dos grupos. Los datos muestran la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Morfología celular y alteraciones fenotípicas en BAV-TAAD y TAV-TAAD derivados de pacientes HASMC-OOC. Imagen representativa de la tinción de actina F de HASMC primarios derivados de BAV-TAAD (A) y HASMC primarios derivados de TAV-TAAD (B) en condiciones estáticas y de deformación. Tinción de inmunofluorescencia SM22 en HASMC primarios derivados de BAV-TAAD (C) y HASMC primarios derivados de TAV-TAAD (D) en condiciones estáticas y de deformación. Imagen representativa de la tinción por inmunofluorescencia de CNN1 en HASMC primarios derivados de BAV-TAAD (E) y HASMC primarios derivados de TAV-TAAD (F) en condiciones estáticas y de deformación. (G) La intensidad relativa de la tinción de inmunofluorescencia SM22 y CNN1 en HASMC primarios derivados de BAV-TAAD. (H) Expresión de ARNm de SM22 y CNN1 en HASMC primarios derivados de BAV-TAAD en condiciones estáticas y de deformación. (I) La intensidad relativa de la tinción de inmunofluorescencia SM22 y CNN1 en HASMCs primarios derivados de TAV-TAAD. (J) Expresión del ARNm de SM22 y CNN1 en HASMC primarios derivados de TAV-TAAD en condiciones estáticas y de deformación. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, se utilizaron pruebas t de Student de dos colas para comparar los dos grupos. Los datos muestran la media ± DE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Instrucción esquemática de la preparación del equipo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Con el rápido desarrollo de la tecnología microfluídica, en los últimos años han surgido modelos OOC que pueden replicar la función biológica y la estructura de uno o más órganos in vitro para aplicaciones en biología, medicina y farmacología15. La OOC puede simular funciones clave del microambiente fisiológico humano, esencial para explorar los mecanismos de la enfermedad y promover la traducción preclínicade fármacos 8,16. Aunque OOC todavía se encuentra en las primeras etapas y se necesita más información para optimizar el diseño de OOC, se ha avanzado mucho en los últimos años17,18. A diferencia de otros modelos de cultivo celular tridimensional, OOC puede imitar los parámetros biomecánicos del cuerpo humano que son esenciales para el desarrollo de tejidos y el mantenimiento de la función de los órganos. Los órganos y tejidos del sistema cardiovascular están constantemente sujetos a cizallamiento inducido por flujo de fluido y tensión cíclica in vivo. Por lo tanto, los experimentos celulares in vitro del sistema cardiovascular deben realizarse en una plataforma experimental que proporcione dichos parámetros biomecánicos para obtener resultados experimentales realistas comparables a los obtenidos de estudios in vivo.
En este estudio, establecimos un HASMC-OOC que puede controlar con precisión los parámetros de la cepa biomecánica a la que están sometidos los HASMC. Es posible controlar la velocidad del fluido y el cizallamiento del fluido al que están sometidas las células, así como controlar con precisión la amplitud, la frecuencia y el ritmo de diferentes patrones de tensión cíclica. De los muchos materiales que se han utilizado en el campo de OOC, PDMS es uno de los más ampliamente adoptados 19,20,21. PDMS es transparente, flexible, biocompatible y transpirable, y estas propiedades contribuyen a su amplio uso en el campo de los chips microfluídicos19. Los cambios de presión aplicados pueden deformar el PDMS para lograr la fuerza mecánica de contracción y relajación, y la permeabilidad del PDMS garantiza que el entorno de cultivo celular en el chip pueda ser consistente con las condiciones de incubación del 5% deCO2 a 37 °C en la incubadora. Por lo tanto, PDMS no solo proporciona una fuerza mecánica controlada a las células, sino que también proporciona un entorno de cultivo adecuado para el crecimiento celular normal. Nuestros resultados experimentales muestran que la morfología y la actividad de las células cultivadas en el chip PDMS son consistentes con las condiciones de cultivo 2D, lo que indica que PDMS es biocompatible.
En condiciones fisiológicas biomiméticas in vivo , los HASMC en la pared aórtica se someten a la cepa cíclica de aproximadamente 9%22. En condiciones patológicas, como hipertensión, dilatación aórtica y aneurisma aórtico, los HASMC están sometidos a una tensión cíclica superior al 16%23. Caracterizamos las propiedades de tracción del chip PDMS, y los resultados experimentales muestran que una presión de vacío de 10 kPa indujo una deformación de 7,18 ± 0,44% y una deformación inducida de 15 kPa de 17,28 ± 0,91%. Además, la frecuencia de la tensión y el esfuerzo cortante del fluido pueden controlarse mediante este sistema de chip PDMS. Utilizando HASMC primarios derivados de pacientes BAV-TAAD y TAV-TAAD, los mecanismos moleculares y el cribado farmacológico de estas enfermedades aórticas se pueden realizar utilizando este modelo in vitro HASMC-OOC, que puede replicar la patogénesis de la enfermedad de diferentes enfermedades aórticas. Utilizando este sistema, hemos establecido un modelo de enfermedad para estudiar la patogénesis de BAV-TAAD y revelado que el activador de la fusión mitocondrial podría rescatar parcialmente la disfunción mitocondrial en células enfermas24.
El HASMC-OOC fue diseñado en base a la inspiración y referencia del pulmón en un chip del trabajo de Ingber9. Su dispositivo replicaba los movimientos respiratorios fisiológicos de los alvéolos en el pulmón, y el chip consistía en tres capas: canales medios superiores e inferiores, una membrana PDMS porosa y dos cámaras de vacío laterales. Las cámaras de vacío laterales solo se pueden fabricar en laboratorios especializados con equipos microfluídicos avanzados. Para permitir el montaje en condiciones de laboratorio más generales, colocamos las cámaras de vacío en la parte superior e inferior del chip. Ambos enfoques de estiramiento tienen funciones similares, por lo que la estructura del chip se puede elegir de acuerdo con las condiciones del laboratorio y las necesidades de investigación para que se seleccione. Además, para establecer estructuralmente la estructura tubular de la aorta humana y obtener más muestras biológicas de las células para realizar análisis biológicos complejos y ensayos experimentales, establecimos un chip PDMS de cinco capas con canales más grandes, que consistía en un canal medio medio, dos membranas PDMS y cámaras de vacío superior e inferior. Dos membranas PDMS y los grandes canales del chip PDMS aumentaron el área de cultivo celular hasta 8,4 cm2, proporcionando suficientes muestras para el análisis de proteínas. Las plataformas previamente reportadas se enfocaron principalmente en investigar enfermedades arteriales menores, como una arteria cerebral, vaso periférico u otras enfermedades arteriales25,26. La aorta es un vaso grande con un diámetro de 25-35 mm, y la túnica media de la aorta está compuesta principalmente de células musculares lisas sujetas a una alta tensión de tracción. La patología de la aortopatía se asocia con la remodelación de la pared aórtica, la apoptosis de las células musculares lisas y el cambio fenotípico, todo lo cual puede ser regulado por el estrés mecánico. Por lo tanto, los HASMC derivados del paciente y la tensión de tracción son componentes esenciales para el éxito de HASMC-OOC. Sin embargo, hay algunas limitaciones para este estudio. HASMC-OOC no utilizó células vasculares cocultivadas, incluyendo HASMCs, células endoteliales aórticas y fibroblastos, que podrían simular mejor el microambiente in vivo de la aorta humana y pueden usarse para estudiar la interacción entre estas células. Aunque los HASMC experimentan tensión rítmica, las células todavía se cultivan en una membrana PDMS plana que no imita la matriz extracelular. En futuros estudios, superaremos estas limitaciones combinando chips microfluídicos con tecnología de bioimpresión 3D.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen que este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghai (20ZR1411700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81771971) y el Programa de Vela de Shanghai (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
