Summary
Här utvecklade vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip-modell för att replikera den in vivo biomekaniska stammen av glattmuskelceller i den mänskliga aortaväggen.
Abstract
Konventionella tvådimensionella cellodlingstekniker och djurmodeller har använts i studien av human thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD). Men mänsklig TAAD kan ibland inte karakteriseras av djurmodeller. Det finns ett uppenbart artgap mellan kliniska studier på människa och djurförsök som kan hindra upptäckten av terapeutiska läkemedel. Däremot kan den konventionella cellodlingsmodellen inte simulera in vivo biomekaniska stimuli. För detta ändamål har mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker utvecklats kraftigt under de senaste åren och gett nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som replikerar den biomekaniska mikromiljön. I denna studie utvecklades en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell för att simulera de patofysiologiska parametrarna för aortabiomekanik, inklusive amplituden och frekvensen av cyklisk belastning som upplevs av humana aorta glattmuskelceller (HASMCs) som spelar en viktig roll i TAAD. I denna modell blev morfologin hos HASMC långsträckt i form, justerad vinkelrätt mot töjningsriktningen och presenterade en mer kontraktil fenotyp under töjningsförhållanden än under statiska konventionella förhållanden. Detta överensstämde med cellorienteringen och fenotypen i infödda mänskliga aortaväggar. Dessutom, med hjälp av bicuspid aortaklaffrelaterad TAAD (BAV-TAAD) och tricuspid aortaklaffrelaterad TAAD (TAV-TAAD) patient-härledd primär HASMCs, etablerade vi BAV-TAAD och TAV-TAAD sjukdomsmodeller, som replikerar HASMC-egenskaper i TAAD. HASMC-OOC-modellen tillhandahåller en ny in vitro-plattform som kompletterar djurmodeller för att ytterligare utforska patogenesen av TAAD och upptäcka terapeutiska mål.
Introduction
Thoraxaortaaneurysm och dissektion (TAAD) är en lokaliserad dilatation eller delaminering av aortaväggen som är förknippad med hög sjuklighet och dödlighet1. Mänskliga aorta glattmuskelceller (HASMC) spelar en viktig roll i patogenesen av TAAD. HASMC är inte terminalt differentierade celler, och HASMC behåller hög plasticitet, vilket gör att de kan byta fenotyper som svar på olika stimuli2. HASMC utsätts huvudsakligen för rytmisk dragspänning in vivo, och detta är en av de viktigaste faktorerna som reglerar glattmuskelmorfologiska förändringar, differentiering och fysiologiska funktioner 3,4. Därför kan rollen av cyklisk stam i studien av HASMC inte ignoreras. Konventionella 2D-cellkulturer kan emellertid inte replikera den biomekaniska stimuleringen av cyklisk stam som upplevs av HASMC in vivo. Dessutom är konstruktionen av en TAAD-modell för djur inte lämplig för vissa typer av TAAD, såsom bicuspid aortaklaffen (BAV) -relaterad TAAD. Dessutom kan artklyftan mellan kliniska studier på människa och djurförsök inte ignoreras. Det hindrar läkemedelsöversättning i klinisk praxis. Således finns det ett brådskande behov av mer komplexa och fysiologiska system för att simulera den biomekaniska miljön in vivo i forskningen om aortasjukdomar.
Djurförsök som används inom biomedicinsk forskning och läkemedelsutveckling är kostsamma, tidskrävande och etiskt tveksamma. Dessutom misslyckas resultaten från djurstudier ofta med att förutsäga de resultat som erhållits i kliniska prövningar på människa 5,6. Bristen på humana prekliniska modeller och hög felfrekvens i kliniska prövningar har resulterat i få effektiva läkemedel för kliniken, vilket har ökat sjukvårdskostnaderna7. Därför är det angeläget att hitta andra experimentella modeller som komplement till djurmodeller. Mikrofabrikation och mikrofluidiktekniker har utvecklats mycket under de senaste åren och ger nya tekniker för att etablera organoider-på-ett-chip-modeller som avhjälper nackdelarna med traditionella 2D-cellodlingstekniker och etablerar en mer realistisk, billig och effektiv in vitro-modell för fysiologiska studier och läkemedelsutveckling. Med hjälp av mikrofluidiska anordningar etableras organ-på-chips för att odla levande celler i mikrometerstora kamrar med olika stimuli för att replikera nyckelfunktionerna hos en vävnad eller ett organ. Systemet består av enstaka eller flera mikrofluidiska mikrokanaler, där antingen en typ av cell odlas i en perfuserad kammare som replikerar funktioner av en vävnadstyp eller olika celltyper odlade på porösa membran för att återskapa gränssnitt mellan olika vävnader. Mikrofluidikbaserade organoider i kombination med patient-härledda celler har den unika fördelen att överbrygga den stora artskillnaden mellan mus- och mänskliga sjukdomsmodeller och övervinna nackdelarna med traditionell 2D-cellodling för sjukdomsmekanismforskning och läkemedelsupptäckt. Med den snabba utvecklingen av mikrofluidik under de senaste åren har forskare insett användbarheten av in vitro-organ-on-a-chip (OOC) -modeller som replikerar komplexa in vivo biologiska parametrar8. Dessa mikrofluidiska organoider simulerar in vitro biomekaniska miljöer, såsom cyklisk stam, skjuvspänning och vätsketryck, vilket ger en tredimensionell (3D) cellodlingsmiljö. Hittills har flera OOC-modeller etablerats för att simulera biomekaniska stimuli i organ som lungan9, njure 10, lever 11, tarm12 och hjärta 13, men dessa har inte tillämpats i stor utsträckning för studier av mänsklig aortasjukdom.
I denna studie presenterar vi en human aorta glattmuskelcell organ-on-a-chip (HASMC-OOC) modell som kan styra de biomimetiska mekaniska krafter och rytmer som tillämpas på TAAD patient-härledda primära HASMCs. Chipet består av treskiktade tjocka plattor av polydimetylsiloxan (PDMS) etsade med kanaler och två kommersialiserade mycket flexibla PDMS-membran. HASMC odlas på PDMS-membranen. Kanalen i mitten av chipet är fylld med ett odlingsmedium för cellodling. Chipets övre och nedre kanaler är anslutna till ett vakuumtryckförsörjningssystem som kan styra rytmen och frekvensen för mekanisk dragspänning hos PDMS-membranen. Rytmisk belastning som upplevs av HASMC kan simuleras i HASMC-OOC, vilket replikerar den biomekaniska mikromiljön hos vävnad eller organ som inte är funktionellt uppnåeliga med konventionella 2D-odlingssystem. Med fördelen av högupplöst, realtidsavbildning och biomekanisk mikromiljö kan de biokemiska, genetiska och metaboliska aktiviteterna hos levande celler studeras för vävnadsutveckling, organfysiologi, sjukdomsetiologi, molekylära mekanismer och biomarköridentifiering, hjärt-kärlsjukdom och aortasjukdom. I kombination med vävnadsspecifika och patientceller kan detta system användas för läkemedelsscreening, personlig medicin och toxicitetstestning. Denna HASMC-OOC-modell ger en ny in vitro-plattform för att studera patogenesen av aortasjukdomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana aortaprover användes för primär HASMC-isolering under godkännande av Zhongshan Hospital, Fudan University Ethics Committee (NO. B2020-158). Aortaprover samlades in från patienter som genomgick stigande aortakirurgi vid Zhongshan Hospital, Fudan University. Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla patienter före deltagandet.
1. Primär human aorta glattmuskelcellisolering
- Tvätta den högra sidoregionen av den stigande aortan med steril PBS, 1x-2x.
- Ta bort intima och adventitia-skikten i vävnaden med två oftalmiska pincett och behåll medieskiktet för att skörda cellerna.
- Lägg medieskiktet på en 10 cm odlingsskål och skär det i små bitar (2-3 mm) med sax. Tillsätt 5 ml glattmuskelcellsodlingsmedium (SMCM) som innehåller 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin.
- Flytta den lilla vävnaden i odlingsflaskan med en steril droppare och sprid vävnaden jämnt. Kassera odlingsmediet så mycket som möjligt och vänd sedan flaskan upp och ner.
- Tillsätt 2 ml SMCM i den inverterade odlingsflaskan och placera den i inkubatorn (5%CO2) vid 37 ° C i 1-2 timmar, vrid den sedan långsamt höger sida uppåt och tillsätt ytterligare 2 ml SMCM.
- Efter 5-7 dagars inkubation, byt ut SMCM med 4 ml färsk SMCM. I allmänhet klättrar sporadiska glattmuskelceller ut på cirka 2 veckor.
- Kassera långsamt SMCM och tillsätt den långsamt när du byter medium. Transportera odlingsflaskan långsamt när du flyttar till en mikroskopstation; Annars kommer vävnaderna att flyta, och cellerna växer långsamt.
- När cellerna når cirka 80% sammanflöde, tvätta med 2 ml PBS, smälta med 2 ml 0,25% trypsin och dela dem i två nya odlingsflaskor med 4 ml färsk SMCM.
- Identifiera cellerna genom en immunofluorescensanalys av fyra olika specifika markörer för glattmuskelceller (CNN1, SM22)14.
2. Beredning av PDMS-chip
- För att polymerisera PDMS, tillsätt härdningsmedel (B-komponent) till basen (A-komponent) vid ett viktförhållande av A: B = 10: 1 w / w och blanda komplexet helt i 5 minuter; Volymen beror på studiens behov.
- Placera den beredda PDMS-gelén i en vakuumutsugningstank i 30-60 minuter och håll trycket under -0,8 mPa.
OBS: Högt tryck kommer att leda till otillräcklig extraktion av små bubblor inuti PDMS-gelén som kommer att påverka nästa steg i chiptillverkningen. - Med hjälp av CAD-programvara (Computer-Aided Design) kan du designa formen med en 100 mm × 40 mm × 8 mm yttre ramkonstruktion och en 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal.
- Skräddarsy formarna i de tre lagren med hjälp av en dator med hög precision numerisk kontrollgravyrmaskin. Skär ut ramen på formarna och mikrokanalerna med hjälp av polymetylmetakrylatplattor (PMMA) och limma dem sedan på en annan PMMA-platta.
- Häll den beredda PDMS-gelén på en form med en 100 mm × 40 mm × 6 mm yttre ram och 70 mm × 6 mm × 4 mm kanal och tvärbinda sedan vid 70 ° C i 1-2 timmar.
- Dra av de tvärbundna PDMS-plattorna från formen och skär de kommersialiserade PDMS-membranen i 100 mm × 40 mm sektioner.
- Behandla de tre beredda PDMS-plattorna och två PDMS-membran med syreplasma i 5 minuter för PDMS-ytaktivering. Använd följande specifika inställningar: rumsluft som processgas; tryck inställt på -100 kPa; nuvarande inställd på 180--200 Ma; spänning inställd på 200 V; processtid till 5 min.
- Stansa hål på de tre PDMS-plattorna med en 1 mm hålslagare för att göra inlopp och utlopp av luft och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet.
- Bind ihop tre PDMS-plattor och två PDMS-membran i ordningen: luftkanal PDMS-platta (toppskikt) - PDMS-membran - PDMS-platta med medelkanal (mellanlager) - PDMS-membran- luftkanal PDMS-platta (bottenskikt). Utför detta steg under ett stereoskopiskt mikroskop vid 4x för att helt överlappa luftmikrokanalerna med de medelstora mikrokanalerna.
- Placera det monterade PDMS-chipet i en 70 °C inkubator i 1 h.
- Förbered flera 1 mm innerdiameter och 3 cm långa latexslangar. Sätt in en 1 mm ytterdiameter och 1 cm lång nål i rostfritt stål i ena änden av den förberedda slangen och sätt sedan in en Luer i den andra änden av slangen för att skapa röret anslutet till luften och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet.
- Sätt in de förberedda rören i utloppen och inloppen i luften och medelstora mikrokanaler på PDMS-chipet.
3. PDMS-chip ytbehandling och sterilisering
- Infusera 2 ml 80 mg/ml muskollagen i PDMS-chipets mikrokanal med en 2 ml spruta och inkubera vid rumstemperatur i 30 minuter.
- Efter inkubation, ta bort kollagenet från kanalen och kom ihåg med en 2 ml spruta. Placera de kollagenbelagda PDMS-chipsen i en 60 °C inkubator över natten.
- Placera PDMS-chipsen i en UV-sterilisator i mer än 1 timme. Placera de steriliserade PDMS-chipsen på en ultraren bänk som förberedelse för cellexperimentet.
4. Cellsådd på PDMS-chipet och cellsträckningsprocessen
- Odling 4 x 10 5 primära humana glattmuskelceller (HASMC) från patienter som använder glattmuskelcellmedium (SMCM) innehållande 2% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin i en5% CO 2-inkubator vid 37 ° C.
- När HASMC-densiteten når 80%, kassera SMCM och tvätta cellerna med 2 ml PBS.
- Smält cellerna med 1 ml 0,25% trypsin i 2 minuter och centrifugera vid 100 x g i 5 min. Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 1 ml färsk SMCM. Använd 8 ml SMCM för att odla cellerna på en 10 cm odlingsskål.
- Beräkna cellnumret med hjälp av en cytometer och använd cellerna i en slutlig koncentration av 2 x 105 celler/ml.
- Häll långsamt 2 ml PBS i den kollagenbelagda och steriliserade PDMS-chipmediemikrokanalen och kassera senare med en 2 ml spruta.
- Häll långsamt totalt 2 ml 2 x 105 celler/ml HASMC-suspension i PDMS-chipets mediummikrokanal med en 2 ml spruta. Stäng sedan Luer vid ingången och utgången av PDMS-chipet. Placera PDMS-chipet i en inkubator (5% CO2) vid 37 ° C i 1 dag.
- När cellerna är fästa vid PDMS-membranet i PDMS-chipet, nästan efter 24 timmar, ansluter du luftmikrokanalens utlopp på PDMS-chipet till vakuumstyrsystemet. När cellen är fäst kan en långsträckt, normal cellulär form ses under mikroskopet, i kontrast till de suspenderade runda cellerna.
- Slå på magnetventilen och vakuumpumpen. Öppna vakuumregulatorn och justera trycknivån till 10 kPa för 7,18 ± 0,44% belastning och 15 kPa för 17,28 ± 0,91% belastning.
- När parametrarna för styrsystemet har ställts in, placera PDMS-chipsen i en inkubator (5% CO2) vid 37 ° C och sträck i 24 timmar.
5. Förberedelse av det mekaniska styrsystemet
- Förbered flera magnetventiler, vakuumfilter, vakuumregulatorer, en vakuumpump, en peristaltisk pump och en programmerbar logisk styrenhet (PLC) som styr magnetventilen.
- Programmera PLC-styrenheten och ställ in på/av-tidsintervallet till 1 Hz. Anslut magnetventilerna till den programmerade styrenheten.
- Anslut vakuumpumpens inlopp till vakuumfiltren och anslut sedan vakuumfiltrens utlopp till vakuumregulatorerna. Anslut vakuumregulatorernas utlopp till magnetventiler och anslut slutligen magnetventilernas utlopp till utloppen på luftmikrokanalerna på PDMS-chipsen.
- Anslut utloppet från den peristaltiska pumpen till inloppet till PDMS-chipets mediummikrokanal och inloppet till den peristaltiska pumpens utlopp till utloppet från det medelstora mikrokanals PDMS-chipet för byte av odlingsmedium och läkemedelshantering.
- Justera amplituden för stammen av regulatorn och töjningsfrekvensen av mikrokontrollern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HASMC-OOC-modellen består av ett vakuumstyrsystem, ett cirkulationssystem och PDMS-chips och den schematiska utformningen av HASMC-OOC-modellen (figur 1). Vakuumstyrsystemet består av en vakuumpump, magnetventiler och en PLC-styrenhet. För att fungera som cirkulationssystem användes en peristaltisk pump för att uppdatera cellodlingsmediet och tillsätta läkemedel. PDMS-chipet bestod av två vakuumkammare och en mellankammare fylld med SMCM för celltillväxt. Enligt utformningen av chipstrukturen framställdes PMMA-formen och de tre PDMS-plattorna framställdes genom att hälla i formar och tvärbinda vid 70 ° C i 2 timmar. Efter behandling med plasma bands de tre PDMS-plattorna och två PDMS-membranen samman (figur 2). När PDMS-chipsen förbereddes odlades HASMC: erna på PDMS-membranet i chipet, och PDMS-chipsen var anslutna till vakuumstyrsystemet och cirkulationssystemet. Ett schema över hela systemet visas i kompletterande figur 1. PDMS-chipparametrarna visas i figur 3A och de mekaniska egenskaperna hos PDMS-membranet visas i figur 3B. För att kvantifiera dragstammarna i PDMS-membranet fångade vi realtidsdeformationerna av PDMS-membranen från en tvärsnittsvy av den mikrofluidiska modellen, med vakuumtryck på 0 kPa, 10 kPa, 15 kPa, 20 kPa, 25 kPa och 30 kPa. Vi mätte också förändringarna i längd för att utvärdera PDMS-membranets töjningsstorlek i olika odlingskanalbredder på 2 mm, 4 mm och 6 mm (figur 3C-E). Mikrokanaler 6 mm i bredd användes i PDMS-chipet. Resultaten visade att ett vakuumtryck på 10 kPa inducerade 7,18 ± 0,44% töjning och 15 kPa inducerade 17,28 ± 0,91% töjning (figur 3E).
För att verifiera cellviabiliteten hos HASMC-cellinjen (CRL1999) i PDMS-chipet utfördes en LIVE/DEAD-analys på dag 3 och 5 efter att cellerna odlats. Resultaten visade att cellviabiliteten var högre än 90% vid dag 3 och dag 5 (figur 4A). Cytoskelettfärgning (F-aktin) av CRL1999 i PDMS-chipet visade normal cellmorfologi och celler riktade vinkelrätt mot stammen efter sträckning i 24 timmar (figur 4B-C). Immunofluorescensfärgning av kontraktilmarkörerna SM22 och CNN1 utfördes med användning av HASMC-OOC efter 24 timmars rytmisk belastning (figur 4D-E). Till att börja med hälldes 2 ml PBS långsamt i kanalen och kasserades med en 2 ml spruta. Därefter hälldes 2 ml 4% (v / v) paraformaldehyd i kanalen och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter hälldes 2 ml 0,2% (v / v) Triton X-100 i kanalen med en 2 ml spruta och inkuberades i 15 min vid rumstemperatur. Detta följdes av att 2 ml PBS långsamt hälldes i kanalen och kasserades med en 2 ml spruta efter tvättning av cellerna. Därefter hälldes 2 ml 5% (w / v) bovint serumalbumin långsamt i kanalen och inkuberades i 30 minuter vid rumstemperatur. Därefter hälldes 1 ml SM22- eller CNN1-antikropp långsamt i kanalen och inkuberades över natten vid 4 °C. Efter inkubation hälldes 1 ml get-anti-kanin sekundär antikropp långsamt i kanalen och inkuberades i 1 h vid rumstemperatur. Slutligen hälldes 1 ml DAPI-lösning långsamt i kanalen och inkuberades i 10 minuter vid rumstemperatur. Resultaten visade att fluorescensintensiteten för SM22 och CNN1 under töjningsförhållanden var högre än under statiska förhållanden (figur 4F). Jämfört med statiska förhållanden uppreglerades SM22- och CNN1-generna i HASMC under stamförhållanden (figur 4G). Dessa data tydde på att CRL1999 anpassade sig vinkelrätt mot töjningsriktningen och att en kontraktil fenotyp var mer uttalad under töjningsförhållanden än under konventionell cellodling under statiska förhållanden.
Med hjälp av bicuspid aortaklaffrelaterad TAAD (BAV-TAAD) och tricuspid aortaklaffrelaterad TAAD (TAV-TAAD) patient-härledd primär HASMC etablerade vi BAV-TAAD och TAV-TAAD sjukdomsmodeller. Resultaten av F-aktinfärgning av BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledda primära HASMC visade normal cellmorfologi och celler i linje vinkelrätt mot töjningsriktningen efter sträckning i 24 timmar (figur 5A-B). Immunofluorescensfärgning visade att SM22- och CNN1-uttrycket i BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledda primära HASMC var högre under töjningsförhållanden än under statiska förhållanden (figur 5C-G,I). Genuttrycksnivåerna för SM22 och CNN1 i BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledda primära HASMC uppreglerades under stamförhållanden i motsats till statiska förhållanden (figur 5H,J). Dessa resultat i BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledda primära HASMCs i PDMS-chipet överensstämde med resultaten från HASMC-cellinjen CRL1999, vilket indikerar att kombinationen av patient-härledda primära HASMCs och HASMC-OOC-modellen replikerar HASMC-egenskaper i TAAD, vilket ger en BAV-TAAD och TAV-TAAD in vitro-sjukdomsmodell för vidare undersökning av sjukdomens molekylära mekanismer och läkemedelsscreening.
Bild 1: Schematisk design av HASMC-OOC-systemet. Systemet består av ett vakuumkontrollsystem, ett cirkulationssystem och PDMS-chips. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förberedelseförfarande för PDMS-chip. PDMS-gelén hälldes i en PMMA-form och tvärbands vid 70 °C i 1-2 timmar. Därefter behandlades de tre PDMS-plattorna och två PDMS-membran med plasma i 5 minuter och bands ihop. Slutligen steriliserades de beredda PDMS-chipsen och en koncentration av 2 x 105 celler / ml HASMC-suspension hälldes långsamt i PDMS-chipets mediummikrokanal. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: De detaljerade parametrarna och mekaniska egenskaperna hos PDMS-chipet. (A) De detaljerade parametrarna för PDMS-chipet. PDMS-plattans storlek var 100 mm × 40 mm × 6 mm och mikrokanalstorleken var 70 mm × 6 mm × 4 mm. (B) Parametrarna för det kommersiella PDMS-membranet. Den beräknade sträckamplituden för PDMS-membranet vid olika vakuumtryck för mikrokanalbredder på 2 mm (C), 4 mm (D) och 6 mm (E). Data visar medelvärdet ± standardavvikelse (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Cellmorfologi, orientering och fenotypförändring av HASMC under cykliska töjningsförhållanden. (A) Representativ bild av LIVE/DEAD-testet vid dag 3 och dag 5 efter HASMC-cellinjen (CRL1999) som odlas på ett PDMS-chip. B) F-aktinfärgning av CRL1999 under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. (C) Cellorienteringen av CRL1999 under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. Representativ bild av immunofluorescensfärgningen av SM22 (D) och CNN1 (E) i CRL1999 under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. (F) Den relativa intensiteten av immunofluorescensfärgning av SM22 och CNN1. (G) SM22 - och CNN1 mRNA-uttryck i CRL1999 under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tvåsidiga Students t-tester användes för att jämföra de två grupperna. Data visar medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Cellmorfologi och fenotypiska förändringar i BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledd HASMC-OOC. Representativ bild av F-aktinfärgning av BAV-TAAD (A)-härledda primära HASMC och TAV-TAAD (B)-härledda primära HASMC under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. SM22 immunofluorescensfärgning i BAV-TAAD (C)-härledda primära HASMCs och TAV-TAAD (D)-härledda primära HASMC under statiska och töjningsförhållanden. Representativ bild av immunofluorescensfärgningen av CNN1 i BAV-TAAD (E)-härledda primära HASMC och TAV-TAAD (F)-härledda primära HASMC under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. (G) Den relativa intensiteten av SM22- och CNN1-immunofluorescensfärgning i BAV-TAAD-härledda primära HASMCs. (H) SM22 - och CNN1 mRNA-uttryck i BAV-TAAD-härledda primära HASMC under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. (I) Den relativa intensiteten av SM22- och CNN1-immunofluorescensfärgning i TAV-TAAD-härledda primära HASMCs. (J) SM22 - och CNN1 mRNA-uttryck i TAV-TAAD-härledda primära HASMC under statiska förhållanden och töjningsförhållanden. n = 3, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001, tvåsidiga Students t-tester användes för att jämföra de två grupperna. Uppgifterna visar medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Schematisk instruktion för förberedelse av utrustning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den snabba utvecklingen av mikrofluidisk teknik har OOC-modeller som kan replikera den biologiska funktionen och strukturen hos ett eller flera organ in vitro dykt upp de senaste åren för tillämpningar inom biologi, medicin och farmakologi15. OOC kan simulera nyckelfunktioner i den mänskliga fysiologiska mikromiljön, vilket är viktigt för att utforska sjukdomsmekanismer och främja preklinisk läkemedelsöversättning 8,16. Även om OOC fortfarande är i ett tidigt skede och mer input behövs för att optimera utformningen av OOC, har stora framsteg gjorts under de senaste åren17,18. Till skillnad från andra tredimensionella cellodlingsmodeller kan OOC efterlikna de biomekaniska parametrarna i människokroppen som är väsentliga för vävnadsutveckling och upprätthållande av organfunktion. Organ och vävnader i hjärt-kärlsystemet utsätts ständigt för vätskeflödesinducerad skjuvning och cyklisk spänning in vivo. Därför måste in vitro-cellulära experiment av hjärt-kärlsystemet utföras i en experimentell plattform som tillhandahåller sådana biomekaniska parametrar för att få realistiska experimentella resultat som är jämförbara med dem som erhållits från in vivo-studier.
I denna studie etablerade vi en HASMC-OOC som exakt kan styra parametrarna för den biomekaniska stammen som HASMC utsätts för. Det är möjligt att styra vätskehastigheten och vätskeskjuvningen som cellerna utsätts för, samt att exakt kontrollera amplituden, frekvensen och rytmen för olika mönster av cyklisk belastning. Av de många material som har använts inom OOC-området är PDMS ett av de mest antagna 19,20,21. PDMS är transparent, flexibelt, biokompatibelt och andas, och dessa egenskaper bidrar till dess breda användning inom mikrofluidiska chips19. Applicerade tryckförändringar kan deformera PDMS för att uppnå den mekaniska kraften av sammandragning och avkoppling, och permeabiliteten hos PDMS säkerställer att cellodlingsmiljön på chipet kan överensstämma med inkubationsförhållandena för 5%CO2 vid 37 ° C i inkubatorn. Därför ger PDMS inte bara kontrollerad mekanisk kraft till cellerna utan ger också en odlingsmiljö som är lämplig för normal celltillväxt. Våra experimentella resultat visar att morfologin och aktiviteten hos celler odlade i PDMS-chipet överensstämmer med 2D-odlingsförhållanden, vilket indikerar att PDMS är biokompatibelt.
Under biomimetiska in vivo fysiologiska förhållanden utsätts HASMC i aortaväggen för den cykliska stammen på cirka 9%22. Vid patologiska tillstånd, såsom högt blodtryck, aorta dilatation och aortaaneurysm, utsätts HASMC för cyklisk stam större än 16%23. Vi karakteriserade dragegenskaperna hos PDMS-chipet, och de experimentella resultaten visar att ett vakuumtryck på 10 kPa inducerade 7,18 ± 0,44% belastning och 15 kPa inducerade 17,28 ± 0,91% belastning. Dessutom kan frekvensen av töjnings- och vätskeskjuvspänningen styras av detta PDMS-chipsystem. Med hjälp av BAV-TAAD och TAV-TAAD patient-härledda primära HASMC kan de molekylära mekanismerna och läkemedelsscreeningen av dessa aortasjukdomar utföras med hjälp av denna HASMC-OOC in vitro-modell , som kan replikera sjukdomspatogenesen av olika aortasjukdomar. Med hjälp av detta system har vi etablerat en sjukdomsmodell för att studera patogenesen av BAV-TAAD och avslöjat att mitokondriell fusionsaktivator delvis kan rädda mitokondriell dysfunktion i sjuka celler24.
HASMC-OOC designades baserat på inspiration och referens från lung-on-a-chip från Ingbers arbete9. Deras enhet replikerade fysiologiska andningsrörelser hos alveolerna i lungan, och chipet bestod av tre lager: övre och nedre medelkanaler, ett poröst PDMS-membran och två sidovakuumkammare. Sidovakuumkammare kan endast tillverkas i specialiserade laboratorier med avancerad mikrofluidisk utrustning. För att möjliggöra montering under mer allmänna laboratorieförhållanden placerade vi vakuumkamrarna på toppen och botten av chipet. Båda sträckningsmetoderna har liknande funktioner, så chipstrukturen kan väljas enligt laboratorieförhållandena och forskningsbehoven så attvald. För att strukturellt fastställa den rörformiga strukturen hos den mänskliga aortan och erhålla fler biologiska prover från cellerna för att genomföra ytterligare komplexa biologiska analyser och experimentella analyser, etablerade vi dessutom ett femskiktigt PDMS-chip med större kanaler, som bestod av en mellersta mediumkanal, två PDMS-membran och topp- och bottenvakuumkammare. Två PDMS-membran och de stora kanalerna i PDMS-chipet ökade cellodlingsområdet upp till 8,4 cm2, vilket gav tillräckligt med prover för proteinanalys. De tidigare rapporterade plattformarna fokuserade främst på att undersöka mindre artärsjukdomar, såsom en cerebral artär, perifert kärl eller andra arteriella sjukdomar25,26. Aortan är ett stort kärl med en diameter på 25-35 mm, och tunica-mediet i aortan består huvudsakligen av glattmuskelceller som utsätts för hög dragkraft. Patologin för aortopati är förknippad med ombyggnad av aortaväggen, glattmuskelcellsapoptos och fenotypisk växling, som alla kan regleras av mekanisk stress. Således är patient-härledda HASMCs och dragspänning viktiga komponenter för framgången för HASMC-OOC. Det finns dock vissa begränsningar för denna studie. HASMC-OOC använde inte odlade vaskulära celler, inklusive HASMC, aortaendotelceller och fibroblaster, som bättre kan simulera in vivo-mikromiljön hos den mänskliga aortan och kan användas för att studera interaktionen mellan dessa celler. Även om HASMC upplever rytmisk belastning, odlas cellerna fortfarande på ett platt PDMS-membran som inte efterliknar den extracellulära matrisen. I framtida studier kommer vi att övervinna dessa begränsningar genom att kombinera mikrofluidiska chips med 3D-bioprintningsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner att detta arbete stöddes av bidrag från Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (20ZR1411700), National Natural Science Foundation of China (81771971) och Shanghai Sailing Program (22YF1406600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0099-100ml | Used for cell immobilization |
| Alexa Fluor 350-labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0408 | Antibodies used for immunostaining |
| Bovine serum albumin | Beyotime | ST025-20g | |
| Calcium AM/PI | Invitrogen | L3224 | |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | |
| CNN1 | Abcam | Ab46794 | |
| Commercial flexible PDMS membrane |
Hangzhou Bald Advanced Materials | KYQ-200 | |
| F-actin | Invitrogen | R415 | |
| FBS | Sigma | M8318 | |
| Hoses | Runze Fluid | 96410 | 1 mm inner diameter; 3 mm outer diameter; 1 mm wall thickness; Official website address: https://www.runzefluidsystem.com |
| Human aortic smooth muscle cell line CRL1999 |
ATCC | Lot Number:70019189 | |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to identify fluorescence intensity |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. |
|
| Luer | Runze Fluid | RH-M016 | Official website address: https://www.runzefluidsystem.com. |
| Microscope | Olympus | ||
| mouse collagen | Sigma | C7661 | |
| Oxygen plasma | Changzhou Hongming Instrument | HM-Plasma5L | |
| Pasteur pipette | Biologix | 30-0138A1 | |
| PBS | Beyotime | C0221A | |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| peristaltic pump | Kamoer | F01A-STP-B046 | |
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| PLC controller | Zhejiang Jun Teng (BenT) CNC factory | BR010-11T8X2M | The detailed program setting can be found in supplementary. Official website address: files.http://www.btcnc.net |
| polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| SM22 | Abcam | ab14106 | |
| SMCM | ScienCell | Cat 1101 | |
| solenoid valve | SMC (China) | VQZ300 | |
| Syringe | Becton,Dickinson and Company | 300841 | |
| Triton-X 100 | Beyotime | ST795 | To penetrate cell membranes |
| Trizol | Invitrogen | 10296010 | Used for RNA extraction |
| trypsin | Sigma | 15400054 | |
| vacuum filter | SMC (China) | ZFC5-6 | Official website address: https://www.smc.com.cn |
| vacuum pump | Kamoer | KVP15-KL-S | |
| vacuum regulator | AirTAC | GVR-200-06 | |
| Primers | |||
| Primer Name | Forward (5’ to 3’) | Reverse (5’ to 3’) | |
| SM22 | CCGTGGAGATCCCAACTGG | CCATCTGAAGGCCAATGACAT | |
| CNN1 | CTCCATTGACTCGAACGACTC | CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA |
References
- Olsson, C., Thelin, S., Ståhle, E., Ekbom, A., Granath, F. Thoracic aortic aneurysm and dissection: increasing prevalence and improved outcomes reported in a nationwide population-based study of more than 14,000 cases from 1987 to 2002. Circulation. 114 (24), 2611-2618 (2006).
- van Varik, B. J., et al. Mechanisms of arterial remodeling: lessons from genetic diseases. Frontiers in Genetics. 3 (290), 1-10 (2012).
- Halka, A. T., et al. The effects of stretch on vascular smooth muscle cell phenotype in vitro. Cardiovascular Pathology. 17 (2), 98-102 (2008).
- Wang, Y., et al. Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).
- Fabre, K., et al. Introduction to a manuscript series on the characterization and use of microphysiological systems (MPS) in pharmaceutical safety and ADME applications. Lab on a Chip. 20, 1049-1057 (2020).
- Golding, H., Khurana, S., Zaitseva, M. What is the predictive value of animal models for vaccine efficacy in humans? The importance of bridging studies and species-independent correlates of protection. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (4), 028902 (2018).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews. Genetics. 25, 1-25 (2022).
- Niu, L., et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomaterials Science & Engineering. 5 (9), 4844-4851 (2019).
- Huh, D., et al. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1 (69), 1-25 (2017).
- Yoon No, D., Lee, K. H., Lee, J., Lee, S. H. 3D liver models on a microplatform: well-defined culture, engineering of liver tissue and liver-on-a-chip. Lab on a Chip. 15 (19), 3822-3837 (2015).
- Bein, A., et al. Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).
- Jastrzebska, E., Tomecka, E., Jesion, I. Heart-on-a-chip based on stem cell biology. Biosensors & Bioelectronics. 75 (1), 67-81 (2016).
- Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity. Netherlands Heart Journal. 15 (3), 100-108 (2007).
- Perestrelo, A. R., Águas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic organ/body-on-a-chip devices at the convergence of biology and microengineering. Sensors. 15 (12), 31142-31170 (2015).
- Liu, Y., et al. Construction of cancer-on-a-chip for drug screening. Drug Discovery Today. 26 (8), 1875-1890 (2021).
- Yang, Q., et al. Design of organ-on-a-chip to improve cell capture efficiency. International Journal of Mechanical Sciences. 209, 106705 (2021).
- Yang, Q., Lian, Q., Xu, F. Perspective: Fabrication of integrated organ-on-a-chip via bioprinting. Biomicrofluidics. 11 (3), 031301 (2017).
- Mohammed, M. I., et al. Fabrication of microfluidic devices: improvement of surface quality of CO2 laser machined poly (methylmethacrylate) polymer. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (1), 015021 (2017).
- Tsao, C. W. Polymer microfluidics: Simple, low-cost fabrication process bridging academic lab research to commercialized production. Micromachines. 7 (12), 225-236 (2016).
- Kirschbaum, S. E., Baeumner, A. J. A review of electrochemiluminescence (ECL) in and for microfluidic analytical devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (14), 3911-3926 (2015).
- Stefanadis, C., et al. Pressure-diameter relation of the human aorta. A new method of determination by the application of a special ultrasonic dimension catheter. Circulation. 92 (8), 2210-2219 (1995).
- Williams, B. Mechanical influences on vascular smooth muscle cell function. Journal of Hypertension. 16 (12), 1921-1929 (1998).
- Abudupataer, M., et al. Aorta smooth muscle-on-a-chip reveals impaired mitochondrial dynamics as a therapeutic target for aortic aneurysm in bicuspid aortic valve disease. eLife. 10, 69310 (2021).
- Poussin, C., et al. 3d human microvessel-on-a-chip model for studying monocyte-to-endothelium adhesion under flow - application in systems toxicology. Altex. 1, 47-63 (2020).
- Yasotharan, S., Pinto, S., Sled, J. G., Bolz, S., Gunther, A. Artery-on-a-chip platform for automated, multimodal assessment of cerebral blood vessel structure and function. Lab on a Chip. 15, 2660-2669 (2015).
