Summary
Den flydende biopsi har revolutioneret vores tilgang til onkologiske translationelle undersøgelser, hvor prøveindsamling, kvalitet og opbevaring er afgørende skridt for dens vellykkede kliniske anvendelse. Her beskriver vi en standardiseret og valideret protokol til downstream cirkulerende-frie DNA-applikationer, der kan anvendes i de fleste translationelle forskningslaboratorier.
Abstract
Udtrykket flydende biopsi (LB) refererer til molekyler såsom proteiner, DNA, RNA, celler eller ekstracellulære vesikler i blod og andre kropsvæsker, der stammer fra den primære og / eller metastatiske tumor. LB er opstået som en grundpille i translationel forskning og er begyndt at blive en del af klinisk onkologisk praksis, hvilket giver et minimalt invasivt alternativ til fast biopsi. LB tillader realtidsovervågning af en tumor via en minimalt invasiv prøveekstraktion, såsom blod. Ansøgningerne omfatter tidlig påvisning af kræft, patientopfølgning til påvisning af sygdomsprogression, vurdering af minimal restsygdom og potentiel identifikation af molekylær progression og resistensmekanisme. For at opnå en pålidelig analyse af disse prøver, der kan rapporteres i klinikken, bør de præanalytiske procedurer overvejes nøje og følges nøje. Prøveindsamling, kvalitet og opbevaring er afgørende trin, der bestemmer deres anvendelighed i downstream-applikationer. Her præsenterer vi standardiserede protokoller fra vores arbejdsmodul til flydende biopsi til indsamling, behandling og opbevaring af plasma- og serumprøver til downstream flydende biopsianalyse baseret på cirkulerende frit DNA. De protokoller, der præsenteres her, kræver standardudstyr og er tilstrækkeligt fleksible til at blive anvendt i de fleste laboratorier med fokus på biologiske procedurer.
Introduction
Udtrykket "flydende biopsi" blev defineret i 20101 som tilstedeværelsen af molekyler (fx protein, deoxyribonukleinsyre (DNA), ribonukleinsyre (RNA)), celler eller ekstracellulære vesikler (fx exosomer) i blod og andre kropsvæsker, der stammer fra den primære tumor. Anvendelsen af flydende biopsiprøver har revolutioneret translationel onkologisk forskning, da vævsbiopsier, der er begrænset til en bestemt region på et bestemt tidspunkt, kan gå glip af relevante kloner på grund af tumor heterogenitet. Derudover spiller flydende biopsi en relevant rolle i tumortyper, hvor primært væv er knappe eller ikke tilgængelige, da det kan undgå en invasiv biopsi, hvilket reducerer omkostninger og risiko for patienter. Desuden udvikler tumormolekylære egenskaber sig konstant hovedsageligt på grund af terapitrykket, og flydende biopsiprøver kan fange tumorklonaldynamikken, da de kan tages i længderetningen i forskellige kliniske og terapeutiske tider af sygdommen, såsom baseline, ved behandling, bedste respons og ved sygdomsprogression eller endda før. Begrebet "real-time flydende biopsi" betyder, at dynamiske ændringer i tumoren kan overvåges i realtid, hvilket muliggør præcisionsmedicin i denne sygdom. Den flydende biopsi har adskillige potentielle anvendelser i klinikken, herunder screening og tidlig påvisning af kræft, realtidsovervågning af sygdom, påvisning af minimal restsygdom, undersøgelse af mekanismer til behandlingsresistens og stratificering af patienter på terapeutisk niveau1. Tidlig påvisning af sygdomsgenfald og progression er et uopfyldt klinisk behov i mange tumortyper og er en nøglefaktor for at øge kræftpatienters overlevelse og livskvalitet. Rutinemæssige billeddannelsesmetoder og opløselige tumormarkører kan mangle den følsomhed og / eller specificitet, der kræves til denne opgave. Således er der et presserende behov for nye forudsigelige markører i klinikken, såsom dem, der er baseret på cirkulerende frie nukleinsyrer.
De typer prøver, der anvendes til flydende biopsiundersøgelser, omfatter, men er ikke begrænset til, blod-, urin-, spyt- og afføringsprøver. Andre tumorspecifikke prøver kan være celleaspirater, cerebrospinalvæske, pleurvæske, cyste og ascitesvæske, sputum og bugspytkirtelsaft2. De tidligere væsker kan indeholde forskellige typer kræftafledte materialer, cirkulerende tumorceller (CTC) eller fragmenter såsom exosomer og cellefrit cirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Nukleinsyrer kan indkapsles i ekstracellulære vesikler (EV'er) eller frigives i kropsvæsker på grund af celledød og skade. Cirkulerende frit DNA (cfDNA) frigives hovedsageligt i blodbanen fra apoptotiske eller nekrotiske celler og er til stede hos alle individer, hvilket viser øgede niveauer i inflammatoriske eller onkologiske sygdomme3. Exosomer er små ekstracellulære vesikler (~ 30-150 nm) udskilt af celler indeholdende nukleinsyrer, proteiner og lipider. Disse vesikler udgør en del af det intercellulære kommunikationsnetværk og findes almindeligvis i mange typer kropsvæsker2. Nukleinsyrerne indesluttet i elbiler er beskyttet mod det barske miljø i kropsvæsker, hvilket giver en mere robust måde at studere disse molekyler i den flydende biopsiindstilling.
Samlet set er niveauerne af cirkulerende nukleinsyrer i flydende biopsiprøver meget lave, og derfor er følsomme metoder nødvendige til påvisning, såsom digital PCR eller næste generations sekventering (NGS). Præanalytisk styring af prøven er afgørende for at forhindre blodcellelyse og frigivelse af intakt DNA, hvilket forårsager forurening af cfDNA med det genomiske DNA. Desuden skal der udvises forsigtighed ved ekstraktion af prøver for at undgå tilstedeværelse af inhibitorer af enzymbaserede analysemetoder.
Her præsenterer vi en standardiseret metode til indsamling og opbevaring af plasma- og serumprøver, hvilket er et afgørende første skridt for flydende biopsibaserede downstream-applikationer, herunder cirkulerende nukleinsyreanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forudgående etisk godkendelse blev opnået fra deltagende centre inden ekstraktion af blodprøver. Følgende protokoller for serum- og plasmaisolering blev udført i overensstemmelse med de etiske principper for biomedicinsk forskning.
BEMÆRK: Forudgående overvejelser, inden protokollen påbegyndes, findes her. Der kræves forudgående etisk godkendelse af anvendelsen af humanprøver i biomedicinsk forskning med det tilsvarende informerede samtykke. Et klasse II biosikkerhedsskab er påkrævet for at håndtere blodprøver. En laboratoriefrakke, beskyttelseshandsker og briller bør bæres under hele proceduren for at undgå infektion med blodbårne patogener. Der kræves mindst 30 minutter til behandling af serumprøver. Efter blodekstraktion i rør uden antikoagulant skal du opretholde ved stuetemperatur (RT) i 30-45 minutter for at tillade dannelse af blodpropper. Der kræves mindst 40 minutter til plasmaforberedelse, og prøver skal behandles inden for 4 timer fra ekstraktionstidspunktet ved anvendelse af ethylendiamin tetra-eddikesyre (EDTA) rør eller inden for 24-48 timer, hvis der anvendes cellestabiliserende opsamlingsrør eller specifikke cellefrie DNA-opsamlingsrør. Ifølge nogle producenter er prøverne imidlertid stabile i op til 2 uger i disse specialiserede rør. Det er vigtigt at kontrollere for hæmolyse, hvilket vil give plasma- eller serumfraktionen et rødligt udseende. Se afsnittet om fejlfinding for hæmolyserede prøver i diskussionen.
1. Serumpræparat til undersøgelser af flydende biopsi
BEMÆRK: Den samlede tid, der kræves for at udføre dette trin, er 30 minutter (figur 1).
- Ekstrakt 4-10 ml blod i rør, der ikke indeholder antikoagulant (rød eller rød / grå-sort hætte) og opbevares ved RT i 30-45 min. Behandle disse prøver inden for 4 timer fra ekstraktionstidspunktet.
- Registrer tid og dato for prøveudtrækningen og identifikationen af emnet (ID) i en passende designet prøvedatabase.
- Iført kittel, beskyttelseshandsker og glas centrifugeres røret med frisk blod ved RT (15 °C-25 °C) i 10 minutter ved 1.600 (± 150) x g med den maksimale pause.
- Efter centrifugering fjernes røret forsigtigt fra centrifugen; den øvre fase af serumsupernatanten vil fremstå klar og gullig (figur 2). Kontroller, om prøven viser tegn på hæmolyse (figur 3), og registrer tilstedeværelsen af hæmolyse, når det er relevant.
- I et klasse II biosikkerhedsskab overføres serumet til opsamlingsrør som 250 μL alikvoter.
BEMÆRK: Volumenet af aliquoterne skal tilpasses undersøgelseskravene. - Serumet fryses straks lodret i en opbevaringsboks ved -80 °C, og opbevaringstiden for prøver registreres.
- Kontroller, at prøverne blev behandlet inden for den krævede tidsramme på 4 timer.
2. Plasmapræparat til undersøgelser af flydende biopsi
BEMÆRK: Den samlede tid, der kræves for at udføre dette trin, er 40 minutter (figur 4).
- Ekstrakt 4-10 ml blod i rør indeholdende ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA). Behandl prøverne inden for 4 timer fra ekstraktionstidspunktet.
- Registrer tid og dato for prøveudtrækningen og emne-id'et i en korrekt designet prøvedatabase.
- Iført kittel, beskyttelseshandsker og briller centrifugeres EDTA-røret ved RT (15 °C-25 °C) i 10 minutter ved 1.600 (± 150) x g med den maksimale pause.
BEMÆRK: Se producentens anvisninger, når du bruger andre opsamlingsrør. - Efter centrifugering vil plasmasupernatanten fremstå klar og gullig. Kontroller, om prøven viser tegn på hæmolyse (figur 3), og overfør plasmaet (supernatant) til et 15 ml centrifugerør uden at forstyrre cellelaget ved hjælp af en engangsservologisk pipette (eller engangspærepipette eller p1000 pipetter med filterspids). Efterlad et lille resterende volumen plasma over cellelaget (ca. 5 mm).
- Hvis der observeres hæmolyse, kasseres prøven til yderligere analyser. (Figur 5). Se afsnittet fejlfinding i diskussionen for at vurdere hæmolyse.
- Plasmaet centrifugeres i et 15 ml centrifugerør ved RT (15 °C-25 °C) i 10-20 minutter ved 3.000 (±150) x g. Udfør dette trin for at fjerne eventuelle resterende intakte blodlegemer, der overføres fra det første centrifugeringstrin.
- Efter centrifugering fjernes røret forsigtigt fra centrifugen, og 1-4 ml plasma overføres til 1-4 ml polypropylenkryogene hætteglas ved hjælp af en engangs serologisk pipette (eller engangspærepipette eller p1000 pipetter med filterspids). Et restvolumen plasma (ca. 0,3 ml eller 7 mm højde) skal efterlades i bunden af røret for at undgå at forurene plasmaet med blodlegemer (figur 5).
- Plasmaet skal straks fryses lodret i opbevaringsboksen ved -80 °C, og tidspunktet for opbevaring af prøver registreres. Kontroller, at prøverne blev behandlet inden for den krævede tidsramme på 4 timer.
- Saml det cellulære lag (buffy coat) ved hjælp af en P1000 og filtreret spids og overfør det til et 2 ml rør. Straks fryses og opbevares ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter centrifugering af blodrørene uden antikoagulant vises den øvre fase en lysegul og svarer til serumfraktionen (figur 2). Denne fraktion fjernes omhyggeligt og aliquoteres til efterfølgende analyse.
Hæmolyse kan være til stede i enten plasma- eller serumfraktionen, og den øvre fase vil have et rødligt udseende, hvilket indikerer tilstedeværelsen og graden af hæmolyse (figur 3).
Efter centrifugering af EDTA-rør vil flere faser eller lag være tydelige; den øvre fase (lysegul) er plasmafraktionen, som tegner sig for 55% af det samlede blodvolumen; den tynde gråhvide grænseflade er det buffy coat-lag, der indeholder hvide blodlegemer og blodplader og tegner sig for <1% af det samlede blodvolumen; den nedre fase (rød farve) indeholder røde blodlegemer, som tegner sig for 45% af det samlede blodvolumen). Aspirer 1 cm over leukocytlaget, og sørg for, at cellelaget ikke forstyrres for at reducere forurening af plasmaet med blodlegemer (figur 5). Denne fraktion skal omhyggeligt fjernes og aliquoteres til efterfølgende analyse.
Koncentrationen og integriteten af cfDNA ekstraheret fra plasmaprøver bør vurderes ved hjælp af elektroforesebaserede metoder. cfDNA blev ekstraheret ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kolonnebaseret sæt. Kvantificering blev udført ved hjælp af et gelbaseret kommercielt tilgængeligt sæt, der er specifikt til cfDNA-applikationer (Table of Materials). Figur 6A viser et eksempel på en cfDNA-ekstraktion af høj kvalitet, der kan bruges til downstream-applikationer. Figur 6B viser et eksempel på en uegnet prøve med et højt niveau af genomisk forurening.
Figur 1: Serumpræparat til undersøgelser af flydende biopsi. Der er vist en oversigt over serumforberedelsesprocessen fra prøvecentrifugering til opbevaring af alikvoter. Trin 1: Blodprøve i et rør uden antikoagulant til isolering af serum. Trin 2: Centrifuger blodrøret for at opnå serum inden for 4 timer efter ekstraktion. Trin 3: Fjern den øverste fase af serumsupernatant til efterfølgende opbevaring. Trin 4: Frys serumrøret lodret ved -80 °C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Blodprøver indsamlet i rør uden antikoagulantia efter centrifugering. Den øvre fase svarer til serumfraktionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Et eksempel på en hæmolyseret prøve efter centrifugering. Den øvre fase svarende til plasma/ serumfraktionen ser rød ud på grund af hæmolyse. Ideelt set bør disse prøver kasseres, eller i det mindste bør tilstedeværelsen af hæmolyse i prøven registreres, da dette kan påvirke nogle downstream-applikationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Plasmapræparat til undersøgelser af flydende biopsi. Der er vist en oversigt over serumforberedelsesprocessen fra prøvecentrifugering til opbevaring af alikvoter og buffy coat-opsamling. Trin 1: Blodprøve i et rør indeholdende ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) til isolering af plasma. Trin 2: Centrifuger blodrøret for at opnå plasma inden for 4 timer efter ekstraktion. Trin 3: Overfør plasmasupernatanten til et 15 ml centrifugerør uden at forstyrre det cellulære lag. Trin 4: Centrifuger plasmaet for at fjerne eventuelle blodlegemer, der overføres fra det første centrifugeringstrin. Trin 5: Overfør plasmaet til kryogene hætteglas, og plasmarøret fryser lodret ved -80 °C. Trin 6: Saml det cellulære lag (buffy coat) og opbevar ved -80 ° C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: EDTA blodprøver efter centrifugering. Tre synlige lag er synlige efter centrifugering af rørene indeholdende frisk blod. Den øvre fase svarer til plasmafraktionen, den tynde gråhvide grænseflade svarer til buffycoaten og indeholder hvide blodlegemer og blodplader, og den nederste fase indeholder røde blodlegemer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Elektroforesebaseret analyse af cfDNA isoleret fra plasma. (A) Et eksempel på et optimalt eksperiment. (B) Et eksempel på et suboptimalt eksperiment. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den flydende biopsi har mange potentielle anvendelser på forskellige tidspunkter under behandling af kræft. For det første ved diagnosen for at identificere tumormolekylære markører, der tyder på tilstedeværelsen af en potentiel tumorlæsion, der kan undersøges yderligere klinisk. For det andet under behandling til realtidsovervågning af sygdommen, vurdering af behandlingsmolekylær respons, klonal udvikling og tidlig påvisning af sygdomstilbagefald eller behandlingsresistens. Endelig efter den kirurgiske behandling som et redskab til påvisning af minimal restsygdom. European Society of Medical Oncology (ESMO) har for nylig offentliggjort retningslinjer for implementering af ctDNA-mutationstest i metastatisk ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) for at identificere handlingsmæssige terapeutiske mål. Disse retningslinjer omfatter metodologiske overvejelser, teknisk evaluering og validering af ctDNA-profilering og diskussion af nogle udfordringer såsom somatisk mosaik, lav variant allelfrekvens (VAF) og tilfældig påvisning af kimlinjepatogen variant4. De nyligt offentliggjorte ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnostics, staging og behandling af patienter med metastatisk brystkræft indikerer ctDNA-baseret analyse i tilfælde, hvor der er en ændring i behandlingsmetoden, eller hvis det er en forudsætning for at indgå i et klinisk forsøg5.
Prøver skal behandles inden for 4 timer fra ekstraktionstidspunktet. Prøvebehandling uden for denne tidsramme kan føre til nedbrydning af prøver og resultere i øget hæmolyse, hvilket kan påvirke cfDNA-koncentrationen og påvirke downstream-applikationer såsom miRNA-profilering. Anvendelse af 2-4 ml plasma anbefales for at opnå tilstrækkelig følsomhed til downstream-analyse. cfDNA-baserede applikationer indeholder et konserveringsmiddel, der stabiliserer nukleerede blodlegemer og forhindrer frigivelse af forurenende genomisk DNA (gDNA); DNA er stabilt i disse rør i op til 14 dage ved 6 °C til 37 °C efter blodekstraktion. Prøver skal dog behandles inden for 24-48 timer for at undgå forurening med lysede hvide blodlegemer.
Der bør anvendes alikvoter med et passende volumen for at undgå fryse-optøning af serum- og plasmaprøverne. Mængden og antallet af alikvoter afhænger af downstream-anvendelsen af prøverne og også lagerkapaciteten i -80 °C-fryseren. 1 ml aliquoter er nyttige, da dette er standardvolumenet, der bruges til mange cfDNA-ekstraktionsprotokoller, og forskellige alikvoter kan optøes, hvis der kræves mere volumen.
Hæmolyse af en prøve kan estimeres ved at måle absorbansen ved en bølgelængde på 540 nm af den mistænkte hæmolyserede prøve sammenlignet med en ikke-hæmolyseret prøve med et klart gulligt udseende. Den relative hæmolyse af en prøve beregnes som forholdet mellem absorbansen ved en bølgelængde på 540 nm af en ikke-hæmolyseret prøve (med et klart gulligt udseende) og af den hæmolyserede prøve (med et rødligt udseende). Læserne rådes til at henvise til artiklen af TylerVan Buren et al, for yderligere information6.
Prøveintegritet er afgørende i alle downstream flydende biopsiapplikationer, og tiden fra prøveekstraktion til behandling og prøveopsamlingsrørtype er to kritiske faktorer, der bør overvejes, da de påvirker kvaliteten og udbyttet af ctDNA-markører. Som hovedregel skal alle prøver indsamles i et cfDNA-specifikt rør eller EDTA-rør og behandles inden for henholdsvis 48 timer og 4 timer efter ekstraktion. Det er derfor vigtigt at have en god koordinering med det personale og de tjenester, der er involveret i prøveindsamlingen. Ideelt set bør der etableres et detaljeret prøveindsamlingskredsløb, der klart definerer opgaverne for alle involverede personer med detaljerede instruktioner om håndtering og overførsel af prøver. Plasma foretrækkes frem for serum til cfDNA-anvendelser, da serum har tendens til at være forurenet med genomisk DNA på grund af lysis af hvide blodlegemer under koagulationsprocessen7. På den anden side indeholder plasma generelt PCR-hæmmere såsom heparin, hæmoglobin, hormoner, immunoglobulin G og lactoferrin8. Prøvefortynding kan dog hjælpe med at overvinde dette problem, forudsat at prøven har en tilstrækkelig koncentration af cfDNA. En nylig undersøgelse rapporterer en præanalytisk arbejdsgang for flydende biopsiapplikationer, sammenligning af forskellige stabiliserende rør og kvantificerings- og kvalitetsmålinger af nukleinsyrer isoleret fra plasma, hvilket viser betydningen af en standardiseret behandlingsprotokol til reproducerbar downstream-analyse9. National Cancer Institute (NCI) cfDNA analyse retningslinjer anbefaler, at EDTA rør behandles inden for 2-4 timer og dem med et særligt konserveringsmiddel inden for 3 dage10. Biobanker kan være en nyttig facilitet for efterforskere uden det nødvendige udstyr til prøvebehandling og opbevaring. Ideelt set bør prøver ikke fryses optøes mere end én gang og ikke opbevares i mere end 3 år før brug; Der skal derfor lægges stor vægt på mængden af alikvoter til downstream-anvendelser for at undgå fryse-optøningscyklusser.
Et andet kritisk trin i plasmabehandling er centrifugering; den første bestemmer den korrekte isolering af plasma fra mononukleære celler, kilden til gDNA-forurening, der i høj grad kan fortynde den relative overflod af ctDNA. Den anden centrifugering udført ved hurtigere hastigheder er beregnet til yderligere at fjerne lysede hvide blodlegemer11. Anvendelsen af bremsen efter centrifugeringens afslutning synes ikke at have nogen indvirkning på plasmaprøvernes kvalitet12. En anden vigtig overvejelse ved behandling af blodprøver er den type centrifugerotor, der skal bruges, enten en sving-ud eller fast rotor. Til behandling af blodprøver anbefales en sving-ud rotor. Dette format muliggør en bedre adskillelse af blodkomponenter baseret på densitetsgradienter, og placeringen af cellepillen efter centrifugering er i bunden af centrifugerøret, mens cellepillen dannes langs siden af røret med en fast rotorcentrifuge. Faste rotorer tillader mere tyngdekraft at blive brugt og en mere egnet til adskillelse af proteiner og nukleinsyrer, selvom de normalt tillader flere prøver at blive behandlet på samme tid.
Det endelige udbytte af cfDNA er afgørende for downstream applikationsfølsomhed. Med tidligere data er der derfor behov for mindst 3,6 nanogram (ng) cfDNA for at opnå en følsomhed på <0,1% og 36 ng for at opnå en følsomhed på <0,01% til påvisning af mutante alleler13. Kvalitet, men også kvantitet af cfDNA skal tages i betragtning, når der træffes beslutning om en prøvemængde til indsamling og ekstraktion. For eksempel viste tidligere undersøgelser, at den gennemsnitlige / mediane koncentration af cfDNA ekstraheret fra 1 ml plasma er 21 ng / ml i endometriecancer14, 14,3 (interval 7-204) ng / ml i Hodgkin lymfom15, 8,02 (± 7,81) ng / ml i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC)16 og 1,35 ng / ml i tilfælde af kræft i bugspytkirtlen17. Det krævede plasmavolumen afhænger af den anvendte downstream-teknologi, men brugen af 2-4 ml anbefales for at opnå tilstrækkelig følsomhed.
Sporbarhed af prøver er et vigtigt aspekt, der skal tages i betragtning, når der oprettes prøvesamlinger. alle prøver og alikvoter skal mærkes korrekt og tydeligt, så de let kan identificeres efterfølgende. Biobanker kan også bruges, da de har et akkrediteret kvalitetsstyringssystem, der garanterer kvaliteten, sikkerheden og sporbarheden af de lagrede data og biologiske prøver i overensstemmelse med gældende lokale og internationale love og regler. De data, der er knyttet til prøverne, bør ideelt set lagres i en database, der er egnet til dette formål, såsom Research Electronic Data Capture (REDCap), en webbaseret applikation udviklet af Vanderbilt University til at indsamle data til klinisk forskning og oprette databaser og projekter (https://www.project-redcap.org/). Brug af en sikker server med datakryptering anbefales også stærkt.
Udfordringerne i forbindelse med implementeringen af den flydende biopsi i klinikken er for nylig blevet gennemgået10, og et centralt spørgsmål, der blev fremhævet, var standardiseringen af præanalytiske forhold såsom prøveindsamling, behandling og opbevaring, som direkte påvirker analytisk og klinisk validering samt reproducerbarhed af resultater. Flydende biopsikonsortier som CANCER-ID, European Liquid Biopsy Society (ELBS) og Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) sigter mod at standardisere præanalytiske trin og definere bedste praksis for flydende biopsiundersøgelser i klinisk indstilling18,19.
Flydende biopsi er et meget fleksibelt og nyttigt værktøj med stort potentiale i forbindelse med kræftdiagnose, behandling og opfølgning20. En stigende mængde beviser viser dens enorme relevans, og for dens korrekte gennemførelse og brug er vigtigheden af at indsamle prøver på en standardiseret måde nøglen til at opnå værdifulde og sammenlignelige data. Arbejdet med standardiserede protokoller er afgørende for at undgå tekniske hindringer i efterfølgende analyser, hvilket tidligere har været en reel begrænsning med brugen af gamle arkivprøver. Her leverede vi validerede protokoller, der kan hjælpe med at garantere optimale præanalytiske procedurer for kliniske og forskning cfDNA-baserede flydende biopsiundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB modtog honoraria for taler, konsulent- eller rådgivende rolle fra Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer og BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL modtog honorarer for taler, konsulent- eller rådgivningsrolle fra Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline og Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT modtog honorarer for taler, konsulent- eller rådgivningsrolle fra Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM og ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): modtog honorar for taler, konsulent eller rådgivende rolle fra Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly og Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) rapporterer at have modtaget forskningsbevillinger relateret til denne undersøgelse fra Novartis og forskningsbevillinger, der ikke er relateret til denne undersøgelse fra AstraZeneca og Beigene. De resterende forfattere har ingen oplysninger om manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) for deres støtte og følgende projektbevilling: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC platform til standardisering og fremme af flydende biopsi. Pi Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
