Summary
De vloeibare biopsie heeft een revolutie teweeggebracht in onze benadering van oncologische translationele studies, waarbij monsterverzameling, kwaliteit en opslag cruciale stappen zijn voor de succesvolle klinische toepassing ervan. Hier beschrijven we een gestandaardiseerd en gevalideerd protocol voor downstream circulerende DNA-toepassingen die in de meeste translationele onderzoekslaboratoria kunnen worden toegepast.
Abstract
De term vloeibare biopsie (LB) verwijst naar moleculen zoals eiwitten, DNA, RNA, cellen of extracellulaire blaasjes in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire en / of gemetastaseerde tumor. LB is naar voren gekomen als een steunpilaar in translationeel onderzoek en is begonnen deel uit te maken van de klinische oncologiepraktijk, en biedt een minimaal invasief alternatief voor solide biopsie. De LB maakt real-time monitoring van een tumor mogelijk via een minimaal invasieve monsterextractie, zoals bloed. De toepassingen omvatten vroege detectie van kanker, follow-up van patiënten voor de detectie van ziekteprogressie, beoordeling van minimale restziekte en potentiële identificatie van moleculaire progressie en resistentiemechanisme. Om een betrouwbare analyse van deze monsters te bereiken die in de kliniek kan worden gerapporteerd, moeten de preanalytische procedures zorgvuldig worden overwogen en strikt worden gevolgd. Monsterverzameling, kwaliteit en opslag zijn cruciale stappen die hun nut in downstream-toepassingen bepalen. Hier presenteren we gestandaardiseerde protocollen van onze vloeibare biopsiewerkmodule voor het verzamelen, verwerken en opslaan van plasma- en serummonsters voor downstream vloeibare biopsieanalyse op basis van circulerend vrij DNA. De hier gepresenteerde protocollen vereisen standaardapparatuur en zijn voldoende flexibel om te worden toegepast in de meeste laboratoria die gericht zijn op biologische procedures.
Introduction
De term "vloeibare biopsie" werd in 2010gedefinieerd 1 als de aanwezigheid van moleculen (bijv. Eiwit, desoxyribonucleïnezuur (DNA), ribonucleïnezuur (RNA)), cellen of extracellulaire blaasjes (bijv. Exosomen) in bloed en andere lichaamsvloeistoffen die afkomstig zijn van de primaire tumor. Het gebruik van vloeibare biopsiemonsters heeft een revolutie teweeggebracht in translationeel oncologisch onderzoek, omdat weefselbiopten, beperkt tot een bepaald gebied op een bepaald moment, relevante klonen kunnen missen vanwege tumorheterogeniteit. Bovendien speelt vloeibare biopsie een relevante rol bij tumortypen waar primair weefsel schaars of niet toegankelijk is, omdat het een invasieve biopsie kan vermijden, waardoor de kosten en het risico voor patiënten worden verminderd. Bovendien evolueren de moleculaire kenmerken van de tumor voortdurend, voornamelijk als gevolg van de therapiedruk, en vloeibare biopsiemonsters kunnen de tumorklonale dynamiek vastleggen omdat ze longitudinaal kunnen worden genomen, in verschillende klinische en therapeutische tijden van de ziekte, zoals baseline, op behandeling, beste respons en bij ziekteprogressie of zelfs eerder. Het concept van de "real-time vloeibare biopsie" betekent dat dynamische veranderingen in de tumor in realtime kunnen worden gevolgd, waardoor precisiegeneeskunde bij deze ziekte mogelijk is. De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen in de kliniek, waaronder screening en vroege detectie van kanker, real-time monitoring van de ziekte, detectie van minimale restziekte, het bestuderen van mechanismen voor behandelingsresistentie en stratificatie van patiënten op therapeutisch niveau1. De vroege detectie van ziekterecidief en progressie zijn een onvervulde klinische behoefte bij veel tumortypen en is een belangrijke factor in het verhogen van de overleving en kwaliteit van leven van kankerpatiënten. Routinematige beeldvormingsmodaliteiten en oplosbare tumormarkers kunnen de gevoeligheid en / of specificiteit missen die vereist is voor deze taak. Nieuwe voorspellende markers zijn dus dringend nodig in de kliniek, zoals die op basis van circulerende vrije nucleïnezuren.
De soorten monsters die worden gebruikt voor vloeibare biopsiestudies omvatten maar zijn niet beperkt tot bloed-, urine-, speeksel- en ontlastingsmonsters. Andere tumorspecifieke monsters kunnen celaspiraten, hersenvocht, pleuravocht, cyste- en ascitesvloeistof, sputum en pancreassapzijn 2. De voormalige vloeistoffen kunnen verschillende soorten van kanker afgeleide materialen, circulerende tumorcellen (CTC) of fragmenten zoals exosomen en celvrij circulerend tumor-DNA (ctDNA) bevatten. Nucleïnezuren kunnen worden ingekapseld in extracellulaire blaasjes (EV's) of vrijkomen in lichaamsvloeistoffen als gevolg van celdood en schade. Circulerend vrij DNA (cfDNA) wordt voornamelijk vrijgegeven in de bloedbaan vanuit apoptotische of necrotische cellen en is aanwezig in alle individuen, met verhoogde niveaus bij ontstekings- of oncologische ziekten3. Exosomen zijn kleine extracellulaire blaasjes (~ 30-150 nm) uitgescheiden door cellen die nucleïnezuren, eiwitten en lipiden bevatten. Deze blaasjes maken deel uit van het intercellulaire communicatienetwerk en worden vaak aangetroffen in vele soorten lichaamsvloeistoffen2. De nucleïnezuren in EV's worden beschermd tegen de ruwe omgeving in lichaamsvloeistoffen, waardoor een robuustere manier is om deze moleculen in de vloeibare biopsie-instelling te bestuderen.
Over het algemeen zijn de niveaus van circulerende nucleïnezuren in vloeibare biopsiemonsters erg laag en daarom zijn gevoelige methoden nodig voor detectie, zoals digitale PCR of next-generation sequencing (NGS). Preanalytisch beheer van het monster is cruciaal om bloedcellysis en afgifte van intact DNA te voorkomen, waardoor besmetting van het cfDNA met het genomische DNA ontstaat. Bovendien moet bij het extraheren van monsters voorzichtig worden om de aanwezigheid van remmers van op enzymen gebaseerde analysemethoden te voorkomen.
Hier presenteren we een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen en opslaan van plasma- en serummonsters, wat een cruciale eerste stap is voor downstream-toepassingen op basis van vloeibare biopsie, inclusief circulerende nucleïnezuuranalyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voorafgaande ethische goedkeuring werd verkregen van deelnemende centra vóór de extractie van bloedmonsters. De volgende protocollen voor serum- en plasma-isolatie werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische principes voor biomedisch onderzoek.
OPMERKING: Voorafgaande overwegingen voordat u met het protocol begint, vindt u hier. Voorafgaande ethische goedkeuring is vereist voor het gebruik van menselijke monsters in biomedisch onderzoek, met de bijbehorende geïnformeerde toestemming. Een klasse II bioveiligheidskast is vereist om bloedmonsters te verwerken. Een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril moeten tijdens de hele procedure worden gedragen om infectie door door bloed overgedragen ziekteverwekkers te voorkomen. Een minimum van 30 minuten is vereist voor de verwerking van serummonsters. Na bloedextractie in buizen zonder antistollingsmiddel, handhaven op kamertemperatuur (RT) gedurende 30-45 minuten om stolselvorming mogelijk te maken. Een minimum van 40 minuten is vereist voor plasmabereiding en monsters moeten binnen 4 uur na het moment van extractie worden verwerkt bij gebruik van ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) buizen of binnen 24-48 uur bij gebruik van celstabiliserende verzamelbuizen of specifieke celvrije DNA-verzamelbuizen. Volgens sommige fabrikanten zijn de monsters echter tot 2 weken stabiel in deze gespecialiseerde buizen. Het is belangrijk om te controleren op hemolyse, waardoor het plasma of de serumfractie een roodachtig uiterlijk krijgt. Zie de sectie probleemoplossing voor gehemolyseerde monsters in de discussie.
1. Serumpreparaat voor vloeibare biopsiestudies
OPMERKING: De totale tijd die nodig is om deze stap uit te voeren is 30 minuten (figuur 1).
- Extraheer 4-10 ml bloed in buizen die geen antistollingsmiddel bevatten (rode of rood/grijszwarte dop) en houd gedurende 30-45 minuten aan op RT. Verwerk deze monsters binnen 4 uur vanaf het moment van extractie.
- Noteer de tijd en datum van de monsterextractie en de identificatie van de proefpersoon (ID) in een goed ontworpen monsterdatabase.
- Draag een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril en centrifugeer de buis met vers bloed bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10 minuten bij 1.600 (± 150) x g, met de maximale pauze toegepast.
- Verwijder na centrifugatie voorzichtig de buis uit de centrifuge; de bovenste fase van serumsupernatant ziet er helder en geelachtig uit (figuur 2). Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont (figuur 3) en noteer indien nodig de aanwezigheid van hemolyse.
- Breng het serum in een bioveiligheidskast van klasse II over naar verzamelbuizen als aliquots van 250 μL.
OPMERKING: Het volume van de aliquots moet worden aangepast aan de onderzoeksvereisten. - Vries het serum onmiddellijk rechtop in een bewaardoos bij -80 °C in en noteer het tijdstip van opslag van het monster.
- Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van 4 uur zijn verwerkt.
2. Plasmapreparaat voor vloeibare biopsiestudies
OPMERKING: De totale tijd die nodig is om deze stap uit te voeren is 40 minuten (figuur 4).
- Extract 4-10 ml bloed in buizen die ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) bevatten. Verwerk de monsters binnen 4 uur na het moment van extractie.
- Noteer de tijd en datum van de monsterextractie en de onderwerp-ID in een goed ontworpen monsterdatabase.
- Met een laboratoriumjas, beschermende handschoenen en een bril op, centrifugeert u de EDTA-buis bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10 minuten bij 1.600 (± 150) x g, met de maximale pauze toegepast.
OPMERKING: Raadpleeg de instructies van de fabrikant wanneer u andere opvangbuizen gebruikt. - Na centrifugatie zal het plasma-supernatant helder en geelachtig lijken. Controleer of het monster tekenen van hemolyse vertoont (figuur 3) en breng het plasma (supernatant) over naar een centrifugebuis van 15 ml zonder de cellaag te verstoren met behulp van een wegwerp serologische pipet (of wegwerpbolpipet of p1000 pipetten met filterpunt). Laat een klein restvolume plasma boven de cellaag (ongeveer 5 mm).
- Als hemolyse wordt waargenomen, gooit u het monster weg voor verdere analyses. (Figuur 5). Zie het gedeelte probleemoplossing in de discussie om hemolyse te beoordelen.
- Centrifugeer het plasma in een centrifugebuis van 15 ml bij RT (15 °C-25 °C) gedurende 10-20 minuten bij 3.000 (±150) x g. Voer deze stap uit om eventuele resterende intacte bloedcellen te verwijderen die zijn overgedragen van de eerste centrifugatiestap.
- Verwijder na centrifugatie voorzichtig de buis uit de centrifuge en breng 1-4 ml plasma over op 1-4 ml polypropyleen cryogene injectieflacons met behulp van een wegwerp serologische pipet (of wegwerpbolpipet of p1000-pipetten met filterpunt). Een restvolume plasma (ongeveer 0,3 ml of 7 mm hoog) moet aan de onderkant van de buis worden achtergelaten om besmetting van het plasma met bloedcellen te voorkomen (figuur 5).
- Vries het plasma onmiddellijk rechtop in de bewaardoos bij -80 °C en noteer het tijdstip van opslag van het monster. Controleer of de monsters binnen de vereiste periode van 4 uur zijn verwerkt.
- Verzamel de cellaag (buffy coat) met behulp van een P1000 en gefilterde tip en breng deze over naar een buis van 2 ml. Onmiddellijk invriezen en bewaren bij -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na centrifugering van de bloedbuizen zonder antistollingsmiddel lijkt de bovenste fase lichtgeel en komt overeen met de serumfractie (figuur 2). Deze fractie wordt zorgvuldig verwijderd en gealiquoteerd voor latere analyse.
Hemolyse kan aanwezig zijn in het plasma of de serumfractie en de bovenste fase zal een roodachtig uiterlijk hebben, wat wijst op de aanwezigheid en mate van hemolyse (figuur 3).
Na centrifugatie van EDTA-buizen zullen verschillende fasen of lagen zichtbaar zijn; de bovenste fase (lichtgeel) is de plasmafractie, die goed is voor 55% van het totale bloedvolume; de dunne grijsachtig witte interface is de buffy vachtlaag die witte bloedcellen en bloedplaatjes bevat en goed is voor <1% van het totale bloedvolume; de onderste fase (rode kleur) bevat rode bloedcellen, die goed zijn voor 45% van het totale bloedvolume). Aspirateer 1 cm boven de leukocytenlaag en zorg ervoor dat de cellaag niet wordt verstoord om besmetting van het plasma met bloedcellen te verminderen (figuur 5). Deze fractie moet zorgvuldig worden verwijderd en gealiquoteerd voor latere analyse.
De concentratie en integriteit van cfDNA geëxtraheerd uit plasmamonsters moeten worden beoordeeld met behulp van op elektroforese gebaseerde methoden. cfDNA werd geëxtraheerd met behulp van een in de handel verkrijgbare op kolommen gebaseerde kit. Kwantificering werd uitgevoerd met behulp van een op gel gebaseerde commercieel verkrijgbare kit die specifiek is voor cfDNA-toepassingen (Materiaaltabel). Figuur 6A toont een voorbeeld van een cfDNA-extractie van hoge kwaliteit die kan worden gebruikt voor downstream-toepassingen. Terwijl figuur 6B een voorbeeld toont van een ongeschikt monster met een hoge mate van genomische besmetting.
Figuur 1: Serumpreparaat voor vloeibare biopsiestudies. Een overzicht van het serumpreparatieproces wordt getoond, van monstercentrifugatie tot de opslag van aliquots. Stap 1: Bloedmonster in een buis zonder antistollingsmiddel voor de isolatie van serum. Stap 2: Centrifugeer de bloedbuis om serum te verkrijgen binnen 4 uur na extractie. Stap 3: Verwijder de bovenste fase van het serumsupernatant voor latere opslag. Stap 4: Vries de serumbuis rechtop in bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.
Figuur 2: Bloedmonsters verzameld in buizen zonder antistollingsmiddel na centrifugatie. De bovenste fase komt overeen met de serumfractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Een voorbeeld van een gehemolyseerd monster na centrifugatie. De bovenste fase die overeenkomt met de plasma/serumfractie lijkt rood als gevolg van hemolyse. Idealiter moeten deze monsters worden weggegooid, of moet ten minste de aanwezigheid van hemolyse in het monster worden geregistreerd, omdat dit van invloed kan zijn op sommige downstream-toepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Plasmapreparaat voor vloeibare biopsiestudies. Een overzicht van het serumpreparatieproces wordt getoond, van monstercentrifugatie tot de opslag van aliquots en buffy coat collection. Stap 1: Bloedmonster in een buis met ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) voor de isolatie van plasma. Stap 2: Centrifugeer de bloedbuis om plasma te verkrijgen binnen 4 uur na extractie. Stap 3: Breng het plasma-supernatant over naar een centrifugebuis van 15 ml zonder de cellaag te verstoren. Stap 4: Centrifugeer het plasma om eventuele bloedcellen te verwijderen die zijn overgedragen van de eerste centrifugatiestap. Stap 5: Breng het plasma over naar cryogene injectieflacons en vries de plasmabuis rechtop in bij -80 °C. Stap 6: Verzamel de cellaag (buffy coat) en bewaar bij -80 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: EDTA-bloedmonsters na centrifugatie. Drie zichtbare lagen zijn zichtbaar na centrifugeren van de buisjes met vers bloed. De bovenste fase komt overeen met de plasmafractie, de dunne grijsachtig witte interface komt overeen met de buffy vacht en bevat witte bloedcellen en bloedplaatjes, en de onderste fase bevat rode bloedcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Elektroforese-gebaseerde analyse van cfDNA geïsoleerd uit plasma. (A) Een voorbeeld van een optimaal experiment. (B) Een voorbeeld van een suboptimaal experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vloeibare biopsie heeft tal van potentiële toepassingen op verschillende momenten tijdens de behandeling van kanker. Ten eerste, bij diagnose om tumormoleculaire markers te identificeren die de aanwezigheid van een potentiële tumorlaesie zouden suggereren die klinisch verder kan worden onderzocht. Ten tweede, tijdens de behandeling voor real-time monitoring van de ziekte, beoordeling van de moleculaire respons van de behandeling, klonale evolutie en vroege detectie van terugvallen van de ziekte of behandelingsresistentie. Ten slotte, na de chirurgische behandeling, als een hulpmiddel voor de detectie van minimale restziekte. De European Society of medical oncology (ESMO) heeft onlangs richtlijnen gepubliceerd voor de implementatie van ctDNA-mutatietests bij gemetastaseerde niet-kleincellige longkanker (NSCLC) om bruikbare therapeutische doelen te identificeren. Deze richtlijnen omvatten de methodologische overwegingen, technische evaluatie en validatie van ctDNA-profilering en het bespreken van enkele uitdagingen zoals somatisch mozaïcisme, lage variant allelfrequentie (VAF) en incidentele kiembaanpathogene variantdetectie4. De onlangs gepubliceerde ESMO Clinical Practice Guidelines voor de diagnose, stadiëring en behandeling van patiënten met gemetastaseerde borstkanker duiden op ctDNA-gebaseerde analyse in gevallen waarin er een verandering is in de behandelingsaanpak of als het een vereiste is om deel te nemen aan een klinische studie5.
Monsters moeten binnen 4 uur na het moment van extractie worden verwerkt. Monsterverwerking buiten dit tijdsbestek kan leiden tot monsterafbraak en resulteren in verhoogde hemolyse, wat van invloed kan zijn op de cfDNA-concentratie en van invloed kan zijn op downstream-toepassingen zoals miRNA-profilering. Het gebruik van 2-4 ml plasma wordt aanbevolen om voldoende gevoeligheid voor downstream-analyse te verkrijgen. cfDNA-gebaseerde toepassingen bevatten een conserveermiddel dat nucleated bloedcellen stabiliseert en de afgifte van besmettend genomisch DNA (gDNA) voorkomt; DNA is stabiel in deze buizen gedurende maximaal 14 dagen bij 6 °C tot 37 °C na bloedextractie. Monsters moeten echter binnen 24-48 uur worden verwerkt om besmetting met gelyseerde witte bloedcellen te voorkomen.
Aliquots met een voldoende volume moeten worden gebruikt om bevriezing en ontdooiing van de serum- en plasmamonsters te voorkomen. Het volume en het aantal aliquots zijn afhankelijk van het downstreamgebruik van de monsters en ook van de opslagcapaciteit van de -80 °C vriezer. 1 ml aliquots zijn nuttig omdat dit het standaardvolume is dat wordt gebruikt voor veel cfDNA-extractieprotocollen en verschillende aliquots kunnen worden ontdooid als er meer volume nodig is.
Hemolyse van een monster kan worden geschat door de absorptie te meten op een golflengte van 540 nm van het vermoedelijke gehemolyseerde monster in vergelijking met een niet-gehemolyseerd monster met een duidelijk geelachtig uiterlijk. De relatieve hemolyse van een monster wordt berekend als de verhouding van de absorptie bij een golflengte van 540 nm van een niet-gehemolyseerd monster (met een helder geelachtig uiterlijk) en van het gehemolyseerde monster (met een roodachtig uiterlijk). De lezers wordt geadviseerd om het artikel van TylerVan Buren et al. te raadplegen voor meer informatie6.
Monsterintegriteit is cruciaal in alle downstream vloeibare biopsietoepassingen, en de tijd van monsterextractie tot verwerking en monsterverzamelingsbuistype zijn twee kritieke factoren waarmee rekening moet worden gehouden omdat ze de kwaliteit en opbrengst van ctDNA-markers beïnvloeden. Als algemene regel geldt dat alle monsters in een cfDNA-specifieke buis of EDTA-buis moeten worden verzameld en binnen respectievelijk 48 uur en 4 uur na extractie moeten worden verwerkt. Het is dus belangrijk om een goede coördinatie te hebben met het personeel en de diensten die betrokken zijn bij het verzamelen van monsters. Idealiter zou een gedetailleerd monsterverzamelingscircuit moeten worden opgezet dat de taken van alle betrokken personen duidelijk definieert, met gedetailleerde instructies voor de behandeling en overdracht van monsters. Plasma heeft de voorkeur boven serum voor cfDNA-toepassingen, omdat serum de neiging heeft besmet te zijn met genomisch DNA als gevolg van witte bloedcellysis tijdens het stollingsproces7. Aan de andere kant bevat plasma over het algemeen PCR-remmers zoals heparine, hemoglobine, hormonen, immunoglobuline G en lactoferrine8. Monsterverdunning kan echter helpen dit probleem op te lossen, op voorwaarde dat het monster een voldoende concentratie cfDNA heeft. Een recente studie rapporteert een preanalytische workflow voor vloeibare biopsietoepassingen, waarbij verschillende stabiliserende buizen en kwantificerings- en kwaliteitsmetingen van nucleïnezuren geïsoleerd uit plasma worden vergeleken, wat het belang aantoont van een gestandaardiseerd verwerkingsprotocol voor reproduceerbare downstream-analyse9. De cfDNA-analyserichtlijnen van het National Cancer Institute (NCI) bevelen aan dat EDTA-buizen binnen 2-4 uur worden verwerkt en die met een speciaal conserveermiddel binnen 3 dagen10. Biobanken kunnen een nuttige faciliteit zijn voor onderzoekers zonder de vereiste apparatuur voor monsterverwerking en -opslag. Idealiter mogen monsters niet meer dan één keer worden bevroren en niet langer dan 3 jaar vóór gebruik worden bewaard; daarom moet zorgvuldig aandacht worden besteed aan het volume aliquots voor downstream-toepassingen om vries-dooicycli te voorkomen.
Een andere cruciale stap in de plasmaverwerking is centrifugatie; de eerste bepaalt de juiste isolatie van plasma uit mononucleaire cellen, de bron van gDNA-besmetting die de relatieve abundantie van ctDNA sterk kan verdunnen. De tweede centrifugatie die met hogere snelheden wordt uitgevoerd, is bedoeld om gelyseerde witte bloedcellen verder te verwijderen11. Het gebruik van de rem nadat de centrifugatie is voltooid, lijkt geen effect te hebben op de kwaliteit van de plasmamonsters12. Een andere belangrijke overweging bij het verwerken van bloedmonsters is het type centrifugerotor dat moet worden gebruikt, een uitzwaaibare of vaste rotor. Voor het verwerken van bloedmonsters wordt een uitzwaaibare rotor aanbevolen. Dit formaat maakt een betere scheiding van bloedcomponenten mogelijk op basis van dichtheidsgradiënten, en de locatie van de celpellet na centrifugatie bevindt zich aan de onderkant van de centrifugebuis, terwijl bij een vaste rotorcentrifuge de celpellet zich langs de zijkant van de buis vormt. Vaste rotoren maken het mogelijk om meer zwaartekracht te gebruiken en een meer geschikt voor het scheiden van eiwitten en nucleïnezuren, hoewel ze meestal toestaan dat meer monsters tegelijkertijd worden verwerkt.
De uiteindelijke opbrengst van cfDNA is van cruciaal belang voor de gevoeligheid van downstream-toepassingen. Dienovereenkomstig is met eerdere gegevens minimaal 3,6 nanogram (ng) cfDNA nodig om een gevoeligheid van <0,1% en 36 ng te bereiken om een gevoeligheid van <0,01% te verkrijgen voor de detectie van mutante allelen13. Kwaliteit maar ook kwantiteit van cfDNA moet worden overwogen bij het bepalen van een monstervolume voor verzameling en extractie. Eerdere studies toonden bijvoorbeeld aan dat de gemiddelde/mediane concentratie van cfDNA geëxtraheerd uit 1 ml plasma 21 ng/ml is bij endometriumkanker14, 14,3 (bereik 7-204) ng/ml bij Hodgkin-lymfoom15, 8,02 (± 7,81) ng/ml bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC)16 en 1,35 ng/ml bij gevallen van alvleesklierkanker17. Het vereiste plasmavolume is afhankelijk van de downstream-technologie die wordt gebruikt, maar het gebruik van 2-4 ml wordt aanbevolen om voldoende gevoeligheid te bereiken.
Traceerbaarheid van monsters is een belangrijk aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het maken van monsterverzamelingen; alle monsters en aliquots moeten correct en duidelijk worden geëtiketteerd, zodat ze achteraf kunnen worden geïdentificeerd. Biobanken kunnen ook worden gebruikt omdat ze een geaccrediteerd kwaliteitsmanagementsysteem hebben, dat de kwaliteit, veiligheid en traceerbaarheid van de opgeslagen gegevens en biologische monsters garandeert, in overeenstemming met de toepasselijke lokale en internationale wet- en regelgeving. De gegevens die aan de monsters zijn gekoppeld, moeten idealiter worden opgeslagen in een database die geschikt is voor dit doel, zoals Research Electronic Data Capture (REDCap), een webgebaseerde applicatie ontwikkeld door Vanderbilt University om gegevens vast te leggen voor klinisch onderzoek en databases en projecten te maken (https://www.project-redcap.org/). Het gebruik van een beveiligde server met gegevensversleuteling wordt ook sterk aanbevolen.
De uitdagingen met betrekking tot de implementatie van de vloeibare biopsie in de kliniek zijn onlangs beoordeeld10, en een belangrijk probleem dat werd benadrukt, was de standaardisatie van preanalytische omstandigheden zoals monsterverzameling, verwerking en opslag, die rechtstreeks van invloed zijn op analytische en klinische validatie, evenals reproduceerbaarheid van resultaten. Vloeibare biopsieconsortia zoals CANCER-ID, de European Liquid Biopsy Society (ELBS) en de Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) hebben tot doel preanalytische stappen te standaardiseren en best practices voor vloeibare biopsiestudies in de klinische setting te definiëren18,19.
Vloeibare biopsie is een zeer flexibel en nuttig hulpmiddel met een groot potentieel in de context van kankerdiagnose, behandeling en follow-up20. Een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal toont de enorme relevantie ervan aan, en voor de juiste implementatie en het gebruik ervan is het belang van het verzamelen van monsters op een gestandaardiseerde manier de sleutel tot het verkrijgen van waardevolle en vergelijkbare gegevens. Het werken met gestandaardiseerde protocollen is cruciaal om technische belemmeringen in latere analyses te voorkomen, wat in het verleden een echte beperking was met het gebruik van oude archiefmonsters. Hier hebben we gevalideerde protocollen verstrekt die kunnen helpen optimale preanalytische procedures te garanderen voor klinische en op cfDNA gebaseerde vloeibare biopsiestudies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer en BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline en Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM en ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): ontving honoraria voor spreker, consultancy of adviserende rol van Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly en Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) meldt onderzoekssubsidies te ontvangen met betrekking tot deze studie van Novartis en onderzoeksbeurzen die geen verband houden met deze studie van AstraZeneca en Beigene. De overige auteurs hebben geen onthullingen met betrekking tot het manuscript.
Acknowledgments
We willen het Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) bedanken voor hun steun en de volgende projectsubsidie: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-platform voor de standaardisatie en promotie van vloeibare biopsie. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
