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Cancer Research

Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/64123

Summary

La biopsie liquide a révolutionné notre approche des études translationnelles en oncologie, la collecte, la qualité et le stockage des échantillons étant des étapes cruciales pour son application clinique réussie. Nous décrivons ici un protocole standardisé et validé pour les applications d’ADN libre circulant en aval qui peut être appliqué dans la plupart des laboratoires de recherche translationnelle.

Abstract

Le terme biopsie liquide (LB) fait référence à des molécules telles que les protéines, l’ADN, l’ARN, les cellules ou les vésicules extracellulaires dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire et / ou métastatique. LB est devenu un pilier de la recherche translationnelle et a commencé à faire partie de la pratique clinique en oncologie, offrant une alternative mini-invasive à la biopsie solide. Le LB permet la surveillance en temps réel d’une tumeur via une extraction d’échantillon mini-invasive, comme le sang. Les applications comprennent la détection précoce du cancer, le suivi des patients pour la détection de la progression de la maladie, l’évaluation de la maladie résiduelle minimale et l’identification potentielle de la progression moléculaire et du mécanisme de résistance. Afin d’obtenir une analyse fiable de ces échantillons qui peut être rapportée en clinique, les procédures préanalytiques doivent être soigneusement examinées et strictement suivies. La collecte, la qualité et le stockage des échantillons sont des étapes cruciales qui déterminent leur utilité dans les applications en aval. Nous présentons ici des protocoles standardisés de notre module de travail de biopsie liquide pour la collecte, le traitement et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum pour l’analyse de biopsie liquide en aval basée sur de l’ADN sans circulation. Les protocoles présentés ici nécessitent un équipement standard et sont suffisamment flexibles pour être appliqués dans la plupart des laboratoires axés sur les procédures biologiques.

Introduction

Le terme « biopsie liquide » a été défini en 20101 comme la présence de molécules (p. ex. protéines, acide désoxyribonucléique (ADN), acide ribonucléique (ARN)), de cellules ou de vésicules extracellulaires (p. ex., exosomes) dans le sang et d’autres fluides corporels qui proviennent de la tumeur primaire. L’utilisation d’échantillons de biopsie liquide a révolutionné la recherche translationnelle en oncologie, car les biopsies tissulaires, limitées à une région particulière à un moment donné, peuvent manquer des clones pertinents en raison de l’hétérogénéité tumorale. En outre, la biopsie liquide joue un rôle important dans les types de tumeurs où le tissu primaire est rare ou inaccessible, car elle peut éviter une biopsie invasive, réduisant ainsi les coûts et les risques pour les patients. En outre, les caractéristiques moléculaires de la tumeur évoluent constamment principalement en raison de la pression thérapeutique, et les échantillons de biopsie liquide peuvent capturer la dynamique clonale de la tumeur car ils peuvent être prélevés longitudinalement, à différents moments cliniques et thérapeutiques de la maladie tels que la ligne de base, le traitement, la meilleure réponse et à la progression de la maladie ou même avant. Le concept de « biopsie liquide en temps réel » signifie que les changements dynamiques dans la tumeur peuvent être surveillés en temps réel, permettant ainsi une médecine de précision dans cette maladie. La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles en clinique, notamment le dépistage et la détection précoce du cancer, la surveillance en temps réel de la maladie, la détection de la maladie résiduelle minimale, l’étude des mécanismes de résistance au traitement et la stratification des patients au niveau thérapeutique1. La détection précoce de la récurrence et de la progression de la maladie est un besoin clinique non satisfait dans de nombreux types de tumeurs et est un facteur clé dans l’augmentation de la survie et de la qualité de vie des patients atteints de cancer. Les modalités d’imagerie de routine et les marqueurs tumoraux solubles peuvent manquer de la sensibilité et / ou de la spécificité requises pour cette tâche. Ainsi, de nouveaux marqueurs prédictifs sont nécessaires de toute urgence en clinique, tels que ceux basés sur les acides nucléiques libres circulants.

Les types d’échantillons utilisés pour les études de biopsie liquide comprennent, sans toutefois s’y limiter, des échantillons de sang, d’urine, de salive et de selles. D’autres échantillons spécifiques à la tumeur peuvent être des aspirateurs cellulaires, du liquide céphalo-rachidien, du liquide pleural, du liquide kystique et ascite, des expectorations et du suc pancréatique2. Les premiers liquides peuvent contenir différents types de matériaux dérivés du cancer, des cellules tumorales circulantes (CTC) ou des fragments tels que des exosomes et de l’ADN tumoral circulant sans cellules (ADNct). Les acides nucléiques peuvent être encapsulés dans des vésicules extracellulaires (VE) ou libérés dans les fluides corporels en raison de la mort cellulaire et des dommages. L’ADN libre circulant (cfDNA) est principalement libéré dans la circulation sanguine par les cellules apoptotiques ou nécrotiques et est présent chez tous les individus, montrant des niveaux accrus dans les maladies inflammatoires ou oncologiques3. Les exosomes sont de petites vésicules extracellulaires (~30-150 nm) sécrétées par des cellules contenant des acides nucléiques, des protéines et des lipides. Ces vésicules font partie du réseau de communication intercellulaire et se trouvent couramment dans de nombreux types de fluides corporels2. Les acides nucléiques enfermés à l’intérieur des VE sont protégés de l’environnement hostile dans les fluides corporels, offrant ainsi un moyen plus robuste d’étudier ces molécules dans le cadre de la biopsie liquide.

Dans l’ensemble, les niveaux d’acides nucléiques circulants dans les échantillons de biopsie liquide sont très faibles et, par conséquent, des méthodes sensibles sont nécessaires pour la détection, telles que la PCR numérique ou le séquençage de nouvelle génération (NGS). La gestion préanalytique de l’échantillon est cruciale pour prévenir la lyse des cellules sanguines et la libération d’ADN intact, provoquant une contamination de l’ADNf par l’ADN génomique. En outre, des précautions doivent être prises lors de l’extraction des échantillons pour éviter la présence d’inhibiteurs des méthodes d’analyse à base d’enzymes.

Nous présentons ici une méthode standardisée pour la collecte et le stockage d’échantillons de plasma et de sérum, qui est une première étape cruciale pour les applications en aval basées sur la biopsie liquide, y compris les analyses d’acides nucléiques circulants.

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Protocol

Une approbation éthique préalable a été obtenue auprès des centres participants avant l’extraction des échantillons de sang. Les protocoles suivants pour l’isolement du sérum et du plasma ont été réalisés conformément aux principes éthiques de la recherche biomédicale.

REMARQUE: Les considérations préalables avant de commencer le protocole sont fournies ici. Une approbation éthique préalable est requise pour l’utilisation d’échantillons humains dans la recherche biomédicale, avec le consentement éclairé correspondant. Une armoire de biosécurité de classe II est nécessaire pour traiter les échantillons de sang. Une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes doivent être portés tout au long de la procédure pour éviter l’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang. Un minimum de 30 min est requis pour le traitement des échantillons de sérum. Après extraction du sang dans des tubes sans anticoagulant, maintenir à température ambiante (RT) pendant 30-45 min pour permettre la formation de caillots. Un minimum de 40 minutes est requis pour la préparation du plasma, et les échantillons doivent être traités dans les 4 h suivant le moment de l’extraction lors de l’utilisation de tubes d’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) ou dans les 24 à 48 heures si vous utilisez des tubes de prélèvement stabilisateurs cellulaires ou des tubes de prélèvement d’ADN spécifiques sans cellules. Cependant, selon certains fabricants, les échantillons sont stables jusqu’à 2 semaines dans ces tubes spécialisés. Il est important de vérifier l’hémolyse, qui donnera au plasma ou à la fraction sérique un aspect rougeâtre. Consultez la section de dépannage pour les exemples hémolysés dans la discussion.

1. Préparation du sérum pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 30 min (Figure 1).

  1. Extraire 4-10 mL de sang dans des tubes ne contenant pas d’anticoagulant (capuchon rouge ou rouge/gris-noir) et maintenir à TA pendant 30-45 min. Traiter ces échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
  2. Consignez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’identification du sujet (ID) dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
  3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifuger le tube contenant du sang frais à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
  4. Après centrifugation, retirer soigneusement le tube de la centrifugeuse; la phase supérieure du surnageant sérique apparaîtra claire et jaunâtre (Figure 2). Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et notez la présence d’hémolyse le cas échéant.
  5. Dans une armoire de biosécurité de classe II, transférer le sérum dans des tubes de collecte sous forme d’aliquotes de 250 μL.
    REMARQUE : Le volume des aliquotes doit être ajusté aux exigences de l’étude.
  6. Congelez immédiatement le sérum à la verticale dans une boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon.
  7. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.

2. Préparation plasmatique pour les études de biopsie liquide

REMARQUE : Le temps total requis pour effectuer cette étape est de 40 min (Figure 4).

  1. Extraire 4 à 10 mL de sang dans des tubes contenant de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA). Traiter les échantillons dans les 4 heures suivant l’extraction.
  2. Enregistrez l’heure et la date de l’extraction de l’échantillon et l’ID du sujet dans une base de données d’échantillons conçue de manière appropriée.
  3. En portant une blouse de laboratoire, des gants de protection et des lunettes, centrifugez le tube EDTA à RT (15 °C-25 °C) pendant 10 min à 1 600 (± 150) x g, avec la pause maximale appliquée.
    REMARQUE: Reportez-vous aux instructions du fabricant lorsque vous utilisez d’autres tubes de collecte.
  4. Après centrifugation, le surnageant plasmatique apparaîtra clair et jaunâtre. Vérifiez si l’échantillon présente des signes d’hémolyse (Figure 3) et transférez le plasma (surnageant) dans un tube centrifuge de 15 mL sans perturber la couche cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout de filtre). Laissez un petit volume résiduel de plasma au-dessus de la couche cellulaire (environ 5 mm).
  5. Si une hémolyse est observée, jeter l’échantillon pour d’autres analyses. (Figure 5). Consultez la section de dépannage de la discussion pour évaluer l’hémolyse.
  6. Centrifuger le plasma dans un tube de centrifugeuse de 15 mL à RT (15 °C-25 °C) pendant 10-20 min à 3 000 (±150) x g. Effectuez cette étape pour éliminer toutes les cellules sanguines intactes résiduelles reportées de la première étape de centrifugation.
  7. Après centrifugation, retirez soigneusement le tube de la centrifugeuse et transférez 1 à 4 mL de plasma dans des flacons cryogéniques en polypropylène de 1 à 4 mL à l’aide d’une pipette sérologique jetable (ou d’une pipette à bulbe jetable ou de pipettes p1000 avec embout filtrant). Un volume résiduel de plasma (environ 0,3 mL ou 7 mm de hauteur) doit être laissé au fond du tube pour éviter de contaminer le plasma avec des cellules sanguines (figure 5).
  8. Congelez immédiatement le plasma à la verticale dans la boîte de stockage à -80 °C et enregistrez le temps de stockage de l’échantillon. Vérifier que les échantillons ont été traités dans les 4 heures requises.
  9. Recueillir la couche cellulaire (buffy coat) à l’aide d’une pointe P1000 et filtrée et la transférer dans un tube de 2 mL. Congeler et conserver immédiatement à -80 °C.

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Representative Results

Après centrifugation des tubes sanguins sans anticoagulant, la phase supérieure apparaît jaune pâle et correspond à la fraction sérique (Figure 2). Cette fraction est soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

L’hémolyse peut être présente dans la fraction plasmatique ou sérique, et la phase supérieure aura un aspect rougeâtre, ce qui indique la présence et le degré d’hémolyse (Figure 3).

Après centrifugation des tubes EDTA, plusieurs phases ou couches seront apparentes; la phase supérieure (jaune pâle) est la fraction plasmatique, qui représente 55% du volume sanguin total; la fine interface gris-blanc est la couche de pelage bouffant qui contient des globules blancs et des plaquettes, et représente <1% du volume sanguin total; la phase inférieure (couleur rouge) contient des globules rouges, qui représentent 45% du volume sanguin total). Aspirer 1 cm au-dessus de la couche leucocytaire et s’assurer que la couche cellulaire n’est pas perturbée pour réduire la contamination du plasma par les cellules sanguines (Figure 5). Cette fraction doit être soigneusement enlevée et alicitée pour une analyse ultérieure.

La concentration et l’intégrité de l’ADNf extrait des échantillons de plasma doivent être évaluées à l’aide de méthodes basées sur l’électrophorèse. CfDNA a été extrait à l’aide d’un kit à base de colonnes disponible dans le commerce. La quantification a été réalisée à l’aide d’un kit à base de gel disponible dans le commerce spécifique aux applications cfDNA (Table des matériaux). La figure 6A montre un exemple d’extraction d’ADNf de haute qualité qui peut être utilisée pour des applications en aval. Tandis que la figure 6B montre un exemple d’échantillon inapproprié avec un niveau élevé de contamination génomique.

Figure 1
Figure 1 : Préparation sérique pour les études de biopsie liquide. Un aperçu du processus de préparation du sérum est montré, de la centrifugation de l’échantillon au stockage des aliquotes. Étape 1: Échantillon de sang dans un tube sans anticoagulant pour l’isolement du sérum. Étape 2 : Centrifuger le tube sanguin pour obtenir du sérum dans les 4 h suivant l’extraction. Étape 3: Retirez la phase supérieure du surnageant sérique pour un stockage ultérieur. Étape 4: Congelez le tube de sérum à la verticale à -80 ° C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Échantillons de sang prélevés dans des tubes sans anticoagulant après centrifugation. La phase supérieure correspond à la fraction sérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exemple d’échantillon hémolysé après centrifugation. La phase supérieure correspondant à la fraction plasma/sérum apparaît rouge en raison de l’hémolyse. Idéalement, ces échantillons devraient être jetés, ou au moins la présence d’hémolyse dans l’échantillon devrait être enregistrée, car cela peut affecter certaines applications en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Préparation plasmatique pour les études de biopsie liquide. Un aperçu du processus de préparation du sérum est montré, de la centrifugation de l’échantillon au stockage des aliquotes et à la collecte du pelage bouffant. Étape 1 : Échantillon de sang dans un tube contenant de l’acide éthylènediamine tétra-acétique (EDTA) pour l’isolement du plasma. Étape 2 : Centrifuger le tube sanguin pour obtenir du plasma dans les 4 h suivant l’extraction. Étape 3 : Transférer le surnageant plasma dans un tube centrifuge de 15 mL sans perturber la couche cellulaire. Étape 4 : Centrifugez le plasma pour éliminer les cellules sanguines transférées de la première étape de centrifugation. Étape 5 : Transférer le plasma dans des flacons cryogéniques et congeler le tube de plasma à la verticale à -80 °C. Étape 6: Collectez la couche cellulaire (manteau bouffant) et conservez-la à -80 ° C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Échantillons de sang EDTA après centrifugation. Trois couches visibles sont visibles après centrifugation des tubes contenant du sang frais. La phase supérieure correspond à la fraction plasmatique, la fine interface gris-blanc correspond au pelage bouffant et contient des globules blancs et des plaquettes, et la phase inférieure contient des globules rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Analyse par électrophorèse de l’ADNcf isolé du plasma. (A) Un exemple d’expérience optimale. (B) Exemple d’expérience sous-optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La biopsie liquide a de nombreuses applications potentielles à différents moments de la prise en charge du cancer. Tout d’abord, au moment du diagnostic, identifier les marqueurs moléculaires tumoraux qui suggéreraient la présence d’une lésion tumorale potentielle qui pourrait faire l’objet d’une étude clinique plus approfondie. Deuxièmement, pendant le traitement pour la surveillance en temps réel de la maladie, l’évaluation de la réponse moléculaire du traitement, l’évolution clonale et la détection précoce des rechutes de la maladie ou de la résistance au traitement. Enfin, après le traitement chirurgical, comme outil de détection de la maladie résiduelle minimale. La Société européenne d’oncologie médicale (ESMO) a récemment publié des lignes directrices pour la mise en œuvre de tests de mutation de l’ADNct dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) métastatique afin d’identifier des cibles thérapeutiques exploitables. Ces lignes directrices comprennent les considérations méthodologiques, l’évaluation technique et la validation du profilage de l’ADNct, et discutent de certains défis tels que le mosaïcisme somatique, la fréquence des allèles variants faibles (VAF) et la détection des variants pathogènes germinauxaccidentels 4. Les lignes directrices de pratique clinique de l’ESMO récemment publiées pour le diagnostic, la stadification et le traitement des patientes atteintes d’un cancer du sein métastatique indiquent une analyse basée sur l’ADNct dans les cas où il y a un changement dans l’approche du traitement ou si c’est une condition requise pour entrer dans un essai clinique5.

Les échantillons doivent être traités dans les 4 heures suivant l’extraction. Le traitement des échantillons en dehors de cette période peut entraîner une dégradation des échantillons et entraîner une hémolyse accrue, ce qui peut avoir un impact sur la concentration d’ADNf et affecter les applications en aval telles que le profilage des miARN. L’utilisation de 2 à 4 mL de plasma est recommandée afin d’obtenir une sensibilité suffisante pour l’analyse en aval. Les applications à base d’ADNf contiennent un agent de conservation qui stabilise les cellules sanguines nucléées et empêche la libération d’ADN génomique contaminant (ADNg); L’ADN est stable dans ces tubes jusqu’à 14 jours à 6 °C à 37 °C après extraction du sang. Cependant, les échantillons doivent être traités dans les 24 à 48 heures afin d’éviter la contamination par les globules blancs lysés.

Des aliquotes d’un volume adéquat doivent être utilisées afin d’éviter la décongélation-décongélation des échantillons de sérum et de plasma. Le volume et le nombre d’aliquotes dépendront de l’utilisation en aval des échantillons ainsi que de la capacité de stockage du congélateur à -80 °C. Les aliquotes de 1 mL sont utiles car il s’agit du volume standard utilisé pour de nombreux protocoles d’extraction d’ADNf et diverses aliquotes peuvent être décongelées si un volume supplémentaire est nécessaire.

L’hémolyse d’un échantillon peut être estimée en mesurant l’absorbance à une longueur d’onde de 540 nm de l’échantillon hémolysé suspecté par rapport à un échantillon non hémolysé avec un aspect jaunâtre clair. L’hémolyse relative d’un échantillon est calculée comme le rapport de l’absorbance à une longueur d’onde de 540 nm d’un échantillon non hémolysé (avec un aspect jaunâtre clair) et de l’échantillon hémolysé (avec un aspect rougeâtre). Il est conseillé aux lecteurs de se référer à l’article de TylerVan Buren et al, pour plus d’informations6.

L’intégrité de l’échantillon est cruciale dans toutes les applications de biopsie liquide en aval, et le temps écoulé entre l’extraction de l’échantillon et le traitement et le type de tube de prélèvement d’échantillons sont deux facteurs critiques qui doivent être pris en compte car ils influencent la qualité et le rendement des marqueurs d’ADNct. En règle générale, tous les échantillons doivent être prélevés dans un tube spécifique à l’ADNf ou un tube EDTA et traités dans les 48 h et 4 h suivant l’extraction, respectivement. Il est donc important d’avoir une bonne coordination avec le personnel et les services impliqués dans la collecte des échantillons. Idéalement, un circuit détaillé de prélèvement d’échantillons devrait être établi qui définit clairement les tâches de toutes les personnes impliquées, avec des instructions détaillées sur la manipulation et le transfert des échantillons. Le plasma est préféré au sérum pour les applications d’ADNf car le sérum a tendance à être contaminé par l’ADN génomique en raison de la lyse des globules blancs pendant le processus de coagulation7. D’autre part, le plasma contient généralement des inhibiteurs de la PCR tels que l’héparine, l’hémoglobine, les hormones, l’immunoglobuline G et la lactoferrine8. Cependant, la dilution de l’échantillon peut aider à surmonter ce problème, à condition que l’échantillon ait une concentration suffisante d’ADNf. Une étude récente fait état d’un flux de travail préanalytique pour les applications de biopsie liquide, comparant différents tubes stabilisateurs et des mesures de quantification et de qualité des acides nucléiques isolés du plasma, démontrant l’importance d’un protocole de traitement normalisé pour une analyse en aval reproductible9. Les directives d’analyse cfDNA du National Cancer Institute (NCI) recommandent que les tubes EDTA soient traités dans les 2-4 h et ceux avec un conservateur spécial dans les 3 jours10. Les biobanques peuvent être une installation utile pour les enquêteurs qui n’ont pas l’équipement requis pour le traitement et le stockage des échantillons. Idéalement, les échantillons ne devraient pas être congelés-décongelés plus d’une fois et ne pas être conservés plus de 3 ans avant utilisation; il convient donc d’accorder une attention particulière au volume des aliquotes pour les applications en aval afin d’éviter les cycles de gel-dégel.

Une autre étape critique dans le traitement du plasma est la centrifugation; la première détermine l’isolement correct du plasma des cellules mononucléaires, la source de contamination par l’ADNg qui peut grandement diluer l’abondance relative de l’ADNct. La deuxième centrifugation effectuée à des vitesses plus rapides est destinée à éliminer davantage les globules blancs lysés11. L’utilisation du frein après la fin de la centrifugation ne semble pas avoir d’effet sur la qualité des échantillons de plasma12. Une autre considération importante lors du traitement des échantillons de sang est le type de rotor de centrifugeuse à utiliser, soit un rotor oscillant ou fixe. Pour le traitement des échantillons de sang, un rotor pivotant est recommandé. Ce format permet une meilleure séparation des composants sanguins en fonction des gradients de densité, et l’emplacement de la pastille cellulaire après centrifugation est au fond du tube de centrifugeuse, alors que, avec une centrifugeuse à rotor fixe, la pastille cellulaire se forme le long du côté du tube. Les rotors fixes permettent d’utiliser plus de force gravitationnelle et de séparer les protéines et les acides nucléiques, bien qu’ils permettent généralement de traiter plus d’échantillons en même temps.

Le rendement final de cfDNA est essentiel pour la sensibilité des applications en aval. En conséquence, avec les données précédentes, un minimum de 3,6 nanogrammes (ng) de cfDNA est nécessaire pour atteindre une sensibilité de <0,1% et 36 ng pour obtenir une sensibilité de <0,01% pour la détection des allèles mutants13. La qualité mais aussi la quantité d’ADNf doivent être prises en compte lors de la détermination d’un volume d’échantillon pour la collecte et l’extraction. Par exemple, des études antérieures ont montré que la concentration moyenne/médiane d’ADNf extrait de 1 mL de plasma est de 21 ng/mL dans le cancer de l’endomètre14, de 14,3 (plage 7-204) ng/mL dans le lymphome hodgkinien15, de 8,02 (± 7,81) ng/mL dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC)16 et de 1,35 ng/mL dans les cas de cancer du pancréas17. Le volume de plasma requis dépendra de la technologie en aval utilisée, mais l’utilisation de 2 à 4 mL est recommandée afin d’atteindre une sensibilité suffisante.

La traçabilité des échantillons est un aspect important qui doit être pris en compte lors de la création de collections d’échantillons; tous les échantillons et aliquotes doivent être étiquetés correctement et clairement, ce qui permet une identification ultérieure. Les biobanques peuvent également être utilisées car elles disposent d’un système de gestion de la qualité accrédité, qui garantit la qualité, la sécurité et la traçabilité des données et des échantillons biologiques stockés, conformément à la législation et à la réglementation locales et internationales applicables. Les données associées aux échantillons devraient idéalement être stockées dans une base de données adaptée à cet effet, telle que la capture électronique des données de recherche (REDCap), une application Web développée par l’Université Vanderbilt pour capturer des données pour la recherche clinique et créer des bases de données et des projets (https://www.project-redcap.org/). L’utilisation d’un serveur sécurisé avec cryptage des données est également fortement recommandée.

Les défis liés à la mise en œuvre de la biopsie liquide en clinique ont été récemment examinés10, et l’un des principaux problèmes mis en évidence était la normalisation des conditions préanalytiques telles que la collecte, le traitement et le stockage des échantillons, qui ont un impact direct sur la validation analytique et clinique, ainsi que sur la reproductibilité des résultats. Les consortiums de biopsie liquide tels que CANCER-ID, l’European Liquid Biopsy Society (ELBS) et le Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) visent à normaliser les étapes préanalytiques et à définir les meilleures pratiques pour les études de biopsie liquide en milieu clinique18,19.

La biopsie liquide est un outil très flexible et utile avec un grand potentiel dans le contexte du diagnostic, du traitement et du suivi du cancer20. Un nombre croissant de preuves montre sa grande pertinence, et pour sa mise en œuvre et son utilisation correctes, l’importance de collecter des échantillons de manière standardisée est essentielle pour obtenir des données précieuses et comparables. Travailler avec des protocoles standardisés est crucial pour éviter les obstacles techniques dans les analyses ultérieures, ce qui a été une réelle limitation dans le passé avec l’utilisation d’anciens échantillons d’archives. Ici, nous avons fourni des protocoles validés qui peuvent aider à garantir des procédures préanalytiques optimales pour les études cliniques et de recherche de biopsie liquide à base d’ADNcf.

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Disclosures

Beatriz Bellosillo (BB) : BB a reçu des honoraires pour son rôle de conférencière, de consultante ou de conseil de la part d’Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer et BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL a reçu des honoraires pour son rôle de conférencière, de consultante ou de conseil de la part d’Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline et Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT a reçu des honoraires pour conférencier, consultant ou conseiller d’Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM et ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL) : a reçu des honoraires pour conférencier, consultant ou conseiller de la part d’Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly et Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) rapporte avoir reçu des subventions de recherche liées à cette étude de Novartis et des subventions de recherche sans rapport avec cette étude d’AstraZeneca et Beigene. Les autres auteurs n’ont aucune divulgation concernant le manuscrit.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier le Réseau de recherche biomédicale sur le cancer (CIBERONC) pour son soutien et la subvention de projet suivante: LB CIBERONC PLATFORM: Plate-forme CIBERONC pour la normalisation et la promotion de la biopsie liquide. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 120.086 Any standard tubes/equipment can be used
10 mL serological disposable pipettes BIOFIL GSP010010 Any standard tubes/equipment can be used
10 mL Vacutainer K2 EDTA tube Becton Dickinson 367525 These tubes can be used for plasma collection
15 mL polypropylene centrifuge tubes BIOFIL CFT411150 Any standard tubes/equipment can be used
3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant Becton Dickinson 368965 Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing Corning 430662 Any standard tubes/equipment can be used
4 mL Vacutainer K2 EDTA tube Becton Dickinson 367864 These tubes can be used for plasma collection
4200 TapeStation System Agilent G2991BA Several quantification methods are available with a  specific application for cfDNA
5 mL serological disposable pipettes BIOFIL GSP010005 Any standard tubes/equipment can be used
8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant Becton Dickinson 366468 Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection
Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor Thermo Fisher Scientific Sorvall ST 16  10688725 Any standard tubes/equipment can be used
Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials Corning 431120 These boxes are needed when using 4 mL vials for storage
p1000 pipette tips CORNING 4809 Any standard tubes/equipment can be used
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit Qiagen 55114 Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol.
Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL Streck 218997 These tubes can be used for plasma collection
Temperature Freezer (-80 °C) ESCO 2180104 Any standard tubes/equipment can be used

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
  2. Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
  3. Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
  4. Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
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Recherche sur le cancer numéro 187
Un protocole préanalytique normalisé de biopsie liquide pour les applications d’ADN libre circulant en aval
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