Summary
הביופסיה הנוזלית חוללה מהפכה בגישה שלנו למחקרים תרגומיים אונקולוגיים, כאשר איסוף הדגימות, האיכות והאחסון היוו שלבים מכריעים ליישום הקליני המוצלח שלה. כאן אנו מתארים פרוטוקול מתוקנן ומאומת ליישומי דנ"א ללא מחזור במורד הזרם, שניתן ליישם ברוב מעבדות המחקר התרגומיות.
Abstract
המונח ביופסיה נוזלית (LB) מתייחס למולקולות כגון חלבונים, דנ"א, רנ"א, רנ"א, תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני ו/או הגרורתי. LB התגלתה כעמוד תווך במחקר תרגומי והחלה להפוך לחלק מהפרקטיקה האונקולוגית הקלינית, המספקת חלופה זעיר פולשנית לביופסיה מוצקה. ה- LB מאפשר ניטור בזמן אמת של גידול באמצעות מיצוי דגימה זעיר פולשנית, כגון דם. היישומים כוללים גילוי מוקדם של סרטן, מעקב אחר מטופלים לגילוי התקדמות המחלה, הערכה של מחלה שיורית מינימלית, וזיהוי פוטנציאלי של התקדמות מולקולרית ומנגנון עמידות. על מנת להשיג ניתוח אמין של דגימות אלה שניתן לדווח עליהן במרפאה, יש לשקול בזהירות את ההליכים הקדם-אנליטיים ולעקוב בקפדנות. איסוף דגימות, איכות ואחסון הם שלבים חיוניים שקובעים את התועלת שלהם ביישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים סטנדרטיים ממודול העבודה שלנו בביופסיה נוזלית לאיסוף, עיבוד ואחסון דגימות פלזמה וסרום לניתוח ביופסיה נוזלית במורד הזרם בהתבסס על דנ"א ללא מחזור הדם. הפרוטוקולים המוצגים כאן דורשים ציוד סטנדרטי והם גמישים מספיק כדי להיות מיושמים ברוב המעבדות המתמקדות בהליכים ביולוגיים.
Introduction
המונח "ביופסיה נוזלית" הוגדר בשנת 20101 כנוכחות של מולקולות (למשל, חלבון, חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), חומצה ריבונוקלאית (RNA)), תאים או שלפוחיות חוץ-תאיות (למשל, אקסוזומים) בדם ובנוזלי גוף אחרים שמקורם בגידול הראשוני. השימוש בדגימות ביופסיה נוזלית חולל מהפכה במחקר האונקולוגי התרגומי, שכן ביופסיות רקמות, המוגבלות לאזור מסוים ברגע מסוים, עלולות להחמיץ שיבוטים רלוונטיים בשל הטרוגניות הגידול. בנוסף, ביופסיה נוזלית ממלאת תפקיד רלוונטי בסוגי גידולים שבהם הרקמה הראשונית נדירה או אינה נגישה, שכן היא עשויה למנוע ביופסיה פולשנית, ולהפחית עלויות וסיכון לחולים. יתר על כן, המאפיינים המולקולריים של הגידול מתפתחים ללא הרף בעיקר בשל לחץ הטיפול, ודגימות ביופסיה נוזליות יכולות ללכוד את הדינמיקה הקלונלית של הגידול כפי שניתן לקחת אותן לאורך, בזמנים קליניים וטיפוליים שונים של המחלה כגון בסיס, על הטיפול, על הטיפול, התגובה הטובה ביותר, ובהתקדמות המחלה או אפילו לפני כן. הרעיון של "ביופסיה נוזלית בזמן אמת" פירושו שניתן לעקוב אחר שינויים דינמיים בגידול בזמן אמת, ובכך לאפשר רפואה מדויקת במחלה זו. לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים במרפאה, כולל סינון וגילוי מוקדם של סרטן, ניטור בזמן אמת של המחלה, זיהוי מחלה שיורית מינימלית, חקר מנגנונים לעמידות לטיפול וריבוד חולים ברמה הטיפולית1. הגילוי המוקדם של הישנות המחלה והתקדמותה הם צורך קליני שלא קיבל מענה בסוגי גידולים רבים ומהווים גורם מפתח בהגדלת ההישרדות ואיכות החיים של חולי סרטן. שיטות הדמיה שגרתיות וסמני גידול מסיסים עשויים להיות חסרים את הרגישות ו/או הספציפיות הנדרשות למשימה זו. לפיכך, יש צורך דחוף בסמני חיזוי חדשניים במרפאה, כגון אלה המבוססים על הפצת חומצות גרעין חופשיות במחזור הדם.
סוגי הדגימות המשמשות למחקרי ביופסיה נוזלית כוללים, בין היתר, דגימות דם, שתן, רוק וצואה. דגימות אחרות הספציפיות לגידול יכולות להיות שאיפות תאים, נוזל מוחי, נוזל pleural, נוזל ציסטה ומיימת, כיח ומיץ לבלב2. הנוזלים הראשונים עשויים להכיל סוגים שונים של חומרים שמקורם בסרטן, תאי גידול במחזור הדם (CTC), או שברים כגון אקסוזומים ודנ"א גידולי במחזור ללא תאים (ctDNA). חומצות גרעין עשויות להיות עטופות בשלפוחיות חוץ-תאיות (רכבים חשמליים) או להשתחרר לנוזלי הגוף עקב מוות ונזק לתאים. דנ"א חופשי במחזור הדם (cfDNA) משתחרר בעיקר לזרם הדם מתאים אפופטוטיים או נמקיים ונמצא בכל האנשים, ומראה רמות מוגברות במחלות דלקתיות או אונקולוגיות3. אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות (כ-30-150 ננומטר) המופרשות על-ידי תאים המכילים חומצות גרעין, חלבונים וליפידים. שלפוחיות אלה מהוות חלק מרשת התקשורת הבין-תאית והן נמצאות בדרך כלל בסוגים רבים של נוזלי גוף2. חומצות הגרעין הסגורות בתוך כלי רכב חשמליים מוגנות מפני הסביבה הקשה בנוזלי הגוף, ובכך מספקות דרך איתנה יותר לחקור את המולקולות הללו במסגרת הביופסיה הנוזלית.
באופן כללי, הרמות של חומצות גרעין במחזור הדם בדגימות ביופסיה נוזלית נמוכות מאוד, ולכן יש צורך בשיטות רגישות לזיהוי, כגון PCR דיגיטלי או ריצוף מהדור הבא (NGS). ניהול פרה-אנליטי של הדגימה הוא חיוני כדי למנוע תזה של תאי דם ושחרור של דנ"א שלם, מה שגורם לזיהום של ה-cfDNA עם הדנ"א הגנומי. יתר על כן, יש לנקוט משנה זהירות בעת חילוץ דגימות כדי למנוע נוכחות של מעכבים של שיטות ניתוח מבוססות אנזימים.
כאן אנו מציגים שיטה מתוקננת לאיסוף ואחסון של דגימות פלזמה וסרום, המהווה צעד ראשון מכריע עבור יישומים מבוססי ביופסיה נוזלית במורד הזרם, כולל ניתוחי חומצות גרעין במחזור הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
אישור אתי מוקדם התקבל מהמרכזים המשתתפים לפני הפקת דגימות הדם. הפרוטוקולים הבאים לבידוד סרום ופלזמה בוצעו בהתאם לעקרונות האתיים למחקר ביו-רפואי.
הערה: שיקולים קודמים לפני תחילת הפרוטוקול מובאים כאן. נדרש אישור אתי מוקדם לשימוש בדגימות אנושיות במחקר ביו-רפואי, בהסכמה מדעת מתאימה. ארון בטיחות ביולוגית מדרגה II נדרש כדי לטפל בדגימות דם. יש ללבוש מעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים לאורך כל ההליך כדי למנוע זיהום על ידי פתוגנים הנישאים בדם. נדרש מינימום של 30 דקות לעיבוד דגימות סרום. לאחר שאיבת הדם בצינורות ללא נוגדי קרישה, יש לשמור על טמפרטורת החדר (RT) במשך 30-45 דקות כדי לאפשר היווצרות קרישי דם. לפחות 40 דקות נדרשות להכנת פלזמה, ויש לעבד דגימות תוך 4 שעות מרגע המיצוי בעת שימוש בצינורות חומצה טטרה-אצטית אתילנדיאמין (EDTA) או תוך 24-48 שעות אם משתמשים בצינורות איסוף מייצבי תאים או בצינורות איסוף DNA ספציפיים ללא תאים. עם זאת, לדברי כמה יצרנים, הדגימות יציבות עד שבועיים בצינורות מיוחדים אלה. חשוב לבדוק אם יש המוליזה, אשר תיתן לחלק הפלזמה או הסרום מראה אדמדם. עיין בסעיף פתרון הבעיות לקבלת דוגמאות המוליות בדיון.
1. הכנת סרום למחקרי ביופסיה נוזלית
הערה: הזמן הכולל הנדרש לביצוע שלב זה הוא 30 דקות (איור 1).
- יש לחלץ 4-10 מ"ל דם בצינורות שאינם מכילים נוגדי קרישה (כובע אדום או אדום/אפור-שחור) ולשמור ב-RT למשך 30-45 דקות. לעבד דגימות אלה תוך 4 שעות מרגע החילוץ.
- תעד את השעה והתאריך של חילוץ הדגימה ואת זיהוי הנושא (ID) במסד נתונים לדוגמה שתוכנן כראוי.
- לבוש במעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים, צנטריפוגה הצינור המכיל דם טרי ב- RT (15 °C -25 ° C) במשך 10 דקות ב 1,600 (± 150) x g, עם ההפסקה המקסימלית מוחלת.
- לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינור מן הצנטריפוגה; השלב העליון של חומר-העל בסרום ייראה צלול וצהבהב (איור 2). בדקו אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה (איור 3) ותעדו את נוכחות ההמוליזה בעת הצורך.
- בארון בטיחות ביולוגית מסוג II, העבירו את הסרום לצינורות האיסוף כ-250 μL aliquots.
הערה: יש להתאים את נפח האליקוטים לדרישות המחקר. - מיד להקפיא את הסרום זקוף בקופסת אחסון בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולרשום את זמן אחסון הדגימה.
- ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של 4 שעות.
2. הכנת פלזמה למחקרי ביופסיה נוזלית
הערה: הזמן הכולל הנדרש לביצוע שלב זה הוא 40 דקות (איור 4).
- יש לחלץ 4-10 מ"ל דם בצינורות המכילים חומצה טטרה-אצטית אתילנדיאמין (EDTA). לעבד את הדגימות ברדיוס של 4 שעות מרגע החילוץ.
- רשום את השעה והתאריך של חילוץ הדגימה ואת מזהה הנושא במסד נתונים לדוגמה שתוכנן כראוי.
- לבוש במעיל מעבדה, כפפות מגן ומשקפיים, צנטריפוגה בצינור EDTA ב- RT (15 °C -25 ° C) למשך 10 דקות ב 1,600 (± 150) x g, עם ההפסקה המרבית מוחלת.
הערה: עיין בהוראות היצרן בעת שימוש בצינורות איסוף אחרים. - לאחר צנטריפוגה, סופרנאטנט הפלזמה ייראה צלול וצהבהב. בדקו אם הדגימה מראה סימנים של המוליזה (איור 3) והעברת הפלזמה (סופרנטנט) לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מבלי להפריע לשכבת התא באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית (או פיפטת נורה חד פעמית או פיפטות p1000 עם קצה מסנן). השאירו נפח שיורי קטן של פלזמה מעל שכבת התא (כ-5 מ"מ).
- אם ההמוליזה נצפתה, השליכו את הדגימה לניתוחים נוספים. (איור 5). עיין בסעיף פתרון הבעיות בדיון כדי להעריך את ההמוליזה.
- צנטריפוגה הפלזמה בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ב- RT (15 °C-25 °C) למשך 10-20 דקות ב 3,000 (±150) x g. בצע שלב זה כדי להסיר את כל שאריות תאי הדם השלמים המועברים משלב הצנטריפוגה הראשון.
- לאחר צנטריפוגה, הסר בזהירות את הצינור מהצנטריפוגה והעביר 1-4 מ"ל של פלזמה לבקבוקונים קריוגניים של פוליפרופילן 1-4 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית (או פיפטת נורה חד פעמית או פיפטות p1000 עם קצה מסנן). יש להשאיר נפח שיורי של פלזמה (כ-0.3 מ"ל או 7 מ"מ גובה) בתחתית הצינור כדי למנוע זיהום של הפלזמה בתאי הדם (איור 5).
- מיד להקפיא את הפלזמה זקופה בקופסת האחסון ב -80 מעלות צלזיוס ולרשום את זמן אחסון הדגימה. ודא שהדגימות עובדו במסגרת הזמן הנדרשת של 4 שעות.
- אספו את השכבה התאית (ציפוי באפי) באמצעות P1000 והקצה המסונן והעבירו אותה לצינור של 2 מ"ל. מיד להקפיא ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לאחר צנטריפוגה של צינורות הדם ללא נוגדי קרישה, הפאזה העליונה נראית צהובה בהירה ומתאימה לשבר הסרום (איור 2). חלק זה מוסר בקפידה ומועבר לניתוח הבא.
המוליזה עשויה להיות נוכחת בחלק הפלזמה או הסרום, והפאזה העליונה תהיה בעלת מראה אדמדם, מה שמעיד על נוכחות ומידת ההמוליזה (איור 3).
לאחר צנטריפוגה של צינורות EDTA, מספר שלבים או שכבות יהיו גלויים; השלב העליון (צהוב חיוור) הוא שבר הפלזמה, המהווה 55% מנפח הדם הכולל; הממשק הדקיק בין אפרפר ללבן הוא שכבת הפרווה הבאפית המכילה תאי דם וטסיות דם לבנים, ומהווה <1% מנפח הדם הכולל; השלב התחתון (צבע אדום) מכיל תאי דם אדומים, המהווים 45% מנפח הדם הכולל). שאפו 1 ס"מ מעל שכבת הלויקוציטים, וודאו ששכבת התא לא תופרע כדי להפחית את הזיהום של הפלזמה בתאי הדם (איור 5). חלק זה צריך להיות מוסר בזהירות aliquoted עבור ניתוח הבא.
יש להעריך את הריכוז והשלמות של cfDNA המופק מדגימות פלזמה בשיטות מבוססות אלקטרופורזה. cfDNA חולץ באמצעות ערכה מבוססת עמודים הזמינה מסחרית. הכימות בוצע באמצעות ערכה מסחרית מבוססת ג'ל ספציפית ליישומי cfDNA (טבלת חומרים). איור 6A מציג דוגמה למיצוי cfDNA באיכות גבוהה שניתן להשתמש בו עבור יישומים במורד הזרם. ואילו איור 6B מראה דוגמה של דגימה לא מתאימה עם רמה גבוהה של זיהום גנומי.
איור 1: הכנת סרום למחקרי ביופסיה נוזלית. מוצגת מתווה של תהליך הכנת הסרום, מצנטריפוגת מדגם ועד לאחסון של אליקוטים. שלב 1: דגימת דם בצינור ללא נוגדי קרישה לבידוד הסרום. שלב 2: צנטריפוגה של צינור הדם כדי להשיג סרום תוך 4 שעות של מיצוי. שלב 3: הסר את השלב העליון של חומר העל בסרום לאחסון הבא. שלב 4: הקפיאו את צינור הסרום זקוף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. אנא לחצו כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: דגימות דם שנאספו בצינורות ללא נוגדי קרישה לאחר צנטריפוגה. השלב העליון מתאים לשבר הנסיוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דוגמה לדגימה המולית לאחר צנטריפוגה. הפאזה העליונה המתאימה לחלק הפלזמה/סרום נראית אדומה עקב המוליזה. באופן אידיאלי, דגימות אלה צריכות להיות מושלכות, או לפחות נוכחות של המוליזה במדגם צריך להיות נרשם, שכן זה עשוי להשפיע על כמה יישומים במורד הזרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הכנת פלזמה למחקרי ביופסיה נוזלית. מוצג מתווה של תהליך הכנת הסרום, החל מצנטריפוגה לדוגמה ועד לאחסון של אליקוטים ואוסף ציפויים באפיים. שלב 1: דגימת דם בצינור המכילה חומצה אתילנדיאמין טטרה-אצטית (EDTA) לבידוד פלזמה. שלב 2: צנטריפוגה של צינור הדם כדי להשיג פלזמה תוך 4 שעות מהמיצוי. שלב 3: העבר את הפלזמה לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל מבלי להפריע לשכבת התאים. שלב 4: צנטריפוגה של הפלזמה כדי להסיר את כל תאי הדם שנישאו משלב הצנטריפוגה הראשון. שלב 5: מעבירים את הפלזמה לבקבוקונים קריוגניים ומקפיאים את צינור הפלזמה זקוף בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. שלב 6: אסוף את השכבה הסלולרית (ציפוי באפי) ואחסן בטמפרטורה של -80 °C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דגימות דם EDTA לאחר צנטריפוגה. שלוש שכבות נראות לעין לאחר צנטריפוגה של הצינורות המכילים דם טרי. הפאזה העליונה מתאימה לשבר הפלזמה, הממשק הדקיק בצבע לבן-אפרפר מתאים לפרווה הבאפית ומכיל תאי דם לבנים וטסיות דם, והפאזה התחתונה מכילה תאי דם אדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: ניתוח מבוסס אלקטרופורזה של cfDNA שבודד מפלזמה. (B) דוגמה לניסוי תת-אופטימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לביופסיה הנוזלית יש יישומים פוטנציאליים רבים בזמנים שונים במהלך ניהול הסרטן. ראשית, באבחון כדי לזהות סמנים מולקולריים של גידולים שיצביעו על נוכחות של נגע פוטנציאלי בגידול שעשוי להיחקר עוד יותר מבחינה קלינית. שנית, במהלך הטיפול לניטור בזמן אמת של המחלה, הערכת התגובה המולקולרית של הטיפול, אבולוציה קלונלית וגילוי מוקדם של הישנות המחלה או עמידות לטיפול. לבסוף, לאחר הטיפול הכירורגי, ככלי לזיהוי מחלה שיורית מינימלית. האגודה האירופית לאונקולוגיה רפואית (ESMO) פרסמה לאחרונה הנחיות ליישום בדיקות מוטציות ctDNA בסרטן ריאה גרורתי של תאים לא קטנים (NSCLC) כדי לזהות מטרות טיפוליות מעשיות. קווים מנחים אלה כוללים את השיקולים המתודולוגיים, הערכה טכנית ותיקוף של פרופיל ctDNA, ודיון בכמה אתגרים כגון פסיפס סומטי, תדירות אלל וריאנטים נמוכה (VAF), וזיהוי מקרי של וריאנטים פתוגניים של חיידקים4. הנחיות הפרקטיקה הקלינית של ESMO שפורסמו לאחרונה לאבחון, היערכות וטיפול בחולות עם סרטן שד גרורתי מצביעות על ניתוח מבוסס ctDNA במקרים בהם יש שינוי בגישת הטיפול או אם הוא נדרש לכניסה לניסוי קליני5.
דגימות צריך להיות מעובד בתוך 4 שעות מרגע החילוץ. עיבוד דגימות מחוץ למסגרת זמן זו עלול להוביל לפירוק הדגימה ולגרום להמוליזה מוגברת, מה שעלול להשפיע על ריכוז ה-cfDNA ולהשפיע על יישומים במורד הזרם כגון פרופיל miRNA. השימוש ב 2-4 מ"ל של פלזמה מומלץ על מנת לקבל רגישות מספקת לניתוח במורד הזרם. יישומים מבוססי cfDNA מכילים חומר משמר המייצב תאי דם גרעיניים ומונע שחרור של דנ"א גנומי מזהם (gDNA); הדנ"א יציב בצינורות אלה עד 14 יום בטמפרטורה של 6 מעלות צלזיוס עד 37 מעלות צלזיוס לאחר שאיבת הדם. עם זאת, דגימות צריך להיות מעובד בתוך 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם תאי דם לבנים lysed.
יש להשתמש באליקוטים בנפח הולם על מנת למנוע הפשרה בהקפאה של דגימות הסרום והפלזמה. הנפח והמספר של aliquots יהיה תלוי בשימוש במורד הזרם של הדגימות וגם את קיבולת האחסון של -80 °C מקפיא. 1 מ"ל aliquots הם שימושיים כמו זה נפח סטנדרטי המשמש עבור פרוטוקולי מיצוי cfDNA רבים ו aliquots שונים ניתן להפשיר אם נדרש נפח גדול יותר.
ניתן להעריך את ההמוליזה של דגימה על ידי מדידת הספיגה באורך גל של 540 ננומטר של דגימת ההמוליזה החשודה בהשוואה לדגימה שאינה המוליזה עם מראה צהבהב ברור. ההמוליזה היחסית של דגימה מחושבת כיחס בין הספיגה באורך גל של 540 ננומטר של דגימה שאינה המוליזה (עם מראה צהבהב ברור) ושל הדגימה ההמוליזה (עם מראה אדמדם). מומלץ לקוראים להפנות למאמר של טיילרוואן ביורן ואחרים, למידע נוסף6.
שלמות הדגימה היא חיונית בכל יישומי הביופסיה הנוזלית במורד הזרם, והזמן ממיצוי הדגימה ועד לעיבוד וסוג צינור איסוף הדגימות הם שני גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון מכיוון שהם משפיעים על האיכות והתפוקה של סמני ctDNA. ככלל, יש לאסוף את כל הדגימות בצינור ספציפי ל-cfDNA או בצינור EDTA ולעבד אותן תוך 48 שעות ו-4 שעות מהמיצוי, בהתאמה. לכן, חשוב שיהיה תיאום טוב עם כוח האדם והשירותים המעורבים באיסוף הדגימות. באופן אידיאלי, יש לקבוע מעגל איסוף דגימות מפורט המגדיר בבירור את המשימות של כל האנשים המעורבים, עם הוראות מפורטות של טיפול והעברת דגימות. פלזמה עדיפה על סרום ליישומי cfDNA מכיוון שהסרום נוטה להיות מזוהם בדנ"א גנומי עקב תזה של תאי דם לבנים במהלך תהליך הקרישה7. מצד שני, פלזמה מכילה בדרך כלל מעכבי PCR כגון הפרין, המוגלובין, הורמונים, אימונוגלובולין G ולקטופרין8. עם זאת, דילול דגימה יכול לעזור להתגבר על בעיה זו, בתנאי שלדגימה יש ריכוז מספיק של cfDNA. מחקר שנערך לאחרונה מדווח על זרימת עבודה פרה-אנליטית ליישומי ביופסיה נוזלית, המשווה צינורות מייצבים שונים ומדדי כימות ואיכות של חומצות גרעין שבודדו מפלזמה, ומדגים את החשיבות של פרוטוקול עיבוד מתוקנן לניתוח במורד הזרםהניתן לשחזור 9. הנחיות ניתוח cfDNA של המכון הלאומי לסרטן (NCI) ממליצות לעבד את צינורות ה-EDTA תוך 2-4 שעות ואת אלה עם חומר משמר מיוחד תוך 3 ימים10. ביובנקים יכולים להיות מתקן שימושי לחוקרים ללא הציוד הנדרש לעיבוד ואחסון דגימות. באופן אידיאלי, אין להפשיר את הדגימות בהקפאה יותר מפעם אחת ולא לאחסן אותן במשך יותר מ-3 שנים לפני השימוש; לפיכך, יש לתת תשומת לב זהירה לנפח האליקוטים עבור יישומים במורד הזרם על מנת למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה.
שלב קריטי נוסף בעיבוד פלזמה הוא צנטריפוגה; הראשון קובע את הבידוד הנכון של פלזמה מתאים חד-גרעיניים, המקור לזיהום gDNA שיכול לדלל מאוד את השפע היחסי של ctDNA. הצנטריפוגה השנייה המתבצעת במהירויות גבוהות יותר נועדה להסיר עוד יותר את תאי הדם הלבנים11. השימוש בבלם לאחר סיום הצנטריפוגה לא נראה שיש לו השפעה כלשהי על איכות דגימות הפלזמה12. שיקול חשוב נוסף בעת עיבוד דגימות דם הוא סוג הרוטור הצנטריפוגה שיש להשתמש בו, או רוטור מתנדנד או קבוע. לעיבוד דגימות דם מומלץ לבצע רוטור מתנדנד. תבנית זו מאפשרת הפרדה טובה יותר של מרכיבי הדם בהתבסס על שיפועי צפיפות, והמיקום של גלולת התא לאחר צנטריפוגה נמצא בתחתית צינור הצנטריפוגה, בעוד שעם צנטריפוגת רוטור קבועה, כדור התא נוצר לאורך צד הצינור. רוטורים קבועים מאפשרים שימוש בכוח כבידה רב יותר ומתאים יותר להפרדת חלבונים וחומצות גרעין, אם כי הם בדרך כלל מאפשרים לעבד יותר דגימות בו זמנית.
התשואה הסופית של cfDNA היא קריטית לרגישות יישומים במורד הזרם. בהתאם לכך, עם נתונים קודמים, יש צורך במינימום של 3.6 ננוגרם (ng) של cfDNA כדי להשיג רגישות של <0.1% ו-36 ng כדי לקבל רגישות של <0.01% לזיהוי אללים מוטנטיים13. יש לקחת בחשבון איכות אך גם כמות של cfDNA כאשר מחליטים על נפח דגימה לאיסוף ומיצוי. לדוגמה, מחקרים קודמים הראו כי הריכוז הממוצע/חציוני של cfDNA המופק מ-1 מ"ל של פלזמה הוא 21 ננוגרם/מ"ל בסרטן רירית הרחם14, 14.3 (טווח 7-204) ng/mL בלימפומה הודג'קין15, 8.02 (± 7.81) ng/mL בסרטן ריאה של תאים לא קטנים (NSCLC)16, ו-1.35 ng/mL במקרים של סרטן הלבלב17. נפח הפלזמה הנדרש יהיה תלוי בטכנולוגיה במורד הזרם המופעלת אך מומלץ להשתמש ב-2-4 מ"ל על מנת להגיע לרגישות מספקת.
עקיבות מדגם היא היבט חשוב שיש לקחת בחשבון בעת יצירת אוספי דגימות; כל הדגימות והאליקוטים צריכים להיות מסומנים בצורה נכונה וברורה, ומאפשרים בקלות זיהוי לאחר מכן. ניתן להשתמש בביו-בנקים גם מכיוון שיש להם מערכת ניהול איכות מוסמכת, המבטיחה את האיכות, האבטחה והעקיבות של הנתונים והדגימות הביולוגיות המאוחסנות, בהתאם לחקיקה ולתקנות המקומיות והבינלאומיות הרלוונטיות. הנתונים המשויכים לדגימות צריכים להיות מאוחסנים באופן אידיאלי במסד נתונים המתאים למטרה זו, כגון מחקר לכידת נתונים אלקטרונית (REDCap), יישום מבוסס אינטרנט שפותח על ידי אוניברסיטת ונדרבילט כדי ללכוד נתונים למחקר קליני וליצור מסדי נתונים ופרויקטים (https://www.project-redcap.org/). השימוש בשרת מאובטח עם הצפנת נתונים הוא גם מומלץ מאוד.
האתגרים הקשורים ליישום הביופסיה הנוזלית במרפאה נבדקו לאחרונה10, ונושא מרכזי אחד שהודגש היה סטנדרטיזציה של מצבים פרה-אנליטיים כגון איסוף דגימות, עיבוד ואחסון, המשפיעים ישירות על אימות אנליטי וקליני, כמו גם על שכפול התוצאות. קונסורציום ביופסיה נוזלית כגון CANCER-ID, האגודה האירופית לביופסיה נוזלית (ELBS) ואטלס פרופילי הדם בסרטן (BloodPAC) שואפים לתקנן שלבים פרה-אנליטיים ולהגדיר שיטות עבודה מומלצות למחקרי ביופסיה נוזלית במסגרת הקלינית18,19.
ביופסיה נוזלית היא כלי מאוד גמיש ושימושי עם פוטנציאל גדול בהקשר של אבחון סרטן, טיפול ומעקב20. גוף הולך וגדל של ראיות מראה את הרלוונטיות העצומה שלו, ולצורך יישומו הנכון והשימוש בו החשיבות של איסוף דגימות באופן סטנדרטי היא המפתח להשגת נתונים יקרי ערך ודומים. עבודה עם פרוטוקולים סטנדרטיים היא חיונית כדי למנוע מכשולים טכניים בניתוחים הבאים, שהיוו מגבלה אמיתית בעבר עם השימוש בדוגמאות ארכיוניות ישנות. כאן, סיפקנו פרוטוקולים מאומתים שיכולים לסייע בהבטחת הליכים קדם-אנליטיים אופטימליים למחקרים קליניים ומחקריים מבוססי ביופסיה נוזלית מבוססי cfDNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ביאטריס בלוסיו (BB): BB קיבלה כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ מאמג'ן, אסטרה-זנקה, ביוקרטיס, יאנסן, מרק-סרונו, נוברטיס, קיאג'ן, רוש דיאגנוסטיקה, רוש פארמה, תרמופישר, פייזר ו-BMS. שרה לופס-טרואלה (SL): SL קיבלה תואר כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ של אסטרה-זנקה/דאיצ'י-סנקיו, MSD, נוברטיס, פייזר, רוש פארמה, גיליאד, לילי, פייר פברה, סיגן, גלקסו סמית'קליין ו-Veracyte. נוליה טרזונה (NT): NT קיבלה תואר כבוד על תפקיד הדוברת, הייעוץ או הייעוץ מאמג'ן, פייזר, מרק-סרונו, Servier, SEOM ו-ESMO. חוויאר הרננדז-לוסה (JHL): קיבל תואר כבוד על תפקיד הדובר, הייעוץ או הייעוץ של אסטרה-זנקה, יאנסן, נוברטיס, רוש דיאגנוסטיקה, רוש פארמה, תרמופישר, לילי ודיאצ'וטיקה. רודריגו טולדו (RT) מדווח על קבלת מענקי מחקר הקשורים למחקר זה מנוברטיס ומענקי מחקר שאינם קשורים למחקר זה מ-AstraZeneca ו-Beigene. לשאר המחברים אין גילויים לגבי כתב היד.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לרשת המחקר הביו-רפואי בסרטן (CIBERONC) על תמיכתם ועל מענק הפרויקט הבא: LB CIBERONC PLATFORM: פלטפורמת CIBERONC לתקנון וקידום ביופסיה נוזלית. PI רודריגו טולדו, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
