Summary
तरल बायोप्सी ने ऑन्कोलॉजी ट्रांसलेशनल अध्ययन के लिए हमारे दृष्टिकोण में क्रांति ला दी है, नमूना संग्रह, गुणवत्ता और भंडारण इसके सफल नैदानिक अनुप्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। यहां हम डाउनस्ट्रीम परिसंचारी मुक्त डीएनए अनुप्रयोगों के लिए एक मानकीकृत और मान्य प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसे अधिकांश अनुवादक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है।
Abstract
तरल बायोप्सी (एलबी) शब्द प्रोटीन, डीएनए, आरएनए, कोशिकाओं या रक्त में बाह्य पुटिकाओं और अन्य शारीरिक तरल पदार्थों जैसे अणुओं को संदर्भित करता है जो प्राथमिक और / एलबी ट्रांसलेशनल रिसर्च में एक मुख्य आधार के रूप में उभरा है और नैदानिक ऑन्कोलॉजी अभ्यास का हिस्सा बनना शुरू कर दिया है, जो ठोस बायोप्सी के लिए न्यूनतम इनवेसिव विकल्प प्रदान करता है। एलबी रक्त जैसे न्यूनतम इनवेसिव नमूना निष्कर्षण के माध्यम से ट्यूमर की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है। अनुप्रयोगों में प्रारंभिक कैंसर का पता लगाना, रोग प्रगति का पता लगाने के लिए रोगी अनुवर्ती, न्यूनतम अवशिष्ट रोग का मूल्यांकन और आणविक प्रगति की संभावित पहचान और प्रतिरोध का तंत्र शामिल है। क्लिनिक में रिपोर्ट किए जा सकने वाले इन नमूनों का एक विश्वसनीय विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, पूर्वविश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए और कड़ाई से पालन किया जाना चाहिए। नमूना संग्रह, गुणवत्ता और भंडारण महत्वपूर्ण कदम हैं जो डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में उनकी उपयोगिता निर्धारित करते हैं। यहां, हम परिसंचारी मुक्त डीएनए के आधार पर डाउनस्ट्रीम तरल बायोप्सी विश्लेषण के लिए प्लाज्मा और सीरम नमूनों को इकट्ठा करने, प्रसंस्करण और संग्रहीत करने के लिए हमारे तरल बायोप्सी वर्किंग मॉड्यूल से मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को मानक उपकरणों की आवश्यकता होती है और जैविक प्रक्रियाओं पर केंद्रित अधिकांश प्रयोगशालाओं में लागू होने के लिए पर्याप्त रूप से लचीले होते हैं।
Introduction
शब्द "तरल बायोप्सी" को 20101 में अणुओं (जैसे, प्रोटीन, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (डीएनए), राइबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए)), कोशिकाओं, या बाह्य पुटिकाओं (जैसे, एक्सोसोम) की उपस्थिति के रूप में परिभाषित किया गया था रक्त और अन्य शारीरिक तरल पदार्थ जो प्राथमिक ट्यूमर से उत्पन्न होते हैं। तरल बायोप्सी नमूनों के उपयोग ने ट्रांसलेशनल ऑन्कोलॉजी अनुसंधान में क्रांति ला दी है क्योंकि ऊतक बायोप्सी, एक विशेष क्षण में एक विशेष क्षेत्र तक सीमित है, ट्यूमर विषमता के कारण प्रासंगिक क्लोन को याद कर सकती है। इसके अलावा, तरल बायोप्सी ट्यूमर प्रकारों में एक प्रासंगिक भूमिका निभाती है जहां प्राथमिक ऊतक दुर्लभ है या सुलभ नहीं है, क्योंकि यह आक्रामक बायोप्सी से बच सकता है, जिससे रोगियों के लिए लागत और जोखिम कम हो सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर आणविक विशेषताएं लगातार मुख्य रूप से चिकित्सा दबाव के कारण विकसित हो रही हैं, और तरल बायोप्सी नमूने ट्यूमर क्लोनल गतिशीलता को पकड़ सकते हैं क्योंकि उन्हें अनुदैर्ध्य रूप से लिया जा सकता है, रोग के विभिन्न नैदानिक और चिकित्सीय समय जैसे बेसलाइन, उपचार पर, सर्वोत्तम प्रतिक्रिया, और रोग की प्रगति पर या इससे पहले भी। "वास्तविक समय तरल बायोप्सी" की अवधारणा का अर्थ है कि ट्यूमर में गतिशील परिवर्तनों की वास्तविक समय में निगरानी की जा सकती है, इस प्रकार इस बीमारी में सटीक दवा की अनुमति मिलती है। क्लिनिक में तरल बायोप्सी के कई संभावित अनुप्रयोग हैं, जिनमें कैंसर की स्क्रीनिंग और शुरुआती पहचान, बीमारी की वास्तविक समय की निगरानी, न्यूनतम अवशिष्ट रोग का पता लगाना, उपचार प्रतिरोध के लिए तंत्र का अध्ययन करना और चिकित्सीय स्तर पर रोगियों का स्तरीकरणशामिल है। रोग पुनरावृत्ति और प्रगति का प्रारंभिक पता लगाना कई ट्यूमर प्रकारों में एक अपूर्ण नैदानिक आवश्यकता है और कैंसर रोगियों के अस्तित्व और जीवन की गुणवत्ता को बढ़ाने में एक महत्वपूर्ण कारक है। नियमित इमेजिंग तौर-तरीकों और घुलनशील ट्यूमर मार्करों में इस कार्य के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और / इस प्रकार, क्लिनिक में उपन्यास भविष्य कहनेवाला मार्करों की तत्काल आवश्यकता होती है, जैसे कि मुक्त न्यूक्लिक एसिड परिसंचारी पर आधारित।
तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूनों के प्रकारों में शामिल हैं लेकिन रक्त, मूत्र, लार और मल के नमूनों तक सीमित नहीं हैं। अन्य ट्यूमर-विशिष्ट नमूने सेल एस्पिरेट्स, मस्तिष्कमेरु द्रव, फुफ्फुस द्रव, पुटी और जलोदर द्रव, थूक और अग्नाशयी रस हो सकते हैं2. पूर्व तरल पदार्थों में विभिन्न प्रकार के कैंसर-व्युत्पन्न सामग्री, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाएं (सीटीसी), या एक्सोसोम और सेल-फ्री परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) जैसे टुकड़े हो सकते हैं। न्यूक्लिक एसिड को बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) में समझाया जा सकता है या कोशिका मृत्यु और क्षति के कारण शरीर के तरल पदार्थों में जारी किया जा सकता है। परिसंचारी मुक्त डीएनए (सीएफडीएनए) मुख्य रूप से एपोप्टोटिक या नेक्रोटिक कोशिकाओं से रक्तप्रवाह में जारी किया जाता है और सभी व्यक्तियों में मौजूद होता है, जो भड़काऊ या ऑन्कोलॉजिकल बीमारियों में वृद्धि के स्तर को दर्शाता है3. एक्सोसोम छोटे बाह्य पुटिकाएं (~ 30-150 एनएम) हैं जो न्यूक्लिक एसिड, प्रोटीन और लिपिड युक्त कोशिकाओं द्वारा स्रावित होती हैं। ये पुटिकाएं अंतरकोशिकीय संचार नेटवर्क का हिस्सा बनती हैं और आमतौर पर कई प्रकार के शरीर के तरल पदार्थों में पाई जाती हैं2. ईवीएस के अंदर संलग्न न्यूक्लिक एसिड शारीरिक तरल पदार्थों के भीतर कठोर वातावरण से संरक्षित होते हैं, इस प्रकार तरल बायोप्सी सेटिंग में इन अणुओं का अध्ययन करने का एक अधिक मजबूत तरीका प्रदान करते हैं।
कुल मिलाकर, तरल बायोप्सी नमूनों में परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड का स्तर बहुत कम है, और इसलिए पता लगाने के लिए संवेदनशील तरीकों की आवश्यकता होती है, जैसे कि डिजिटल पीसीआर या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस)। नमूने का पूर्वविश्लेषणात्मक प्रबंधन रक्त कोशिका लसीका को रोकने और बरकरार डीएनए की रिहाई को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे जीनोमिक डीएनए के साथ सीएफडीएनए का संदूषण होता है। इसके अलावा, एंजाइम-आधारित विश्लेषण विधियों के अवरोधकों की उपस्थिति से बचने के लिए नमूने निकालते समय देखभाल की जानी चाहिए।
यहां हम प्लाज्मा और सीरम नमूनों के संग्रह और भंडारण के लिए एक मानकीकृत विधि प्रस्तुत करते हैं, जो तरल बायोप्सी-आधारित डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण पहला कदम है, जिसमें परिसंचारी न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण शामिल हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
रक्त के नमूनों के निष्कर्षण से पहले भाग लेने वाले केंद्रों से पूर्व नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था। सीरम और प्लाज्मा अलगाव के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए नैतिक सिद्धांतों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।
नोट: प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले पूर्व विचार यहां प्रदान किए गए हैं। जैव चिकित्सा अनुसंधान में मानव नमूनों के उपयोग के लिए पूर्व नैतिक अनुमोदन की आवश्यकता होती है, इसी सूचित सहमति के साथ। रक्त के नमूनों को संभालने के लिए एक द्वितीय श्रेणी जैव सुरक्षा कैबिनेट की आवश्यकता होती है। रक्त जनित रोगजनकों द्वारा संक्रमण से बचने के लिए एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पूरी प्रक्रिया में पहना जाना चाहिए। सीरम नमूनों के प्रसंस्करण के लिए न्यूनतम 30 मिनट की आवश्यकता होती है। थक्कारोधी के बिना ट्यूबों में रक्त निष्कर्षण के बाद, थक्का गठन की अनुमति देने के लिए 30-45 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर बनाए रखें। प्लाज्मा तैयारी के लिए न्यूनतम 40 मिनट की आवश्यकता होती है, और नमूनों को निष्कर्षण के समय से 4 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए जब एथिलीनेडियामाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (ईडीटीए) ट्यूबों का उपयोग करते समय या सेल स्थिर संग्रह ट्यूबों या विशिष्ट सेल-मुक्त डीएनए संग्रह ट्यूबों का उपयोग करते समय 24-48 घंटे के भीतर। हालांकि, कुछ निर्माताओं के अनुसार, नमूने इन विशेष ट्यूबों में 2 सप्ताह तक स्थिर होते हैं। हेमोलिसिस की जांच करना महत्वपूर्ण है, जो प्लाज्मा या सीरम अंश को लाल रंग की उपस्थिति देगा। चर्चा में हेमोलाइज्ड नमूनों के लिए समस्या निवारण अनुभाग देखें।
1. तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए सीरम तैयारी
नोट: इस चरण को करने के लिए आवश्यक कुल समय 30 मिनट (चित्रा 1) है।
- कोई थक्कारोधी (लाल या लाल / ग्रे-ब्लैक कैप) युक्त ट्यूबों में 4-10 मिलीलीटर रक्त निकालें और 30-45 मिनट के लिए आरटी पर बनाए रखें। निष्कर्षण के समय से 4 घंटे के भीतर इन नमूनों को संसाधित करें।
- नमूना निष्कर्षण का समय और दिनांक और उचित रूप से डिज़ाइन किए गए नमूना डेटाबेस में विषय पहचान (आईडी) रिकॉर्ड करें।
- एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहने हुए, आरटी (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर ताजा रक्त युक्त ट्यूब को 1,600 (± 150) एक्स जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, अधिकतम ब्रेक लागू होने के साथ।
- सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटा दें; सीरम सतह पर तैरनेवाला का ऊपरी चरण स्पष्ट और पीला दिखाई देगा (चित्रा 2)। जांचें कि क्या नमूना हेमोलिसिस (चित्रा 3) के संकेत दिखाता है और उचित होने पर हेमोलिसिस की उपस्थिति रिकॉर्ड करता है।
- एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में, 250 μL विभाज्य के रूप में संग्रह ट्यूबों के लिए सीरम हस्तांतरण।
नोट: विभाज्य की मात्रा अध्ययन आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। - तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर एक भंडारण बॉक्स में सीरम को सीधे फ्रीज करें और नमूना भंडारण के समय को रिकॉर्ड करें।
- सत्यापित करें कि नमूने आवश्यक 4 घंटे समय सीमा के भीतर संसाधित किए गए थे।
2. तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए प्लाज्मा तैयारी
नोट: इस चरण को करने के लिए आवश्यक कुल समय 40 मिनट (चित्रा 4) है।
- एथिलेनेडियामाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त ट्यूबों में 4-10 मिलीलीटर रक्त निकालें। निष्कर्षण के समय से 4 घंटे के भीतर नमूनों को संसाधित करें।
- नमूना निष्कर्षण और विषय आईडी का समय और दिनांक उचित रूप से डिज़ाइन किए गए नमूना डेटाबेस में रिकॉर्ड करें।
- एक प्रयोगशाला कोट, सुरक्षात्मक दस्ताने और चश्मा पहने हुए, आरटी (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर ईडीटीए ट्यूब को 1,600 (± 150) एक्स जी पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, अधिकतम ब्रेक लागू होने के साथ।
नोट: अन्य संग्रह ट्यूबों का उपयोग करते समय निर्माता के निर्देशों का संदर्भ लें। - सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला स्पष्ट और पीला दिखाई देगा। जांचें कि क्या नमूना हेमोलिसिस (चित्रा 3) के संकेत दिखाता है और प्लाज्मा (सतह पर तैरनेवाला) को डिस्पोजेबल सीरोलॉजिकल पिपेट (या फिल्टर टिप के साथ पी 1000 पिपेट) का उपयोग करके सेलुलर परत को परेशान किए बिना 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करता है। सेल परत (लगभग 5 मिमी) के ऊपर प्लाज्मा की एक छोटी अवशिष्ट मात्रा छोड़ दें।
- यदि हेमोलिसिस मनाया जाता है, तो आगे के विश्लेषण के लिए नमूने को त्याग दें। (चित्र 5)। हेमोलिसिस का आकलन करने के लिए चर्चा में समस्या निवारण अनुभाग देखें।
- 3,000 (±150) एक्स जी पर 10-20 मिनट के लिए आरटी (15 डिग्री सेल्सियस -25 डिग्री सेल्सियस) पर एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में प्लाज्मा अपकेंद्रित्र । पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से किए गए किसी भी अवशिष्ट बरकरार रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए इस चरण को करें।
- सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ध्यान से अपकेंद्रित्र से ट्यूब को हटा दें और डिस्पोजेबल सीरोलॉजिकल पिपेट (या डिस्पोजेबल बल्ब पिपेट या फिल्टर टिप के साथ पी 1000 पिपेट) का उपयोग करके 1-4 एमएल प्लाज्मा को 1-4 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन क्रायोजेनिक शीशियों में स्थानांतरित करें। प्लाज्मा की एक अवशिष्ट मात्रा (लगभग 0.3 एमएल या 7 मिमी ऊंचाई) रक्त कोशिकाओं (चित्रा 5) के साथ प्लाज्मा को दूषित करने से बचने के लिए ट्यूब के तल पर छोड़ दिया जाना चाहिए।
- तुरंत -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण बॉक्स में प्लाज्मा सीधे फ्रीज और नमूना भंडारण के समय रिकॉर्ड। सत्यापित करें कि नमूने आवश्यक 4 घंटे समय सीमा के भीतर संसाधित किए गए थे।
- एक पी 1000 और फ़िल्टर टिप का उपयोग करके सेलुलर परत (बफी कोट) लीजिए और इसे 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। तुरंत फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
थक्कारोधी के बिना रक्त ट्यूबों के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, ऊपरी चरण एक हल्का पीला दिखाई देता है और सीरम अंश (चित्रा 2) से मेल खाता है। इस अंश को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है और बाद के विश्लेषण के लिए विभाज्य किया जाता है।
हेमोलिसिस या तो प्लाज्मा या सीरम अंश में मौजूद हो सकता है, और ऊपरी चरण में एक लाल उपस्थिति होगी, जो हेमोलिसिस (चित्रा 3) की उपस्थिति और डिग्री को इंगित करता है।
ईडीटीए ट्यूबों के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, कई चरण या परतें स्पष्ट होंगी; ऊपरी चरण (हल्का पीला) प्लाज्मा अंश है, जो कुल रक्त की मात्रा का 55% है; पतली भूरे-सफेद इंटरफ़ेस बफी कोट परत है जिसमें सफेद रक्त कोशिकाएं और प्लेटलेट्स होते हैं, और कुल रक्त की मात्रा का <1% होता है; निचले चरण (लाल रंग) में लाल रक्त कोशिकाएं होती हैं, जो कुल रक्त की मात्रा का 45% हिस्सा होती हैं। ल्यूकोसाइट परत के ऊपर 1 सेमी की आकांक्षा करें, और सुनिश्चित करें कि कोशिका परत रक्त कोशिकाओं (चित्रा 5) के साथ प्लाज्मा के संदूषण को कम करने के लिए परेशान नहीं है। इस अंश को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाना चाहिए और बाद के विश्लेषण के लिए विभाज्य किया जाना चाहिए।
प्लाज्मा नमूनों से निकाले गए सीएफडीएनए की एकाग्रता और अखंडता का मूल्यांकन वैद्युतकणसंचलन-आधारित विधियों का उपयोग करके किया जाना चाहिए। सीएफडीएनए को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कॉलम-आधारित किट का उपयोग करके निकाला गया था। सीएफडीएनए अनुप्रयोगों (सामग्री की तालिका) के लिए विशिष्ट जेल-आधारित व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके मात्रा का ठहराव किया गया था। चित्रा 6 ए उच्च गुणवत्ता के सीएफडीएनए निष्कर्षण का एक उदाहरण दिखाता है जिसका उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। जबकि, चित्रा 6 बी जीनोमिक संदूषण के उच्च स्तर के साथ एक अनुपयुक्त नमूने का एक उदाहरण दिखाता है।
चित्रा 1: तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए सीरम तैयारी। सीरम तैयारी प्रक्रिया की एक रूपरेखा नमूना सेंट्रीफ्यूजेशन से विभाज्य के भंडारण तक दिखाई गई है। चरण 1: सीरम के अलगाव के लिए थक्कारोधी के बिना एक ट्यूब में रक्त का नमूना। चरण 2: निष्कर्षण के 4 घंटे के भीतर सीरम प्राप्त करने के लिए रक्त ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। चरण 3: बाद के भंडारण के लिए सीरम सतह पर तैरनेवाला के ऊपरी चरण को हटा दें। चरण 4: सीरम ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर सीधे फ्रीज करें कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद थक्कारोधी के बिना ट्यूबों में एकत्र किए गए रक्त के नमूने। ऊपरी चरण सीरम अंश से मेल खाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एक हेमोलाइज्ड नमूने का एक उदाहरण। सीरम अंश के अनुरूप ऊपरी चरण हेमोलिसिस के कारण लाल दिखाई देता है। आदर्श रूप से, इन नमूनों को त्याग दिया जाना चाहिए, या कम से कम नमूने में हेमोलिसिस की उपस्थिति दर्ज की जानी चाहिए, क्योंकि यह कुछ डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए प्लाज्मा तैयारी। सीरम तैयारी प्रक्रिया की एक रूपरेखा नमूना सेंट्रीफ्यूजेशन से विभाज्य और बफी कोट संग्रह के भंडारण तक दिखाई गई है। चरण 1: प्लाज्मा के अलगाव के लिए एथिलीनेडियामाइन टेट्रा-एसिटिक एसिड (ईडीटीए) युक्त ट्यूब में रक्त का नमूना। चरण 2: निष्कर्षण के 4 घंटे के भीतर प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए रक्त ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें। चरण 3: सेलुलर परत को परेशान किए बिना प्लाज्मा सतह पर तैरनेवाला को 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। चरण 4: पहले सेंट्रीफ्यूजेशन चरण से किए गए किसी भी रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए प्लाज्मा को अपकेंद्रित्र करें। चरण 5: प्लाज्मा को क्रायोजेनिक शीशियों में स्थानांतरित करें और प्लाज्मा ट्यूब को -80 डिग्री सेल्सियस पर सीधे फ्रीज करें। चरण 6: सेलुलर परत (बफी कोट) लीजिए और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद ईडीटीए रक्त के नमूने। ताजा रक्त युक्त ट्यूबों के सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद तीन दृश्यमान परतें दिखाई देती हैं। ऊपरी चरण प्लाज्मा अंश से मेल खाता है, पतली भूरे-सफेद इंटरफ़ेस बफी कोट से मेल खाती है और इसमें सफेद रक्त कोशिकाएं और प्लेटलेट्स होते हैं, और निचले चरण में लाल रक्त कोशिकाएं होती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: प्लाज्मा से पृथक सीएफडीएनए का वैद्युतकणसंचलन-आधारित विश्लेषण। (ए) एक इष्टतम प्रयोग का एक उदाहरण। (बी) एक उप-इष्टतम प्रयोग का एक उदाहरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
कैंसर के प्रबंधन के दौरान तरल बायोप्सी में अलग-अलग समय पर कई संभावित अनुप्रयोग होते हैं। सबसे पहले, ट्यूमर आणविक मार्करों की पहचान करने के लिए निदान पर जो संभावित ट्यूमर घाव की उपस्थिति का सुझाव देगा जिसे नैदानिक रूप से आगे की जांच की जा सकती है। दूसरा, रोग की वास्तविक समय की निगरानी के लिए उपचार के दौरान, उपचार आणविक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन, क्लोनल विकास, और रोग रिलेप्स या उपचार प्रतिरोध का प्रारंभिक पता लगाना। अंत में, सर्जिकल उपचार के बाद, न्यूनतम अवशिष्ट रोग का पता लगाने के लिए एक उपकरण के रूप में। यूरोपियन सोसाइटी ऑफ मेडिकल ऑन्कोलॉजी (ईएसएमओ) ने हाल ही में मेटास्टैटिक गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) में सीटीडीएनए उत्परिवर्तन परीक्षण के कार्यान्वयन के लिए दिशानिर्देश प्रकाशित किए हैं ताकि कार्रवाई योग्य चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान की जा सके। इन दिशानिर्देशों में सीटीडीएनए प्रोफाइलिंग के पद्धतिगत विचार, तकनीकी मूल्यांकन और सत्यापन, और दैहिक मोज़ेकवाद, कम संस्करण एलील आवृत्ति (वीएएफ), और आकस्मिक जर्मलाइन रोगजनक संस्करण का पता लगाने जैसी कुछ चुनौतियों पर चर्चा करना शामिलहै। मेटास्टैटिक स्तन कैंसर वाले रोगियों के निदान, मंचन और उपचार के लिए हाल ही में प्रकाशित ईएसएमओ क्लिनिकल प्रैक्टिस दिशानिर्देश उन मामलों में सीटीडीएनए-आधारित विश्लेषण का संकेत देते हैं जहां उपचार दृष्टिकोण में बदलाव होता है या यदि यह नैदानिक परीक्षण में प्रवेश करने के लिए आवश्यक है5.
नमूने निष्कर्षण के समय से 4 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए। इस समय सीमा के बाहर नमूना प्रसंस्करण से नमूना गिरावट हो सकती है और इसके परिणामस्वरूप हेमोलिसिस में वृद्धि हो सकती है, जो सीएफडीएनए एकाग्रता पर प्रभाव डाल सकती है और एमआईआरएनए प्रोफाइलिंग जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों को प्रभावित कर सकती है। डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए प्लाज्मा के 2-4 एमएल के उपयोग की सिफारिश की जाती है। सीएफडीएनए-आधारित अनुप्रयोगों में एक संरक्षक होता है जो न्यूक्लिएटेड रक्त कोशिकाओं को स्थिर करता है और दूषित जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) की रिहाई को रोकता है; रक्त निष्कर्षण के बाद डीएनए 6 डिग्री सेल्सियस से 37 डिग्री सेल्सियस पर 14 दिनों तक इन ट्यूबों में स्थिर होता है। हालांकि, सफेद रक्त कोशिकाओं के साथ संदूषण से बचने के लिए नमूनों को 24-48 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए।
सीरम और प्लाज्मा नमूनों के फ्रीज-विगलन से बचने के लिए पर्याप्त मात्रा के विभाज्य का उपयोग किया जाना चाहिए। विभाज्य की मात्रा और संख्या नमूनों के डाउनस्ट्रीम उपयोग और -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर की भंडारण क्षमता पर भी निर्भर करेगी। 1 एमएल विभाज्य उपयोगी होते हैं क्योंकि यह कई सीएफडीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के लिए उपयोग की जाने वाली मानक मात्रा है और अधिक मात्रा की आवश्यकता होने पर विभिन्न विभाज्य को डीफ्रॉस्ट किया जा सकता है।
एक नमूने के हेमोलिसिस का अनुमान एक स्पष्ट पीले रंग की उपस्थिति के साथ एक गैर-हेमोलाइज्ड नमूने की तुलना में संदिग्ध हेमोलाइज्ड नमूने के 540 एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषण को मापकर लगाया जा सकता है। एक नमूने के सापेक्ष हेमोलिसिस की गणना गैर-हेमोलाइज्ड नमूने (एक स्पष्ट पीले रंग की उपस्थिति के साथ) के 540 एनएम की तरंग दैर्ध्य और हेमोलाइज्ड नमूने (लाल उपस्थिति के साथ) पर अवशोषण के अनुपात के रूप में की जाती है। पाठकों को सलाह दी जाती है कि वे अधिक जानकारी के लिए टायलर वान ब्यूरन एट अल द्वारा लेख का उल्लेख करें6.
नमूना अखंडता सभी डाउनस्ट्रीम तरल बायोप्सी अनुप्रयोगों में महत्वपूर्ण है, और नमूना निष्कर्षण से प्रसंस्करण और नमूना संग्रह ट्यूब प्रकार तक का समय दो महत्वपूर्ण कारक हैं जिन्हें माना जाना चाहिए क्योंकि वे सीटीडीएनए मार्करों की गुणवत्ता और उपज को प्रभावित करते हैं। एक सामान्य नियम के रूप में, सभी नमूनों को सीएफडीएनए-विशिष्ट ट्यूब या ईडीटीए ट्यूब में एकत्र किया जाना चाहिए और क्रमशः निष्कर्षण के 48 घंटे और 4 घंटे के भीतर संसाधित किया जाना चाहिए। इस प्रकार, नमूना संग्रह में शामिल कर्मियों और सेवाओं के साथ अच्छा समन्वय होना महत्वपूर्ण है। आदर्श रूप से, एक विस्तृत नमूना संग्रह सर्किट स्थापित किया जाना चाहिए जो नमूनों की हैंडलिंग और हस्तांतरण के विस्तृत निर्देशों के साथ, सभी लोगों के कार्यों को स्पष्ट रूप से परिभाषित करता है। प्लाज्मा को सीएफडीएनए अनुप्रयोगों के लिए सीरम के लिए पसंद किया जाता है क्योंकि थक्के की प्रक्रिया के दौरान सफेद रक्त कोशिका लसीका के कारण सीरम जीनोमिक डीएनए से दूषित हो जाताहै 7. दूसरी ओर, प्लाज्मा में आमतौर पर पीसीआर अवरोधक होते हैं जैसे हेपरिन, हीमोग्लोबिन, हार्मोन, इम्युनोग्लोबुलिन जी और लैक्टोफेरिन8। हालांकि, नमूना कमजोर पड़ने से इस समस्या को दूर करने में मदद मिल सकती है, बशर्ते कि नमूने में सीएफडीएनए की पर्याप्त एकाग्रता हो। एक हालिया अध्ययन तरल बायोप्सी अनुप्रयोगों के लिए एक पूर्वविश्लेषणात्मक वर्कफ़्लो की रिपोर्ट करता है, प्लाज्मा से अलग न्यूक्लिक एसिड के विभिन्न स्थिर ट्यूबों और मात्रा का ठहराव और गुणवत्ता उपायों की तुलना करता है, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एक मानकीकृत प्रसंस्करण प्रोटोकॉल के महत्व का प्रदर्शनकरता है 9. राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एनसीआई) सीएफडीएनए विश्लेषण दिशानिर्देश अनुशंसा करते हैं कि ईडीटीए ट्यूबों को 2-4 घंटे के भीतर संसाधित किया जाए और 3 दिनों के भीतर एक विशेष संरक्षक वाले लोगोंको 10. बायोबैंक नमूना प्रसंस्करण और भंडारण के लिए आवश्यक उपकरणों के बिना जांचकर्ताओं के लिए एक उपयोगी सुविधा हो सकती है। आदर्श रूप से, नमूनों को एक से अधिक बार फ्रीज-पिघलाया नहीं जाना चाहिए और उपयोग से पहले 3 साल से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाना चाहिए; इस प्रकार, फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए विभाज्य की मात्रा पर सावधानीपूर्वक ध्यान दिया जाना चाहिए।
प्लाज्मा प्रसंस्करण में एक और महत्वपूर्ण कदम सेंट्रीफ्यूजेशन है; पहला मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से प्लाज्मा के सही अलगाव को निर्धारित करता है, जीडीएनए संदूषण का स्रोत जो सीटीडीएनए की सापेक्ष बहुतायत को बहुत पतला कर सकता है। तेज गति से किए गए दूसरे सेंट्रीफ्यूजेशन का उद्देश्य सफेद रक्त कोशिकाओं को और अधिक हटाना है11. सेंट्रीफ्यूजेशन समाप्त होने के बाद ब्रेक का उपयोग प्लाज्मा नमूनों की गुणवत्ता पर कोई प्रभाव नहीं डालता है12. रक्त के नमूनों को संसाधित करते समय एक और महत्वपूर्ण विचार अपकेंद्रित्र रोटर का प्रकार उपयोग करने के लिए है, या तो स्विंग-आउट या निश्चित रोटर। रक्त के नमूनों को संसाधित करने के लिए, स्विंग-आउट रोटर की सिफारिश की जाती है। यह प्रारूप घनत्व ढाल के आधार पर रक्त घटकों के बेहतर पृथक्करण की अनुमति देता है, और सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद सेल गोली का स्थान अपकेंद्रित्र ट्यूब के नीचे होता है, जबकि, एक निश्चित रोटर अपकेंद्रित्र के साथ, सेल गोली ट्यूब के किनारे बनती है। फिक्स्ड रोटर अधिक गुरुत्वाकर्षण बल का उपयोग करने की अनुमति देते हैं और प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड को अलग करने के लिए अधिक उपयुक्त होते हैं, हालांकि वे आमतौर पर एक ही समय में अधिक नमूनों को संसाधित करने की अनुमति देते हैं।
डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन संवेदनशीलता के लिए सीएफडीएनए की अंतिम उपज महत्वपूर्ण है। तदनुसार, पिछले आंकड़ों के साथ, उत्परिवर्ती एलील 13 का पता लगाने के लिए <0.01% की संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए <0.1% और 36 एनजी की संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए सीएफडीएनए के न्यूनतम3.6 नैनोग्राम (एनजी) की आवश्यकता होती है। संग्रह और निष्कर्षण के लिए नमूना मात्रा पर निर्णय लेते समय गुणवत्ता लेकिन सीएफडीएनए की मात्रा पर भी विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्लाज्मा के 1 एमएल से निकाले गए सीएफडीएनए की औसत / औसत एकाग्रता एंडोमेट्रियल कैंसरमें 21 एनजी / एमएल है 14, 14.3 (रेंज 7-204) एनजी / एमएल हॉजकिन लिंफोमा में15, 8.02 (±7.81) एनजी / एमएल गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) 16 में एनजी / आवश्यक प्लाज्मा वॉल्यूम नियोजित डाउनस्ट्रीम तकनीक पर निर्भर करेगा लेकिन पर्याप्त संवेदनशीलता तक पहुंचने के लिए 2-4 एमएल के उपयोग की सिफारिश की जाती है।
नमूना ट्रेसेबिलिटी एक महत्वपूर्ण पहलू है जिसे नमूना संग्रह बनाते समय विचार किया जाना चाहिए; सभी नमूनों और विभाज्य को सही ढंग से और स्पष्ट रूप से लेबल किया जाना चाहिए, आसानी से बाद की पहचान की अनुमति देता है। बायोबैंक का उपयोग इसलिए भी किया जा सकता है क्योंकि उनके पास एक मान्यता प्राप्त गुणवत्ता प्रबंधन प्रणाली है, जो लागू स्थानीय और अंतर्राष्ट्रीय कानून और नियमों का पालन करते हुए संग्रहीत डेटा और जैविक नमूनों की गुणवत्ता, सुरक्षा और ट्रेसबिलिटी की गारंटी देती है। नमूनों से जुड़े डेटा को आदर्श रूप से इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त डेटाबेस में संग्रहीत किया जाना चाहिए, जैसे कि रिसर्च इलेक्ट्रॉनिक डेटा कैप्चर (आरईडीसीएपी), नैदानिक अनुसंधान के लिए डेटा कैप्चर करने और डेटाबेस और प्रोजेक्ट बनाने के लिए वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय द्वारा विकसित एक वेब-आधारित एप्लिकेशन (https://www.project-redcap.org/)। डेटा एन्क्रिप्शन के साथ एक सुरक्षित सर्वर का उपयोग भी अत्यधिक अनुशंसित है।
क्लिनिक में तरल बायोप्सी के कार्यान्वयन से संबंधित चुनौतियों की हाल ही में10 समीक्षा की गई है, और हाइलाइट किया गया एक प्रमुख मुद्दा नमूना संग्रह, प्रसंस्करण और भंडारण जैसी पूर्वविश्लेषणात्मक स्थितियों का मानकीकरण था, जो सीधे विश्लेषणात्मक और नैदानिक सत्यापन को प्रभावित करता है, साथ ही परिणामों की प्रजनन क्षमता भी। कैंसर-आईडी, यूरोपीय तरल बायोप्सी सोसाइटी (ईएलबीएस), और कैंसर में रक्त प्रोफाइलिंग एटलस (ब्लडपीएसी) जैसे तरल बायोप्सी कंसोर्टियम का उद्देश्य पूर्वविश्लेषणात्मक चरणों को मानकीकृत करना और नैदानिक सेटिंग18,19 में तरल बायोप्सी अध्ययन के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं को परिभाषित करना है।
तरल बायोप्सी कैंसर निदान, उपचार और अनुवर्ती20 के संदर्भ में महान क्षमता के साथ एक बहुत ही लचीला और उपयोगी उपकरण है। साक्ष्य का एक बढ़ता हुआ शरीर इसकी विशाल प्रासंगिकता को दर्शाता है, और इसके उचित कार्यान्वयन के लिए और मानकीकृत तरीके से नमूने एकत्र करने के महत्व का उपयोग मूल्यवान और तुलनीय डेटा प्राप्त करने की कुंजी है। मानकीकृत प्रोटोकॉल के साथ काम करना बाद के विश्लेषणों में तकनीकी बाधाओं से बचने के लिए महत्वपूर्ण है, जो पुराने अभिलेखीय नमूनों के उपयोग के साथ अतीत में एक वास्तविक सीमा रही है। यहां, हमने मान्य प्रोटोकॉल प्रदान किए हैं जो नैदानिक और अनुसंधान सीएफडीएनए-आधारित तरल बायोप्सी अध्ययनों के लिए इष्टतम पूर्वविश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं की गारंटी देने में मदद कर सकते हैं।
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
बीट्रिज बेलोसिलो (बीबी): बीबी को एमजेन, एस्ट्रा-जेनेका, बायोकार्टिस, जानसेन, मर्क-सेरोनो, नोवार्टिस, कियागेन, रोश डायग्नोस्टिक्स, रोश फार्मा, थर्मोफिशर, फाइजर और बीएमएस से स्पीकर, कंसल्टेंसी या सलाहकार की भूमिका के लिए मानदेय मिला। सारा लोपेज़-तारुएला (श्रीलंका): एसएल को स्पीकर, परामर्श या सलाहकार की भूमिका के लिए मानदेय मिला एस्ट्रा-ज़ेनेका/दाइची-सैंक्यो, एमएसडी, नोवार्टिस, फाइजर, रोश फार्मा, गिलियड, लिली, पियरे फेब्रे, सीजेन, ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन और वेरासाइट। नोएलिया ताराजोना (एनटी): एनटी को एम्जेन, फाइजर, मर्क-सेरोनो, सर्वियर, एसईओएम और ईएसएमओ से स्पीकर, परामर्श या सलाहकार की भूमिका के लिए मानदेय मिला। जेवियर हर्नांडेज़-लोसा (जेएचएल): एस्ट्रा-ज़ेनेका, जानसेन, नोवार्टिस, रोश डायग्नोस्टिक्स, रोश फार्मा, थर्मोफिशर, लिली और डायस्यूटिक्स से स्पीकर, कंसल्टेंसी या सलाहकार की भूमिका के लिए मानदेय प्राप्त किया। रोड्रिगो टोलेडो (आरटी) नोवार्टिस से इस अध्ययन से संबंधित अनुसंधान अनुदान प्राप्त करने और एस्ट्राजेनेका और बीजीन से इस अध्ययन से असंबंधित अनुसंधान अनुदान प्राप्त करने की रिपोर्ट करता है। शेष लेखकों के पास पांडुलिपि के संबंध में कोई खुलासा नहीं है।
Acknowledgments
हम उनके समर्थन और निम्नलिखित परियोजना अनुदान के लिए कैंसर में बायोमेडिकल रिसर्च नेटवर्क (सीआईबेरॉन्क) को धन्यवाद देना चाहते हैं: एलबी सीआईबेरॉन्क प्लेटफॉर्म: तरल बायोप्सी के मानकीकरण और प्रचार के लिए सीआईबीरॉन्क प्लेटफॉर्म। पीआई रोड्रिगो टोलेडो, (सीआईबीईआरओएनसी), 2019-2021।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
