Summary
La biopsia liquida ha rivoluzionato il nostro approccio agli studi traslazionali oncologici, con la raccolta, la qualità e lo stoccaggio dei campioni come passaggi cruciali per la sua applicazione clinica di successo. Qui descriviamo un protocollo standardizzato e convalidato per applicazioni di DNA senza circolazione a valle che può essere applicato nella maggior parte dei laboratori di ricerca traslazionale.
Abstract
Il termine biopsia liquida (LB) si riferisce a molecole come proteine, DNA, RNA, cellule o vescicole extracellulari nel sangue e altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario e / o metastatico. LB è emerso come un pilastro nella ricerca traslazionale e ha iniziato a diventare parte della pratica oncologica clinica, fornendo un'alternativa minimamente invasiva alla biopsia solida. L'LB consente il monitoraggio in tempo reale di un tumore tramite un'estrazione del campione minimamente invasiva, come il sangue. Le applicazioni includono la diagnosi precoce del cancro, il follow-up del paziente per il rilevamento della progressione della malattia, la valutazione della malattia residua minima e la potenziale identificazione della progressione molecolare e del meccanismo di resistenza. Al fine di ottenere un'analisi affidabile di questi campioni che può essere riportata in clinica, le procedure preanalitiche devono essere attentamente considerate e rigorosamente seguite. La raccolta, la qualità e l'archiviazione dei campioni sono passaggi cruciali che ne determinano l'utilità nelle applicazioni a valle. Qui, presentiamo protocolli standardizzati dal nostro modulo di lavoro per biopsia liquida per la raccolta, l'elaborazione e la conservazione di campioni di plasma e siero per l'analisi della biopsia liquida a valle basata sul DNA privo di circolazione. I protocolli qui presentati richiedono attrezzature standard e sono sufficientemente flessibili da essere applicati nella maggior parte dei laboratori focalizzati su procedure biologiche.
Introduction
Il termine "biopsia liquida" è stato definito nel 20101 come la presenza di molecole (ad esempio, proteine, acido desossiribonucleico (DNA), acido ribonucleico (RNA)), cellule o vescicole extracellulari (ad esempio, esosomi) nel sangue e in altri fluidi corporei che provengono dal tumore primario. L'uso di campioni di biopsia liquida ha rivoluzionato la ricerca oncologica traslazionale in quanto le biopsie tissutali, limitate a una particolare regione in un particolare momento, possono perdere cloni rilevanti a causa dell'eterogeneità del tumore. Inoltre, la biopsia liquida svolge un ruolo rilevante nei tipi di tumore in cui il tessuto primario è scarso o non accessibile, in quanto può evitare una biopsia invasiva, riducendo i costi e i rischi per i pazienti. Inoltre, le caratteristiche molecolari del tumore sono in continua evoluzione principalmente a causa della pressione della terapia, e i campioni di biopsia liquida possono catturare la dinamica clonale del tumore in quanto possono essere prelevati longitudinalmente, in diversi momenti clinici e terapeutici della malattia come al basale, al trattamento, alla migliore risposta e alla progressione della malattia o anche prima. Il concetto di "biopsia liquida in tempo reale" significa che i cambiamenti dinamici nel tumore possono essere monitorati in tempo reale, consentendo così la medicina di precisione in questa malattia. La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in clinica, tra cui lo screening e la diagnosi precoce del cancro, il monitoraggio in tempo reale della malattia, il rilevamento della malattia residua minima, lo studio dei meccanismi di resistenza al trattamento e la stratificazione dei pazienti a livello terapeutico1. La diagnosi precoce della recidiva e della progressione della malattia è un'esigenza clinica insoddisfatta in molti tipi di tumore ed è un fattore chiave per aumentare la sopravvivenza e la qualità della vita dei malati di cancro. Le modalità di imaging di routine e i marcatori tumorali solubili possono non avere la sensibilità e / o la specificità richieste per questo compito. Pertanto, nuovi marcatori predittivi sono urgentemente necessari nella clinica, come quelli basati su acidi nucleici liberi circolanti.
I tipi di campioni utilizzati per gli studi di biopsia liquida includono, ma non sono limitati a sangue, urina, saliva e campioni di feci. Altri campioni specifici del tumore possono essere aspirati cellulari, liquido cerebrospinale, liquido pleurico, liquido di cisti e ascite, espettorato e succo pancreatico2. I primi liquidi possono contenere diversi tipi di materiali derivati dal cancro, cellule tumorali circolanti (CTC) o frammenti come esosomi e DNA tumorale circolante privo di cellule (ctDNA). Gli acidi nucleici possono essere incapsulati in vescicole extracellulari (EV) o rilasciati nei fluidi corporei a causa della morte e del danno cellulare. Il DNA libero circolante (cfDNA) viene rilasciato principalmente nel flusso sanguigno da cellule apoptotiche o necrotiche ed è presente in tutti gli individui, mostrando livelli aumentati nelle malattie infiammatorie o oncologiche3. Gli esosomi sono piccole vescicole extracellulari (~ 30-150 nm) secrete da cellule contenenti acidi nucleici, proteine e lipidi. Queste vescicole fanno parte della rete di comunicazione intercellulare e si trovano comunemente in molti tipi di fluidi corporei2. Gli acidi nucleici racchiusi all'interno dei veicoli elettrici sono protetti dall'ambiente ostile all'interno dei fluidi corporei, fornendo così un modo più robusto per studiare queste molecole nell'ambiente della biopsia liquida.
Nel complesso, i livelli di acidi nucleici circolanti nei campioni di biopsia liquida sono molto bassi e quindi sono necessari metodi sensibili per il rilevamento, come la PCR digitale o il sequenziamento di nuova generazione (NGS). La gestione preanalitica del campione è fondamentale per prevenire la lisi delle cellule del sangue e il rilascio di DNA intatto, causando la contaminazione del cfDNA con il DNA genomico. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante l'estrazione dei campioni per evitare la presenza di inibitori dei metodi di analisi basati su enzimi.
Qui presentiamo un metodo standardizzato per la raccolta e lo stoccaggio di campioni di plasma e siero, che è un primo passo cruciale per le applicazioni a valle basate sulla biopsia liquida, comprese le analisi degli acidi nucleici circolanti.
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Protocol
La previa approvazione etica è stata ottenuta dai centri partecipanti prima dell'estrazione dei campioni di sangue. I seguenti protocolli per l'isolamento del siero e del plasma sono stati eseguiti in conformità con i principi etici per la ricerca biomedica.
NOTA: le considerazioni preliminari prima di iniziare il protocollo sono fornite qui. È necessaria una previa approvazione etica per l'uso di campioni umani nella ricerca biomedica, con il corrispondente consenso informato. Per gestire i campioni di sangue è necessario un armadietto di biosicurezza di classe II. Un cappotto da laboratorio, guanti protettivi e occhiali devono essere indossati durante tutta la procedura per evitare l'infezione da agenti patogeni trasmessi dal sangue. È richiesto un minimo di 30 minuti per l'elaborazione dei campioni di siero. Dopo l'estrazione del sangue in tubi senza anticoagulante, mantenere a temperatura ambiente (RT) per 30-45 minuti per consentire la formazione di coaguli. È richiesto un minimo di 40 minuti per la preparazione del plasma e i campioni devono essere elaborati entro 4 ore dal momento dell'estrazione quando si utilizzano tubi di acido tetra-acetico (EDTA) di etilendiammina o entro 24-48 ore se si utilizzano tubi di raccolta stabilizzanti cellulari o specifici tubi di raccolta del DNA privi di cellule. Tuttavia, secondo alcuni produttori, i campioni sono stabili fino a 2 settimane in questi tubi specializzati. È importante verificare l'emolisi, che darà al plasma o alla frazione sierica un aspetto rossastro. Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi per gli esempi emolizzati nella discussione.
1. Preparazione del siero per studi di biopsia liquida
NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 30 minuti (Figura 1).
- Estrarre 4-10 ml di sangue in provette prive di anticoagulante (cappuccio rosso o rosso/grigio-nero) e mantenere a RT per 30-45 min. Elaborare questi campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
- Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'identificazione del soggetto (ID) in un database di campioni opportunamente progettato.
- Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo contenente sangue fresco a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima pausa applicata.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga; la fase superiore del surnatante sierico apparirà chiara e giallastra (Figura 2). Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e registrare la presenza di emolisi quando appropriato.
- In un armadio di biosicurezza di classe II, trasferire il siero in tubi di raccolta come aliquote da 250 μL.
NOTA: Il volume delle aliquote deve essere adeguato alle esigenze dello studio. - Congelare immediatamente il siero in posizione verticale in una scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione.
- Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.
2. Preparazione del plasma per studi di biopsia liquida
NOTA: il tempo totale necessario per eseguire questo passaggio è di 40 minuti (Figura 4).
- Estratto 4-10 ml di sangue in provette contenenti acido tetra-acetico etilendiammina (EDTA). Elaborare i campioni entro 4 ore dal momento dell'estrazione.
- Registrare l'ora e la data dell'estrazione del campione e l'ID soggetto in un database di campioni progettato in modo appropriato.
- Indossando un camice da laboratorio, guanti protettivi e occhiali, centrifugare il tubo EDTA a RT (15 °C-25 °C) per 10 minuti a 1.600 (± 150) x g, con la massima rottura applicata.
NOTA: fare riferimento alle istruzioni del produttore quando si utilizzano altri tubi di raccolta. - Dopo la centrifugazione, il surnatante plasmatico apparirà chiaro e giallastro. Controllare se il campione mostra segni di emolisi (Figura 3) e trasferire il plasma (surnatante) in un tubo centrifugo da 15 ml senza disturbare lo strato cellulare utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta del filtro). Lasciare un piccolo volume residuo di plasma sopra lo strato cellulare (circa 5 mm).
- Se si osserva emolisi, scartare il campione per ulteriori analisi. (Figura 5). Vedere la sezione relativa alla risoluzione dei problemi nella Discussione per valutare l'emolisi.
- Centrifugare il plasma in un tubo centrifugo da 15 mL a RT (15 °C-25 °C) per 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Eseguire questo passaggio per rimuovere eventuali cellule del sangue intatte residue trasportate dalla prima fase di centrifugazione.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il tubo dalla centrifuga e trasferire 1-4 mL di plasma in flaconcini criogenici in polipropilene da 1-4 mL utilizzando una pipetta sierologica monouso (o pipetta a bulbo monouso o pipette p1000 con punta filtrante). Un volume residuo di plasma (circa 0,3 ml o 7 mm di altezza) deve essere lasciato sul fondo del tubo per evitare di contaminare il plasma con cellule del sangue (Figura 5).
- Congelare immediatamente il plasma in posizione verticale nella scatola di stoccaggio a -80 °C e registrare il tempo di conservazione del campione. Verificare che i campioni siano stati elaborati entro il periodo di tempo richiesto di 4 ore.
- Raccogliere lo strato cellulare (buffy coat) utilizzando un P1000 e la punta filtrata e trasferirlo in un tubo da 2 ml. Congelare e conservare immediatamente a -80 °C.
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Representative Results
Dopo la centrifugazione delle provette del sangue senza anticoagulante, la fase superiore appare di un giallo pallido e corrisponde alla frazione sierica (Figura 2). Questa frazione viene accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.
L'emolisi può essere presente sia nel plasma che nella frazione sierica e la fase superiore avrà un aspetto rossastro, che indica la presenza e il grado di emolisi (Figura 3).
Dopo la centrifugazione dei tubi EDTA, saranno evidenti diverse fasi o strati; la fase superiore (giallo pallido) è la frazione plasmatica, che rappresenta il 55% del volume totale del sangue; la sottile interfaccia bianco-grigiastra è lo strato di mantello buffy che contiene globuli bianchi e piastrine e rappresenta <1% del volume totale del sangue; la fase inferiore (colore rosso) contiene globuli rossi, che rappresentano il 45% del volume totale del sangue). Aspirare 1 cm sopra lo strato leucocitario e assicurarsi che lo strato cellulare non sia disturbato per ridurre la contaminazione del plasma con le cellule del sangue (Figura 5). Questa frazione deve essere accuratamente rimossa e aliquotata per un'analisi successiva.
La concentrazione e l'integrità del cfDNA estratto da campioni di plasma devono essere valutate utilizzando metodi basati sull'elettroforesi. cfDNA è stato estratto utilizzando un kit basato su colonne disponibile in commercio. La quantificazione è stata eseguita utilizzando un kit disponibile in commercio a base di gel specifico per applicazioni cfDNA (Table of Materials). La Figura 6A mostra un esempio di estrazione di cfDNA di alta qualità che può essere utilizzato per applicazioni a valle. Mentre, la Figura 6B mostra un esempio di un campione inadatto con un alto livello di contaminazione genomica.
Figura 1: Preparazione del siero per studi di biopsia liquida. Viene mostrato uno schema del processo di preparazione del siero, dalla centrifugazione del campione allo stoccaggio delle aliquote. Fase 1: Campione di sangue in un tubo senza anticoagulante per l'isolamento del siero. Fase 2: Centrifugare il tubo sanguigno per ottenere il siero entro 4 ore dall'estrazione. Fase 3: Rimuovere la fase superiore del surnatante sierico per la successiva conservazione. Passaggio 4: congelare il tubo di siero in posizione verticale a -80 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Campioni di sangue raccolti in provette senza anticoagulante dopo centrifugazione. La fase superiore corrisponde alla frazione sierica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un esempio di campione emolizzato dopo centrifugazione. La fase superiore corrispondente alla frazione plasmatica/sierica appare rossa a causa dell'emolisi. Idealmente, questi campioni dovrebbero essere scartati, o almeno la presenza di emolisi nel campione dovrebbe essere registrata, in quanto ciò potrebbe influire su alcune applicazioni a valle. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Preparazione al plasma per studi di biopsia liquida. Viene mostrato uno schema del processo di preparazione del siero, dalla centrifugazione del campione allo stoccaggio delle aliquote e alla raccolta del buffy coat. Fase 1: Campione di sangue in un tubo contenente acido tetra-acetico etilendiammina (EDTA) per l'isolamento del plasma. Fase 2: Centrifugare il tubo sanguigno per ottenere il plasma entro 4 ore dall'estrazione. Fase 3: Trasferire il surnatante al plasma in un tubo centrifugo da 15 ml senza disturbare lo strato cellulare. Fase 4: Centrifugare il plasma per rimuovere eventuali cellule del sangue trasportate dalla prima fase di centrifugazione. Fase 5: Trasferire il plasma in flaconcini criogenici e congelare il tubo di plasma in posizione verticale a -80 °C. Passo 6: Raccogliere lo strato cellulare (buffy coat) e conservare a -80 °C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Campioni di sangue EDTA dopo centrifugazione. Tre strati visibili sono visibili dopo la centrifugazione dei tubi contenenti sangue fresco. La fase superiore corrisponde alla frazione plasmatica, la sottile interfaccia bianco-grigiastra corrisponde al mantello buffy e contiene globuli bianchi e piastrine, e la fase inferiore contiene globuli rossi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi basata sull'elettroforesi del cfDNA isolato dal plasma. (A) Un esempio di esperimento ottimale. (B) Un esempio di esperimento non ottimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La biopsia liquida ha numerose potenziali applicazioni in momenti diversi durante la gestione del cancro. In primo luogo, alla diagnosi per identificare i marcatori molecolari tumorali che suggerirebbero la presenza di una potenziale lesione tumorale che potrebbe essere ulteriormente studiata clinicamente. In secondo luogo, durante il trattamento per il monitoraggio in tempo reale della malattia, la valutazione della risposta molecolare del trattamento, l'evoluzione clonale e la diagnosi precoce delle recidive della malattia o della resistenza al trattamento. Infine, dopo il trattamento chirurgico, come strumento per l'individuazione della malattia residua minima. La European Society of medical oncology (ESMO) ha recentemente pubblicato linee guida per l'implementazione del test di mutazione del ctDNA nel carcinoma polmonare non a piccole cellule metastatico (NSCLC) per identificare bersagli terapeutici attuabili. Queste linee guida includono le considerazioni metodologiche, la valutazione tecnica e la convalida del profilo ctDNA e la discussione di alcune sfide come il mosaicismo somatico, la bassa frequenza allelica variante (VAF) e il rilevamento accidentale della variante patogena germinale4. Le linee guida di pratica clinica ESMO recentemente pubblicate per la diagnosi, la stadiazione e il trattamento di pazienti con carcinoma mammario metastatico indicano un'analisi basata sul ctDNA nei casi in cui vi è un cambiamento nell'approccio terapeutico o se è un requisito per entrare in uno studio clinico5.
I campioni devono essere elaborati entro 4 ore dal momento dell'estrazione. L'elaborazione del campione al di fuori di questo lasso di tempo può portare alla degradazione del campione e provocare un aumento dell'emolisi, che può avere un impatto sulla concentrazione di cfDNA e influenzare le applicazioni a valle come la profilazione dei miRNA. Si raccomanda l'uso di 2-4 mL di plasma per ottenere una sensibilità sufficiente per l'analisi a valle. Le applicazioni basate su cfDNA contengono un conservante che stabilizza le cellule del sangue nucleate e impedisce il rilascio di DNA genomico contaminante (gDNA); Il DNA è stabile in questi tubi fino a 14 giorni a 6 °C a 37 °C dopo l'estrazione del sangue. Tuttavia, i campioni devono essere elaborati entro 24-48 ore al fine di evitare la contaminazione con globuli bianchi lisati.
Devono essere utilizzate aliquote di volume adeguato per evitare lo scongelamento da congelamento dei campioni di siero e plasma. Il volume e il numero di aliquote dipenderanno dall'uso a valle dei campioni e anche dalla capacità di stoccaggio del congelatore a -80 °C. Le aliquote da 1 mL sono utili in quanto questo è il volume standard utilizzato per molti protocolli di estrazione del cfDNA e varie aliquote possono essere scongelate se è richiesto più volume.
L'emolisi di un campione può essere stimata misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 540 nm del campione emolizzato sospetto rispetto a un campione non emolizzato con un chiaro aspetto giallastro. L'emolisi relativa di un campione è calcolata come il rapporto tra l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 540 nm di un campione non emolizzato (con un chiaro aspetto giallastro) e del campione emolizzato (con aspetto rossastro). Si consiglia ai lettori di fare riferimento all'articolo di TylerVan Buren et al, per ulteriori informazioni6.
L'integrità del campione è fondamentale in tutte le applicazioni di biopsia liquida a valle e il tempo dall'estrazione del campione alla lavorazione e al tipo di tubo di raccolta del campione sono due fattori critici che dovrebbero essere considerati in quanto influenzano la qualità e la resa dei marcatori ctDNA. Come regola generale, tutti i campioni devono essere raccolti in un tubo specifico per cfDNA o tubo EDTA e trattati rispettivamente entro 48 ore e 4 ore dall'estrazione. Pertanto, è importante avere un buon coordinamento con il personale e i servizi coinvolti nella raccolta dei campioni. Idealmente, dovrebbe essere istituito un circuito dettagliato di raccolta dei campioni che definisca chiaramente i compiti di tutte le persone coinvolte, con istruzioni dettagliate sulla gestione e il trasferimento dei campioni. Il plasma è preferito al siero per applicazioni di cfDNA poiché il siero tende ad essere contaminato dal DNA genomico a causa della lisi dei globuli bianchi durante il processo di coagulazione7. D'altra parte, il plasma contiene generalmente inibitori della PCR come eparina, emoglobina, ormoni, immunoglobuline G e lattoferrina8. Tuttavia, la diluizione del campione può aiutare a superare questo problema, a condizione che il campione abbia una concentrazione sufficiente di cfDNA. Un recente studio riporta un flusso di lavoro preanalitico per applicazioni di biopsia liquida, confrontando diversi tubi stabilizzatori e misure di quantificazione e qualità degli acidi nucleici isolati dal plasma, dimostrando l'importanza di un protocollo di elaborazione standardizzato per l'analisi a valle riproducibile9. Le linee guida per l'analisi del cfDNA del National Cancer Institute (NCI) raccomandano che i tubi EDTA vengano elaborati entro 2-4 ore e quelli con un conservante speciale entro 3 giorni10. Le biobanche possono essere una struttura utile per gli investigatori senza le attrezzature necessarie per l'elaborazione e lo stoccaggio dei campioni. Idealmente, i campioni non devono essere congelati e scongelati più di una volta e non devono essere conservati per più di 3 anni prima dell'uso; pertanto, occorre prestare particolare attenzione al volume delle aliquote per le applicazioni a valle al fine di evitare cicli di congelamento-disgelo.
Un altro passo critico nella lavorazione del plasma è la centrifugazione; la prima determina il corretto isolamento del plasma dalle cellule mononucleate, fonte di contaminazione da gDNA che può diluire notevolmente l'abbondanza relativa di ctDNA. La seconda centrifugazione effettuata a velocità più elevate ha lo scopo di rimuovere ulteriormente i globuli bianchi lisati11. L'uso del freno al termine della centrifugazione non sembra avere alcun effetto sulla qualità dei campioni di plasma12. Un'altra considerazione importante durante l'elaborazione di campioni di sangue è il tipo di rotore centrifugo da utilizzare, sia un rotore swing-out che fisso. Per l'elaborazione di campioni di sangue, si consiglia un rotore swing-out. Questo formato consente una migliore separazione dei componenti del sangue in base ai gradienti di densità e la posizione del pellet cellulare dopo la centrifugazione è sul fondo del tubo della centrifuga, mentre, con una centrifuga a rotore fisso, il pellet cellulare si forma lungo il lato del tubo. I rotori fissi consentono di utilizzare più forza gravitazionale e una più adatta per separare proteine e acidi nucleici, anche se di solito consentono di elaborare più campioni contemporaneamente.
La resa finale di cfDNA è fondamentale per la sensibilità dell'applicazione a valle. Di conseguenza, con i dati precedenti, è necessario un minimo di 3,6 nanogrammi (ng) di cfDNA per ottenere una sensibilità di <0,1% e 36 ng per ottenere una sensibilità di <0,01% per il rilevamento di alleli mutanti13. La qualità ma anche la quantità di cfDNA devono essere considerate quando si decide un volume di campione per la raccolta e l'estrazione. Ad esempio, studi precedenti hanno dimostrato che la concentrazione media/mediana di cfDNA estratto da 1 mL di plasma è di 21 ng/mL nel carcinoma dell'endometrio14, 14,3 (range 7-204) ng/mL nel linfoma di Hodgkin15, 8,02 (± 7,81) ng/mL nel carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC)16 e 1,35 ng/mL nei casi di cancro al pancreas17. Il volume di plasma richiesto dipenderà dalla tecnologia a valle impiegata, ma si raccomanda l'uso di 2-4 ml per raggiungere una sensibilità sufficiente.
La tracciabilità dei campioni è un aspetto importante che deve essere considerato quando si creano raccolte di campioni; tutti i campioni e le aliquote devono essere etichettati correttamente e chiaramente, consentendo facilmente una successiva identificazione. Le biobanche possono anche essere utilizzate in quanto dispongono di un sistema di gestione della qualità accreditato, che garantisce la qualità, la sicurezza e la tracciabilità dei dati e dei campioni biologici conservati, in conformità con la legislazione e i regolamenti locali e internazionali applicabili. I dati associati ai campioni dovrebbero idealmente essere memorizzati in un database adatto a questo scopo, come Research Electronic Data Capture (REDCap), un'applicazione basata sul web sviluppata dalla Vanderbilt University per acquisire dati per la ricerca clinica e creare database e progetti (https://www.project-redcap.org/). Anche l'uso di un server sicuro con crittografia dei dati è altamente raccomandato.
Le sfide relative all'implementazione della biopsia liquida nella clinica sono state recentemente esaminate10 e un problema chiave evidenziato è stata la standardizzazione delle condizioni preanalitiche come la raccolta, l'elaborazione e la conservazione dei campioni, che hanno un impatto diretto sulla convalida analitica e clinica, nonché sulla riproducibilità dei risultati. I consorzi di biopsia liquida come CANCER-ID, la European Liquid Biopsy Society (ELBS) e il Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) mirano a standardizzare le fasi preanalitiche e definire le migliori pratiche per gli studi di biopsia liquida in ambito clinico18,19.
La biopsia liquida è uno strumento molto flessibile e utile con un grande potenziale nel contesto della diagnosi, del trattamento e del follow-up del cancro20. Un numero crescente di prove mostra la sua vasta rilevanza e, per la sua corretta implementazione e utilizzo, l'importanza di raccogliere campioni in modo standardizzato è la chiave per ottenere dati preziosi e comparabili. Lavorare con protocolli standardizzati è fondamentale per evitare impedimenti tecnici nelle analisi successive, che è stato un vero e proprio limite in passato con l'uso di vecchi campioni d'archivio. Qui, abbiamo fornito protocolli convalidati che possono aiutare a garantire procedure preanalitiche ottimali per studi clinici e di ricerca di biopsia liquida basati su cfDNA.
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Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer e BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline e Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM ed ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): ha ricevuto onorificenze per il ruolo di relatore, consulenza o consulenza da Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly e Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) riferisce di aver ricevuto sovvenzioni di ricerca relative a questo studio da Novartis e sovvenzioni di ricerca non correlate a questo studio da AstraZeneca e Beigene. Gli altri autori non hanno divulgazioni in merito al manoscritto.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare la Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) per il loro sostegno e la seguente sovvenzione di progetto: LB CIBERONC PLATFORM: piattaforma CIBERONC per la standardizzazione e la promozione della biopsia liquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
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