Summary
Den flytende biopsien har revolusjonert vår tilnærming til onkologiske translasjonsstudier, med prøveinnsamling, kvalitet og lagring som avgjørende skritt for vellykket klinisk anvendelse. Her beskriver vi en standardisert og validert protokoll for nedstrøms sirkulasjonsfrie DNA-applikasjoner som kan brukes i de fleste translasjonelle forskningslaboratorier.
Abstract
Begrepet flytende biopsi (LB) refererer til molekyler som proteiner, DNA, RNA, celler eller ekstracellulære vesikler i blod og andre kroppsvæsker som stammer fra den primære og / eller metastatiske svulsten. LB har dukket opp som en bærebjelke i translasjonsforskning og har begynt å bli en del av klinisk onkologisk praksis, noe som gir et minimalt invasivt alternativ til solid biopsi. LB tillater sanntidsovervåking av en svulst via en minimal invasiv prøveekstraksjon, for eksempel blod. Søknadene inkluderer tidlig kreftdeteksjon, pasientoppfølging for påvisning av sykdomsprogresjon, vurdering av minimal restsykdom og potensiell identifisering av molekylær progresjon og resistensmekanisme. For å oppnå en pålitelig analyse av disse prøvene som kan rapporteres i klinikken, bør de preanalytiske prosedyrene vurderes nøye og følges nøye. Prøveinnsamling, kvalitet og lagring er avgjørende trinn som bestemmer nytten i nedstrømsapplikasjoner. Her presenterer vi standardiserte protokoller fra vår flytende biopsi-arbeidsmodul for innsamling, behandling og lagring av plasma- og serumprøver for nedstrøms flytende biopsianalyse basert på sirkulerende fritt DNA. Protokollene som presenteres her krever standardutstyr og er tilstrekkelig fleksible til å brukes i de fleste laboratorier fokusert på biologiske prosedyrer.
Introduction
Begrepet "flytende biopsi" ble definert i2010 1 som tilstedeværelse av molekyler (f.eks. Protein, deoksyribonukleinsyre (DNA), ribonukleinsyre (RNA)), celler eller ekstracellulære vesikler (f.eks. eksosomer) i blod og andre kroppsvæsker som stammer fra den primære svulsten. Bruken av flytende biopsiprøver har revolusjonert translasjonell onkologisk forskning, da vevsbiopsier, begrenset til en bestemt region på et bestemt tidspunkt, kan savne relevante kloner på grunn av tumor heterogenitet. I tillegg spiller flytende biopsi en relevant rolle i tumortyper der primærvev er lite eller ikke tilgjengelig, da det kan unngå en invasiv biopsi, redusere kostnader og risiko for pasienter. Videre utvikler de tumormolekylære egenskapene seg kontinuerlig, hovedsakelig på grunn av terapitrykket, og flytende biopsiprøver kan fange svulsten klonal dynamikk som de kan tas i lengderetningen, i forskjellige kliniske og terapeutiske tider av sykdommen som baseline, på behandling, beste respons, og ved sykdomsprogresjon eller til og med før. Konseptet med "sanntids flytende biopsi" betyr at dynamiske endringer i svulsten kan overvåkes i sanntid, og dermed tillate presisjonsmedisin i denne sykdommen. Væskebiopsien har mange potensielle anvendelser i klinikken, inkludert screening og tidlig påvisning av kreft, sanntidsovervåking av sykdom, påvisning av minimal restsykdom, studier av mekanismer for behandlingsresistens og stratifisering av pasienter på terapeutisk nivå1. Tidlig påvisning av sykdomsresidiv og progresjon er et udekket klinisk behov i mange tumortyper og er en nøkkelfaktor for å øke overlevelsen og livskvaliteten til kreftpasienter. Rutinemessige bildemodaliteter og løselige tumormarkører kan mangle følsomheten og / eller spesifisiteten som kreves for denne oppgaven. Dermed er det presserende behov for nye prediktive markører i klinikken, for eksempel de som er basert på sirkulerende frie nukleinsyrer.
De typer prøver som brukes til flytende biopsi studier inkluderer, men er ikke begrenset til blod, urin, spytt og avføring prøver. Andre tumorspesifikke prøver kan være celleaspirater, cerebrospinalvæske, pleuravæske, cyste og ascitesvæske, sputum og bukspyttkjerteljuice2. De tidligere væskene kan inneholde forskjellige typer kreftavledede materialer, sirkulerende tumorceller (CTC) eller fragmenter som eksosomer og cellefritt sirkulerende tumor-DNA (ctDNA). Nukleinsyrer kan innkapsles i ekstracellulære vesikler (EV) eller slippes ut i kroppsvæsker på grunn av celledød og skade. Sirkulerende fritt DNA (cfDNA) frigjøres hovedsakelig i blodet fra apoptotiske eller nekrotiske celler og er tilstede hos alle individer, og viser økte nivåer i inflammatoriske eller onkologiske sykdommer3. Eksosomer er små ekstracellulære vesikler (~ 30-150 nm) utskilt av celler som inneholder nukleinsyrer, proteiner og lipider. Disse vesiklene er en del av det intercellulære kommunikasjonsnettverket og finnes ofte i mange typer kroppsvæsker. Nukleinsyrene innelukket i EV er beskyttet mot det tøffe miljøet i kroppsvæsker, og gir dermed en mer robust måte å studere disse molekylene i flytende biopsiinnstilling.
Samlet sett er nivåene av sirkulerende nukleinsyrer i flytende biopsiprøver svært lave, og derfor er det nødvendig med følsomme metoder for deteksjon, for eksempel digital PCR eller neste generasjons sekvensering (NGS). Preanalytisk styring av prøven er avgjørende for å forhindre blodcellelyse og frigjøring av intakt DNA, noe som forårsaker forurensning av cfDNA med genomisk DNA. Videre må det utvises forsiktighet ved ekstrahering av prøver for å unngå tilstedeværelse av inhibitorer av enzymbaserte analysemetoder.
Her presenterer vi en standardisert metode for innsamling og lagring av plasma- og serumprøver, som er et avgjørende første skritt for flytende biopsibaserte nedstrømsapplikasjoner, inkludert sirkulerende nukleinsyreanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forutgående etisk godkjenning ble innhentet fra deltakende sentre før uttak av blodprøver. Følgende protokoller for serum- og plasmaisolering ble utført i samsvar med etiske prinsipper for biomedisinsk forskning.
MERK: Tidligere vurderinger før du begynner protokollen er gitt her. Etisk forhåndsgodkjenning kreves for bruk av humane prøver i biomedisinsk forskning, med tilsvarende informert samtykke. Et biosikkerhetsskap i klasse II er nødvendig for å håndtere blodprøver. En laboratoriefrakk, vernehansker og briller bør brukes gjennom hele prosedyren for å unngå infeksjon av blodbårne patogener. Det kreves minimum 30 minutter for behandling av serumprøver. Etter blodutvinning i rør uten antikoagulant, opprettholde ved romtemperatur (RT) i 30-45 minutter for å tillate koagulasjonsdannelse. Minst 40 minutter er nødvendig for plasmapreparering, og prøver bør behandles innen 4 timer fra ekstraksjonstidspunktet ved bruk av etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) rør eller innen 24-48 timer hvis du bruker cellestabiliserende oppsamlingsrør eller spesifikke cellefrie DNA-innsamlingsrør. Men ifølge noen produsenter er prøvene stabile i opptil 2 uker i disse spesialiserte rørene. Det er viktig å sjekke for hemolyse, noe som vil gi plasma- eller serumfraksjonen et rødaktig utseende. Se feilsøkingsdelen for hemolyserte prøver i diskusjonen.
1. Serumpreparat for flytende biopsistudier
MERK: Total tid som kreves for å utføre dette trinnet er 30 minutter (figur 1).
- Trekk ut 4-10 ml blod i rør som ikke inneholder antikoagulant (rød eller rød / grå-svart hette) og hold ved RT i 30-45 min. Behandle disse prøvene innen 4 timer fra ekstraksjonstidspunktet.
- Registrer klokkeslett og dato for prøveutvinningen og emneidentifikasjonen (ID) i en passende utformet eksempeldatabase.
- Iført laboratoriefrakk, beskyttelseshansker og briller sentrifugerer tuben som inneholder friskt blod ved RT (15 °C-25 °C) i 10 minutter ved 1 600 (± 150) x g, med maksimal pause påført.
- Etter sentrifugering, fjern forsiktig røret fra sentrifugen; den øvre fasen av serum supernatant vil fremstå som klar og gulaktig (figur 2). Sjekk om prøven viser tegn til hemolyse (figur 3) og registrer tilstedeværelse av hemolyse når det er hensiktsmessig.
- I et biosikkerhetsskap i klasse II overfører du serumet til oppsamlingsrør som 250 μL aliquots.
MERK: Volumet av aliquots må tilpasses studiekravene. - Frys serumet umiddelbart stående i en oppbevaringsboks ved -80 °C og registrer tidspunktet for prøvelagring.
- Kontroller at prøvene ble behandlet innen den nødvendige tidsrammen på 4 timer.
2. Plasma forberedelse for flytende biopsi studier
MERK: Den totale tiden som kreves for å utføre dette trinnet er 40 minutter (figur 4).
- Ekstra 4-10 ml blod i rør som inneholder etylendiamin tetra-eddiksyre (EDTA). Behandle prøvenemed 4 timer fra ekstraksjonstidspunktet.
- Registrer klokkeslett og dato for prøveuttrekket og emne-ID-en i en passende utformet eksempeldatabase.
- Iført laboratoriefrakk, vernehansker og briller sentrifugerer du EDTA-tuben ved RT (15 °C-25 °C) i 10 minutter ved 1 600 (± 150) x g, med maksimal pause påført.
MERK: Se produsentens instruksjoner når du bruker andre oppsamlingsrør. - Etter sentrifugering vil plasma supernatanten virke klar og gulaktig. Kontroller om prøven viser tegn på hemolyse (figur 3) og overfør plasma (supernatant) til et 15 ml sentrifugerør uten å forstyrre cellelaget ved hjelp av en serologisk engangspipette (eller engangspærepipette eller p1000 pipetter med filterspiss). La et lite gjenværende volum plasma ligge over cellelaget (ca. 5 mm).
- Hvis hemolyse observeres, kast prøven for videre analyser. (Figur 5). Se feilsøkingsdelen i diskusjonen for å vurdere hemolyse.
- Sentrifuger plasmaet i et 15 ml sentrifugerør ved RT (15 °C-25 °C) i 10-20 minutter ved 3000 (±150) x g. Utfør dette trinnet for å fjerne eventuelle gjenværende intakte blodceller som overføres fra det første sentrifugeringstrinnet.
- Etter sentrifugering fjerner du røret forsiktig fra sentrifugen og overfører 1-4 ml plasma til 1-4 ml polypropylenkryogene hetteglass ved hjelp av en serologisk engangspipette (eller engangspærepipette eller p1000 pipetter med filterspiss). Et restvolum av plasma (ca. 0,3 ml eller 7 mm høyde) må stå i bunnen av tuben for å unngå å forurense plasmaet med blodceller (figur 5).
- Frys plasmaet umiddelbart stående i oppbevaringsboksen ved -80 °C og registrer tidspunktet for prøvelagring. Kontroller at prøvene ble behandlet innen den nødvendige tidsrammen på 4 timer.
- Samle cellelaget (buffy coat) ved hjelp av en P1000 og filtrert spiss og overfør den til et 2 ml rør. Frys umiddelbart og oppbevar ved -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter sentrifugering av blodrørene uten antikoagulant fremstår overfasen som svakt gul og tilsvarer serumfraksjonen (figur 2). Denne fraksjonen fjernes forsiktig og aliquoteres for senere analyse.
Hemolyse kan være tilstede i enten plasma- eller serumfraksjonen, og den øvre fasen vil ha et rødlig utseende, noe som indikerer tilstedeværelse og grad av hemolyse (figur 3).
Etter sentrifugering av EDTA-rør vil flere faser eller lag være tydelige; Den øvre fasen (blekgul) er plasmafraksjonen, som står for 55% av det totale blodvolumet; det tynne gråhvite grensesnittet er det buffy frakklaget som inneholder hvite blodlegemer og blodplater, og står for <1% av det totale blodvolumet; den nedre fasen (rød farge) inneholder røde blodlegemer, som står for 45% av det totale blodvolumet). Aspirer 1 cm over leukocyttlaget, og sørg for at cellelaget ikke forstyrres for å redusere forurensning av plasma med blodceller (figur 5). Denne fraksjonen bør fjernes med forsiktighet og godkjennes for senere analyse.
Konsentrasjonen og integriteten til cfDNA ekstrahert fra plasmaprøver bør vurderes ved hjelp av elektroforesebaserte metoder. cfDNA ble ekstrahert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig kolonnebasert sett. Kvantifisering ble utført ved hjelp av et gelbasert kommersielt tilgjengelig sett spesifikt for cfDNA-applikasjoner (Materialtabell). Figur 6A viser et eksempel på en cfDNA-ekstraksjon av høy kvalitet som kan brukes til nedstrømsapplikasjoner. Mens figur 6B viser et eksempel på en uegnet prøve med høyt nivå av genomisk forurensning.
Figur 1: Serumpreparat for flytende biopsistudier. En oversikt over serumprepareringsprosessen er vist, fra prøvesentrifugering til lagring av aliquots. Trinn 1: Blodprøve i et rør uten antikoagulant for isolering av serum. Trinn 2: Sentrifuger blodrøret for å oppnå serum innen 4 timer etter ekstraksjon. Trinn 3: Fjern den øvre fasen av serum supernatant for påfølgende lagring. Trinn 4: Frys serumrøret oppreist ved -80 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blodprøver samlet i rør uten antikoagulant etter sentrifugering. Den øvre fasen tilsvarer serumfraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Et eksempel på en hemolysert prøve etter sentrifugering. Den øvre fasen som tilsvarer plasma-/serumfraksjonen fremstår som rød på grunn av hemolyse. Ideelt sett bør disse prøvene kasseres, eller i det minste bør tilstedeværelsen av hemolyse i prøven registreres, da dette kan påvirke noen nedstrømsapplikasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Plasmapreparering for flytende biopsistudier. En oversikt over serumprepareringsprosessen er vist, fra prøvesentrifugering til lagring av aliquots og buffy coat-samling. Trinn 1: Blodprøve i et rør som inneholder etylendiamin tetraeddiksyre (EDTA) for isolering av plasma. Trinn 2: Sentrifuger blodrøret for å oppnå plasma innen 4 timer etter ekstraksjon. Trinn 3: Overfør plasma supernatanten til et 15 ml sentrifugerør uten å forstyrre cellelaget. Trinn 4: Sentrifuger plasmaet for å fjerne eventuelle blodceller som overføres fra det første sentrifugeringstrinnet. Trinn 5: Overfør plasmaet til kryogene hetteglass og frys plasmarøret stående ved -80 °C. Trinn 6: Samle cellelaget (buffy coat) og oppbevar ved -80 °C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: EDTA blodprøver etter sentrifugering. Tre synlige lag er synlige etter sentrifugering av rørene som inneholder friskt blod. Den øvre fasen tilsvarer plasmafraksjonen, det tynne gråhvite grensesnittet tilsvarer det buffy kappen og inneholder hvite blodlegemer og blodplater, og bunnfasen inneholder røde blodlegemer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Elektroforesebasert analyse av cfDNA isolert fra plasma. (A) Et eksempel på et optimalt eksperiment. (B) Et eksempel på et suboptimalt eksperiment. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den flytende biopsien har mange potensielle anvendelser på forskjellige tidspunkter under behandling av kreft. Først ved diagnose for å identifisere tumormolekylære markører som tyder på tilstedeværelse av en potensiell tumorlesjon som kan undersøkes videre klinisk. For det andre, under behandling for sanntidsovervåking av sykdommen, vurdering av behandlingsmolekylær respons, klonal evolusjon og tidlig påvisning av sykdomsfall eller behandlingsresistens. Til slutt, etter kirurgisk behandling, som et verktøy for påvisning av minimal gjenværende sykdom. European Society of Medical Oncology (ESMO) har nylig publisert retningslinjer for implementering av ctDNA-mutasjonstesting i metastatisk ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) for å identifisere handlingsbare terapeutiske mål. Disse retningslinjene inkluderer metodologiske betraktninger, teknisk evaluering og validering av ctDNA-profilering, og diskuterer noen utfordringer som somatisk mosaikk, lav variantallelfrekvens (VAF) og tilfeldig germline patogen variantdeteksjon4. De nylig publiserte ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnostisering, iscenesettelse og behandling av pasienter med metastatisk brystkreft indikerer ctDNA-basert analyse i tilfeller der det er endring i behandlingstilnærming eller hvis det er en forutsetning for å gå inn i en klinisk studie5.
Prøver skal behandles innen 4 timer fra tidspunktet for utvinning. Prøvebehandling utenfor denne tidsrammen kan føre til prøvenedbrytning og resultere i økt hemolyse, noe som kan påvirke cfDNA-konsentrasjonen og påvirke nedstrømsapplikasjoner som miRNA-profilering. Bruk av 2-4 ml plasma anbefales for å oppnå tilstrekkelig følsomhet for nedstrømsanalyse. cfDNA-baserte applikasjoner inneholder et konserveringsmiddel som stabiliserer nukleerte blodceller og forhindrer frigjøring av forurensende genomisk DNA (gDNA); DNA er stabilt i disse rørene i opptil 14 dager ved 6 °C til 37 °C etter blodekstraksjon. Prøvene bør imidlertid behandles innen 24-48 timer for å unngå forurensning med lysende hvite blodlegemer.
Aliquots av tilstrekkelig volum bør brukes for å unngå fryse-tining av serum- og plasmaprøver. Volumet og antall aliquots vil avhenge av nedstrøms bruk av prøvene og også lagringskapasiteten til -80 ° C fryseren. 1 ml aliquots er nyttige, da dette er standardvolumet som brukes til mange cfDNA-ekstraksjonsprotokoller, og forskjellige aliquoter kan tines hvis mer volum er nødvendig.
Hemolyse av en prøve kan estimeres ved å måle absorbansen ved en bølgelengde på 540 nm av den mistenkte hemolyserte prøven sammenlignet med en ikke-hemolysert prøve med et klart gulaktig utseende. Den relative hemolysen av en prøve beregnes som forholdet mellom absorbansen ved en bølgelengde på 540 nm av en ikke-hemolysert prøve (med et klart gulaktig utseende) og av den hemolyserte prøven (med et rødaktig utseende). Leserne anbefales å henvise til artikkelen av TylerVan Buren et al, for ytterligere informasjon6.
Prøveintegritet er avgjørende i alle nedstrøms flytende biopsiapplikasjoner, og tiden fra prøveekstraksjon til behandling og prøveinnsamlingsrørtype er to kritiske faktorer som bør vurderes da de påvirker kvaliteten og utbyttet av ctDNA-markører. Som en generell regel må alle prøver samles i et cfDNA-spesifikt rør eller EDTA-rør og behandles innen henholdsvis 48 timer og 4 timer etter ekstraksjon. Det er derfor viktig å ha god koordinering med personell og tjenester som er involvert i prøvetaking. Ideelt sett bør det etableres en detaljert prøveinnsamlingskrets som klart definerer oppgavene til alle involverte personer, med detaljerte instruksjoner om håndtering og overføring av prøver. Plasma foretrekkes fremfor serum for cfDNA-applikasjoner, da serum har en tendens til å være forurenset med genomisk DNA på grunn av lys av hvite blodlegemer under koaguleringsprosessen7. På den annen side inneholder plasma generelt PCR-hemmere som heparin, hemoglobin, hormoner, immunoglobulin G og laktoferrin8. Prøvefortynning kan imidlertid bidra til å overvinne dette problemet, forutsatt at prøven har en tilstrekkelig konsentrasjon av cfDNA. En nylig studie rapporterer en preanalytisk arbeidsflyt for flytende biopsiapplikasjoner, som sammenligner forskjellige stabiliserende rør og kvantifiserings- og kvalitetsmål av nukleinsyrer isolert fra plasma, og demonstrerer viktigheten av en standardisert prosesseringsprotokoll for reproduserbar nedstrømsanalyse9. National Cancer Institute (NCI) cfDNA-analyseretningslinjer anbefaler at EDTA-rør behandles innen 2-4 timer og de med et spesielt konserveringsmiddel innen 3 dager10. Biobanker kan være et nyttig anlegg for etterforskere uten nødvendig utstyr for prøvebehandling og lagring. Ideelt sett bør prøver ikke fryse-tines mer enn en gang og ikke lagres i mer enn 3 år før bruk; Derfor må det tas hensyn til volumet av aliquots for nedstrøms applikasjoner for å unngå fryse-tine sykluser.
Et annet kritisk skritt i plasmabehandling er sentrifugering; den første bestemmer riktig isolering av plasma fra mononukleære celler, kilden til gDNA-forurensning som i stor grad kan fortynne den relative overflod av ctDNA. Den andre sentrifugering utført ved raskere hastigheter er ment å ytterligere fjerne lysed hvite blodlegemer11. Bruken av bremsen etter at sentrifugering er ferdig ser ikke ut til å ha noen effekt på kvaliteten på plasmaprøvene12. Et annet viktig hensyn ved behandling av blodprøver er hvilken type sentrifugerotor som skal brukes, enten en svingbar eller fast rotor. For behandling av blodprøver anbefales en svingbar rotor. Dette formatet tillater en bedre separasjon av blodkomponenter basert på tetthetsgradienter, og plasseringen av cellepelleten etter sentrifugering er i bunnen av sentrifugerrøret, mens cellepelleten med en fast rotorentrifuge dannes langs siden av røret. Faste rotorer tillater mer gravitasjonskraft å bli brukt og en mer egnet for separering av proteiner og nukleinsyrer, selv om de vanligvis tillater flere prøver å bli behandlet samtidig.
Det endelige utbyttet av cfDNA er kritisk for nedstrøms applikasjonsfølsomhet. Følgelig, med tidligere data, er det nødvendig med minst 3,6 nanogram (ng) cfDNA for å oppnå en følsomhet på <0,1% og 36 ng for å oppnå en følsomhet på <0,01% for påvisning av mutante alleler13. Kvalitet, men også kvantitet av cfDNA må vurderes når man bestemmer et prøvevolum for innsamling og ekstraksjon. For eksempel viste tidligere studier at gjennomsnittlig/median konsentrasjon av cfDNA ekstrahert fra 1 ml plasma er 21 ng/ml ved endometriekreft14, 14,3 (område 7-204) ng/ml ved Hodgkins lymfom15, 8,02 (± 7,81) ng/ml ved ikke-småcellet lungekreft (NSCLC)16 og 1,35 ng/ml ved kreft i bukspyttkjertelen17. Det nødvendige plasmavolumet vil avhenge av nedstrømsteknologien som brukes, men bruk av 2-4 ml anbefales for å oppnå tilstrekkelig følsomhet.
Sporbarhet av prøver er et viktig aspekt som må vurderes når du oppretter prøvesamlinger; alle prøver og aliquots skal være korrekt og tydelig merket, slik at det enkelt kan identifiseres senere. Biobanker kan også brukes da de har et akkreditert kvalitetsstyringssystem, som garanterer kvaliteten, sikkerheten og sporbarheten av dataene og biologiske prøvene som er lagret, i samsvar med gjeldende lokale og internasjonale lover og forskrifter. Dataene knyttet til prøvene bør ideelt sett lagres i en database som er egnet for dette formålet, for eksempel Research Electronic Data Capture (REDCap), en nettbasert applikasjon utviklet av Vanderbilt University for å fange data for klinisk forskning og lage databaser og prosjekter (https://www.project-redcap.org/). Bruk av en sikker server med datakryptering anbefales også på det sterkeste.
Utfordringene knyttet til implementering av flytende biopsi i klinikken har nylig blitt gjennomgått10, og et sentralt problem som ble fremhevet var standardisering av preanalytiske forhold som prøveinnsamling, prosessering og lagring, som direkte påvirker analytisk og klinisk validering, samt reproduserbarhet av resultater. Flytende biopsi konsortier som CANCER-ID, European Liquid Biopsy Society (ELBS) og Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) tar sikte på å standardisere preanalytiske trinn og definere beste praksis for flytende biopsistudier i klinisk setting18,19.
Flytende biopsi er et svært fleksibelt og nyttig verktøy med stort potensial i forbindelse med kreftdiagnose, behandling og oppfølging20. En økende mengde bevis viser sin enorme relevans, og for riktig implementering og bruk er viktigheten av å samle prøver på en standardisert måte nøkkelen til å skaffe verdifulle og sammenlignbare data. Arbeid med standardiserte protokoller er avgjørende for å unngå tekniske hindringer i senere analyser, noe som har vært en reell begrensning tidligere ved bruk av gamle arkivprøver. Her ga vi validerte protokoller som kan bidra til å garantere optimale preanalytiske prosedyrer for kliniske og forsknings cfDNA-baserte flytende biopsistudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB mottok honorar for foredragsholder, konsulent eller rådgivende rolle fra Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer og BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL mottok honorar for foredragsholder, konsulent- eller rådgivende rolle fra Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline og Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT mottok honorar for høyttaler, rådgivning eller rådgivende rolle fra Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM og ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): mottok honorar for høyttaler, rådgivning eller rådgivende rolle fra Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly og Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) rapporterer å motta forskningsmidler knyttet til denne studien fra Novartis og forskningsstipender som ikke er relatert til denne studien fra AstraZeneca og Beigene. De resterende forfatterne har ingen opplysninger om manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) for deres støtte og følgende prosjektstipend: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC-plattform for standardisering og promotering av flytende biopsi. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
