Summary
A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.
Abstract
O termo biópsia líquida (LB) refere-se a moléculas como proteínas, DNA, RNA, células ou vesículas extracelulares no sangue e outros fluidos corporais que se originam do tumor primário e/ou metastático. A LB emergiu como um pilar na pesquisa translacional e começou a fazer parte da prática clínica de oncologia, fornecendo uma alternativa minimamente invasiva à biópsia sólida. A LB permite o monitoramento em tempo real de um tumor através de uma extração de amostra minimamente invasiva, como sangue. As aplicações incluem detecção precoce de câncer, acompanhamento do paciente para detecção de progressão da doença, avaliação de doença residual mínima e identificação potencial de progressão molecular e mecanismo de resistência. Para obter uma análise confiável dessas amostras que possam ser relatadas na clínica, os procedimentos pré-analíticos devem ser cuidadosamente considerados e rigorosamente seguidos. Coleta, qualidade e armazenamento de amostras são etapas cruciais que determinam sua utilidade em aplicações a jusante. Aqui, apresentamos protocolos padronizados do nosso módulo de trabalho de biópsia líquida para coleta, processamento e armazenamento de amostras de plasma e soro para análise de biópsia líquida a jusante com base no DNA livre de circulação. Os protocolos aqui apresentados exigem equipamentos padrão e são suficientemente flexíveis para serem aplicados na maioria dos laboratórios focados em procedimentos biológicos.
Introduction
O termo "biópsia líquida" foi definido em 20101 como a presença de moléculas (por exemplo, proteína, ácido desoxiribonucleico (DNA), ácido ribonucleico (RNA)), células ou vesículas extracelulares (por exemplo, exosomos) no sangue e outros fluidos corporais originários do tumor primário. O uso de amostras de biópsia líquida revolucionou a pesquisa de oncologia translacional como biópsias teciduais, limitadas a uma determinada região em um determinado momento, podendo perder clones relevantes devido à heterogeneidade tumoral. Além disso, a biópsia líquida desempenha um papel relevante nos tipos de tumores onde o tecido primário é escasso ou não acessível, pois pode evitar uma biópsia invasiva, reduzindo custos e riscos aos pacientes. Além disso, as características moleculares tumorais estão em constante evolução principalmente devido à pressão terapêutica, e amostras de biópsia líquida podem capturar a dinâmica clonal tumoral, pois podem ser tomadas longitudinalmente, em diferentes momentos clínicos e terapêuticos da doença, como linha de base, no tratamento, na melhor resposta e na progressão da doença ou mesmo antes. O conceito de "biópsia líquida em tempo real" significa que mudanças dinâmicas no tumor podem ser monitoradas em tempo real, permitindo assim a medicina de precisão nesta doença. A biópsia líquida possui inúmeras aplicações potenciais na clínica, incluindo rastreamento e detecção precoce de câncer, monitoramento em tempo real da doença, detecção de doença residual mínima, estudo de mecanismos de resistência ao tratamento e estratificação de pacientes no nível terapêutico1. A detecção precoce da recidiva e progressão da doença são uma necessidade clínica não atendida em muitos tipos de tumores e é um fator-chave para aumentar a sobrevivência e a qualidade de vida dos pacientes com câncer. Modalidades de imagem de rotina e marcadores tumorais solúveis podem não ter a sensibilidade e/ou especificidade necessária para essa tarefa. Assim, novos marcadores preditivos são urgentemente necessários na clínica, como aqueles baseados na circulação de ácidos nucleicos livres.
Os tipos de amostras que são usadas para estudos de biópsia líquida incluem, mas não se limitam a amostras de sangue, urina, saliva e fezes. Outras amostras específicas do tumor podem ser aspirados celulares, fluido cefalorraquidiano, fluido pleural, cisto e ascites fluido, escarro e suco pancreático2. Os líquidos antigos podem conter diferentes tipos de materiais derivados do câncer, células tumorais circulantes (CTC), ou fragmentos como exosóis e DNA tumor circulante livre de células (CTDNA). Os ácidos nucleicos podem ser encapsulados em vesículas extracelulares (EVs) ou liberados em fluidos corporais devido à morte e danos celulares. O DNA livre circulante (CFN) é liberado principalmente na corrente sanguínea a partir de células apoptóticas ou necróticas e está presente em todos os indivíduos, apresentando níveis aumentados em doenças inflamatórias ou oncológicas3. Exosomos são pequenas vesículas extracelulares (~30-150 nm) secretadas por células que contêm ácidos nucleicos, proteínas e lipídios. Essas vesículas fazem parte da rede de comunicação intercelular e são comumente encontradas em muitos tipos de fluidos corporais2. Os ácidos nucleicos fechados dentro dos EVs são protegidos do ambiente áspero dentro dos fluidos corporais, fornecendo assim uma maneira mais robusta de estudar essas moléculas no cenário da biópsia líquida.
No geral, os níveis de ácidos nucleicos circulantes em amostras de biópsia líquida são muito baixos e, portanto, métodos sensíveis são necessários para detecção, como PCR digital ou sequenciamento de última geração (NGS). O manejo pré-analítico da amostra é crucial para prevenir a lise das células sanguíneas e a liberação de DNA intacto, causando contaminação do CFDNA com o DNA genômico. Além disso, deve-se tomar cuidado ao extrair amostras para evitar a presença de inibidores de métodos de análise baseados em enzimas.
Aqui apresentamos um método padronizado para a coleta e armazenamento de amostras de plasma e soro, que é um primeiro passo crucial para aplicações a jusante à base de biópsia líquida, incluindo análises de ácido nucleico circulante.
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Protocol
A aprovação ética prévia foi obtida nos centros participantes antes da extração de amostras de sangue. Os seguintes protocolos de isolamento sérico e plasmá plasma foram realizados de acordo com os princípios éticos para a pesquisa biomédica.
NOTA: Considerações prévias antes de iniciar o protocolo são fornecidas aqui. É necessária aprovação ética prévia para o uso de amostras humanas em pesquisas biomédicas, com o consentimento informado correspondente. Um armário de biossegurança classe II é necessário para manusear amostras de sangue. Um jaleco, luvas de proteção e óculos devem ser usados durante todo o procedimento para evitar infecções por patógenos transmitidos pelo sangue. É necessário um mínimo de 30 min para o processamento de amostras de soro. Após a extração de sangue em tubos sem anticoagulante, mantenha-se em temperatura ambiente (RT) por 30-45 min para permitir a formação de coágulos. É necessário um mínimo de 40 min para a preparação do plasma, e as amostras devem ser processadas dentro de 4 h a partir do momento da extração quando usar tubos de ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA) ou dentro de 24-48 h se usar tubos de coleta de estabilização celular ou tubos específicos de coleta de DNA sem células. No entanto, de acordo com alguns fabricantes, as amostras são estáveis por até 2 semanas nestes tubos especializados. É importante verificar se há hemólise, o que dará à fração de plasma ou soro uma aparência avermelhada. Veja a seção de solução de problemas para amostras hemolisada na discussão.
1. Preparação do soro para estudos de biópsia líquida
NOTA: O tempo total necessário para realizar esta etapa é de 30 min (Figura 1).
- Extrair 4-10 mL de sangue em tubos que não contenham anticoagulant (vermelho ou vermelho/cinza-preto) e manter em RT por 30-45 min. Processe essas amostras dentro de 4h a partir do momento da extração.
- Registo a hora e a data da extração da amostra e a identificação do sujeito (ID) em um banco de dados de amostras devidamente projetado.
- Usando um jaleco, luvas de proteção e óculos, centrifugar o tubo contendo sangue fresco na RT (15 °C-25 °C) por 10 min a 1.600 (± 150) x g, com a quebra máxima aplicada.
- Após a centrifugação, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga; a fase superior do supernante sérico aparecerá clara e amarelada (Figura 2). Verifique se a amostra apresenta sinais de hemólise (Figura 3) e regissou a presença de hemólise quando apropriado.
- Em um armário de biossegurança classe II, transfira o soro para tubos de coleta como alíquotas de 250 μL.
NOTA: O volume das alíquotas deve ser ajustado aos requisitos do estudo. - Congele imediatamente o soro ereto em uma caixa de armazenamento a -80 °C e registe o tempo de armazenamento da amostra.
- Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de 4h necessário.
2. Preparação de plasma para estudos de biópsia líquida
NOTA: O tempo total necessário para realizar esta etapa é de 40 min (Figura 4).
- Extrair 4-10 mL de sangue em tubos contendo ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA). Processe as amostras dentro de 4h a partir do momento da extração.
- Regissão a hora e a data da extração da amostra e o ID do assunto em um banco de dados de amostras devidamente projetado.
- Usando um jaleco, luvas de proteção e óculos, centrifute o tubo EDTA em RT (15 °C-25 °C) por 10 min a 1.600 (± 150) x g, com a quebra máxima aplicada.
NOTA: Consulte as instruções do fabricante ao usar outros tubos de coleta. - Após a centrifugação, o supernatante de plasma parecerá claro e amarelado. Verifique se a amostra mostra sinais de hemólise (Figura 3) e transfira o plasma (supernacante) para um tubo de centrífuga de 15 mL sem perturbar a camada celular usando uma pipeta sorológica descartável (ou pipetas descartáveis ou pipetas p1000 com ponta de filtro). Deixe um pequeno volume residual de plasma acima da camada celular (aproximadamente 5 mm).
- Se for observada a hemólise, descarte a amostra para novas análises. (Figura 5). Consulte a seção de solução de problemas na Discussão para avaliar a hemólise.
- Centrifugar o plasma em um tubo de centrífuga de 15 mL em RT (15 °C-25 °C) por 10-20 min a 3.000 (±150) x g. Realize esta etapa para remover quaisquer células sanguíneas intactas residuais transportadas a partir da primeira etapa de centrifugação.
- Após a centrifugação, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga e transfira 1-4 mL de plasma para frascos criogênicos de polipropileno de 1-4 mL usando uma pipeta sorológica descartável (ou pipeta de bulbo descartável ou pipetas p1000 com ponta de filtro). Um volume residual de plasma (aproximadamente 0,3 mL ou 7 mm de altura) deve ser deixado na parte inferior do tubo para evitar contaminar o plasma com células sanguíneas (Figura 5).
- Congele imediatamente o plasma ereto na caixa de armazenamento a -80 °C e regise o tempo de armazenamento da amostra. Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de 4h necessário.
- Colete a camada celular (casaco buffy) usando uma ponta P1000 e filtrada e transfira-a para um tubo de 2 mL. Congele imediatamente e armazene a -80 °C.
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Representative Results
Após a centrifugação dos tubos sanguíneos sem anticoagulante, a fase superior parece um amarelo pálido e corresponde à fração do soro (Figura 2). Esta fração é cuidadosamente removida e aliquoted para análise subsequente.
A hemólise pode estar presente na fração plasmática ou sárida, e a fase superior terá uma aparência avermelhada, o que indica a presença e o grau de hemólise (Figura 3).
Após a centrifugação dos tubos EDTA, várias fases ou camadas serão aparentes; a fase superior (amarelo pálido) é a fração plasmática, que representa 55% do volume sanguíneo total; a fina interface acinzentado-branco é a camada de casaco buffy que contém glóbulos brancos e plaquetas, e é responsável por <1% do volume sanguíneo total; a fase inferior (cor vermelha) contém glóbulos vermelhos, o que representa 45% do volume sanguíneo total). Aspire 1 cm acima da camada leucócito, e certifique-se de que a camada celular não seja perturbada para reduzir a contaminação do plasma com células sanguíneas (Figura 5). Esta fração deve ser cuidadosamente removida e aliquoted para análise subsequente.
A concentração e integridade do CFDNA extraídos de amostras de plasma devem ser avaliadas utilizando métodos à base de eletroforese. cfDNA foi extraído usando um kit baseado em colunas comercialmente disponível. A quantificação foi realizada utilizando-se um kit comercialmente disponível em gel específico para aplicações de CFDNA (Tabela de Materiais). A Figura 6A mostra um exemplo de uma extração de CFDNA de alta qualidade que pode ser usada para aplicações a jusante. Considerando que a Figura 6B mostra um exemplo de uma amostra inadequada com alto nível de contaminação genômica.
Figura 1: Preparação do soro para estudos de biópsia líquida. Um esboço do processo de preparação do soro é mostrado, desde a centrifugação da amostra até o armazenamento de alíquotas. Passo 1: Amostra de sangue em um tubo sem anticoagulante para o isolamento do soro. Passo 2: Centrifugar o tubo sanguíneo para obter soro dentro de 4h de extração. Passo 3: Remova a fase superior do supernatante sérico para armazenamento subsequente. Passo 4: Congele o tubo de soro ereto a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Amostras de sangue coletadas em tubos sem anticoagulante após centrifugação. A fase superior corresponde à fração do soro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Um exemplo de uma amostra hemolisada após centrifugação. A fase superior correspondente à fração plasma/soro parece vermelha devido à hemólise. O ideal é que essas amostras sejam descartadas, ou pelo menos a presença de hemólise na amostra deve ser registrada, pois isso pode afetar algumas aplicações a jusante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Preparação plasmática para estudos de biópsia líquida. Um esboço do processo de preparação do soro é mostrado, desde a centrifugação da amostra até o armazenamento de alíquotas e coleta de casacos buffy. Passo 1: Amostra de sangue em um tubo contendo ácido tetra-acético de etilenodiamina (EDTA) para o isolamento do plasma. Passo 2: Centrifugar o tubo sanguíneo para obter plasma dentro de 4h de extração. Passo 3: Transfira o supernatante de plasma para um tubo de centrífuga de 15 mL sem perturbar a camada celular. Passo 4: Centrifugar o plasma para remover quaisquer células sanguíneas transportadas a partir da primeira etapa de centrifugação. Passo 5: Transfira o plasma para frascos criogênicos e congele o tubo de plasma ereto a -80 °C. Passo 6: Colete a camada celular (casaco buffy) e armazene a -80 °C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Amostras de sangue EDTA após centrifugação. Três camadas visíveis são visíveis após a centrifugação dos tubos contendo sangue fresco. A fase superior corresponde à fração plasmática, a fina interface acinzentado-branco corresponde ao casaco buffy e contém glóbulos brancos e plaquetas, e a fase inferior contém glóbulos vermelhos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Análise baseada em eletroforese do CFDNA isolado do plasma. (A) Um exemplo de um experimento ideal. (B) Um exemplo de um experimento subótimo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A biópsia líquida tem inúmeras aplicações potenciais em diferentes momentos durante o manejo do câncer. Primeiro, no diagnóstico para identificar marcadores moleculares tumorais que sugerem a presença de uma lesão tumoral potencial que poderia ser mais investigada clinicamente. Em segundo lugar, durante o tratamento para monitoramento em tempo real da doença, avaliação da resposta molecular do tratamento, evolução clonal e detecção precoce de recaídas da doença ou resistência ao tratamento. Finalmente, após o tratamento cirúrgico, como ferramenta de detecção de doença residual mínima. A Sociedade Europeia de Oncologia Médica (ESMO) publicou recentemente diretrizes para a implementação de testes de mutação ctDNA em câncer de pulmão de células metastáticas não pequenas (NSCLC) para identificar alvos terapêuticos acionáveis. Essas diretrizes incluem as considerações metodológicas, avaliação técnica e validação do perfil ctDNA, e discutir alguns desafios como mosaico somático, baixa frequência de alelo variante (VAF) e detecção de variantes patogênicasgerminas 4. As Diretrizes de Prática Clínica ESMO recentemente publicadas para o diagnóstico, estadiamento e tratamento de pacientes com câncer de mama metastático indicam análise baseada em CTDNA nos casos em que há uma mudança na abordagem do tratamento ou se é necessário para entrar em um ensaio clínico5.
As amostras devem ser processadas dentro de 4h a partir do momento da extração. O processamento da amostra fora desse período de tempo pode levar à degradação da amostra e resultar em aumento da hemólise, que pode impactar na concentração de CFDNA e afetar aplicações a jusante, como o perfil do miRNA. Recomenda-se o uso de 2-4 mL de plasma para obter sensibilidade suficiente para análise a jusante. as aplicações baseadas em cfDNA contêm um conservante que estabiliza as células sanguíneas nucleadas e impede a liberação de DNA genômico contaminante (gDNA); O DNA é estável nestes tubos por até 14 dias a 6 °C a 37 °C após a extração do sangue. No entanto, as amostras devem ser processadas entre 24 e 48 horas, a fim de evitar contaminação com glóbulos brancos lísticos.
Alíquotas de um volume adequado devem ser utilizadas para evitar o congelamento das amostras de soro e plasma. O volume e o número de alíquotas dependerão do uso a jusante das amostras e também da capacidade de armazenamento do congelador de -80 °C. As alíquotas de 1 mL são úteis, pois este é o volume padrão usado para muitos protocolos de extração de CFDNA e várias alíquotas podem ser descongeladas se for necessário mais volume.
A hemólise de uma amostra pode ser estimada medindo a absorvência em um comprimento de onda de 540 nm da amostra suspeita de hemolisada em comparação com uma amostra não hemolisada com uma aparência amarelada clara. A hemólise relativa de uma amostra é calculada como a razão da absorvância em um comprimento de onda de 540 nm de uma amostra não hemolisada (com aparência amarelada clara) e da amostra hemolisada (com aparência avermelhada). Os leitores são aconselhados a consultar o artigo de TylerVan Buren et al, para obter mais informações6.
A integridade da amostra é crucial em todas as aplicações de biópsia líquida a jusante, e o tempo da extração da amostra ao processamento e tipo de tubo de coleta de amostras são dois fatores críticos que devem ser considerados, pois influenciam a qualidade e o rendimento dos marcadores ctDNA. Como regra geral, todas as amostras devem ser coletadas em um tubo específico de CFDNA ou tubo EDTA e processadas dentro de 48 h e 4h de extração, respectivamente. Assim, é importante ter uma boa coordenação com o pessoal e os serviços envolvidos na coleta de amostras. Idealmente, deve ser estabelecido um circuito detalhado de coleta de amostras que defina claramente as tarefas de todas as pessoas implicadas, com instruções detalhadas sobre o manuseio e transferência de amostras. O plasma é preferido para o soro para aplicações de CFDNA, pois o soro tende a ser contaminado com DNA genômico devido à lise de glóbulos brancos durante o processo de coagulação7. Por outro lado, o plasma geralmente contém inibidores de PCR como heparina, hemoglobina, hormônios, imunoglobulina G e lactoferrina8. No entanto, a diluição amostral pode ajudar a superar esse problema, desde que a amostra tenha uma concentração suficiente de CFDNA. Um estudo recente relata um fluxo de trabalho pré-analítico para aplicações de biópsia líquida, comparando diferentes tubos estabilizadores e medidas de quantificação e qualidade de ácidos nucleicos isolados do plasma, demonstrando a importância de um protocolo de processamento padronizado para análise a jusante reprodutível9. As diretrizes de análise do Instituto Nacional de Câncer (NCI) recomendam que os tubos EDTA sejam processados no prazo de 2-4 h e aqueles com um conservante especial no prazo de 3 dias10. Os biobancos podem ser uma instalação útil para os investigadores sem os equipamentos necessários para processamento e armazenamento de amostras. O ideal é que as amostras não sejam descongeladas mais de uma vez e não sejam armazenadas por mais de 3 anos antes do uso; assim, deve-se dar atenção cuidadosa ao volume de alíquotas para aplicações a jusante, a fim de evitar ciclos de congelamento.
Outro passo crítico no processamento de plasma é a centrifugação; o primeiro determina o isolamento correto do plasma das células mononucleares, a fonte da contaminação gDNA que pode diluir muito a abundância relativa de CTDNA. A segunda centrifugação realizada em velocidades mais rápidas tem como objetivo remover ainda mais os glóbulos brancos11. O uso do freio após o término da centrifugação não parece ter qualquer efeito na qualidade das amostras de plasma12. Outra consideração importante ao processar amostras de sangue é o tipo de rotor de centrífugas a ser usado, seja um swing-out ou rotor fixo. Para o processamento de amostras de sangue, recomenda-se um rotor swing-out. Este formato permite uma melhor separação dos componentes sanguíneos com base nos gradientes de densidade, e a localização da pelota celular após a centrifugação está na parte inferior do tubo centrífuga, enquanto, com uma centrífuga rotor fixa, a pelota celular se forma ao longo da lateral do tubo. Rotores fixos permitem que mais força gravitacional seja usada e mais adequada para separar proteínas e ácidos nucleicos, embora eles geralmente permitam que mais amostras sejam processadas ao mesmo tempo.
O rendimento final do CFDNA é fundamental para a sensibilidade da aplicação a jusante. Assim, com dados anteriores, é necessário um mínimo de 3,6 nanogramas (ng) de CFDNA para alcançar uma sensibilidade de <0,1% e 36 ng para obter uma sensibilidade de <0,01% para a detecção de alelos mutantes13. A qualidade, mas também a quantidade de CFDNA deve ser considerada na hora de decidir sobre um volume amostral para coleta e extração. Por exemplo, estudos anteriores mostraram que a concentração média/mediana de CFN extraído de 1 mL de plasma é de 21 ng/mL no câncer endometrial14, 14.3 (faixa 7-204) ng/mL em linfoma de Hodgkin15, 8,02 (± 7,81) ng/mL em câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC)16 e 1,35 ng/mL em casos de câncer de pâncreas17. O volume plasmá plasma necessário dependerá da tecnologia a jusante empregada, mas o uso de 2-4 mL é recomendado para alcançar sensibilidade suficiente.
A rastreabilidade da amostra é um aspecto importante que deve ser considerado na criação de coleções amostrais; todas as amostras e alíquotas devem ser corretamente e claramente rotuladas, permitindo facilmente a identificação subsequente. Os biobancos também podem ser utilizados por terem um Sistema de Gestão da Qualidade credenciado, que garanta a qualidade, a segurança e a rastreabilidade dos dados e amostras biológicas armazenados, cumprindo a legislação e regulamentos locais e internacionais aplicáveis. Os dados associados às amostras devem ser armazenados idealmente em um banco de dados adequado para esse fim, como o Research Electronic Data Capture (REDCap), um aplicativo baseado na Web desenvolvido pela Universidade Vanderbilt para capturar dados para pesquisa clínica e criar bancos de dados e projetos (https://www.project-redcap.org/). O uso de um servidor seguro com criptografia de dados também é altamente recomendado.
Os desafios relacionados à implementação da biópsia líquida na clínica foram recentemente revistos10, e uma questão fundamental destacada foi a padronização de condições pré-analíticas como coleta, processamento e armazenamento de amostras, que impactam diretamente a validação analítica e clínica, bem como a reprodutibilidade dos resultados. Consórcios de biópsia líquida como o CANCER-ID, a Sociedade Europeia de Biópsia Líquida (ELBS) e o Atlas de Perfil de Sangue em Câncer (BloodPAC) visam padronizar etapas pré-analíticas e definir as melhores práticas para estudos de biópsia líquida no cenário clínico18,19.
A biópsia líquida é uma ferramenta muito flexível e útil com grande potencial no contexto do diagnóstico, tratamento e acompanhamento do câncer20. Um conjunto crescente de evidências mostra sua vasta relevância, e para sua implementação adequada e uso da importância de coletar amostras de forma padronizada é fundamental para a obtenção de dados valiosos e comparáveis. Trabalhar com protocolos padronizados é crucial para evitar impedimentos técnicos em análises subsequentes, o que tem sido uma limitação real no passado com o uso de amostras de arquivamento antigas. Aqui, fornecemos protocolos validados que podem ajudar a garantir procedimentos pré-analíticos ideais para estudos de biópsia líquida baseados em CFDNA clínicos e de pesquisa.
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Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB recebeu honoraria para palestrante, consultoria ou assessoria da Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer e BMS. Sara López-Tarruella (SL): A SL recebeu honoraria para palestrante, consultoria ou papel consultivo da Astra-Zeneca/Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline e Veracyte. Noelia Tarazona (NT): A NT recebeu honoraria para palestrante, consultoria ou papel consultivo da Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM e ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): recebeu honoraria para palestrante, consultoria ou papel consultivo da Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly e Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) relata ter recebido bolsas de pesquisa relacionadas a este estudo da Novartis e bolsas de pesquisa não relacionadas a este estudo da AstraZeneca e beigene. Os demais autores não têm revelações sobre o manuscrito.
Acknowledgments
Agradecemos à Rede de Pesquisa Biomédica em Câncer (CIBERONC) pelo apoio e pela seguinte concessão do projeto: LB CIBERONC PLATAFORMA: Plataforma CIBERONC para a padronização e promoção da biópsia líquida. PI Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
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