Summary
Den flytande biopsin har revolutionerat vårt tillvägagångssätt för onkologiska translationella studier, med provinsamling, kvalitet och lagring som avgörande steg för dess framgångsrika kliniska tillämpning. Här beskriver vi ett standardiserat och validerat protokoll för nedströms cirkulationsfria DNA-applikationer som kan tillämpas i de flesta translationella forskningslaboratorier.
Abstract
Termen flytande biopsi (LB) avser molekyler som proteiner, DNA, RNA, celler eller extracellulära vesiklar i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära och / eller metastatiska tumören. LB har framstått som en grundpelare i translationell forskning och har börjat bli en del av klinisk onkologipraxis, vilket ger ett minimalt invasivt alternativ till fast biopsi. LB möjliggör realtidsövervakning av en tumör via en minimalt invasiv provutvinning, såsom blod. Applikationerna inkluderar tidig upptäckt av cancer, patientuppföljning för upptäckt av sjukdomsprogression, bedömning av minimal restsjukdom och potentiell identifiering av molekylär progression och resistensmekanism. För att uppnå en tillförlitlig analys av dessa prover som kan rapporteras i kliniken bör de preanalytiska procedurerna noggrant övervägas och följas strikt. Provinsamling, kvalitet och lagring är viktiga steg som avgör deras användbarhet i underordnade program. Här presenterar vi standardiserade protokoll från vår flytande biopsiarbetsmodul för insamling, bearbetning och lagring av plasma- och serumprover för nedströms flytande biopsianalys baserat på cirkulerande fritt DNA. Protokollen som presenteras här kräver standardutrustning och är tillräckligt flexibla för att kunna tillämpas i de flesta laboratorier som fokuserar på biologiska förfaranden.
Introduction
Termen "flytande biopsi" definierades 20101 som närvaron av molekyler (t.ex. protein, deoxiribonukleinsyra (DNA), ribonukleinsyra (RNA)), celler eller extracellulära vesiklar (t.exosomer) i blod och andra kroppsvätskor som härrör från den primära tumören. Användningen av flytande biopsiprover har revolutionerat translationell onkologiforskning eftersom vävnadsbiopsier, begränsade till en viss region vid ett visst ögonblick, kan missa relevanta kloner på grund av tumörheterogenitet. Dessutom spelar flytande biopsi en relevant roll i tumörtyper där primär vävnad är knapp eller inte tillgänglig, eftersom det kan undvika en invasiv biopsi, vilket minskar kostnaderna och risken för patienterna. Dessutom utvecklas tumörmolekylära egenskaper ständigt främst på grund av terapitrycket, och flytande biopsiprover kan fånga tumörklonaldynamiken eftersom de kan tas i längdriktningen, i olika kliniska och terapeutiska tider av sjukdomen, såsom baslinje, vid behandling, bästa svar och vid sjukdomsprogression eller till och med tidigare. Begreppet "flytande biopsi i realtid" innebär att dynamiska förändringar i tumören kan övervakas i realtid, vilket möjliggör precisionsmedicin vid denna sjukdom. Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar i kliniken, inklusive screening och tidig upptäckt av cancer, realtidsövervakning av sjukdom, upptäckt av minimal restsjukdom, studier av mekanismer för behandlingsresistens och stratifiering av patienter på terapeutisk nivå1. Tidig upptäckt av återkommande och progression av sjukdomar är ett ouppfyllt kliniskt behov i många tumörtyper och är en nyckelfaktor för att öka överlevnaden och livskvaliteten för cancerpatienter. Rutinmässiga avbildningsmetoder och lösliga tumörmarkörer kan sakna den känslighet och / eller specificitet som krävs för denna uppgift. Således behövs nya prediktiva markörer i kliniken, såsom de som är baserade på cirkulerande fria nukleinsyror.
De typer av prover som används för flytande biopsistudier inkluderar men är inte begränsade till blod-, urin-, saliv- och avföringsprover. Andra tumörspecifika prover kan vara cellsaspirater, cerebrospinalvätska, pleuravätska, cyst- och ascitesvätska, sputum och bukspottkörteljuice2. De tidigare vätskorna kan innehålla olika typer av cancer-härledda material, cirkulerande tumörceller (CTC) eller fragment såsom exosomer och cellfritt cirkulerande tumör-DNA (ctDNA). Nukleinsyror kan vara inkapslade i extracellulära vesiklar (EV) eller släppas ut i kroppsvätskor på grund av celldöd och skada. Cirkulerande fritt DNA (CFDNA) frigörs huvudsakligen i blodomloppet från apoptotiska eller nekrotiska celler och finns hos alla individer, vilket visar ökade nivåer vid inflammatoriska eller onkologiska sjukdomar3. Exosomer är små extracellulära vesiklar (~ 30-150 nm) utsöndras av celler som innehåller nukleinsyror, proteiner och lipider. Dessa vesiklar utgör en del av det intercellulära kommunikationsnätverket och finns vanligtvis i många typer av kroppsvätskor2. Nukleinsyrorna som är inneslutna i elbilar är skyddade från den hårda miljön i kroppsvätskor, vilket ger ett mer robust sätt att studera dessa molekyler i flytande biopsiinställning.
Sammantaget är nivåerna av cirkulerande nukleinsyror i flytande biopsiprover mycket låga, och därför behövs känsliga metoder för detektion, såsom digital PCR eller nästa generations sekvensering (NGS). Preanalytisk hantering av provet är avgörande för att förhindra blodcellslys och frisättning av intakt DNA, vilket orsakar kontaminering av CFDNA med det genomiska DNA. Dessutom måste man vara försiktig vid extraktion av prover för att undvika förekomst av hämmare av enzymbaserade analysmetoder.
Här presenterar vi en standardiserad metod för insamling och lagring av plasma- och serumprover, vilket är ett avgörande första steg för flytande biopsibaserade nedströmsapplikationer, inklusive cirkulerande nukleinsyraanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tidigare etiskt godkännande erhölls från deltagande centra före utvinning av blodprover. Följande protokoll för serum- och plasmaisolering utfördes i enlighet med de etiska principerna för biomedicinsk forskning.
OBS: Tidigare överväganden innan protokollet påbörjas finns här. Förhandsetiskt godkännande krävs för användning av humanprover i biomedicinsk forskning, med motsvarande informerade samtycke. Ett klass II biosäkerhetsskåp krävs för att hantera blodprover. En labbrock, skyddshandskar och glasögon bör bäras under hela proceduren för att undvika infektion med blodburna patogener. Minst 30 min krävs för bearbetning av serumprover. Efter blodextraktion i rör utan antikoagulantia, håll vid rumstemperatur (RT) i 30-45 minuter för att möjliggöra proppbildning. Minst 40 min krävs för plasmaberedning, och prover bör bearbetas inom 4 timmar från extraktionstillfället vid användning av etylendiamintetraättiksyrarör (EDTA) eller inom 24-48 timmar om man använder cellstabiliserande uppsamlingsrör eller specifika cellfria DNA-uppsamlingsrör. Enligt vissa tillverkare är proverna dock stabila i upp till 2 veckor i dessa specialiserade rör. Det är viktigt att kontrollera om hemolys, vilket ger plasma- eller serumfraktionen ett rödaktigt utseende. Se felsökningsavsnittet för hemolyserade exempel i diskussionen.
1. Serumpreparat för flytande biopsistudier
OBS: Total tid som krävs för att utföra detta steg är 30 min (figur 1).
- Extrahera 4-10 ml blod i rör som inte innehåller något antikoagulantia (rött eller rött/grå-svart lock) och håll vid RT i 30-45 min. Bearbeta dessa prover inom 4 timmar från extraktionstillfället.
- Registrera tid och datum för extraktionen av provet och ämnesidentifieringen (ID) i en lämpligt utformad provdatabas.
- Iförd labbrock, skyddshandskar och glasögon, centrifugera röret som innehåller färskt blod vid RT (15 °C-25 °C) i 10 minuter vid 1 600 (± 150) x g, med maximal paus applicerad.
- Efter centrifugering, ta försiktigt bort röret från centrifugen; den övre fasen av serumsupnatanten kommer att se klar och gulaktig ut (figur 2). Kontrollera om provet visar tecken på hemolys (figur 3) och registrera förekomsten av hemolys när så är lämpligt.
- I ett klass II biosäkerhetsskåp överför du serumet till uppsamlingsrör som 250 μL alikvoter.
OBS: Alikvoternas volym måste anpassas till studiekraven. - Frys omedelbart serumet upprätt i en förvaringslåda vid -80 °C och registrera tiden för provlagring.
- Kontrollera att proverna behandlades inom den tidsram som krävs inom den tidsram på 4 timmar som krävs.
2. Plasmapreparat för flytande biopsistudier
OBS: Den totala tiden som krävs för att utföra detta steg är 40 min (figur 4).
- Extrahera 4-10 ml blod i rör som innehåller etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Bearbeta proverna inom 4 timmar från extraktionstillfället.
- Registrera tid och datum för extrahering av prover och ämnes-ID i en lämpligt utformad exempeldatabas.
- Bär en labbrock, skyddshandskar och glasögon och centrifugera EDTA-röret vid RT (15 ° C-25 ° C) i 10 minuter vid 1 600 (± 150) x g, med maximal paus applicerad.
OBS: Se tillverkarens instruktioner när du använder andra uppsamlingsrör. - Efter centrifugering kommer plasmasupernatanten att visas klar och gulaktig. Kontrollera om provet visar tecken på hemolys (figur 3) och överför plasmat (supernatant) till ett 15 ml centrifugrör utan att störa cellskiktet med hjälp av en engångs serologisk pipett (eller engångspipett eller p1000-pipetter med filterspets). Lämna en liten restvolym plasma ovanför cellskiktet (ca 5 mm).
- Om hemolys observeras, kassera provet för vidare analys. (Figur 5). Se felsökningsavsnittet i diskussionen för att bedöma hemolys.
- Centrifugera plasman i ett 15 ml centrifugrör vid RT (15 °C-25 °C) i 10–20 minuter vid 3 000 (±150) x g. Utför detta steg för att ta bort eventuella kvarvarande intakta blodkroppar som överförs från det första centrifugeringssteget.
- Efter centrifugering, ta försiktigt bort röret från centrifugen och överför 1-4 ml plasma till 1-4 ml polypropylen kryogena ampuller med en engångs serologisk pipett (eller engångslampapipett eller p1000-pipetter med filterspets). En restvolym plasma (cirka 0,3 ml eller 7 mm höjd) måste lämnas längst ner på röret för att undvika att plasman förorenas med blodkroppar (figur 5).
- Frys omedelbart plasman upprätt i förvaringslådan vid -80 °C och registrera tiden för provlagring. Kontrollera att proverna behandlades inom den tidsram som krävs inom den tidsram på 4 timmar som krävs.
- Samla cellskiktet (buffy coat) med en P1000 och filtrerad spets och överför det till ett 2 ml rör. Frys omedelbart och förvaras vid -80 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter centrifugering av blodrören utan antikoagulant uppträder den övre fasen en blekgul och motsvarar serumfraktionen (figur 2). Denna fraktion avlägsnas försiktigt och alikvoteras för efterföljande analys.
Hemolys kan vara närvarande i antingen plasma- eller serumfraktionen, och den övre fasen kommer att ha ett rödaktigt utseende, vilket indikerar närvaron och graden av hemolys (Figur 3).
Efter centrifugering av EDTA-rör kommer flera faser eller lager att vara uppenbara; den övre fasen (blekgul) är plasmafraktionen, som står för 55% av den totala blodvolymen; det tunna gråvita gränssnittet är det buffiga pälsskiktet som innehåller vita blodkroppar och blodplättar och står för <1% av den totala blodvolymen; den nedre fasen (röd färg) innehåller röda blodkroppar, som står för 45% av den totala blodvolymen). Aspirera 1 cm över leukocytskiktet och se till att cellskiktet inte störs för att minska kontaminering av plasma med blodkroppar (Figur 5). Denna fraktion bör avlägsnas noggrant och alikvoteras för efterföljande analys.
Koncentrationen och integriteten hos CFDNA extraherat från plasmaprover bör bedömas med hjälp av elektroforesbaserade metoder. cfDNA extraherades med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kolumnbaserat kit. Kvantifiering utfördes med hjälp av ett gelbaserat kommersiellt tillgängligt kit specifikt för CFDNA-applikationer (Table of Materials). Figur 6A visar ett exempel på en CFDNA-extraktion av hög kvalitet som kan användas för nedströmsapplikationer. Medan figur 6B visar ett exempel på ett olämpligt prov med en hög nivå av genomisk kontaminering.
Figur 1: Serumpreparat för flytande biopsistudier. En översikt över serumberedningsprocessen visas, från provcentrifugering till lagring av alikvoter. Steg 1: Blodprov i ett rör utan antikoagulantia för isolering av serum. Steg 2: Centrifugera blodröret för att erhålla serum inom 4 timmar efter extraktion. Steg 3: Ta bort den övre fasen av serumsupnatanten för efterföljande lagring. Steg 4: Frys serumröret upprätt vid -80 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Blodprover som samlats in i rör utan antikoagulantia efter centrifugering. Den övre fasen motsvarar serumfraktionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ett exempel på ett hemolyserat prov efter centrifugering. Den övre fasen som motsvarar plasma-/serumfraktionen verkar röd på grund av hemolys. Helst bör dessa prover kasseras, eller åtminstone bör förekomsten av hemolys i provet registreras, eftersom detta kan påverka vissa nedströmsapplikationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Plasmapreparat för flytande biopsistudier. En översikt över serumberedningsprocessen visas, från provcentrifugering till lagring av alikvoter och buffy coat-uppsamling. Steg 1: Blodprov i ett rör innehållande etylendiamintetraättiksyra (EDTA) för isolering av plasma. Steg 2: Centrifugera blodröret för att erhålla plasma inom 4 timmar efter extraktion. Steg 3: Överför plasmasupernatanten till ett 15 ml centrifugrör utan att störa cellskiktet. Steg 4: Centrifugera plasmat för att ta bort eventuella blodkroppar som överförts från det första centrifugeringssteget. Steg 5: Överför plasman till kryogena injektionsflaskor och frys plasmaröret upprätt vid -80 °C. Steg 6: Samla cellskiktet (buffy coat) och förvara vid -80 °C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: EDTA-blodprover efter centrifugering. Tre synliga lager är synliga efter centrifugering av rören som innehåller färskt blod. Den övre fasen motsvarar plasmafraktionen, det tunna gråvita gränssnittet motsvarar buffybeläggningen och innehåller vita blodkroppar och blodplättar, och bottenfasen innehåller röda blodkroppar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Elektroforesbaserad analys av CFDNA isolerat från plasma. (B) Ett exempel på ett suboptimalt experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den flytande biopsin har många potentiella tillämpningar vid olika tidpunkter under hanteringen av cancer. Först vid diagnos för att identifiera tumörmolekylära markörer som skulle föreslå förekomsten av en potentiell tumörskada som kan undersökas ytterligare kliniskt. För det andra, under behandling för realtidsövervakning av sjukdomen, bedömning av behandlingsmolekylärt svar, klonal evolution och tidig upptäckt av sjukdomsåterfall eller behandlingsresistens. Slutligen, efter den kirurgiska behandlingen, som ett verktyg för detektering av minimal restsjukdom. European Society of Medical Oncology (ESMO) har nyligen publicerat riktlinjer för implementering av ctDNA-mutationstestning vid metastaserad icke-småcellig lungcancer (NSCLC) för att identifiera handlingsbara terapeutiska mål. Dessa riktlinjer inkluderar metodologiska överväganden, teknisk utvärdering och validering av ctDNA-profilering och diskuterar några utmaningar som somatisk mosaicism, låg variant allelfrekvens (VAF) och oavsiktlig bakteriepatogen variantdetektering4. De nyligen publicerade ESMO Clinical Practice Guidelines för diagnos, iscensättning och behandling av patienter med metastaserad bröstcancer indikerar ctDNA-baserad analys i fall där det sker en förändring i behandlingsmetoden eller om det är nödvändigt för att gå in i en klinisk prövning5.
Proverna ska behandlas inom 4 timmar från extraktionstillfället. Provbearbetning utanför denna tidsram kan leda till nedbrytning av prover och resultera i ökad hemolys, vilket kan påverka CFDNA-koncentrationen och påverka nedströmsapplikationer såsom miRNA-profilering. Användning av 2-4 ml plasma rekommenderas för att erhålla tillräcklig känslighet för nedströmsanalys. CFDNA-baserade applikationer innehåller ett konserveringsmedel som stabiliserar kärnblodceller och förhindrar frisättning av förorenande genomiskt DNA (gDNA); DNA är stabilt i dessa rör i upp till 14 dagar vid 6 °C till 37 °C efter blodextraktion. Proverna bör dock behandlas inom 24-48 timmar för att undvika kontaminering med lyserade vita blodkroppar.
Alikvoter med tillräcklig volym bör användas för att undvika frys-upptining av serum- och plasmaproverna. Volymen och antalet alikvoter beror på användningen av proverna i senare led och även lagringskapaciteten hos frysen på -80 °C. 1 ml alikvoter är användbara eftersom detta är standardvolymen som används för många CFDNA-extraktionsprotokoll och olika alikvoter kan tinas om mer volym krävs.
Hemolys av ett prov kan uppskattas genom att mäta absorbansen vid en våglängd av 540 nm av det misstänkta hemolyserade provet jämfört med ett icke-hemolyserat prov med ett klart gulaktigt utseende. Den relativa hemolysen av ett prov beräknas som förhållandet mellan absorbansen vid en våglängd av 540 nm av ett icke-hemolyserat prov (med ett klart gulaktigt utseende) och av det hemolyserade provet (med ett rödaktigt utseende). Läsarna rekommenderas att hänvisa till artikeln av TylerVan Buren et al, för ytterligare information6.
Provintegritet är avgörande i alla nedströms flytande biopsiapplikationer, och tiden från provutvinning till bearbetning och provuppsamlingsrörstyp är två kritiska faktorer som bör beaktas eftersom de påverkar kvaliteten och utbytet av ctDNA-markörer. Som en allmän regel måste alla prover samlas in i ett CFDNA-specifikt rör eller EDTA-rör och bearbetas inom 48 timmar respektive 4 timmar efter extraktion. Därför är det viktigt att ha en god samordning med den personal och de tjänster som är involverade i provtagningen. Helst bör en detaljerad provinsamlingskrets upprättas som tydligt definierar uppgifterna för alla inblandade personer, med detaljerade instruktioner för hantering och överföring av prover. Plasma är att föredra framför serum för CFDNA-applikationer eftersom serum tenderar att vara förorenat med genomiskt DNA på grund av vit blodcellslys under koagulationsprocessen7. Å andra sidan innehåller plasma i allmänhet PCR-hämmare såsom heparin, hemoglobin, hormoner, immunglobulin G och laktoferrin8. Provutspädning kan dock hjälpa till att övervinna detta problem, förutsatt att provet har en tillräcklig koncentration av CFDNA. En nyligen genomförd studie rapporterar ett preanalytiskt arbetsflöde för flytande biopsiapplikationer, som jämför olika stabiliserande rör och kvantifiering och kvalitetsmått av nukleinsyror isolerade från plasma, vilket visar vikten av ett standardiserat bearbetningsprotokoll för reproducerbar nedströmsanalys9. National Cancer Institute (NCI) CFDNA-analysriktlinjer rekommenderar att EDTA-rör bearbetas inom 2-4 timmar och de med ett speciellt konserveringsmedel inom 3 dagar10. Biobanker kan vara en användbar anläggning för utredare utan den utrustning som krävs för provbehandling och lagring. Helst bör proverna inte frysas och tinas mer än en gång och inte förvaras i mer än 3 år före användning. Därför måste volymen alikvoter för tillämpningar nedströms ägnas stor uppmärksamhet för att undvika frys-tö-cykler.
Ett annat kritiskt steg i plasmabearbetning är centrifugering; den första bestämmer den korrekta isoleringen av plasma från mononukleära celler, källan till gDNA-kontaminering som kraftigt kan späda ut det relativa överflödet av ctDNA. Den andra centrifugeringen som utförs med snabbare hastigheter är avsedd att ytterligare avlägsna lyserade vita blodkroppar11. Användningen av bromsen efter det att centrifugeringen har avslutats verkar inte ha någon inverkan på plasmaprovernas kvalitet12. En annan viktig faktor vid bearbetning av blodprover är vilken typ av centrifugrotor som ska användas, antingen en svängbar eller fast rotor. För bearbetning av blodprover rekommenderas en svängbar rotor. Detta format möjliggör en bättre separation av blodkomponenter baserat på densitetsgradienter, och cellpelletens placering efter centrifugering är längst ner på centrifugröret, medan cellpelleten med en fast rotorcentrifug bildas längs rörets sida. Fasta rotorer tillåter mer gravitationskraft att användas och en mer lämplig för att separera proteiner och nukleinsyror, även om de vanligtvis tillåter att fler prover bearbetas samtidigt.
Det slutliga utbytet av CFDNA är avgörande för nedströms applikationskänslighet. Följaktligen, med tidigare data, behövs minst 3,6 nanogram (ng) cfDNA för att uppnå en känslighet på <0,1% och 36 ng för att erhålla en känslighet på <0,01% för detektion av mutanta alleler13. Kvalitet men även kvantitet av CFDNA måste beaktas när beslut fattas om en provvolym för insamling och extraktion. Till exempel visade tidigare studier att medel-/mediankoncentrationen av CFDNA extraherat från 1 ml plasma är 21 ng/ml vid endometriecancer14, 14,3 (intervall 7-204) ng/ml i Hodgkins lymfom15, 8,02 (± 7,81) ng/ml vid icke-småcellig lungcancer (NSCLC)16 och 1,35 ng/ml i fall av bukspottkörtelcancer17. Den erforderliga plasmavolymen beror på den nedströmsteknik som används, men användning av 2-4 ml rekommenderas för att uppnå tillräcklig känslighet.
Provspårbarhet är en viktig aspekt som måste beaktas när man skapar provsamlingar. Alla prover och alikvoter bör vara korrekt och tydligt märkta, så att det är lätt att identifiera dem. Biobanker kan också användas eftersom de har ett ackrediterat kvalitetsstyrningssystem som garanterar kvaliteten, säkerheten och spårbarheten för de data och biologiska prover som lagras, i enlighet med gällande lokala och internationella lagar och förordningar. Data som är associerade med proverna bör helst lagras i en databas som är lämplig för detta ändamål, såsom Research Electronic Data Capture (REDCap), en webbaserad applikation utvecklad av Vanderbilt University för att fånga data för klinisk forskning och skapa databaser och projekt (https://www.project-redcap.org/). Användning av en säker server med datakryptering rekommenderas också starkt.
Utmaningarna relaterade till implementeringen av flytande biopsi i kliniken har nyligen granskats10, och en nyckelfråga som lyftes fram var standardiseringen av preanalytiska tillstånd som provinsamling, bearbetning och lagring, vilket direkt påverkar analytisk och klinisk validering, samt reproducerbarhet av resultat. Flytande biopsikonsortier som CANCER-ID, European Liquid Biopsy Society (ELBS) och Blood Profiling Atlas in Cancer (BloodPAC) syftar till att standardisera preanalytiska steg och definiera bästa praxis för flytande biopsistudier i klinisk miljö18,19.
Flytande biopsi är ett mycket flexibelt och användbart verktyg med stor potential i samband med cancerdiagnos, behandling och uppföljning20. En ökande mängd bevis visar dess stora relevans, och för dess korrekta genomförande och användning är vikten av att samla in prover på ett standardiserat sätt nyckeln till att få värdefulla och jämförbara data. Att arbeta med standardiserade protokoll är avgörande för att undvika tekniska hinder i efterföljande analyser, vilket tidigare har varit en verklig begränsning med användning av gamla arkivprover. Här tillhandahöll vi validerade protokoll som kan hjälpa till att garantera optimala preanalytiska procedurer för kliniska och forsknings cfdna-baserade flytande biopsistudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beatriz Bellosillo (BB): BB fick honoraria för talare, konsult- eller rådgivande roll från Amgen, Astra-Zeneca, Biocartis, Janssen, Merck-Serono, Novartis, Qiagen, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Pfizer och BMS. Sara López-Tarruella (SL): SL fick honoraria för talare, konsult eller rådgivande roll från Astra-Zeneca / Daiichi-Sankyo, MSD, Novartis, Pfizer, Roche Pharma, Gilead, Lilly, Pierre Fabre, Seagen, GlaxoSmithKline och Veracyte. Noelia Tarazona (NT): NT fick honoraria för talare, konsult eller rådgivande roll från Amgen, Pfizer, Merck-Serono, Servier, SEOM och ESMO. Javier Hernandez-Losa (JHL): fick honoraria för talare, konsult eller rådgivande roll från Astra-Zeneca, Janssen, Novartis, Roche Diagnostics, Roche Pharma, ThermoFisher, Lilly och Diaceutics. Rodrigo Toledo (RT) rapporterar att han fått forskningsbidrag relaterade till denna studie från Novartis och forskningsbidrag som inte är relaterade till denna studie från AstraZeneca och Beigene. De återstående författarna har inga upplysningar om manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Biomedical Research Network in Cancer (CIBERONC) för deras stöd och följande projektbidrag: LB CIBERONC PLATFORM: CIBERONC plattform för standardisering och främjande av flytande biopsi. Pi Rodrigo Toledo, (CIBERONC), 2019-2021.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010010 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 10 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367525 | These tubes can be used for plasma collection |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | BIOFIL | CFT411150 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 3.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 368965 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| 4 mL polypropylene cryogenic vial, round bottom, self-standing | Corning | 430662 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 4 mL Vacutainer K2 EDTA tube | Becton Dickinson | 367864 | These tubes can be used for plasma collection |
| 4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | Several quantification methods are available with a specific application for cfDNA |
| 5 mL serological disposable pipettes | BIOFIL | GSP010005 | Any standard tubes/equipment can be used |
| 8.5 mL BD Vacutainer tube without anticoagulant | Becton Dickinson | 366468 | Either 8.5 or 3.5 mL tubes can be used for serum collection |
| Centrifuge, capable of ~3000 x g with a swing bucket rotor | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST 16 10688725 | Any standard tubes/equipment can be used |
| Freezer storage boxes for 1–4 mLcryogenic vials | Corning | 431120 | These boxes are needed when using 4 mL vials for storage |
| p1000 pipette tips | CORNING | 4809 | Any standard tubes/equipment can be used |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | Any commercially available kit that is specific for cfDNA isolation can be used with this blood prcessing protocol. |
| Streck Cell-Free DNA BCT CE tubes 10 mL | Streck | 218997 | These tubes can be used for plasma collection |
| Temperature Freezer (-80 °C) | ESCO | 2180104 | Any standard tubes/equipment can be used |
References
- Alix-Panabières, C., Pantel, K. Clinical applications of circulating tumor cells and circulating tumor DNA as liquid biopsy. Cancer Discovery. 6 (5), 479-491 (2016).
- Zhou, B., et al. Application of exosomes as liquid biopsy in clinical diagnosis. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 144 (2020).
- Bettegowda, C., et al. Liquid biopsies: Genotyping circulating tumor DNA. Nature Medicine. 4 (6), (2014).
- Heitzer, E., et al. Recommendations for a practical implementation of circulating tumor DNA mutation testing in metastatic non-small-cell lung cancer. ESMO Open. 7 (2), 100399 (2022).
- Gennari, A., et al. ESMO Clinical Practice Guideline for the diagnosis, staging and treatment of patients with metastatic breast cancer. Annals of Oncology: Official Journal of the European Society for Medical Oncology. 32 (12), 1475-1495 (2021).
- Van Buren, T., Arwatz, G., Smits, A. J. A simple method to monitor hemolysis in real time. Scientific Reports. 10 (1), 5101 (2020).
- Ignatiadis, M., Sledge, G. W., Jeffrey, S. S. Liquid biopsy enters the clinic - implementation issues and future challenges. Nature Reviews. Clinical Oncology. 18 (5), 297-312 (2021).
- Sidstedt, M., et al. Inhibition mechanisms of hemoglobin, immunoglobulin G, and whole blood in digital and real-time PCR. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (10), 2569-2583 (2018).
- Maass, K. K., et al. From sampling to sequencing: A liquid biopsy pre-analytic workflow to maximize multi-layer genomic information from a single tube. Cancers. 13 (12), 3002 (2021).
- Greytak, S. R., et al. Harmonizing cell-free DNA collection and processing practices through evidence-based guidance. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 26 (13), 3104-3109 (2020).
- Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699 (2018).
- Boissier, E., et al. The centrifuge brake impacts neither routine coagulation assays nor platelet count in platelet-poor plasma. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 58 (9), 185-188 (2020).
- Johansson, G., et al. Considerations and quality controls when analyzing cell-free tumor DNA. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100078 (2019).
- Casas-Arozamena, C., et al. Genomic profiling of uterine aspirates and cfDNA as an integrative liquid biopsy strategy in endometrial cancer. Journal of Clinical Medicine. 9 (2), 585 (2020).
- Alcoceba, M., et al. Liquid biopsy: a non-invasive approach for Hodgkin lymphoma genotyping. British Journal of Haematology. 195 (4), 542-551 (2021).
- Szpechcinski, A., et al. Cell-free DNA levels in plasma of patients with non-small-cell lung cancer and inflammatory lung disease. British Journal of Cancer. 113 (3), 476-483 (2015).
- Earl, J., et al. Somatic mutation profiling in the liquid biopsy and clinical analysis of hereditary and familial pancreatic cancer cases reveals kras negativity and a longer overall survival. Cancers. 13 (7), 1612 (2021).
- Lampignano, R., et al. Multicenter evaluation of circulating cell-free DNA extraction and downstream analyses for the development of standardized (pre)analytical work flows. Clinical Chemistry. 66 (1), 149-160 (2020).
- Febbo, P. G., et al. Minimum technical data elements for liquid biopsy data submitted to public databases. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 107 (4), 730-734 (2020).
- De Mattos-Arruda, L., Siravegna, G. How to use liquid biopsies to treat patients with cancer. ESMO Open. 6 (2), 100060 (2021).
