Summary
このプロトコールは、アポリポタンパク質E(ApoE)欠損マウスにおけるアンジオテンシンII放出によって腹部大動脈瘤を誘導するための浸透圧ポンプの連続移植、および反復薬物治療のための頸静脈カテーテルを有する血管アクセスポートの移植を記載する。3D超音波による動脈瘤発達のモニタリングは、背側インプラントにもかかわらず効果的に行われる。
Abstract
腹部大動脈瘤(AAA)の臨床管理には薬学的治療選択肢が欠けているため、動物モデル、特にマウスモデルは、疾患病因の理解を促進し、潜在的な治療標的を同定するために適用される。これらのモデルにおけるAAA増殖をブロックする新規薬物候補物質を試験するには、一般に、実験の時間経過中に薬物投与を繰り返す必要がある。ここでは、AAA誘導、長期治療を容易にするための静脈内カテーテルの挿入、および3D超音波による連続AAAモニタリングのためのコンパイルされたプロトコルについて説明します。動脈瘤は、マウス背部に皮下に移植された浸透圧ミニポンプから28日間にわたってアンジオテンシンII放出によってアポリポタンパク質E(ApoE)欠損マウスにおいて誘導される。続いて、外頸静脈カテーテル検査のための外科的処置が行われ、毎日の静脈内薬物治療または皮下血管アクセスボタンを介した反復採血が可能になる。2つの背側インプラントにもかかわらず、AAA発達のモニタリングは、実験例によって示されるように、大動脈の直径および体積の拡大および動脈瘤形態に関する包括的な情報をもたらす、逐次半自動3D超音波分析によって容易に促進される。
Introduction
腹部大動脈瘤(AAA)は、大動脈壁における炎症性および組織破壊的プロセスによる血管の病理学的拡張であり、最終的に破裂および患者の死につながる可能性がある。外科的AAA修復におけるかなりの成果にもかかわらず、動脈瘤拡張の進行を阻止し、破裂のリスクを潜在的に低下させる保存的薬物治療は、今日まで欠落している。動物モデルは、この疾患の引き金とメディエーターを解明し、治療への新しいアプローチをテストするために開発されました。AAAのマウスモデルは広く適用されており、ヒト組織からのさまざまな観察をカバーしています。それらのパトメカニスティックな違いのために、分子/経路の特定の機能または潜在的な治療薬の有効性を調査するために、しばしば複数のモデルが適用される1,2。AAA誘導の最も一般的に使用されるモデルの中には、アポリポタンパク質E欠損(ApoE KO)マウス3におけるアンジオテンシン−II(Ang−II)投与があり、これは、大動脈壁への急性侮辱からの動脈瘤形成に依存するモデルと比較して、より慢性的な病因を有する4,5。したがって、Ang-IIモデルは疾患の進行をモニタリングするのに特に適しているようであり、代謝および炎症反応に関してヒトAAA疾患によく似ていることが最近示された6。特に、Ang-IIモデルはAAAの発達だけでなく、胸部動脈瘤形成、および壁内血栓形成を伴う大動脈解離も特徴とする。
疾患の開始を予防するのではなく、既に確立されたAAAの進行を標的とすることを目的とした治療は、治療を必要とする既存の状態を有する患者としてより高い翻訳価値を有する可能性がある7,8。同等の実験計画のためには、AAA誘導の前後に大動脈サイズをモニターして疾患発症の閾値を定義し、マウスを治療群に層別化する必要がある。
薬物投与の様式は、それぞれの物質の取り込みおよび安定性に依存する。腹腔内(i.p.)注射は、適用の容易さ、麻酔薬を必要としないこと、および注射量の制約の欠如のために最も頻繁に利用される9。しかし、投与された物質は主に肝門脈循環を介して吸収され、循環に達する前に肝臓代謝を受ける可能性があるため、投与経路を選択する際には薬物動態を考慮する必要があり、初回通過効果に応じて血漿濃度が変化する可能性がある10。静脈内(i.v.)注射は、物質の最高の生物学的利用能をもたらし、反復的なi.v.アクセスの課題は、毎日の投与のためのカテーテルおよび血管アクセスポートの使用によって回避することができる11、12、13。AAA設定に関して、循環中の薬物分布は、定義された濃度での直接動脈瘤曝露を容易にする。
ここでは、浸透圧ポンプの皮下移植を介してAng-IIマウスモデルにAAAを誘導するためのワークフロー、外部頸静脈に挿入されたカテーテルに接続された血管アクセスポートを介した毎日の静脈内薬物治療、ならびに2つの背側インプラントが存在するにもかかわらず3D超音波14 を介して動脈瘤サイズのモニタリングについて記述する。
Protocol
動物実験は、科学目的で使用される動物の保護に関する欧州指令2010/63/EUおよびオーストリア動物実験法2012に準拠して、地元の倫理委員会とオーストリア科学省(BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016)によって承認されました。人道的なエンドポイントは、≥15%の体重減少、食物および/または水分摂取の回避、活動の低下(低運動症)またはジスキネジア、または痛み/症状管理にもかかわらず、長時間の振盪、引っ掻き傷、呼吸困難、またはむしゃがんだ姿勢で設定された。必要に応じて、動物を深い麻酔下、すなわちケタミン(約100mg / kg)およびキシラジン(約5mg / kg)の過剰摂取カクテル、または子宮頸部脱臼によって安楽死させる。外科的処置のために、無菌技術および滅菌/清潔な手袋が全体を通して使用される。
1. ポンプ注入
- 麻酔
- ApoE欠損マウス(B6.129P2-Apoetm1Unc/J)を通常の食事に保ち、好ましくは12〜14週齢の雄動物を実験に含めて、ヒト疾患における雄優勢を表す3。
- 手術の1日前(d-1、pre-OP)に、製造業者のプロトコールに従ってマウス体重に従って所望の濃度のアンジオテンシンIIを浸透圧ポンプに調製および充填し、ポンプを37°Cの生理食塩水中で一晩インキュベートする15。
例:25 g のマウスの場合、送達速度が 1000 ng/kg/min、ポンプ速度が 0.25 μL/h の浸透圧ポンプ( 材料表を参照) を 28 日間使用し、1.8 mg の Ang-II を 300 μL の生理食塩水に溶解させます (1500 ng/h の Ang-II を送達するには 6000 ng/μL 濃度)。鈍い充填針で溶液をポンプにロードし、フローモデレータを挿入してポンプを閉じます。 - 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。マウスを臥位にある加熱テーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。
- 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。
- 生理食塩水中の2.5%ブプレノルフィンをマウス皮下10μL/gで注射し、つま先ピンチで麻酔の深さを確認します。
- マウスの左上にある小さな領域を肩甲骨の上に剃ります。剃毛した部分の消毒のために10%(w / v)のポビドンヨード溶液を塗布する。
- ポンプ挿入(5-7分、顕微鏡なしで実施)
- マウスがつま先のピンチで完全に麻酔をかけられていることを確認し、中脊髄線と左肩甲骨線の間にメスを入れて背中上部の皮膚に1cm横切開します。
- 鉗子で皮膚を持ち上げ、鈍い湾曲したはさみを使用して、左後肢に向かって押して皮下ポケットを作ります。はさみを開き、開いたはさみをカットから引き出し、繰り返してポケットを広げます。
- フローモデレーターでポンプをポケットにそっと挿入し、尾部に向かって(切開部位によるAng-II放出の潜在的な干渉を最小限に抑えるため)。
注:ポケットは、ポンプを挿入するのに十分な幅であるだけでなく、皮膚がポンプの周囲にきつくならないようにし、最適な創傷治癒を可能にするためにポンプと切開部位の間に少なくとも5mmある必要があります。 - 4-0吸収性の中断された縫合糸で創傷を閉じる。
- マウスの生理食塩水中に10%グルコースをマウス皮下10μL/gで注射する。
- 閉じた創傷にポビドンヨード創傷スプレーを塗布し、マウスが加熱ランプの下で意識を回復できるようにしてから、手術後3日間、7.5mgのピリトラミド(拡張疼痛管理用)および20mLの飲料水中の5%グルコース20mLをケージに戻す。
- 痛みや苦痛の兆候がないか1日に数回マウスをチェックしてください。
注:大動脈破裂は20%〜40%の割合で、主に手術後最初の3〜10日以内に起こるため、頻繁な動物モニタリングによって長期にわたる重度の痛みまたは苦痛のリスクを最小限に抑える必要があります。差し迫った破裂の主な適応症には、グループからの分離、むしゃがんだ姿勢、可動性の低下(後肢麻痺の程度まで)、および取り扱い中の応答性の低下または非応答性が含まれる。
2. 頸静脈カテーテル法
注:この外科的処置には、倍率8倍〜10倍の顕微鏡が必要です。
- 血管アクセスシステム(材料表を参照)を使用して、 3Fr側を所望の長さ(シリコーンアンカーの〜5〜7mm前)に切断し、血管アクセスシステム(VAS)の22G金属コネクタにカテーテルを少なくとも3mm重なり合って押して、カテーテルを準備する。アルミキャップをボタンの上に置き、ポートを保護します。
- 長さ1-1.5 cmの6-0シルク合字を準備します。
- 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。
- マウスを仰臥位で加熱したテーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。
- 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。
- マウスの生理食塩水中に2.5%のブプレノルフィンをマウス皮下10μL/gで注射する。
- 腹側と背中上部の右側に首の右側から毛皮を剃ります(左側には浸透圧ポンプが埋め込まれます)。
- 剃毛された領域の消毒のためにポビドンヨード溶液を適用する。
- マウスがつま先のつまみによって完全に麻酔をかけられていることを確認します。
- 頸静脈調製(5-10分、顕微鏡下で実施)
- 右鎖骨の上に首の右側に0.5cmの横方向の鎖骨上皮膚切開を行う。
- 鈍い顕微手術用ピンセットを使用して結合組織と脂肪を分離し、外頸静脈を露出させます。脂肪中の小さな血管を引き裂かないでください。
- 胸筋の近くに、少なくとも5mmの血管を隔離する。
- 曲がったマイクロピンセットを使用して静脈の下の組織を鈍く解剖し、6-0合字の2-3を通過する。
注:関心のある領域に側枝が特定されている場合は、合字を側枝の尾側になるように挿入するか、側枝を分離して6-0の合字で結束することによって恒久的に結紮する必要があります。 - 合字を入れて、サイトに生理食塩水を一滴加えます。
- ボタンの埋め込み(5-7分、顕微鏡なしで実施)
- マウスをひっくり返して、臥位に置きます。つま先のピンチで麻酔の深さを確認し、剃毛された領域を消毒するためにポビドンヨード溶液を塗布する。
- 中脊髄線と右肩甲骨線の間にメスを入れて、背中上部に1cmの矢状切開をします。
- 鈍い湾曲したはさみを使用して、鈍い解剖によって切開部位の周りのVASのサイズよりわずかに大きい円形のポケットを作ります。
- 鈍い湾曲したはさみを使って、はさみをわずかに開き、開いたはさみを引っ張り出し、さらに押し込むようにして、右肩の上を首の腹側切開部に向かって頭蓋にトンネルを掘ります。
メモ: この手順では、マウスの左側をオンにできます。 - トンネルが腹側切開部に到達したら、腹側から背側切開部までの外科用クランプを通過する。
- カテーテルの3Fr端をクランプに取り付け、カテーテルをトンネルを通して引っ張って、腹側頸部切開部から出、VASが背側切開部で所定の位置に来るようにします。
- VASの外科用フェルト椎間板を背中の切開部の皮下に挿入する。
- カテーテルのクランプを外し、カルシウムとマグネシウムを含まない生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS-/-)で洗い流し、ハンドリングツールのフォークエンドを使用して保護アルミニウムキャップを取り外して開存性を確認し、磁気端を使用してボタンを保持し、液体が1Fr端から漏れるまで対応するインジェクタに取り付けられた1mLシリンジで注入します。
注:カテーテルフラッシングは、代わりにステップ2.1で実施することができます。 - ポケットの中のボタンを尾状に押し、VASのフランジの下にあるVASのフェルトディスクの上に皮膚を閉じ、少なくとも2つの4-0中断縫合糸を頭蓋内に閉じます。
メモ: ボタンの周りのスキンに張力がないことを確認します。
- 静脈カテーテル検査(7-10分、顕微鏡下で実施)
- マウスを仰臥位に戻して、つま先のつまみで麻酔の深さを確認し、切断部位に生理食塩水を1滴加えます。
- カテーテルと頸静脈の周りの最初の結紮をできるだけ頭蓋方向に2〜3ノットで結び、静脈を滑らかにし、カテーテルを外側に固定します。第2の結紮を胸筋にできるだけ近づける。
- カテーテルを必要な長さに短くし、カテーテルの約3〜5mmが静脈内になるように、マイクロハサミで斜めの角度で切断して鋭い端を作成します。
- 固定された頭蓋合字を引っ張り、針を静脈に平行に押し込むことによって、生理食塩水で満たされた1mLシリンジに取り付けられた27G針を使用して静脈に穴を開ける。
メモ:逆流による血液が静脈から漏れた場合は、綿棒を使用して出血が止まるまで圧力をかけます。 - 同様に、固定された頭蓋合字を引っ張り、曲がったピンセットを使用してカテーテルを静脈にスライドさせて、カテーテルを静脈に挿入します。カテーテルが静脈に揃うまでカテーテルを押します。
- カテーテルが静脈に挿入されている領域に2〜3ノットで2番目の結紮を結び、血液漏れがないことを確認します。第3の結紮およびいくつかの局所脂肪組織は、カテーテルをさらに固定するために使用され得る。
- 両方の合字の余分な端をマイクロハサミで切り取り、生理食塩水を加えます。
- 4-0吸収性の中断された縫合糸で皮膚を閉じる。
- マウスの生理食塩水中に10%グルコースをマウス皮下10μL/gで注射する。
- ハンドリングツールのフォークエンドを使用して保護アルミニウムキャップを取り外し、次に磁気端を使用してボタンを押したまま、インジェクタに取り付けられた1mLシリンジで注入して、所望の量の阻害剤またはPBS /生理食塩水をマウスに注入する。
メモ:注射前に液体が一滴出るまでプランジャーを押して、注射シリンジに空気や気泡がないことを確認してください。注射器付きのシリンジをVASから外しながらプランジャーに陽圧を維持し、血液をカテーテル先端に引き込み、カテーテル閉塞を引き起こすのを防ぎます。 - 閉じた創傷にポビドンヨード創傷スプレーを塗布し、マウスが加熱ランプの下で意識を回復できるようにしてから、手術後3日間、7.5mgのピリトラミド(拡張疼痛管理用)および20mLの飲料水中の5%グルコース20mLをケージに戻す。
- 痛みや苦痛の兆候がないか1日に数回マウスをチェックしてください。
- 毎日の注射(<5分)
- 毎日の注射では、マウスが意識を失い、呼吸数が遅くなるまで、2L /minO2 と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れ、ステップ2.12.10のように注射する。注射後の腫れの兆候がないか首をチェックし、カテーテルが静脈に挿入されなくなったことを示します。また、カテーテルが閉塞している場合、注射は不可能であることに注意してください。
注:10 μL/gのマウス体重1日あたり1倍の注射は、マウスによる忍容性が良好である。
- 毎日の注射では、マウスが意識を失い、呼吸数が遅くなるまで、2L /minO2 と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れ、ステップ2.12.10のように注射する。注射後の腫れの兆候がないか首をチェックし、カテーテルが静脈に挿入されなくなったことを示します。また、カテーテルが閉塞している場合、注射は不可能であることに注意してください。
3.3D超音波
- 超音波イメージングシステム、加熱テーブル、およびゲルウォーマーを準備し、トランスデューサをシステムに取り付け、横方向の位置(すなわち、マウス脊椎に垂直)でステージの上にセットアップする。
- 超音波ソフトウェアを使用して、ゲインが30dB、画像深度が9.0mm、画像幅が8.08mmになるように設定を調整します。
- 無意識になるまで、 2 L / minのO2と混合した3%〜4%のイソフルランでマウスを麻酔室に入れます。マウスを仰臥位で加熱したテーブル(37°C)に移動し、鼻錐を通してイソフルラン麻酔を1.8%〜2%に維持する。
- 両目に目滑剤を塗布して乾燥を防ぎます。
- マウスの腹部の毛皮を剃る。必要に応じて脱毛クリームを1分間塗布し、湿ったガーゼで拭き取ってきれいにします。
- ステージ上の4つの心電図(ECG)電極のそれぞれに電極ゲルを一滴加え、マウスの四肢をそれらにテープで留めます。
- 温かい超音波ゲルをマウスの腹部に広げ、送信機を下げて動物と接触させます。
- 大動脈を円形の高速脈動血管として識別する。
注:下大静脈(IVC)は大動脈の隣にあり、プローブがしっかりと押さえられていると、大動脈が安定したままIVCが圧縮されます。分析された血管がIVCではなく大動脈であるという確認は、65°の角度を有する脈波ドップラー(PWモード)を使用して得ることができる。大動脈は高い脈波速度を有するであろう。 - 左腎動脈の位置を特定し、関心領域(すなわち、腎上大動脈)に干渉がないことを確認するために、頭蓋内最大12mmまで手動で領域を調査する。左腎動脈に戻り、プローブを左腎動脈から頭蓋方向に6mmにセットします。
注:3D超音波は、原点から尾方向に半分(6mm)から始まり、指定された長さ(12mm)まで頭蓋方向に指定された長さ(すなわち、12mm)を記録します。干渉のトラブルシューティング手順には、探触子をわずかに押し下げる、探触子を持ち上げてから再度下げる、超音波ゲルをさらに塗布する、ステージの角度を傾けることが含まれます。 - 3D超音波取得
- 呼吸ゲーティングを25%の遅延、50%のウィンドウ、ECGトリガー(T1)を50ミリ秒(大動脈のピーク収縮期拡張を記録するため)に設定します。
注:呼吸ゲーティングは、呼吸数と運動アーチファクトが確実に除去されるように努力に基づいて、各動物に最適化することができます。 - 3D オプションから、スキャン距離を 11.96 mm に設定し、ステップサイズを 0.076 mm に設定すると、157 フレームになります。
- プログラムは自動的に約1〜2分で157フレームを取得します。スクロールして画質を確認し、サブパーの場合は繰り返してから、画像を保存します。
- 呼吸ゲーティングを25%の遅延、50%のウィンドウ、ECGトリガー(T1)を50ミリ秒(大動脈のピーク収縮期拡張を記録するため)に設定します。
- 2D直径取得
- 呼吸ゲーティングとECGトリガーをオフにし、上腎大動脈の12mmストレッチで最大の直径を持つ領域を手動で見つけます。
- Bモード画像16を取得する。
- さらに、探触子を動かさずに、同じサイトでシステムの標準設定でECGゲートキロヘルツ可視化(EKV)画像を取得します。
- スキャンの終了
- 腹部から超音波ゲルを拭き取り、マウスをケージに戻します。マウスが完全に回復するまでマウスを監視します。
4. 超音波分析
- ボリューム分析
- 解析ソフトウェアで 3D モード画像を開き、[ 画像処理 ] メニューの [3D に読み込み] を押すと、157 個の 2D フレームが 3D 画像 (キューブ) にコンパイルされます。
- 体積測定メニューで、「平行法と回転法」を選択すると、3D イメージが 1 つのペインに表示されます。
- [ ボリューム] で [ スタート] キーを押し、クリックして最初の点を追加し、カーソルを大動脈の周囲に移動して右クリックして輪郭を完成させて、大動脈の内壁の周りに最初の輪郭を描画します。
- 9 ~ 10 フレーム(0.75 ~ 1 mm)をスキップし、同じ方法で別の輪郭を描きます。最後のフレームに達するまで、これらの手順を繰り返します。これにより、16-17の輪郭が生まれます。
メモ: 12 mm を超える正しいボリュームを計算するには、最初と最後のフレームに輪郭を描く必要があります。 - メニューから最初の輪郭を選択し、「 絞り込み」を選択します。これにより、エッジ検出アルゴリズムが開始され、ラインが容器壁に密接にフィットします。輪郭上の点を新しい位置にドラッグして移動し、輪郭が大動脈の内壁の端に正確に並ぶようにします。
注:Ang-IIモデルでは、壁内血栓が存在する可能性があります。これはこのモデルの一般的な特徴であるため、体積測定には血栓を含める必要があります。 - すべての輪郭を微調整し、「 終了」(Finish) を押して解析を保存します。計算されたボリュームが左下隅に表示されます。
- 直径解析
メモ: 直径の測定は、内壁から内壁、外壁、または内壁から外壁まで行うことができますが、すべての測定で一貫している必要があります。しかし、Ang-IIモデルでは、壁内血栓が存在する可能性があり、これは分析に含めるべきである。- 3Dモード画像から:157フレームを評価し、目視検査によって最大直径を特定します。次に、 測定 メニューから 「線形」 を選択し、大動脈に複数の線を引いて最大直径を決定します。
- BモードまたはEKV(ECGゲートキロヘルツビジュアライゼーション)画像から:シネループで、目視検査によって大動脈の最大膨張(収縮期)を特定します。次に、 測定 メニューから 「線形」 を選択し、大動脈に複数の線を引いて最大直径を決定します。
注:ECGは心周期を決定するために使用することができますが、視覚的な識別は正確な結果をもたらします。
Representative Results
代表的な結果は、ベースライン、8日目、および27日目に超音波によってモニターされた腎上動脈瘤の発症および進行を示す(図1A)。図1Aの27日目大動脈のトリクローム染色(図1B)は、壁郭清および壁内血栓を伴う形成された動脈瘤の形態をさらに示す。大動脈容積(mm3)を12mm14のストレッチにわたって測定し、EKV画像から最大大動脈径を追加的に測定した。ベースラインから8日目までの125%の体積増加の閾値が、初期動脈瘤発症を定義するために設定された。2年間(2020-2021年、n = 157)にわたって収集されたデータに基づいて、このカットオフに従ってAAAを形成できなかった動物はわずか9%でした。しかし、マウスの35%が9日目にカテーテル移植前に大動脈破裂(胸部または腹部)を経験したため、AAA疾患が確立された残りの動物の合計56%が治療群に層別化されることができました(図1C)。注目すべきは、私たちの歴史的なPBSコントロール(n = 21)の中で、動脈瘤はさまざまな程度に発達しました(範囲:128%-314%、8日目のSD大動脈容積増加は199%±55%を意味します)。重要なことに、初期拡張とさらなる疾患進行との間には逆の関係が観察された、すなわち、進行の速い動脈瘤の55%(8日目に>200%の体積成長)は27日目までさらに進行しなかったが、他の動脈瘤の80%(8日目の>125%および<200%の体積成長)は実験の終わりまで拡大し続けた(図1D)。
最近報告された14,17のように、記載された方法は、例えば、確立されたAAAの進行を遮断する際のヒストンシトルリン化阻害剤(GSK484、好中球細胞外トラップ形成の阻害に対する)の治療効果を文書化するために、首尾よく確立され、検証され、および実施されている。ApoE欠損マウスは、皮下移植された浸透圧ポンプにより、28日間にわたってAng-IIを1000ng/kg/minで投与した。動物を、8日目に測定された大動脈容積に基づいてGSK484(0.2μg/g/日)またはPBS処置に1:1で層別化し、9日目に頸静脈カテーテル法処置を受けた。薬物注射は、研究17の終わりまで、マウス体重10μL/gの容量で毎日実施された。図2は、例示的な(n = 2/グループ)超音波結果(絶対および相対体積または直径膨張の経時変化)を示し、GSK484処置がAAA進行を阻害し、動脈瘤が対照マウスにおいて拡大し続けたことを明らかにした。
図1:3D超音波で検出されたAng-IIマウスモデルにおけるAAA形成と進行 (A)Ang-IIポンプ移植後ベースライン(BL)、8日目(d8)、および27日目(d27)に3D超音波で腎上大動脈をモニターした。体積は、3D再構成画像に基づいて、上腎大動脈の12mmストレッチ(157フレーム)にわたって測定された。最大大動脈径はEKV画像から求めた。(b)マウス屠殺後27日目の大動脈の横切片のトリクローム染色及び臓器採取。大動脈解離の存在はL1/L2(内腔1および内腔2)で示され、壁内血栓は A および Bにおいて*で示される。(C)2年間に亘って収集されたデータセット(n=157)から8日目のAAA(>BLからの大動脈容積増加率)および最初の9日以内(胸部または腹部)の大動脈破裂の発生率。(d)PBS対照処置マウスにおける動脈瘤の初期速期形成(>BLから8日目までの大動脈容積増加>200%)対中程度に成長(<125%および200%大動脈容積増殖)の8日目から27日目までの進行頻度(n=21)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血管アクセスボタンを介したGSK484またはPBSの静脈内注射によるAng−IIモデルにおけるAAA進行を遮断するためのヒストンシトルリン化の阻害からの例示的な結果。(B)ベースラインから大動脈容積増加量を算出した(BL=100%)。(C)EKV画像から求めた最大大動脈径。(d)BL. GSK484データから大動脈径成長を計算し、以前に発表された研究から抽出した17。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
Ang-IIモデルは、その低い技術的要求およびヒト疾患3,6に似た特定の特徴のために、AAAの最も一般的に使用されるマウスモデルの1つである。手術時間は1匹あたり約10分であり、皮下ポケットが十分に広く、切開部位から離れて動物の背中に低く置かれている場合、創傷治癒を妨げないように、皮下ポンプ移植はマウスによって十分に許容される。皮膚がポンプの周囲にきつく締まっていると、組織の刺激が起こり、炎症やかさぶたを引き起こし、浸透圧によってポンプの放出メカニズムを潜在的に破壊する可能性があります。動物の犠牲時にポンプに残っていたAng-IIの量を測定すると、Ang-IIが28日間にわたって正常に放出されたかどうかについての洞察が得られます。
Ang-IIモデルは、大動脈瘤と解剖の進行を研究するのに適しており、両方の人間の特徴と類似しているため、最近提案されています6。重要なことに、大動脈拡張をブロックし、リモデリングに影響を与えるために薬物候補を試験することは、現在の臨床的需要と一致するであろう。我々の実験環境では、マウスの絶対大動脈サイズの自然な変動を説明するベースラインに関連して、8日目の125%の体積増加に基づいて、治療開始前に動脈瘤形成のカットオフが定義された。閾値および時点は、組織学における大動脈壁破壊を確認した初期経時変化(データは示さず)に由来し、カテーテル移植前に35%の破裂および56%の観察されたAAAをもたらした。確立された疾患の最小閾値が研究包含のために適用されたが、その後、高い程度の初期大動脈拡張も実験適用性を制限する可能性があることが観察された。8日目までに>200%の体積に急速に進行した動脈瘤は、症例の55%でそのサイズを超えてさらに成長しなかった(図1D)。これは、治療の真の効果を隠す可能性があるため、実験計画およびサンプルサイズの計算中に考慮する必要があります。このモデルの別の側面は、頻繁な大動脈破裂(胸部または腹部)であり、20%〜40%の割合で、主にAng-IIポンプ移植後最初の10日以内に起こる3,18,19。したがって、治療開始を9日目に選択することにより、高い割合の確立された動脈瘤が達成され、頸静脈カテーテル検査は、本質的に実験の終わりまで生存すると予想されるマウスに対して実施された(我々の歴史的対照群の3/24マウスのみが9日目以降に破裂した)、したがって、時間、労力を節約し、 とコスト。
重篤な状態を構成する大動脈破裂とは別に、血管アクセスボタンと浸透圧ポンプを備えたカテーテルの同時移植はマウスによって十分に許容され、手術からの回復後の可動性または行動に顕著な影響はなかった。頸静脈カテーテル法処置は、訓練を受けた研究者のために約30分かかるべきである。(イソフルラン)麻酔への曝露期間は最小限に抑えるべきであり、動物の呼吸数は呼吸抑制を防ぐために注意深く監視されなければならず、これは解決されなければ致命的な結果につながる可能性がある20。カテーテル挿入のために頸静脈を穿刺した後の失血(大口の場合は動物の死につながる)は、頸静脈が頭蓋に適切に結紮されていないか、血管の孤立した領域に供給される側枝が遮断されていない場合に潜在的に起こり得る。その場合、血液漏れが遅くなるか止まるまで綿棒による圧力を穿刺部位に塗布し、カテーテルの挿入と結紮をできるだけ早く行う必要があります。コラーゲン創傷被覆材の小さな小片は、止血を助けるために一時的に利用され得る。
カテーテルの開存性は、カテーテルが静脈またはアクセスボタンから切断されると、薬物が皮下空間に漏れる不適切な薬物送達をもたらすため、最も重要な要因の1つです。カテーテルと金属コネクタの間に最低3mmの重なりがあるという製造業者の勧告に従って、このモデル(2020-2021、n = 73)では、ボタン側のカテーテル切断の1つのケース(ボタンの切開部位から漏れた注入された液体によって示される)のみが記録され、創傷を開き、手術で接続を再確立することによって固定された。さらに、私たちの歴史的なPBS対照群(2/21)では、カテーテル閉塞(注射が不可能になる)、静脈からのカテーテル切断(注射中の首の明らかな腫れによって示される)、または創傷治癒合併症のいずれかのために、約10%のカテーテル開存性障害率が経験されました。これらの問題は、自傷行為、すなわちマウスの傷や咬傷に関連している可能性があります。特に、創傷治癒を妨げる薬物治療は、失敗率を高める可能性がある。開存率を改善するためのトラブルシューティング手順には、静脈に挿入されるカテーテルの長さを長くすること、結紮がカテーテルおよび静脈の周りにしっかりと結び付けられていることを確認すること、および注入中にステップ2.12.10に記載されているように、製造業者の推奨に従って陽圧技術を適用することが含まれる。カテーテル開存性は、さらに、動物の屠殺時に、顕微鏡下での解剖および目視検査によって検証されるべきである。注目すべきは、注射された薬物溶液の1日の量を慎重に考慮する必要があることです。血漿量が血圧を調節するので、注入量はAAA拡張に影響を与える可能性があり、したがって、対照動物はキャリア容積で偽の手順を受ける必要がある。私たちの経験(および未発表の観察結果)に基づいて、1日あたり最大250μLのPBSの許容性は良好であるようです。最後に、ポンプ移植と同様に、移植された血管アクセスボタンの周囲に皮膚刺激が生じ得る。失活組織または壊死組織を伴う炎症が観察される場合、創傷デブリードマンは、生存不能組織を除去することによって実施されるべきであり(壊死組織はしばしば創傷から自然に分離する)、必要に応じて皮膚を縫合すべきである。炎症や壊死が広範囲に及ぶ場合、動物の福祉と人道的なエンドポイントはガイドラインに従って考慮する必要があります。
浸透圧ポンプおよび/またはVASの単一および二重背部移植は、超音波信号を妨げず、超音波ステージ上の適切な位置にマウスを固定することもしなかった。体積測定のために大動脈の3D画像をレンダリングするために12mmを超える157フレームの自動取得は、大動脈が関心領域にわたる干渉から明確であることを確認するだけで済む、簡単で迅速な手順14である。この文脈における1つの落とし穴は、干渉の画像をクリアしようとしている間にトランスデューサに過度の圧力をかけることであり、腹部大動脈の頭蓋端の画像が記録されたときに呼吸数が肋骨の圧迫によって影響を受ける場合、自動測定が中断される可能性がある。直径は、伝統的に、超音波分析を行いながら、オペレータが手動で最大直径の領域を検索することによって、Bモードを使用して取得された画像で測定される。Bモード画像の進歩はEKV画像であり、小さな大動脈運動を解決して、脈動する大動脈の高品質で遅くなった画像を生成することができます。さらに、最大大動脈径は、取得した3Dフレームから決定することができ、157枚の画像は、収縮期に撮影された大動脈の包括的な概要を提供する(設定されたECGトリガーによる)。
結論として、提示されたコンパイルされたプロトコルは、Ang−II誘導AAAのマウスモデルにおける静脈内薬物投与および3D超音波による大動脈サイズモニタリングのための信頼性が高く再現可能なワークフローを提供する。モニタリングと操作の時間点は特定のニーズに合わせて調整することができ、頸静脈カテーテル検査は、静脈注射による特定の物質の送達を必要とする実験セットアップに対して別々に行うことができます。VASは、凝固を防ぐためにカテーテルロック溶液が使用される場合、代わりに反復採血に使用することができる。記載された3D超音波手順は、AAAのエラスターゼまたはCaCl2ベースのマウスモデルにおける急性侮辱時に動脈瘤が発症する腎大動脈を測定するために適合され得る。3D超音波取得は、罹患した大動脈領域および動脈瘤形態の概要を示すという利点を有するが、画像取得はより時間がかかり、したがって、より費用がかかる可能性がある。認識されるべきプロトコルの別の制限は、静脈内注射のために動物を短時間麻酔をかける必要性であるが、腹腔内投与は一般に意識のあるマウスに対して行われる。
Disclosures
著者らは開示していない。
Acknowledgments
動物実験へのご協力をいただいたポデッサー教授とエルマイヤー教授のチーム(ウィーン医科大学生物医学研究部・実験動物飼育中核施設)に感謝いたします。AAAトリクローム染色は、モニカ・ワイスとピーター・ペッツェルバウアー教授(ウィーン医科大学皮膚科)によって親切に行われました。この研究はオーストリア科学基金[SFBプロジェクトF 5409-B21]の支援を受けた。マーク・ベイリーは、ブリティッシュ・ハート財団[FS/18/12/33270]の支援を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
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