Summary
Detta protokoll beskriver den på varandra följande implantationen av en osmotisk pump för att inducera bukaortaaneurysm genom angiotensin II-frisättning i apolipoprotein E (ApoE) bristfälliga möss och av en vaskulär åtkomstport med en halsvenkateter för upprepad läkemedelsbehandling. Övervakning av aneurysmutveckling med 3D-ultraljud utförs effektivt trots dorsala implantat.
Abstract
Eftersom farmaceutiska behandlingsalternativ saknas i den kliniska hanteringen av bukaortaaneurysm (AAA), tillämpas djurmodeller, särskilt musmodeller, för att öka förståelsen av sjukdomspatogenesen och för att identifiera potentiella terapeutiska mål. Att testa nya läkemedelskandidater för att blockera AAA-tillväxt i dessa modeller kräver i allmänhet upprepad läkemedelsadministration under experimentets tidsförlopp. Här beskriver vi ett sammanställt protokoll för AAA-induktion, införande av en intravenös kateter för att underlätta långvarig behandling och seriell AAA-övervakning med 3D-ultraljud. Aneurysmer induceras hos apolipoprotein E (ApoE) bristfälliga möss genom att angiotensin II frisätts under 28 dagar från osmotiska minipumpar implanterade subkutant i musens baksida. Därefter utförs det kirurgiska ingreppet för extern halsvenkateterisering för att möjliggöra daglig intravenös läkemedelsbehandling eller upprepad blodprovtagning via en subkutan vaskulär åtkomstknapp. Trots de två dorsala implantaten underlättas övervakningen av AAA-utvecklingen lätt genom sekventiell halvautomatisk 3D-ultraljudsanalys, vilket ger omfattande information om expansionen av aortadiameter och volym och om aneurysmmorfologi, vilket illustreras av experimentella exempel.
Introduction
En bukaortaaneurysm (AAA) är en patologisk dilatation av ett kärl på grund av inflammatoriska och vävnadsförstörande processer i aortaväggen som i slutändan kan leda till bristning och patientdöd. Trots betydande framsteg inom kirurgisk AAA-reparation saknas hittills en konservativ läkemedelsbehandling för att blockera utvecklingen av aneurysmexpansion och potentiellt minska risken för bristning. Djurmodeller har utvecklats för att belysa utlösare och medlare av sjukdomen och för att testa nya behandlingsmetoder. Musmodeller av AAA används i stor utsträckning och täcker de olika observationerna från mänsklig vävnad. På grund av deras patomekanistiska skillnader tillämpas ofta mer än en modell för att undersöka molekylernas/vägarnas särskilda funktion eller effekten av potentiella terapeutiska läkemedel 1,2. Bland de vanligaste modellerna av AAA-induktion är angiotensin-II (Ang-II) administrering i apolipoprotein E-bristfälliga (ApoE KO) möss3, som har mer kronisk patogenes jämfört med modeller som förlitar sig på aneurysmbildning från en akut förolämpning mot aortaväggen 4,5. Således verkar Ang-II-modellen särskilt lämpad för övervakning av sjukdomsprogression och visade sig nyligen likna mänsklig AAA-sjukdom när det gäller metaboliska och inflammatoriska svar6. I synnerhet har Ang-II-modellen inte bara AAA-utveckling utan även thoraxaneurysmbildning, liksom aortadissektion med intramural trombbildning.
Behandlingar som syftar till att rikta in sig på utvecklingen av redan etablerad AAA snarare än att förhindra initiering av sjukdomen kan ha högre translationellt värde eftersom patienter uppvisar ett befintligt tillstånd som kräver behandling 7,8. För en jämförbar experimentell design måste aortastorleken övervakas före och efter AAA-induktion för att definiera en tröskel för sjukdomsutveckling och potentiellt stratifiera möss i behandlingsgrupper.
Sättet att administrera läkemedel beror på upptaget och stabiliteten hos respektive substans. Intraperitoneala (i.p.) injektioner används oftast på grund av deras användarvänlighet, som inte kräver bedövningsmedel och bristen på begränsningar i injektionsvolymen9. Farmakokinetiken måste dock beaktas vid val av administreringsväg, eftersom substanser som administreras i.p. huvudsakligen absorberas genom leverportalcirkulationen och kan genomgå levermetabolism innan de når cirkulationen, vilket kan resultera i varierande plasmakoncentrationer beroende på första passeffekten10. Intravenös (i.v.) injektion ger den högsta biotillgängligheten av ämnen, och utmaningen med repetitiv i.v. åtkomst kan kringgås genom användning av katetrar och vaskulära åtkomstportar för daglig administrering11,12,13. Med avseende på AAA-inställningen underlättar läkemedelsdistribution i omlopp direkt aneurysmexponering vid definierade koncentrationer.
Här beskriver vi ett arbetsflöde för att inducera AAA i Ang-II-musmodellen via subkutan implantation av en osmotisk pump, för daglig i.v. läkemedelsbehandling via en vaskulär åtkomstport ansluten till en kateter införd i den yttre halsvenen, samt för övervakning av aneurysmstorlek via 3D-ultraljud14 trots närvaron av två dorsala implantat.
Protocol
Djurförsök godkändes av den lokala etikkommittén och det österrikiska vetenskapsministeriet (BMWFW-66.009/0355-WF/V/3b/2016), i enlighet med det europeiska direktivet 2010/63/EU om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och den österrikiska djurförsökslagen 2012. Humana effektmått fastställdes enligt följande: förlust av ≥15% kroppsvikt, undvikande av mat- och / eller vattenintag, minskad aktivitet (hypokinesi) eller dyskinesi, eller långvarig skakning, repor, ansträngd andning eller böjd hållning trots smärta / symptomhantering. Vid behov avlivas ett djur under djupbedövning, dvs. en överdoscocktail av ketamin (ca 100 mg/kg) och xylazin (ca 5 mg/kg), eller genom cervikal dislokation. För kirurgiska ingrepp används aseptisk teknik och sterila/rena handskar genomgående.
1. Pumpimplantation
- Anestesi
- Håll ApoE-bristfälliga möss (B6.129P2-Apoetm1Unc / J) på en normal diet och inkludera helst 12-14 veckor gamla handjur i experimenten för att representera den manliga dominansen vid mänsklig sjukdom3.
- 1 dag före operationen (d-1, pre-OP), förbered och fyll de osmotiska pumparna med önskad koncentration av angiotensin II enligt musens vikt enligt tillverkarens protokoll och inkubera pumparna i saltlösning vid 37 °C över natten15.
Exempel: För en 25 g mus som använder osmotiska pumpar (se materialförteckningen) med en leveranshastighet på 1000 ng/kg/min och en pumphastighet på 0,25 μl/h i 28 dagar, löses 1,8 mg Ang-II upp i 300 μl saltlösning (6000 ng/μl koncentration för att leverera 1500 ng/h Ang-II). Ladda lösningen med den trubbiga påfyllningsnålen i pumpen och sätt sedan in flödesmoderatorn för att stänga pumpen. - Placera musen i anestesikammaren vid 3%-4% isofluran blandat med 2 L/minO2 tills det är medvetslöst. Flytta musen till ett uppvärmt bord (37 °C) i ett benäget läge och håll isoflurananestesi vid 1,8%-2% genom en näskon.
- Applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen för att förhindra torrhet.
- Injicera musen med 2,5 % buprenorfin i saltlösning vid 10 μl/g mus subkutant och kontrollera anestesidjupet med en nypa på tån.
- Raka ett litet område på musens övre vänstra sida över axelbladet. Applicera 10% (w / v) povidon-jodlösning för desinfektion av det rakade området.
- Pumpinsättning (5-7 min, utförs utan mikroskop)
- Kontrollera att musen är helt bedövad av tåklämma och gör ett 1 cm tvärgående snitt i huden på övre delen av ryggen med en skalpell mellan midspinal och vänster scapular linje.
- Håll upp huden med pincett och använd en trubbig, böjd sax för att göra en subkutan ficka genom att trycka mot vänster bakben. Öppna saxen, dra ut den öppnade saxen ur snittet och upprepa för att bredda fickan.
- Sätt försiktigt in pumpen i fickan med flödesmoderatorn mot svansen (för att minimera potentiell störning av Ang-II-frisättning av snittstället).
OBS: Fickan ska inte bara vara tillräckligt bred för pumpinsättningen utan också för att huden inte ska vara tät runt pumpen, och det bör finnas minst 5 mm mellan pumpen och snittstället för att möjliggöra optimal sårläkning. - Stäng såret med 4-0 absorberbara avbrutna suturer.
- Injicera musen med 10% glukos i saltlösning vid 10 μl/g mus subkutant.
- Applicera povidon-jod sårspray på det slutna såret och låt musen återställa medvetandet under en värmelampa, sätt sedan tillbaka den till buret med 7,5 mg piritramid (för förlängd smärtlindring) och 20 ml 5% glukos i 200 ml dricksvatten i 3 dagar efter operationen.
- Kontrollera mössen flera gånger per dag för tecken på smärta eller nöd.
OBS: Eftersom aortabrott uppträder med en hastighet på 20%-40% och övervägande inom de första 3-10 dagarna efter operationen, måste risken för långvarig svår smärta eller nöd minimeras genom frekvent djurövervakning. De viktigaste indikationerna för överhängande bristning inkluderar: separation från gruppen, böjd hållning, minskad rörlighet (i utsträckning av bakbensförlamning) och minskad eller icke-lyhördhet under hantering.
2. Kateterisering av halsvenen
OBS: Detta kirurgiska ingrepp kräver ett mikroskop med 8x-10x förstoring.
- Använd det vaskulära åtkomstsystemet (se materialtabellen), förbered katetern genom att skära 3Fr-sidan till önskad längd (~ 5-7 mm före silikonankaret) och tryck katetern över 22 G-metallkontakten i det vaskulära åtkomstsystemet (VAS) med minst 3 mm överlappning. Placera aluminiumlocket på knappen för att skydda porten.
- Förbered 1-1,5 cm långa 6-0 silkeligaturer.
- Placera musen i anestesikammaren vid 3%-4% isofluran blandat med 2 L/minO2 tills det är medvetslöst.
- Flytta musen till ett uppvärmt bord (37 °C) i ryggläge och håll isoflurananestesi på 1,8%-2% genom en näskon.
- Applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen för att förhindra torrhet.
- Injicera musen med 2,5 % buprenorfin i saltlösning vid 10 μl/g mus subkutant.
- Raka pälsen från höger sida av nacken på den ventrala sidan och på höger sida av övre delen av ryggen (vänster sida kommer att ha den implanterade osmotiska pumpen).
- Applicera povidon-jodlösningen för desinfektion av det rakade området.
- Kontrollera att musen är helt sövd av tåklämma.
- Jugulär venberedning (5-10 min, utförd under mikroskopet)
- Gör ett 0,5 cm tvärgående supraklavikulärt hudsnitt på höger sida av nacken över höger nyckelben.
- Använd trubbig mikrokirurgisk pincett för att separera bindväven och fettet och exponera den yttre halsvenen. Undvik att riva sönder små blodkärl i fettet.
- Isolera minst 5 mm av kärlet, nära bröstmusklerna.
- Trubbig dissekera vävnad under venen med böjd mikropincett och passera genom 2-3 av 6-0-ligaturerna.
OBS: Om några sidogrenar identifieras i intresseområdet, ska antingen ligaturen sättas in för att vara kaudal till sidogrenen eller sidogrenen ska ledas permanent genom att isolera och binda av med en 6-0 ligatur. - Stoppa i ligaturerna och tillsätt en droppe saltlösning på platsen.
- Knappimplantation (5-7 min, utförs utan mikroskop)
- Vänd musen och placera den i benäget läge; verifiera anestesidjupet med en tåknippa och applicera povidon-jodlösningen för att desinficera det rakade området.
- Gör ett 1 cm sagittalt snitt på övre delen av ryggen med en skalpell mellan midspinal och höger scapular linjer.
- Använd trubbiga böjda saxar för att göra en cirkulär ficka bara något större än storleken på VAS runt snittstället genom trubbig dissektion.
- Använd den trubbiga böjda saxen för att tunnla kranialt över höger axel mot det ventrala snittet i nacken genom att öppna saxen något, sedan dra ut den öppnade saxen och upprepa åtgärden när den skjuts längre in.
OBS: Musen kan vridas på vänster sida för detta steg. - När tunneln har nått det ventrala snittet, passera genom kirurgiska klämmor från ventral till dorsal snitt.
- Fäst 3Fr-änden av katetern på klämman och dra katetern genom tunneln så att den är ute ur det ventrala nacksnittet och VAS är på plats vid ryggsnittet.
- Sätt in VAS: s kirurgiska filtskiva subkutant vid snittet på baksidan.
- Lossa katetern och spola med saltlösning eller fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium (PBS-/-), kontrollera om det är patency genom att använda gaffeländen på hanteringsverktyget för att ta bort det skyddande aluminiumlocket och använd sedan magnetänden för att hålla knappen och injicera med en 1 ml spruta fäst vid motsvarande injektor tills vätskan läcker från 1Fr-änden.
OBS: Kateterspolning kan alternativt utföras i steg 2.1. - Tryck på knappen kaudalt i fickan och stäng huden över filtskivan på VAS, under VAS-flänsen, med minst två 4-0 avbrutna suturer kraniellt.
OBS: Se till att det inte finns någon spänning på huden runt knappen.
- Venkateterisering (7-10 min, utförd under mikroskopet)
- Vänd musen tillbaka till ryggläge, verifiera anestesidjupet med en tåknippa och tillsätt en droppe saltlösning till skärplatsen.
- Knyt den första ligaturen runt katetern och halsvenen med 2-3 knop så långt kranialt som möjligt för att ligera venen och förankra katetern på utsidan. Flytta den andra ligaturen så nära bröstmusklerna som möjligt.
- Förkorta katetern till önskad längd så att ~ 3-5 mm av katetern är i venen genom att klippa med mikrosax i diagonal vinkel för att skapa en skarp ände.
- Genomborra ett hål i venen med en 27 G nål fäst vid en 1 ml spruta fylld med saltlösning genom att dra i den säkrade kranialligaturen och trycka nålen parallellt med venen.
OBS: Om blod från återflöde läcker från venen, använd en bomullspinne för att applicera tryck tills blödningen slutar. - För in katetern i venen på samma sätt genom att dra i den säkrade kranialligaturen och skjuta katetern in i venen med hjälp av den böjda pincetten. Tryck på katetern tills den är i linje med venen.
- Bind den andra ligaturen över regionen där katetern sätts in i venen med 2-3 knop och kontrollera att det inte finns något blodläckage. En tredje ligatur och en del av den lokala fettvävnaden kan användas för att dessutom säkra katetern.
- Skär av den överflödiga änden av båda ligaturerna med mikrosax och tillsätt en droppe saltlösning.
- Stäng huden med 4-0 absorberbara avbrutna suturer.
- Injicera musen med 10% glukos i saltlösning vid 10 μl/g mus subkutant.
- Injicera musen med önskad volym hämmare eller PBS/saltlösning genom att använda gaffeländen på hanteringsverktyget för att ta bort det skyddande aluminiumlocket och sedan den magnetiska änden för att hålla knappen intryckt och injicera med en 1 ml spruta fäst vid injektorn.
OBS: Se till att det inte finns några luft- eller luftbubblor i injektionssprutan genom att trycka på kolven tills en droppe vätska kommer ut innan du injicerar. Håll positivt tryck på kolven medan du kopplar bort sprutan med injektorn från VAS för att förhindra att blod dras in i kateterspetsen och orsakar kateterblockering. - Applicera en povidon-jod sårspray på det slutna såret och låt musen återställa medvetandet under en värmelampa, sätt sedan tillbaka den till buret med 7,5 mg piritramid (för förlängd smärtlindring) och 20 ml 5% glukos i 200 ml dricksvatten i 3 dagar efter operationen.
- Kontrollera mössen flera gånger per dag för tecken på smärta eller nöd.
- Dagliga injektioner (<5 min)
- För daglig injektion, placera musen i anestesikammaren vid 3%-4% isofluran blandat med 2 L/min O2 tills den är medvetslös och andningsfrekvensen sänks, injicera sedan som i steg 2.12.10. Kontrollera nacken för tecken på svullnad efter injektion, vilket skulle indikera att katetern inte längre sätts in i venen. Observera också att injektion inte är möjlig om katetern är ockluderad.
OBS: En 10 μl / g musvikt 1x per dag injektion tolereras väl av mössen.
- För daglig injektion, placera musen i anestesikammaren vid 3%-4% isofluran blandat med 2 L/min O2 tills den är medvetslös och andningsfrekvensen sänks, injicera sedan som i steg 2.12.10. Kontrollera nacken för tecken på svullnad efter injektion, vilket skulle indikera att katetern inte längre sätts in i venen. Observera också att injektion inte är möjlig om katetern är ockluderad.
3.3D ultraljud
- Förbered ultraljudsavbildningssystemet, värmebordet och gelvärmaren, fäst givaren i systemet och ställ in ovanför scenen i ett tvärgående läge (dvs vinkelrätt mot musens ryggrad).
- Använd ultraljudsprogramvaran och justera inställningarna för att få 30 dB, bilddjup på 9,0 mm och bildbredd på 8,08 mm.
- Placera musen i anestesikammaren vid 3%-4% isofluran blandat med 2 L/minO2 tills det är medvetslöst. Flytta musen till ett uppvärmt bord (37 °C) i ryggläge och håll isoflurananestesi vid 1,8%-2% genom en näskotte.
- Applicera ögonsmörjmedel på båda ögonen för att förhindra torrhet.
- Raka pälsen på musens buk. Applicera hårborttagningskräm i 1 min om det behövs, torka sedan av och rengör med fuktig gasväv.
- Tillsätt en droppe elektrodgel till var och en av de fyra elektrokardiogramelektroderna (EKG) på scenen och tejpa musens extremiteter på dem.
- Sprid varm ultraljudsgel på musens buk och sänk sändaren för att ställa den i kontakt med djuret.
- Identifiera aortan som ett cirkulärt snabbt pulserande kärl.
OBS: Den underlägsna vena cava (IVC) kommer att ligga bredvid aortan, och om sonden pressas ner ordentligt kommer IVC att komprimeras medan aortan förblir stabil. Bekräftelse på att det analyserade kärlet är aorta snarare än IVC kan erhållas med hjälp av pulsvågsdopplern (PW-läge), med en vinkel på 65 °. Aortan kommer att ha en hög pulsvåghastighet. - Leta reda på den vänstra njurartären och undersök området manuellt upp till 12 mm kranialt för att säkerställa att det inte finns någon störning i intresseområdet (dvs. suprarenal aorta). Återgå till vänster njurartär och ställ sedan sonden på 6 mm kranialt från vänster njurartär.
OBS: 3D-ultraljudet registrerar den angivna längden (dvs. 12 mm) som börjar halvvägs (6 mm) kaudalt från ursprungspunkten och upp den angivna längden (12 mm) kraniellt. Felsökningssteg för störningar inkluderar att trycka ner något med givaren, lyfta och sedan sänka givaren igen, applicera mer ultraljudsgel och luta scenens vinkel. - 3D-ultraljudsförvärv
- Ställ in andningsgrinden på 25% fördröjning och ett fönster på 50% och EKG-utlösaren (T1) till 50 ms (för att registrera maximal systolisk utvidgning av aortan).
OBS: Andningsgrind kan optimeras för varje djur baserat på andningsfrekvensen och ansträngningen för att säkerställa att rörelseartefakter tas bort. - Från 3D-alternativen ställer du in skanningsavståndet till 11,96 mm med en stegstorlek på 0,076 mm, vilket resulterar i 157 ramar.
- Programmet kommer automatiskt att förvärva de 157 ramarna på cirka 1-2 minuter. Bläddra igenom för att kontrollera bildkvaliteten, upprepa om den är undermålig och spara sedan bilden.
- Ställ in andningsgrinden på 25% fördröjning och ett fönster på 50% och EKG-utlösaren (T1) till 50 ms (för att registrera maximal systolisk utvidgning av aortan).
- Förvärv av 2D-diameter
- Stäng av andningsgrinden och EKG-utlösaren och lokalisera manuellt området med den största diametern i 12 mm-sträckan av den suprarenala aortan.
- Skaffa en bild i B-läge16.
- Dessutom, utan att flytta givaren, skaffa en EKV-gated kilohertz visualization (EKV) -bild med systemets standardinställningar på samma plats.
- Avsluta skanningen
- Torka av ultraljudsgelén från buken och sätt tillbaka musen till buret. Övervaka musen tills den återhämtar sig helt.
4. Ultraljudsanalys
- Volymanalys
- Öppna 3D-lägesbilden i analysprogramvaran och tryck på Ladda till 3D, som kompilerar de 157 2D-ramarna till en 3D-bild (dvs. kub) under menyn Bildbehandling.
- I menyn Volymmätning väljer du Parallella & rotationsmetoder och sedan visar programvaran 3D-bilden i en enda ruta.
- Under Volym trycker du på Start och ritar den första konturen runt aortans innervägg genom att klicka för att lägga till den första punkten, flytta markören runt aortan och sedan högerklicka för att slutföra konturen.
- Hoppa över 9-10 ramar (0,75-1 mm) och rita sedan en annan kontur på samma sätt. Upprepa dessa steg tills den sista bildrutan har uppnåtts. Detta bör resultera i 16-17 konturer.
OBS: De första och sista ramarna måste ha konturer ritade för att rätt volym över 12 mm ska kunna beräknas. - Välj den första konturen på menyn och välj Förfina. Detta kommer att initiera kantdetekteringsalgoritmen för att nära passa linjen till kärlväggen. Flytta punkterna på konturen genom att dra dem till en ny position så att konturen exakt kantar aortans innerväggskant.
OBS: I Ang-II-modellen kan en intramural trombus vara närvarande. Eftersom detta är ett vanligt inslag i denna modell bör volymmätningen inkludera trombusen. - Förfina alla konturer och tryck på Slutför för att spara analysen. Den beräknade volymen visas i det nedre vänstra hörnet.
- Analys av diameter
OBS: Diametermätningar kan utföras inre-till-innervägg, ytter-till-yttervägg eller inre-till-yttervägg men måste vara konsekventa för alla mätningar. I Ang-II-modellen kan dock en intramural trombus förekomma, vilket bör inkluderas i analysen.- Från 3D-lägesbilden: Utvärdera de 157 bildrutorna för att identifiera den maximala diametern genom visuell inspektion. Välj sedan Linjär från menyn Mätning och rita flera linjer över aortan för att bestämma den största diametern.
- Från B-läge eller EKV (EKG-gated kilohertz visualisering) bild: I cine loop, identifiera den maximala expansionen av aorta (vid systole) genom visuell inspektion. Välj sedan Linjär från menyn Mätning och rita flera linjer över aortan för att bestämma den största diametern.
EKG kan användas för att bestämma hjärtcykeln, men visuell identifiering ger exakta resultat.
Representative Results
Representativa resultat visar utvecklingen och progressionen av de suprarenala aneurysmerna som övervakas med ultraljud vid baslinjen, dag 8 och dag 27 (figur 1A). En trikrom fläck (figur 1B) av dag 27 aorta i figur 1A illustrerar ytterligare morfologin hos den bildade aneurysmen med väggdissektion och intramural trombus. Aortavolymen (mm3) bestämdes över en sträcka av 12 mm14, och maximal aortadiameter mättes dessutom från EKV-bilderna. En tröskel på 125% volymtillväxt från baslinjen till dag 8 fastställdes för att definiera initial aneurysmutveckling. Baserat på data som samlats in under 2 år (2020-2021, n = 157) misslyckades endast 9% av djuren med att bilda en AAA enligt denna cutoff. 35% av mössen upplevde dock aortabrott (bröstkorg eller buk) före kateterimplantation på dag 9, vilket resulterade i totalt 56% av de återstående djuren med etablerad AAA-sjukdom som är mottagliga för stratifiering i behandlingsgrupper (figur 1C). Observera att bland våra historiska PBS-kontroller (n = 21) utvecklades aneurysmer i varierande grad (intervall: 128% -314%, medelvärde 199% ± 55% SD-aortavolymtillväxt vid dag 8). Viktigt var att ett omvänt förhållande observerades mellan den initiala expansionen och ytterligare sjukdomsprogression, dvs 55% av snabbt fortskridande aneurysmer (>200% volymtillväxt vid dag 8) utvecklades inte längre förrän dag 27, medan 80% av de andra aneurysmerna (>125% och <200% volymtillväxt vid dag 8) fortsatte att expandera till slutet av experimentet (Figur 1D).
Som nyligen rapporterats 14,17 har de beskrivna metoderna framgångsrikt etablerats, validerats och implementerats, t.ex. för att dokumentera den terapeutiska effekten av en histoncitrullinationshämmare (GSK484, för hämning av neutrofil extracellulär fällbildning) för att blockera utvecklingen av etablerad AAA. Apotekssjuka möss fick Ang-II vid 1000 ng/kg/min genom subkutant implanterade osmotiska pumpar under 28 dagar. Djuren stratifierades 1:1 till GSK484 (0,2 μg/g/dag) eller PBS-behandling baserat på den aortavolym som uppmättes dag 8 och genomgick kateteriseringsproceduren för halsvenen dag 9. Läkemedelsinjektioner utfördes dagligen i en volym av 10 μl/g musvikt fram till slutet av studien17. Figur 2 visar exemplifierande (n = 2/grupp) ultraljudsresultat (tidsförlopp med absolut och relativ volym eller diameterexpansion), vilket avslöjar att GSK484-behandling hämmade AAA-progression, medan aneurysmerna fortsatte att förstoras hos kontrollmöss.
Figur 1: AAA-bildning och progression i Ang-II-musmodellen som detekteras med 3D-ultraljud. (A) Den suprarenala aortan övervakades med 3D-ultraljud vid baslinjen (BL), dag 8 (d8) och dag 27 (d27) efter Ang-II-pumpimplantation. Volymen mättes över en 12 mm sträcka av den suprarenala aortan (157 bilder) baserat på en 3D-rekonstruerad bild. Den maximala aortadiametern bestämdes från EKV-bilder. (B) Trikromfläck av en tvärsektion av dag 27 aorta efter musoffer och organsamling. Närvaron av en aortadissektion indikeras av L1 / L2 (lumen 1 och lumen 2), och den intramurala trombusen betecknas med * i A och B. (C) Incidens av AAA (>125% aortavolymtillväxt från BL) vid dag 8 och aortabrott under de första 9 dagarna (bröstkorg eller buk) från en datauppsättning som samlats in under 2 år (n = 157). (D) Progressionsfrekvens från dag 8 till dag 27 av initialt snabbbildande (>200% aortavolymtillväxt från BL till dag 8) jämfört med måttligt växande (>125% och <200% aortavolymtillväxt från BL till dag 8) aneurysmer hos PBS-kontrollbehandlade möss (n = 21). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Exemplifierande resultat från hämning av histoncitrullination för att blockera AAA-progression i Ang-II-modellen genom intravenös injektion av GSK484 eller PBS via vaskulär åtkomstknapp. A) Aortavolym (mm 3) mätt över en 12 mm sträcka av den suprarenala aortan. (B) Beräknad aortavolymtillväxt från baslinjen (BL = 100%). (C) Maximal aortadiameter bestämd från EKV-bilder. (D) Beräknad tillväxt av aortadiameter från BL. GSK484-data extraherades från en tidigare publicerad studie17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Ang-II-modellen är en av de vanligaste musmodellerna av AAA på grund av dess låga tekniska krav och särskilda egenskaper som liknar mänsklig sjukdom 3,6. Operationstiden är cirka 10 min per djur, och den subkutana pumpimplantationen tolereras väl av mössen om den subkutana fickan är tillräckligt bred och placerad lågt på djurets rygg, bort från snittstället, för att inte störa sårläkning. När huden är tät runt pumpen kan vävnadsirritation uppstå, vilket kan orsaka inflammation och skabb och potentiellt störa pumpens mekanism för frisättning genom osmotiskt tryck. Att mäta volymen av Ang-II som finns kvar i pumpen vid tidpunkten för djuroffer ger insikt om huruvida Ang-II framgångsrikt släpptes under de 28 dagarna.
Ang-II-modellen har nyligen föreslagits vara väl lämpad för att studera aortaaneurysm och dissektionsprogression eftersom den uppvisar likhet med mänskliga egenskaper hos båda6. Viktigt är att testa läkemedelskandidater för att blockera aortaexpansion och påverka ombyggnad skulle matcha den nuvarande kliniska efterfrågan. I vår experimentella miljö definierades en cutoff för aneurysmbildning före behandlingsstart baserat på 125% volymtillväxt på dag 8 i förhållande till baslinjen, vilket står för den naturliga variationen i absolut aortastorlek hos möss. Tröskeln och tidpunkten härleddes från en initial tidskurs som bekräftade aortaväggförstöring i histologi (data visas inte) och resulterade i 35% brott och 56% observerade AAA före kateterimplantation. Medan en minimitröskel för etablerad sjukdom tillämpades för studieinkludering, observerades det senare att en hög grad av initial aortaexpansion också kan begränsa experimentell tillämpbarhet. Aneurysmer som utvecklades snabbt till >200% volym vid dag 8 växte inte ytterligare utöver den storleken i 55% av fallen (figur 1D). Detta måste beaktas vid experimentell design och beräkning av provstorlek, eftersom det kan maskera en behandlings verkliga effekt. En annan aspekt av denna modell är de frekventa aortabrotten (bröstkorg eller buk), som uppträder med hastigheter på 20% -40% och mestadels inom de första 10 dagarna efter Ang-II-pumpimplantation 3,18,19. Således, genom att välja behandlingsstart för att vara dag 9, uppnåddes en hög frekvens av etablerade aneurysmer, och halsvenkateteriseringen utfördes i huvudsak på möss som förväntades överleva till slutet av experimentet (endast 3/24 möss i vår historiska kontrollgrupp bröt efter dag 9), vilket bevarade tid, ansträngning, och kostnad.
Bortsett från aortabrotten, som utgör ett allvarligt tillstånd, tolererades den samtidiga implantationen av katetern med vaskulär åtkomstknapp och den osmotiska pumpen väl av mössen, utan någon märkbar effekt på rörlighet eller beteende efter återhämtning från operationen. Halsvenkateteriseringsproceduren bör ta cirka 30 minuter för utbildade forskare. Exponeringstiden för (isofluran) anestesi bör hållas till ett minimum, och djurets andningsfrekvens måste övervakas noggrant för att förhindra andningsdepression, vilket kan leda till dödlig utgång om den inte löses20. Blodförlust efter punktering av halsvenen för kateterinsättning - vilket leder till djurdöd om den är större - kan potentiellt uppstå när halsvenen inte är ordentligt ligerad kranialt eller en sidogren som matas in i kärlets isolerade område inte stängs av. I så fall bör tryck med en bomullspinne appliceras på punkteringsstället tills blodläckage saktar eller stannar, då kateterinsättningen och ligeringen ska göras så snabbt som möjligt; En liten bit av kollagensårsförbandet kan tillfälligt användas för att hjälpa till med hemostas.
Kateterpatency är en av de viktigaste faktorerna, eftersom kateterfrånkoppling från venen eller åtkomstknappen resulterar i felaktig läkemedelsleverans där läkemedlet läcker ut i det subkutana utrymmet. Efter tillverkarens rekommendation om minst 3 mm överlappning mellan katetern och metallanslutningen registrerades endast ett fall av kateterfrånkoppling vid knappsidan (indikerat av den injicerade vätskan som läckte från snittstället vid knappen) under 3 år i denna modell (2020-2021, n = 73), som fixades genom att öppna såret och återupprätta anslutningen vid operation. Dessutom upplevdes en kateterpatensvikt på cirka 10% i vår historiska PBS-kontrollgrupp (2/21) på grund av antingen kateterocklusion (vilket gör det omöjligt att injicera), kateterfrånkoppling från venen (indikeras av uppenbar svullnad i nacken under injektionen) eller sårläkningskomplikationer. Dessa problem kan vara kopplade till självförvållade skador, dvs repor eller bett i musen. I synnerhet kan läkemedelsbehandlingar som stör sårläkning höja felfrekvensen. Felsökningssteg för att förbättra patencyhastigheten inkluderar att öka längden på katetern som sätts in i venen, se till att ligaturer är tätt knutna runt katetern och venen och tillämpa övertryckstekniken enligt tillverkarens rekommendation, som beskrivs i steg 2.12.10., under injektion. Kateterpatency bör dessutom verifieras vid tidpunkten för djuravlivning genom dissektion och visuell inspektion under mikroskopet. Observera att den dagliga volymen av injicerad läkemedelslösning måste övervägas noggrant. Eftersom plasmavolymen reglerar blodtrycket kan injektionsvolymen påverka AAA-expansionen, och därför måste kontrolldjuren få skenproceduren med bärarvolymen. Baserat på vår erfarenhet (och opublicerade observationer) verkar en daglig mängd på upp till 250 μL PBS tolereras väl. Slutligen, i likhet med pumpimplantationen, kan hudirritation uppstå runt den implanterade vaskulära åtkomstknappen. Om inflammation åtföljd av devitaliserad eller nekrotisk vävnad observeras, bör sårdebridering utföras genom att avlägsna icke-livskraftig vävnad (nekrotisk vävnad kommer ofta att separeras naturligt från såret) och huden ska sutureras vid behov; Om inflammation och nekros är omfattande måste djurens välbefinnande och humana endpoints beaktas enligt riktlinjer.
Enkel och dubbel dorsal implantation av den osmotiska pumpen och / eller VAS störde inte ultraljudssignalen eller säkrade musen i en lämplig position på ultraljudssteget. Det automatiserade förvärvet av 157 ramar över 12 mm för att återge en 3D-bild av aortan för volymmätning är ett enkelt och snabbt förfarande14, som endast kräver att aortan är fri från störningar över intresseområdet. En fallgrop i detta sammanhang är att applicera för mycket tryck med givaren medan man försöker rensa bilden av störningar, vilket kan avbryta den automatiska mätningen om andningsfrekvensen påverkas av kompressionen av revbenen när bilder av bukaortans kranialände registreras. Diametern mäts traditionellt i bilder som förvärvats med B-läge av operatören som manuellt söker efter området med maximal diameter medan ultraljudsanalysen utförs. Ett framsteg på B-lägesbilderna är EKV-bilderna, som kan lösa små aortarörelser för att producera en högkvalitativ, långsammare bild av den pulserande aortan. Dessutom kan den maximala aortadiametern bestämmas från de förvärvade 3D-ramarna, där de 157 bilderna ger en omfattande översikt över aortan som tagits vid systole (på grund av den inställda EKG-utlösaren).
Sammanfattningsvis ger det presenterade kompilerade protokollet ett tillförlitligt och reproducerbart arbetsflöde för i.v. läkemedelsadministration i en musmodell av Ang-II-inducerad AAA och för övervakning av aortastorlek med 3D-ultraljud. Tidpunkterna för övervakning och drift kan anpassas till de specifika behoven, och halsvenkateteriseringen kan utföras separat för alla experimentella inställningar som kräver leverans av specifika ämnen via i.v. injektioner. VAS kan alternativt användas för upprepad blodprovtagning om en kateterlåslösning används för att förhindra koagulering. Den beskrivna 3D-ultraljudsproceduren kan anpassas för att mäta den infrarenala aortan, där aneurysmer utvecklas vid akut förolämpning i elastas eller CaCl2-baserade musmodeller av AAA. Medan 3D-ultraljudsförvärv har fördelen att ge en översikt över den drabbade aortaregionen och aneurysmmorfologin, är bildförvärvet mer tidskrävande och kan därför vara mer kostnadsintensivt. En annan begränsning av protokollet som bör erkännas är behovet av att djuren bedövas kort för intravenösa injektioner, medan intraperitoneal administrering i allmänhet utförs på medvetna möss.
Disclosures
Författarna har inga upplysningar.
Acknowledgments
Vi vill tacka prof. Podessers och prof. Ellmeiers team (Inst. för biomedicinsk forskning och Core Facility for Laboratory Animal Breeding and Husbandry, Medical University of Vienna) för hjälp i djurförsöken. AAA-trikromfärgningen utfördes vänligt av Monika Weiss och prof. Peter Petzelbauer (Institutionen för dermatologi, Medicinska universitetet i Wien). Detta arbete stöddes av den österrikiska vetenskapsfonden [SFB-projekt F 5409-B21]. Marc Bailey stöds personligen av British Heart Foundation [FS/18/12/33270].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 Polysorb sutures | Covidien | GL-46-MG | Braided absorbable suture CV-23 Taper |
| 6-0 Silk sutures | Ethicon | 639H | PERMA-HAND Silk |
| ALZET 2004 osmotic pumps | DURECT Corp | 298 | Osmotic mini pumps |
| Angiotensin-II | Bachem | 4006473.0100 | Angiotensin II acetate |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | Parker Labs | PUSG-0308 | Ultrasound gel |
| Betadona Wound Spray | Mundipharma | Wound disinfectant spray (povidone-iodine spray) | |
| Betaisodona Solution | Mundipharma | 15973 | Wound disinfectant solution (povidone-iodine solution) |
| Catheter for mouse femoral vein/artery | Instech Laboratories Inc | C10PU-MFV1301 | 1 to 3Fr, 10.5 cm, collar @1.2 cm. Fits 22 G |
| Hair removal cream | |||
| Handling tool | Instech Laboratories Inc | VABMG | Handling tool for magnetic mouse Vascular Access Buttons |
| HYLO NIGHT Eye Oinment | URSAPHARM | 538922 | Eye lubricant cream |
| Needles and syringes of various sizes | 1 mL and 5 mL syringes, 27 G and 30 G needles | ||
| Olympus SZ51 Stereo microscope | Olympus Corporation | Dissection and inspection microscope | |
| PinPort injectors | Instech Laboratories Inc | PNP3M-50 | Injector for vascular access button |
| Protective aluminum cap | Instech Laboratories Inc | VABM1C | Protective aluminum cap for magnetic 1 channel mouse VAB |
| Signa Electrode Ultrasound Gel | Parker Labs | PE-1560 | Electrode gel |
| Small electric shaver | |||
| Surigcal and microsurgical equipment | |||
| Suprasorb C | Lohmann & Rauscher | 20482 | Collagen wound dressing |
| Vascular access button (VAB) | Instech Laboratories Inc | VABM1B/22 | Vascular Access Button for mouse, magnetic, 1 channel 22 G, injector |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics Inc | 51073-51 | Ultrasound system |
| Vevo Lab 5.6.1 software | FUJIFILM VisualSonics Inc | Ultrasound analysis software | |
| Vevo MX550D transducer | FUJIFILM VisualSonics Inc | Linear Array Transducer For Vevo 3100 system | |
| Vevo Mouse Handling Table | FUJIFILM VisualSonics Inc | 11436 | Mouse heating, mouse core temperature capture and ECG pads for physiological monitoring |
References
- Busch, A., et al. Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery. JVS-Vascular Science. 2, 219-234 (2021).
- Golledge, J., Krishna, S. M., Wang, Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. British Journal of Pharmacology. 179 (5), 792-810 (2022).
- Daugherty, A., Manning, M. W., Cassis, L. A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 105 (11), 1605-1612 (2000).
- Bhamidipati, C. M., et al. Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase. Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).
- Phillips, E. H., et al. Morphological and biomechanical differences in the elastase and AngII apoE -/- rodent models of abdominal aortic aneurysms. BioMed Research International. 2015, 413189 (2015).
- Gäbel, G., et al. Parallel murine and human aortic wall genomics reveals metabolic reprogramming as key driver of abdominal aortic aneurysm progression. Journal of the American Heart Association. 10 (17), 20231 (2021).
- Phie, J., Thanigaimani, S., Golledge, J. Systematic review and meta-analysis of interventions to slow progression of abdominal aortic aneurysm in mouse models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1504-1517 (2021).
- Lu, H. S., Owens, A. P., Liu, B., Daugherty, A. Illuminating the importance of studying interventions on the propagation phase of experimental mouse abdominal aortic aneurysms. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (4), 1518-1520 (2021).
- Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. Intraperitoneal route of drug administration: Should it be used in experimental animal studies. Pharmaceutical Research. 37 (1), 1-17 (2020).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Derde, S., et al. Use of a central venous line for fluids, drugs and nutrient administration in a mouse model of critical illness. Journal of Visualized Experiments. (123), e55553 (2017).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- Jespersen, B., Knupp, L., Northcott, C. A. Femoral arterial and venous catheterization for blood sampling, drug administration and conscious blood pressure and heart rate measurements. Journal of Visualized Experiments. (59), e3496 (2012).
- Waduud, M. A., et al. High-frequency three-dimensional lumen volume ultrasound is a sensitive method to detect early aneurysmal change in elastase-induced murine abdominal aortic aneurysm. Aorta. 9 (6), 215-220 (2020).
- Lu, H., et al. Subcutaneous angiotensin II infusion using osmotic pumps induces aortic aneurysms in mice. Journal of Visualized Experiments. (103), e53191 (2015).
- Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013 (2019).
- Eilenberg, W., et al. Histone citrullination as a novel biomarker and target to inhibit progression of abdominal aortic aneurysms. Translational Research. 233, 32-46 (2021).
- Saraff, K., Babamusta, F., Cassis, L. A., Daugherty, A. Aortic dissection precedes formation of aneurysms and atherosclerosis in angiotensin II-infused, apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (9), 1621-1626 (2003).
- Trachet, B., Fraga-Silva, R. A., Jacquet, P. A., Stergiopulos, N., Segers, P. Incidence, severity, mortality, and confounding factors for dissecting AAA detection in angiotensin II-infused mice: A meta-analysis. Cardiovascular Research. 108 (1), 159-170 (2015).
- Cesarovic, N., et al. Isoflurane and sevoflurane provide equally effective anaesthesia in laboratory mice. Laboratory Animals. 44 (4), 329-336 (2010).
