Summary

In vitro-udvælgelse af aptamerer til differentiering af infektiøse fra ikke-infektiøse vira

Published: September 07, 2022
doi:

Summary

Vi leverer en protokol, der generelt kan anvendes til udvalgte aptamerer, der kun binder til infektiøse vira og ikke til vira, der er gjort ikke-infektiøse ved en desinfektionsmetode eller til andre lignende vira. Dette åbner mulighed for at bestemme smittestatus i bærbare og hurtige test.

Abstract

Virusinfektioner har stor indvirkning på samfundet; De fleste metoder til påvisning har svært ved at afgøre, om en påvist virus er smitsom, hvilket forårsager forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, vil imødekomme denne uopfyldte udfordring. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virus og differentiere den fra den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved desinfektionsmetoder. Her beskriver vi en protokol til udvælgelse af aptamerer, der kan skelne infektiøse vira vs ikke-infektiøse vira ved hjælp af systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX). Vi drager fordel af to funktioner i SELEX. For det første kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål, såsom ikke-infektiøse vira eller andre lignende vira, ved hjælp af modvalg. Derudover kan hele virussen bruges som mål for SELEX, i stedet for for eksempel et viralt overfladeprotein. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for at forstyrre virussen. Denne metode gør det således muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i overfladen af patogener, som ikke behøver at være kendt på forhånd.

Introduction

Virusinfektioner har enorme økonomiske og samfundsmæssige konsekvenser rundt om i verden, hvilket blev stadig tydeligere af den nylige covid-19-pandemi. Tidlig og præcis diagnose er altafgørende i behandling af virusinfektioner, samtidig med at spredning af vira til raske mennesker forhindres. Mens der er udviklet mange virusdetektionsmetoder, såsom PCR-test1,2 og inmunoassays3, er de fleste af de aktuelt anvendte metoder ikke i stand til at bestemme, om den påviste virus faktisk er smitsom eller ej. Dette skyldes, at tilstedeværelsen af komponenter i virussen alene, såsom viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer, at den intakte, infektiøse virus er til stede, og niveauer af disse biomarkører har vist dårlig korrelation med infektivitet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, der almindeligvis anvendes til de nuværende PCR-baserede COVID-19-tests, meget lave niveauer i de tidlige stadier af infektion, når patienten er smitsom, mens RNA-niveauet ofte stadig er meget højt, når patienterne er kommet sig efter infektionen og ikke længere er smitsomme 7,8. De virale protein- eller antigenbiomarkører følger en lignende tendens, men optræder typisk endnu senere end det virale RNA og er dermed endnu mindre prædiktive for infektibilitet 6,9. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet nogle metoder, der kan informere om virusets infektivitetsstatus, men er baseret på cellekulturmikrobiologiske teknikker, der kræver lang tid (dage eller uger) for at opnå resultater 4,10. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, kan således undgå forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virion og differentiere den fra den samme virus, der er blevet gjort ikke-smitsom.

I denne sammenhæng er aptamerer særligt velegnede som et unikt biomolekylært værktøj11,12,13,14. Aptamers er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens, der giver dem mulighed for at danne en specifik 3D-konformation for at genkende et mål med høj affinitet og selektivitet15,16. De opnås ved en kombinatorisk udvælgelsesproces kaldet systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), også kendt som in vitro-selektion, der udføres i reagensglas med et stort tilfældigt DNA-prøveudtagningsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde af denne iterative proces udsættes DNA-puljen først for et selektionstryk gennem inkubation med målet under de ønskede betingelser. Alle sekvenser, der ikke er bundet til målet, fjernes derefter og efterlader kun de få sekvenser, der er i stand til at binde under de givne betingelser. Endelig forstærkes de sekvenser, der er valgt i det foregående trin, af PCR, hvilket beriger poolens population med de ønskede funktionelle sekvenser til den næste udvælgelsesrunde, og processen gentages. Når udvælgelsespuljens aktivitet når et plateau (typisk efter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekventering for at identificere de vindende sekvenser, der udviser den højeste affinitet.

SELEX har unikke fordele, der kan udnyttes til at opnå øget selektivitet i forhold til andre lignende mål20,21, f.eks. for virussens smittestatus 22. For det første kan en lang række forskellige typer mål anvendes til udvælgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For at opnå en aptamer, der binder til en infektiøs virus, kan en intakt virus således anvendes som mål i stedet for et viralt overfladeprotein19. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for forstyrrelse af virussen. For det andet kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål 21,23, såsom andre lignende vira eller ikke-infektiøse inaktiverede vira, ved hjælp af modudvælgelsestrin i hver udvælgelsesrunde22. Under modudvælgelsestrinnene udsættes DNA-puljen for mål, for hvilke binding ikke ønskes, og eventuelle sekvenser, der binder, kasseres.

I dette arbejde leverer vi en protokol, der generelt kan anvendes til udvælgelse af aptamerer, der binder til en infektiøs virus, men ikke til den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved en bestemt desinfektionsmetode eller til andre relaterede vira. Denne metode gør det muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i virusoverfladen, som ikke behøver at være kendt på forhånd, og giver således en yderligere fordel til påvisning af nyligt fremkomne patogener eller til underundersøgte sygdomme.

Protocol

1. Fremstilling af reagenser og buffere Forbered 10x Tris-borat EDTA (10x TBE) ved at tilsætte 0,9 M Tris-base, 0,9 M borsyre, 20 mM EDTA (dinatriumsalt) og deioniseret vand til et endeligt volumen på 1 L. Bland indtil alle komponenter er opløst. Der fremstilles en 10% denaturerende polyacrylamidstamopløsning som følger. I en 250 ml glasflaske tilsættes 120 g urinstof (8 M), 25 ml 10x TBE, 62,5 ml 40% acrylamid / bisacrylamid (29: 1) opløsning og nok destilleret vand til at nå…

Representative Results

Da DNA-aptamerer kan opnås ved hjælp af SELEX i et reagensglas15, blev denne SELEX-strategi omhyggeligt udformet til at omfatte både positive selektionstrin mod det intakte, hele infektiøse virus (dvs. tilbageholde de DNA-molekyler, der binder til det infektiøse virus) samt modudvælgelsestrin for det samme virus, der er gjort ikke-infektiøst ved en bestemt desinfektionsmetode. specifikt UV-behandling, ved at kassere de DNA-sekvenser, der kan binde til den ikke-infektiøse virus. <strong cl…

Discussion

SELEX tillader ikke kun identifikation af aptamerer med høj affinitet i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høj og justerbar selektivitet. Ved at drage fordel af modvalg kan aptamerer med udfordrende selektivitet opnås. For eksempel har Li-gruppen demonstreret evnen til at opnå sekvenser, der kan differentiere patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21</su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for at levere de pseudovirusprøver, der anvendes i denne protokol (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-faciliteten i Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjælp med high-throughput sekventering, og mange medlemmer af Lu-gruppen, der har hjulpet os med in vitro-udvælgelse og aptamerkarakteriseringsteknikker. Dette arbejde blev støttet af et RAPID-tilskud fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøtilskud fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128

References

  1. Carter, L. J., et al. Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis. ACS Central Science. 6 (5), 591-605 (2020).
  2. Ranoa, D. R. E., et al. Saliva-based molecular testing for SARS-CoV-2 that bypasses RNA extraction. bioRxiv. , 1-35 (2020).
  3. Tang, Z., et al. A materials-science perspective on tackling COVID-19. Nature Reviews Materials. 5 (11), 847-860 (2020).
  4. Cook, N., Cliver, D. O. VIRUSES | Detection. Encyclopedia of Food Microbiology. 3, 727-731 (2014).
  5. Weissleder, R., Lee, H., Ko, J., Pittet, M. J. COVID-19 diagnostics in context. Science Translational Medicine. 12 (546), 1-7 (2020).
  6. Joynt, G. M., Wu, W. K. Understanding COVID-19: what does viral RNA load really mean. The Lancet Infectious Diseases. 3099 (20), 19-20 (2020).
  7. Wölfel, R., et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019. Nature. 581 (7809), 465-469 (2020).
  8. Perera, R. A. P. M., et al. SARS-CoV-2 virus culture and subgenomic RNA for respiratory specimens from patients with mild coronavirus disease. Emerging Infectious Diseases. 26 (11), 2701-2704 (2020).
  9. Sethuraman, N., Jeremiah, S. S., Ryo, A. Interpreting diagnostic tests for SARS-CoV-2. JAMA – Journal of the American Medical Association. 323 (22), 2249-2251 (2020).
  10. Basile, K., et al. Cell-based culture informs infectivity and safe de-isolation assessments in patients with coronavirus disease 2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (9), 2952-2959 (2021).
  11. Xing, H., Hwang, K., Li, J., Torabi, S. -. F., Lu, Y. DNA aptamer technology for personalized medicine. Current Opinion in Chemical Engineering. 4, 79-87 (2014).
  12. Xiong, Y., et al. Functional DNA regulated CRISPR-Cas12a sensors for point-of-care diagnostics of non-nucleic-acid targets. Journal of the American Chemical Society. 142 (1), 207-213 (2020).
  13. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  14. Chakraborty, B., et al. Aptamers for viral detection and inhibition. ACS Infectious Diseases. 8 (4), 667-692 (2022).
  15. Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. Functional nucleic acid sensors. Chemical Reviews. 109 (5), 1948-1998 (2009).
  16. Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1 (10), 1-16 (2017).
  17. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
  18. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
  19. Sefah, K., Shangguan, D., Xiong, X., O’Donoghue, M. B., Tan, W. Development of DNA aptamers using Cell-SELEX. Nature Protocols. 5 (6), 1169-1185 (2010).
  20. Bruesehoff, P. J., Li, J., Augustine, A. J., Lu, Y. Improving metal ion specificity during in vitro selection of catalytic DNA. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 5 (4), 327-335 (2012).
  21. Shen, Z., et al. A catalytic DNA activated by a specific strain of bacterial pathogen. Angewandte Chemie International Edition. 55 (7), 2431-2434 (2016).
  22. Peinetti, A. S., et al. Direct detection of human adenovirus or SARS-CoV-2 with ability to inform infectivity using DNA aptamer-nanopore sensors. Science Advances. 7 (39), (2021).
  23. Ihms, H. E., Lu, Y. In vitro selection of metal ion-selective DNAzymes. Ribozymes: Methods and Protocols. , 297-316 (2012).
  24. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
  25. Cui, Q., et al. Identification of diaryl-quinoline compounds as entry inhibitors of Ebola virus. Viruses. 10 (12), 678 (2018).
  26. Guo, Y., et al. Identification of a new region of SARS-CoV S protein critical for viral entry. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 600-605 (2009).
  27. Panec, M., Katz, D. S. Plaque assay protocols. Protocols American Society for Microbiology. 7, 1-5 (2011).
  28. Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: Using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), 1-10 (2014).
  29. Mendoza, E. J., Manguiat, K., Wood, H., Drebot, M. Two detailed plaque assay protocols for the quantification of infectious SARS-CoV-2. Current Protocols in Microbiology. 57 (1), 1-15 (2020).
  30. Luo, Z., He, L., Wang, J., Fang, X., Zhang, L. Developing a combined strategy for monitoring the progress of aptamer selection. The Analyst. 142 (17), 3136-3139 (2017).
  31. . Babraham bioinformatics – FastQC a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2022)
  32. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).
  33. Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T., Stamatakis, A. P. E. A. R. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End reAd mergeR. Bioinformatics. 30 (5), 614-620 (2014).
  34. Alam, K. K., Chang, J. L., Burke, D. H. FASTAptamer: A bioinformatic toolkit for high-throughput sequence analysis of combinatorial selections. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 4 (3), 230 (2015).
  35. McKeague, M., et al. Comprehensive analytical comparison of strategies used for small molecule aptamer evaluation. Analytical Chemistry. 87 (17), 8608-8612 (2015).
  36. Entzian, C., Schubert, T. Mapping the binding site of an aptamer on ATP using MicroScale Thermophoresis. Journal of Visualized Experiments. (119), e55070 (2017).
  37. Romain, M., Thiroux, B., Tardy, M., Quesnel, B., Thuru, X. Measurement of protein-protein interactions through microscale thermophoresis (MST). Bio-Protocol. 10 (7), 1-10 (2020).
  38. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor ligand interaction. Journal of Visualized Experiments. (132), e57334 (2018).
  39. Chang, A. L., McKeague, M., Liang, J. C., Smolke, C. D. Kinetic and equilibrium binding characterization of aptamers to small molecules using a label-free, sensitive, and scalable platform. Analytical Chemistry. 86 (7), 3273-3278 (2014).
  40. Lou, X., Egli, M., Yang, X. Determining functional aptamer-protein interaction by biolayer interferometry. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 67 (1), 7-25 (2016).
  41. Cheng, H., et al. Identification of a coumarin-based antihistamine-like small molecule as an anti-filoviral entry inhibitor. Antiviral Research. 145, 24-32 (2017).
  42. Sun, M., et al. Aptamer blocking strategy inhibits SARS-CoV-2 virus infection. Angewandte Chemie International Edition. 60 (18), 10266-10272 (2021).
  43. Li, J., et al. Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library. Nucleic Acids Research. 49 (13), 7267-7279 (2021).
  44. Zhang, L., et al. Discovery of sandwich type COVID-19 nucleocapsid protein DNA aptamers. Chemical Communications. 56 (70), 10235-10238 (2020).
  45. Hamula, C. L. A., et al. An improved SELEX technique for selection of DNA aptamers binding to M-type 11 of Streptococcus pyogenes. Methods. 97, 51-57 (2016).
  46. Liu, J., Lu, Y. Rational design of "turn-on" allosteric DNAzyme catalytic beacons for aqueous mercury ions with ultrahigh sensitivity and selectivity. Angewandte Chemie International Edition. 46 (40), 7587-7590 (2007).
  47. Liu, J., Mazumdar, D., Lu, Y. A simple and sensitive "dipstick" test in serum based on lateral flow separation of aptamer-linked nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 45 (47), 7955-7959 (2006).
  48. Xiang, Y., Lu, Y. Using personal glucose meters and functional DNA sensors to quantify a variety of analytical targets. Nature Chemistry. 3 (9), 697-703 (2011).
  49. Lake, R. J., Yang, Z., Zhang, J., Lu, Y. DNAzymes as activity-based sensors for metal ions: recent applications, demonstrated advantages, current challenges, and future directions. Accounts of Chemical Research. 52 (12), 3275-3286 (2019).
  50. Li, N., et al. Overcoming the limitations of COVID-19 diagnostics with nanostructures, nucleic acid engineering, and additive manufacturing. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 26, 100966 (2022).
  51. Li, N., et al. Label-free digital detection of intact virions by enhanced scattering microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (4), 1498-1502 (2022).

Play Video

Cite This Article
Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).

View Video