Vi leverer en protokol, der generelt kan anvendes til udvalgte aptamerer, der kun binder til infektiøse vira og ikke til vira, der er gjort ikke-infektiøse ved en desinfektionsmetode eller til andre lignende vira. Dette åbner mulighed for at bestemme smittestatus i bærbare og hurtige test.
Virusinfektioner har stor indvirkning på samfundet; De fleste metoder til påvisning har svært ved at afgøre, om en påvist virus er smitsom, hvilket forårsager forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, vil imødekomme denne uopfyldte udfordring. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virus og differentiere den fra den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved desinfektionsmetoder. Her beskriver vi en protokol til udvælgelse af aptamerer, der kan skelne infektiøse vira vs ikke-infektiøse vira ved hjælp af systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX). Vi drager fordel af to funktioner i SELEX. For det første kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål, såsom ikke-infektiøse vira eller andre lignende vira, ved hjælp af modvalg. Derudover kan hele virussen bruges som mål for SELEX, i stedet for for eksempel et viralt overfladeprotein. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for at forstyrre virussen. Denne metode gør det således muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i overfladen af patogener, som ikke behøver at være kendt på forhånd.
Virusinfektioner har enorme økonomiske og samfundsmæssige konsekvenser rundt om i verden, hvilket blev stadig tydeligere af den nylige covid-19-pandemi. Tidlig og præcis diagnose er altafgørende i behandling af virusinfektioner, samtidig med at spredning af vira til raske mennesker forhindres. Mens der er udviklet mange virusdetektionsmetoder, såsom PCR-test1,2 og inmunoassays3, er de fleste af de aktuelt anvendte metoder ikke i stand til at bestemme, om den påviste virus faktisk er smitsom eller ej. Dette skyldes, at tilstedeværelsen af komponenter i virussen alene, såsom viral nukleinsyre eller proteiner, ikke indikerer, at den intakte, infektiøse virus er til stede, og niveauer af disse biomarkører har vist dårlig korrelation med infektivitet 4,5,6. For eksempel har viralt RNA, der almindeligvis anvendes til de nuværende PCR-baserede COVID-19-tests, meget lave niveauer i de tidlige stadier af infektion, når patienten er smitsom, mens RNA-niveauet ofte stadig er meget højt, når patienterne er kommet sig efter infektionen og ikke længere er smitsomme 7,8. De virale protein- eller antigenbiomarkører følger en lignende tendens, men optræder typisk endnu senere end det virale RNA og er dermed endnu mindre prædiktive for infektibilitet 6,9. For at imødegå denne begrænsning er der udviklet nogle metoder, der kan informere om virusets infektivitetsstatus, men er baseret på cellekulturmikrobiologiske teknikker, der kræver lang tid (dage eller uger) for at opnå resultater 4,10. Udvikling af nye sensorer, der kan informere om inficerbarheden af kliniske eller miljømæssige prøver, kan således undgå forsinkelser i behandlingen og yderligere spredning af virussen. Imidlertid kan meget få metoder opnå sensormolekyler, der kan genkende en intakt infektiøs virion og differentiere den fra den samme virus, der er blevet gjort ikke-smitsom.
I denne sammenhæng er aptamerer særligt velegnede som et unikt biomolekylært værktøj11,12,13,14. Aptamers er korte, enkeltstrengede DNA- eller RNA-molekyler med en specifik nukleotidsekvens, der giver dem mulighed for at danne en specifik 3D-konformation for at genkende et mål med høj affinitet og selektivitet15,16. De opnås ved en kombinatorisk udvælgelsesproces kaldet systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), også kendt som in vitro-selektion, der udføres i reagensglas med et stort tilfældigt DNA-prøveudtagningsbibliotek på 10 14-1015 sekvenser17,18,19. I hver runde af denne iterative proces udsættes DNA-puljen først for et selektionstryk gennem inkubation med målet under de ønskede betingelser. Alle sekvenser, der ikke er bundet til målet, fjernes derefter og efterlader kun de få sekvenser, der er i stand til at binde under de givne betingelser. Endelig forstærkes de sekvenser, der er valgt i det foregående trin, af PCR, hvilket beriger poolens population med de ønskede funktionelle sekvenser til den næste udvælgelsesrunde, og processen gentages. Når udvælgelsespuljens aktivitet når et plateau (typisk efter 8-15 runder), analyseres biblioteket ved DNA-sekventering for at identificere de vindende sekvenser, der udviser den højeste affinitet.
SELEX har unikke fordele, der kan udnyttes til at opnå øget selektivitet i forhold til andre lignende mål20,21, f.eks. for virussens smittestatus 22. For det første kan en lang række forskellige typer mål anvendes til udvælgelsen, fra små molekyler og proteiner til hele patogener og celler16. For at opnå en aptamer, der binder til en infektiøs virus, kan en intakt virus således anvendes som mål i stedet for et viralt overfladeprotein19. Hele virus SELEX giver mulighed for udvælgelse af aptamerer, der binder specifikt til virusets oprindelige tilstand uden behov for forstyrrelse af virussen. For det andet kan SELEX skræddersys til at fjerne konkurrerende mål 21,23, såsom andre lignende vira eller ikke-infektiøse inaktiverede vira, ved hjælp af modudvælgelsestrin i hver udvælgelsesrunde22. Under modudvælgelsestrinnene udsættes DNA-puljen for mål, for hvilke binding ikke ønskes, og eventuelle sekvenser, der binder, kasseres.
I dette arbejde leverer vi en protokol, der generelt kan anvendes til udvælgelse af aptamerer, der binder til en infektiøs virus, men ikke til den samme virus, der er gjort ikke-infektiøs ved en bestemt desinfektionsmetode eller til andre relaterede vira. Denne metode gør det muligt at opnå genkendelsesmidler baseret på funktionelle forskelle i virusoverfladen, som ikke behøver at være kendt på forhånd, og giver således en yderligere fordel til påvisning af nyligt fremkomne patogener eller til underundersøgte sygdomme.
SELEX tillader ikke kun identifikation af aptamerer med høj affinitet i pM-nM-området 22,43,44,45, men også med høj og justerbar selektivitet. Ved at drage fordel af modvalg kan aptamerer med udfordrende selektivitet opnås. For eksempel har Li-gruppen demonstreret evnen til at opnå sekvenser, der kan differentiere patogene bakteriestammer fra ikke-patogene stammer21</su…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Laura M. Cooper og Dr. Lijun Rong fra University of Illinois i Chicago for at levere de pseudovirusprøver, der anvendes i denne protokol (SARS-CoV-2, SARS-CoV-1, H5N1), samt Dr. Alvaro Hernandez og Dr. Chris Wright fra DNA Services-faciliteten i Roy J. Carver Biotechnology Center ved University of Illinois i Urbana-Champaign for deres hjælp med high-throughput sekventering, og mange medlemmer af Lu-gruppen, der har hjulpet os med in vitro-udvælgelse og aptamerkarakteriseringsteknikker. Dette arbejde blev støttet af et RAPID-tilskud fra National Science Foundation (CBET 20-29215) og et frøtilskud fra Institute for Sustainability, Energy and Environment ved University of Illinois i Urbana-Champaign og Illinois-JITRI Institute (JITRI 23965). A.S.P. takker PEW Latin American Fellowship for økonomisk støtte. Vi takker også Robert A. Welch Foundation (Grant F-0020) for støtte til Lu-gruppens forskningsprogram ved University of Texas i Austin.
10% Ammonium persulfate (APS) | BioRad | 1610700 | |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
1x PBS without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CM | |
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution | BioRad | 1610146 | |
Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA clean-up beads – Section 7.2.2 |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC501024 | cut-off 10 kDa |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | Merck | UFC510024 | cut-off 100 kDa |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | 100165 | |
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module | BioRad | 1851148 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Scientific | 88870001 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Thermo Fisher | 65001 | streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9 |
EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | 324503 | |
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | T9661 | 1.5 mL |
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit | Takara Bio USA, Inc. | 632200 | Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1 |
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube | Thermo Scientific | MR02 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | non-UV absorbing |
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels | BioRad | 1658004EDU | |
Mini-PROTEAN Short Plates | BioRad | 1653308 | |
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers | BioRad | 1653310 | |
Molecular Biology Grade Water | Lonza | 51200 | |
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear | BioRad | MLP9611 | |
Nanodrop One | Thermo Scientific | ND-ONE-W | |
OneTaq DNA Polymerase | New England BioLab | M0480S | |
Ovation Ultralow v2 + UDI | Tecan | 0344NB-A01 | High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2. |
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) | Gilson | F144059M, F144058M, F144056M, F144054M | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 4261 | |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Invitrogen | Q32850 | fluorescence-based dsDNA quantification kit – Section 7.2.3 |
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) | Thomas Scientific | 1158U43, 1159M44, 1158U40 | |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002440 | |
SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 1725201 | qPCR mastermix – Section 6.2. |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 | USA scientific | AB1183 | PCR tubes |
Urea | Sigma-Aldrich | U5128 |