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Bioengineering

感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別するためのアプタマーのin vitro選択

Published: September 07, 2022
doi:
10.3791/64127
, , ,
1INQUIMAE (CONICET), Departamento de Química Inorgánica, Analítica y Química Física, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad de Buenos Aires, 2Department of Chemistry,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Chemistry,University of Texas at Austin

Summary

感染性ウイルスのみに結合し、消毒法によって非感染性にされたウイルスや他の同様のウイルスには結合しない選択されたアプタマーに一般的に適用できるプロトコルを提供します。これにより、ポータブルで迅速なテストで感染状態を判断する可能性が開かれます。

Abstract

ウイルス感染は社会に大きな影響を与えます。ほとんどの検出方法は、検出されたウイルスが感染性であるかどうかを判断するのが困難であり、治療の遅延とウイルスのさらなる拡散を引き起こします。臨床サンプルや環境サンプルの感染性を知らせることができる新しいセンサーを開発することで、この満たされていない課題に対処できます。しかし、無傷の感染性ウイルスを認識し、消毒法によって非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。ここでは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)を用いて、感染性ウイルスと非感染性ウイルスを区別できるアプタマーを選択するためのプロトコルについて説明します。SELEXの2つの機能を活用しています。まず、SELEXは、カウンター選択を使用して、非感染性ウイルスまたは他の同様のウイルスなどの競合するターゲットを削除するようにカスタマイズできます。さらに、ウイルス表面タンパク質の代わりに、ウイルス全体をSELEXの標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスを破壊することなく、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。したがって、この方法は、事前に知る必要のない病原体の表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることを可能にする。

Introduction

ウイルス感染は、最近のCOVID-19パンデミックからますます明らかになったように、世界中で甚大な経済的および社会的影響を及ぼしています。タイムリーで正確な診断は、健康な人へのウイルスの拡散を防ぎながらウイルス感染症を治療する上で最も重要です。PCR検査1,2やインミュノアッセイ3など、多くのウイルス検出法が開発されていますが、現在使用されている方法のほとんどは、検出されたウイルスが実際に感染性であるかどうかを判断できません。これは、ウイルス核酸やタンパク質などのウイルスの成分のみの存在は、無傷の感染性ウイルスが存在することを示すものではなく、これらのバイオマーカーのレベルは感染性との相関が低いことを示しているためです4,5,6。たとえば、現在のPCRベースのCOVID-19検査で一般的に使用されているウイルスRNAは、患者が伝染性である場合、感染の初期段階では非常に低いレベルを示しますが、患者が感染から回復し、もはや伝染性ではなくなった場合、RNAレベルは依然として非常に高いことがよくあります7,8。ウイルスタンパク質または抗原バイオマーカーも同様の傾向に従いますが、通常はウイルスRNAよりもさらに遅く現れるため、感染性の予測はさらに低くなります6,9。この制限に対処するために、ウイルスの感染状態を知らせることができるいくつかの方法が開発されているが、結果を得るために長い時間(数日または数週間)を必要とする細胞培養微生物学的技術に基づいている4,10。したがって、臨床サンプルまたは環境サンプルの感染性を通知できる新しいセンサーを開発することで、治療の遅延やウイルスのさらなる拡散を回避できます。しかし、無傷の感染性ビリオンを認識し、非感染性にされた同じウイルスと区別できるセンシング分子を得ることができる方法はほとんどありません。

この文脈において、アプタマーは、ユニークな生体分子ツール11、12、13、14として特に適している。アプタマーは、特定の塩基配列を持つ短い一本鎖DNAまたはRNA分子であり、特定の3D立体配座を形成して、高い親和性と選択性でターゲットを認識することができます15,16。それらは、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化(SELEX)と呼ばれる組み合わせ選択プロセスによって得られ、in vitro選択としても知られ、10 14-10 15配列17,18,19の大きなランダムDNAサンプリングライブラリを備えた試験管で実行されます.この反復プロセスの各ラウンドにおいて、DNAプールは、最初に、所望の条件下で標的とのインキュベーションを通じて選択圧を受ける。ターゲットにバインドされていない配列はすべて削除され、指定された条件下で結合できる少数の配列のみが残ります。最後に、前のステップで選択された配列はPCRによって増幅され、プールの集団を次の選択ラウンドのために所望の機能配列で濃縮し、このプロセスが繰り返される。選択プールの活性がプラトーに達すると(典型的には8〜15ラウンド後)、ライブラリーをDNAシーケンシングによって分析し、最も高い親和性を示す勝利配列を同定する。

SELEXは、ウイルス22の感染性状態など、他の類似の標的20、21に対する選択性を高めるために利用され得る独自の利点を有する。第1に、小分子およびタンパク質から病原体および細胞全体まで、多種多様な異なるタイプの標的を選択に使用することができる16。したがって、感染性ウイルスに結合するアプタマーを得るために、ウイルス表面タンパク質19の代わりに、無傷のウイルスを標的として使用することができる。全ウイルスSELEXは、ウイルスの破壊を必要とせずに、ウイルスの天然状態に特異的に結合するアプタマーの選択を可能にします。第2に、SELEXは、選択22の各ラウンドにおけるカウンター選択ステップを使用して、他の類似のウイルスまたは非感染性不活化ウイルスなどの競合する標的21、23を除去するようにテーラーメイドすることができる。カウンター選択ステップの間、DNAプールは結合が望ましくない標的に曝露され、結合する配列はすべて破棄されます。

この研究では、感染性ウイルスに結合するが、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスまたは他の関連ウイルスには結合しないアプタマーを選択するために一般的に適用できるプロトコルを提供します。この方法は、ウイルス表面の機能の違いに基づいて認識剤を得ることができ、事前に知る必要がないため、新たに出現した病原体の検出や未研究の疾患にさらに利点を提供します。

Protocol

1. 試薬およびバッファーの調製 0.9 Mトリス塩基、0.9 Mホウ酸、20 mM EDTA(二ナトリウム塩)、および脱イオン水を最終容量1 Lまで加えて、10xホウ酸トリスEDTA(10x TBE)を調製します。 以下のようにして10%変性ポリアクリルアミド原液を調製する。250 mL のガラス瓶に、尿素 120 g (8 M)、10x TBE 25 mL、40% アクリルアミド/ビスアクリルアミド (29:1) 溶液 62.5 mL、および最終容量 250 m…

Representative Results

DNAアプタマーは試験管15内でSELEXを用いて得ることができるので、このSELEX戦略は、無傷の感染性ウイルス全体に対するポジティブ選択ステップ(すなわち、感染性ウイルスに結合するDNA分子を保持する)と、特定の消毒方法によって非感染性にされた同じウイルスに対するカウンター選択ステップの両方を含むように慎重に設計され、 具体的にはUV処理は、非感染性ウイルス?…

Discussion

SELEXは、pM-nM範囲22,43,44,45の高い親和性を有するアプタマーの同定だけでなく、高い調整可能な選択性を有するアプタマーの同定も可能にする。カウンター選択を利用することで、難しい選択性を有するアプタマーを得ることができます。例えば、Liグループは、病原性細菌株を非病原性株から区?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

このプロトコルで使用された疑似ウイルスサンプル(SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、H5N1)を提供してくれたイリノイ大学シカゴ校のローラM.クーパー氏とリジュンロン博士、およびイリノイ大学アーバナシャンペーン校のロイJ.カーバーバイオテクノロジーセンターのDNAサービス施設のアルバロヘルナンデス博士とクリスライト博士に、ハイスループットシーケンシングを支援してくれたことに感謝します。 そして、in vitro 選択とアプタマーの特性評価技術で私たちを助けてくれたLuグループの多くのメンバー。この研究は、国立科学財団からのRAPID助成金(CBET 20-29215)と、イリノイ大学アーバナシャンペーン校およびイリノイ大学JITRI研究所の持続可能性、エネルギー、環境研究所からのシード助成金(JITRI 23965)によってサポートされました。A.S.P.は、PEWラテンアメリカフェローシップの財政的支援に感謝します。また、テキサス大学オースティン校のLuグループ研究プログラムを支援してくれたロバートA.ウェルチ財団(助成金F-0020)にも感謝します。

Materials

10% Ammonium persulfate (APS) BioRad 1610700
100% Ethanol Sigma-Aldrich E7023
1x PBS without calcium & magnesium Corning 21-040-CM
40% acrylamide/bisacrylamide (29:1) solution BioRad 1610146
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 DNA clean-up beads – Section 7.2.2
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC501024 cut-off 10 kDa
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit Merck UFC510024 cut-off 100 kDa
Boric Acid Sigma-Aldrich 100165
C1000 Touch Thermal Cycler with Dual 48/48 Fast Reaction Module BioRad 1851148
Calcium Chloride Sigma-Aldrich C4901
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Digital Dry Baths/Block Heaters Thermo Scientific 88870001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Thermo Fisher 65001 streptavidin-modified magnetic beads – Section 4.9
EDTA disodium salt Sigma-Aldrich 324503
Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich T9661 1.5 mL
Lenti-X p24 Rapid Titer Kit Takara Bio USA, Inc. 632200 Lentivirus quantification kit – Section 3.3.2.1
MagJET Separation Rack, 12 x 1.5 mL tube Thermo Scientific MR02
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical BioRad MSB1001 non-UV absorbing
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Ready Gel Precast Gels BioRad 1658004EDU
Mini-PROTEAN Short Plates BioRad 1653308
Mini-PROTEAN Spacer Plates with 0.75 mm Integrated Spacers BioRad 1653310
Molecular Biology Grade Water Lonza 51200
Multiplate 96-Well PCR Plates, high profile, unskirted, clear BioRad MLP9611
Nanodrop One Thermo Scientific ND-ONE-W
OneTaq DNA Polymerase New England BioLab M0480S
Ovation Ultralow v2 + UDI Tecan 0344NB-A01 High-troughput sequencing library preparation kit – Section 7.2.
PIPETMAN G (100-1000 µL, 20-200 µL, 2-20 µL and 0.2-2 µL) Gilson F144059M, F144058M, F144056M, F144054M
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 4261
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorescence-based  dsDNA quantification  kit – Section 7.2.3
SHARP Classic Low Retention Pipet Tips (10 uL, 200 uL, 1000 uL) Thomas Scientific 1158U43, 1159M44, 1158U40
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sorvall Legend Micro 17R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002440
SsoFast EvaGreen Supermix BioRad 1725201 qPCR mastermix – Section 6.2.
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Aldrich T1503
Tubes and Ultra Clear Caps, strips of 8 USA scientific AB1183 PCR tubes
Urea Sigma-Aldrich U5128
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References

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Gramajo, M. E., Lake, R. J., Lu, Y., Peinetti, A. S. In Vitro Selection of Aptamers to Differentiate Infectious from Non-Infectious Viruses. J. Vis. Exp. (187), e64127, doi:10.3791/64127 (2022).
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