Summary
Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un'eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.
Abstract
I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l'omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).
Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.
Introduction
I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica1. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione 2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell'invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7. Per i neuroni postmitotici e altamente polarizzati, i lisosomi svolgono un ruolo critico nell'omeostasi cellulare neuronale, nel rilascio di neurotrasmettitori e nel trasporto a lunga distanza lungo gli assoni 8,9,10,11. Tuttavia, studiare i lisosomi nei neuroni umani è stato un compito impegnativo. I recenti progressi nelle tecnologie dei neuroni derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso alla coltura di neuroni umani vivi che in precedenza erano inaccessibili, colmando il divario tra modelli animali e pazienti umani per studiare il cervello umano12,13. In particolare, l'avanzata tecnologia i3Neuron integra stabilmente il fattore di trascrizione della neurogenina-2 nel genoma iPSC sotto un promotore inducibile dalla doxiciclina, spingendo le iPSC a differenziarsi in neuroni corticali puri in 2 settimane14,15.
A causa dell'attività lisosomiale altamente dinamica, catturare le interazioni lisosomiali con altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. La tecnologia di etichettatura di prossimità è adatta allo studio di queste interazioni dinamiche grazie alla sua capacità di catturare interazioni proteiche sia stabili che transitorie/deboli con un'eccezionale specificità spaziale16,17. La perossidasi ingegnerizzata o la biotina ligasi possono essere geneticamente fuse alla proteina esca. Al momento dell'attivazione, vengono prodotti radicali biotinici altamente reattivi per marcare covalentemente le proteine vicine, che possono quindi essere arricchite da perle rivestite di streptavidina per la proteomica bottom-up a valle tramite piattaforme di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) 17,18,19,20,21.
Un metodo endogeno di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale è stato recentemente sviluppato per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in i3Neuroni22. L'ascorbato perossidasi ingegnerizzata (APEX2) è stata inserita sul C-terminale della proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP1) nelle iPSC, che possono quindi essere differenziate in neuroni corticali. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marcatore lisosomiale classico23. LAMP1 è espresso anche negli endosomi tardivi, che maturano in lisosomi; Questi endosomi-lisosomi tardivi e lisosomi non degradativi sono tutti indicati come lisosomi in questo protocollo. Questa sonda endogena LAMP1-APEX, espressa a livello fisiologico, può ridurre la localizzazione errata di LAMP1 e gli artefatti di sovraespressione. Centinaia di proteine di membrana lisosomiale e interattori lisosomiali possono essere identificati e quantificati con un'eccellente risoluzione spaziale in neuroni umani vivi.
Qui, un protocollo dettagliato per la proteomica della marcatura di prossimità del lisosoma nei neuroni umani derivati da iPSC è descritto con ulteriori miglioramenti rispetto al metodo22 recentemente pubblicato. Il flusso di lavoro complessivo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo include la coltura di neuroni derivati dall'hiPSC, l'attivazione dell'etichettatura di prossimità nei neuroni, la convalida dell'attività APEX mediante microscopia a fluorescenza, la determinazione di un rapporto ottimale tra perline di streptavidina e proteina di input, l'arricchimento di proteine biotinilate, la digestione delle proteine on-beads, la desalinizzazione e la quantificazione dei peptidi, l'analisi LC-MS e l'analisi dei dati proteomici. Vengono inoltre discusse le linee guida per la risoluzione dei problemi e le ottimizzazioni sperimentali per migliorare il controllo della qualità e le prestazioni dell'etichettatura di prossimità.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal comitato etico e di biosicurezza della George Washington University. Le composizioni dei mezzi e dei buffer utilizzati in questo protocollo sono fornite nella Tabella 1. Le informazioni commerciali sul prodotto qui utilizzate sono fornite nella tabella dei materiali.
1. Coltura di neuroni umani derivati da iPSC
- Coltura iPSC umana e integrazione sonda LAMP1-APEX (7 giorni)
- Scongelare Matrigel in un secchiello per il ghiaccio a 4 °C durante la notte, aliquote 500 μL della soluzione in tubi sterili freddi e conservare le aliquote a -80°C. Preparare 50 mL di soluzione di rivestimento aggiungendo 500 μL del materiale madre Matrigel in 49,5 mL di terreno freddo DMEM/F12.
NOTA: Mantenere il Matrigel freddo e utilizzare tubi conici prerefrigerati e punte per pipette per evitare la polimerizzazione. La soluzione di rivestimento può essere conservata a 4 °C per 2 settimane. - Rivestire una capsula di coltura cellulare da 10 cm con 4 ml di soluzione di rivestimento per 1 ora in un'incubatrice a 37 °C.
NOTA: La vitronectina può essere una soluzione di rivestimento alternativa a 5 μg/mL di concentrazione e 2 ore di rivestimento per la coltura iPSC. La vitronectina (componente proteica singola) è più costosa di Matrigel ma ha meno variazioni di batch e segnali di fondo più puliti rispetto a Matrigel, che viene estratto dal tumore del topo con numerose proteine della matrice extracellulare. La piastra di coltura tissutale non trattata è necessaria per il rivestimento di vitronectina. Il rivestimento Matrigel funziona sia per piastre di coltura tissutale trattate che non trattate. - Scongelare e placcare 1-3 milioni di hiPSC su ciascun piatto rivestito da 10 cm precaricato con 8 ml di terreno completo Essential E8 integrato con inibitore ROCK (concentrazione finale 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1).
NOTA: L'aggiunta di inibitore ROCK (Y-27632 o Chroman1) al terreno di coltura delle cellule staminali riduce al minimo l'apoptosi indotta dalla dissociazione dopo la scissione e la conservazione criogenica. Chroman1 ha recentemente dimostrato di essere più potente di Y-27632 nell'inibire sia ROCK1 che ROCK224. - Passare a 10 mL di terreno completo E8 senza inibitore ROCK dopo che le iPSC formano colonie, tipicamente dopo 1-2 giorni. Mantenere la coltura iPSC nel mezzo completo E8 e sostituire il surnatante con terreno fresco a giorni alterni.
- Integrare l'enzima di marcatura di prossimità, la perossidasi ascorbato ingegnerizzata (APEX2), nel C-terminale del gene endogeno LAMP1 mediante l'ingegneria del genoma CRISPR. Per i passaggi dettagliati per generare una linea cellulare stabile ingegnerizzata, fare riferimento al metodo precedentemente pubblicato (Frankenfield et al). 22.
- Scongelare Matrigel in un secchiello per il ghiaccio a 4 °C durante la notte, aliquote 500 μL della soluzione in tubi sterili freddi e conservare le aliquote a -80°C. Preparare 50 mL di soluzione di rivestimento aggiungendo 500 μL del materiale madre Matrigel in 49,5 mL di terreno freddo DMEM/F12.
- Differenziazione iPSC-neurone umana (3 giorni)
- Rivestire un piatto di coltura cellulare da 10 cm per una notte con 4 ml di soluzione di rivestimento Matrigel in un incubatore a 37 °C prima della differenziazione.
- Mantenere le hiPSC fino a ~ 70% di confluenza. Lavare delicatamente le hiPSC con soluzione salina tamponata fosfato (PBS) 2x per rimuovere le cellule morte. Aspirare il PBS e aggiungere 3 mL di Accutase al piatto di cellule da 10 cm. Agitare la piastra per una distribuzione uniforme e incubare per 8 minuti in un'incubatrice a 37 °C.
- Aggiungere 2 ml di PBS per lavare e sollevare le celle dalla piastra e raccogliere tutta la soluzione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 × g per 5 min. La piastra 2-4 × 106 hiPSCs su una piastra rivestita Matrigel precaricata con 8 ml di mezzo di induzione dei neuroni caldi (Tabella 1). Distribuire uniformemente le celle e collocarle in un'incubatrice a 37 °C.
NOTA: La differenziazione neuronale è guidata da un fattore di trascrizione inducibile dalla doxiciclina, la neurogenina-2 (NGN2), che è stata sovraespressa in questa linea cellulare stabile hiPSC15. - Lavare delicatamente le hiPSC con PBS il giorno 1 di differenziazione per rimuovere i detriti di cellule morte. Sostituire con 10 mL di mezzo di induzione caldo senza inibitore ROCK.
- Cambiare con mezzo di induzione caldo senza inibitore ROCK ogni giorno fino al giorno 3 di differenziazione.
NOTA: I neuroni sono pronti per essere riplaccati in mezzo neuronale.
- Placcare i neuroni e mantenere la coltura dei neuroni (10 giorni)
- Preparare una soluzione di rivestimento di poli-L-ornitina (PLO) da 0,1 mg/ml in tampone borato (Tabella 1).
- Rivestire un piatto di coltura cellulare con la soluzione di rivestimento PLO in un incubatore a 37 °C per almeno 1 ora o durante la notte prima della placcatura dei neuroni del giorno 3. Lavare il piatto con 4 ml di acqua sterile tre volte e lasciarlo asciugare completamente all'aria all'interno dell'armadio di biosicurezza.
- Dissociare i neuroni del giorno 3 da ogni piatto da 10 cm con 3 ml di Accutase e placcare 8-10 milioni di cellule su ogni piatto rivestito di OLP da 10 cm precaricato con mezzo neuronale corticale caldo (Tabella 1).
- Eseguire un cambiamento semi-medio ogni 2-3 giorni con il mezzo neuronale caldo fino a quando i3neuroni raggiungono la maturazione in 2 settimane dopo la differenziazione.
2. Marcatura di prossimità in situ e lisi neuronale (2 ore)
- Preparare 500 mM di soluzione madre di biotina-fenolo (BP) in dimetilsolfossido (DMSO) e conservare a -20 °C. Il giorno della marcatura di prossimità, diluire la soluzione madre di BP con un mezzo neuronale caldo e trattare i neuroni a una concentrazione finale di 500 μM per 30 minuti in un incubatore a 37 °C.
NOTA: La doxiciclina viene aggiunta nel mezzo neuronale, che attiverà l'espressione dell'enzima APEX. La doxciclina deve essere aggiunta almeno 24 ore prima dell'esperimento di etichettatura di prossimità. - Avviare la reazione di marcatura aggiungendo H 2 O2ad una concentrazione finale di 1 mM nella coltura neuronale e incubare per esattamente 1 minuto. Aspirare immediatamente il mezzo e risciacquare 3 volte con tampone tempra (Tabella 1).
NOTA: La soluzionedi H 2 O2 deve essere preparata fresca prima della reazione di etichettatura. L'attivazione di H 2 O 2 deve essere esattamente 1 min per ridurre la variazione sperimentale e minimizzare lo stress ossidativo causato dal trattamento prolungato con H 2 O2. - Inclinare la piastra per aspirare tutto il tampone residuo. Aggiungere tampone di lisi cellulare ghiacciato (Tabella 1) direttamente sulla piastra neuronale. Utilizzare 100 μL di tampone di lisi cellulare per 1 milione di neuroni. Ruotare la piastra per una sufficiente lisi cellulare e posizionarla sul ghiaccio.
- Raschiare i lisati cellulari in tubi freddi da 1,5 ml. Sonicare in un bagno di acqua ghiacciata utilizzando un sonicatore da bagno (>100 W) per 15 minuti alternando 40 s on, 20 s off cicli.
NOTA: Una soluzione proteica sufficientemente lisata deve essere limpida senza pellet o bolle eccessive. Una sufficiente sonicazione del lisato cellulare è fondamentale per tagliare gli acidi nucleici e ridurre la viscosità del lisato cellulare per ridurre il legame non specifico nelle procedure a valle. Un sonicatore a sonda può anche essere utilizzato per fornire una lisi cellulare più forte e più veloce, ma è necessario lavare la sonda tra i campioni per ridurre al minimo la contaminazione incrociata e la perdita del campione. - Aggiungere acetone freddo (-20 °C) al campione con un volume 4 volte superiore di tampone di lisi. Vortice brevemente e incubare a -20 °C per 3 ore.
- Centrifugare a 16.500 × g per 10 minuti a 2 °C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet proteico. Lavare il pellet con 1 mL di acetone 2x a -20 °C e rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione.
- Asciugare il pellet proteico con un concentratore sottovuoto per 1 minuto. Aggiungere tampone di lisi cellulare per sciogliere completamente il pellet. Sonicare brevemente se necessario. Conservare i campioni a -80 °C.
NOTA: La precipitazione dell'acetone può rimuovere il residuo di biotina-fenolo nel campione, che può interferire con l'arricchimento a valle delle proteine biotinilate.
3. Microscopia a fluorescenza per convalidare la localizzazione e l'attività di APEX (1,5 giorni)
- Incubare i3neuroni che esprimono LAMP1-APEX endogeno con 500 μM BP per 30 minuti a 37 °C. Attivare l'etichettatura con 1 mM H 2 O2trattamento per solo 1 s per limitare la diffusione della nube di biotina.
- Fissare immediatamente le cellule con paraformaldeide al 4% nel tampone di tempra e lavare delicatamente 3 volte con PBS.
NOTA: Per un piatto da 10 cm, sono necessari 4-6 ml per un lavaggio sufficiente. - Bloccare e permeabilizzare le cellule usando il 3% di siero d'asina e lo 0,1% di saponina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Incubare le cellule con l'anticorpo primario anti-LAMP1 (monoclonale di topo H3A4, 1:1.000) per una notte a 4 °C.
- Lavare i neuroni 3 volte delicatamente con PBS. Incubare i neuroni con anticorpo secondario AF561 anti-topo (1:1.000) e streptavidina-680 (1:1.000) per 1 ora a RT.
- Lavare 2x con PBS e incubare con Hoechst o marcatore nucleare 4',4-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per 10 minuti a RT. Risciacquare le cellule 2x con PBS.
- Visualizza i neuroni fissi al microscopio a fluorescenza. Osservare le proteine biotinilate colorate con streptavidina e colocalizzate con colorazione LAMP1 al di fuori del nucleo per convalidare la corretta posizione dell'attività APEX.
4. Determinazione del rapporto tra sfere di streptavidina e proteine in ingresso (1,5 giorni)
- Eseguire un saggio proteico compatibile con detergente (DCA) per determinare le concentrazioni proteiche totali nei lisati cellulari
- Sciogliere la proteina sierica albumina bovina (BSA) standard nel tampone di lisi cellulare ad una concentrazione di 4 mg/ml. Preparare una serie di soluzioni standard per proteine BSA (0,2-2 mg/ml, 5 diluizioni) utilizzando il tampone di lisi cellulare.
- Trasferire 5 μL da ciascun campione proteico, soluzione standard di proteina BSA e tampone di lisi a cellule bianche in triplice copia in ciascun pozzetto in una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 2 μL di reagente S per 1 mL di reagente A per ottenere il reagente A'. Aggiungere 25 μL di reagente A' a ciascun pozzetto. Aggiungere 200 μL di reagente B a ciascun pozzetto. Mescolare e far scoppiare le bollicine se presenti.
- Incubare quella piastra a 96 pozzetti a RT per 15 minuti, leggere l'assorbanza a 750 nm in un lettore di micropiastre e quantificare le concentrazioni di campioni proteici in base alla curva standard BSA.
- Saggio di titolazione delle perle dot blot (1,5 giorni)
- Trasferire una serie di fanghi magnetici di sfere di streptavidina (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) in provette per strisce PCR. Posizionare i tubi della striscia PCR su un rack magnetico, lavare le perline 3 volte con 100 μL di tampone SDS al 2% e rimuovere completamente il tampone di lavaggio mentre si è sul rack magnetico.
- Aggiungere 50 μg di campione proteico a ciascuna provetta. Aggiungere altro tampone di lisi ad un volume totale di 80 μL. Chiudere ermeticamente ogni tubo e ruotare a 4 °C durante la notte.
- Centrifugare brevemente i tubi della striscia PCR su una microcentrifuga da banco. Posizionare i tubi della striscia PCR su un rack magnetico per 1 minuto. Individuare 2 μL di surnatante da ciascun tubo su una membrana di nitrocellulosa secca e lasciare asciugare completamente la membrana.
NOTA: Se l'intensità del segnale è bassa, è possibile individuare più di 2 μL sulla membrana. Il volume può essere aumentato individuando più volte sullo stesso punto dopo che la membrana è stata asciugata all'aria ogni volta. È possibile utilizzare anche un apparato Bio-Dot. - Incubare la membrana in tampone bloccante (TBS) per 1 ora. Incubare la membrana in Streptavidina Alexa Fluor 680 coniugato (1:1.000 in tampone bloccante) per 1 ora. Quindi, lavare la membrana con TBS-T (Tabella 1) 5x.
NOTA: Un'alternativa al test dot blot è il western blotting utilizzando un anticorpo streptavidina. - Misurare il segnale fluorescente di ciascun punto sulla membrana sotto la lunghezza d'onda di 680 nm e generare un grafico a dispersione con segnale fluorescente sul volume delle perline. Selezionare il volume ottimale di perle necessarie per 50 μg di campione proteico in ingresso in base a dove termina il decadimento esponenziale della curva.
NOTA: L'intensità della fluorescenza rappresenta l'abbondanza di proteine biotinilate nel surnatante, che dovrebbe diminuire con l'aumentare delle quantità di perle.
5. Arricchimento delle proteine biotinilate e digestione on-beads (3 giorni)
- Trasferire campioni di lisato proteico da -80 °C e sonicare i campioni in provette da 1,5 ml per 30 s in un sonicatore da bagno per scongelare rapidamente le soluzioni. Vortice e posizionare le provette di campione sul ghiaccio.
- Trasferire 250 μL di liquame magnetico di sfere magnetiche di streptavidina (SA) in ciascun tubo da 1,5 ml. Mettere i tubi su una griglia magnetica, lavare le perline 3x con 1 mL di tampone di lavaggio A (2% SDS) e rimuovere il tampone residuo.
- Sulla base dei risultati del test dot blot e del test della proteina DC, calcolare la quantità di campione proteico (μg) necessaria per 250 μL di liquame magnetico di sfere di streptavidina.
NOTA: In questa sonda LAMP1-APEX espressa in modo endogeno, sono necessari 5 μL di perline per 50 μg di proteine in ingresso. Pertanto, 2,5 mg di proteine totali vengono aggiunti a 250 μL di perline. Meno di 250 μL di sfere SA possono essere utilizzate per un numero limitato di materiali campione in ingresso. - Aggiungere tampone di lisi cellulare al tubo contenente la miscela magnetica perla-lisato fino ad un volume totale di 1 mL e ruotare a 4 °C durante la notte.
NOTA: I campioni di diversi gruppi o repliche devono essere normalizzati alla stessa concentrazione proteica, volume e quantità di perline per ridurre le variazioni sperimentali. - Ruotare brevemente tutti i tubi su una microcentrifuga da banco e posizionare i tubi su un rack magnetico per 1 minuto. Rimuovere il surnatante mentre si è sul rack magnetico.
NOTA: è fondamentale attendere 1 minuto dopo aver posizionato ogni volta le provette sul rack magnetico. Ciò può ridurre al minimo la perdita di perline a causa della piccola quantità invisibile di perline che si muovono ancora verso il magnete nella soluzione. - Lavare le perline 2x con 1 mL di Wash Buffer A a RT (rotazione di 5 minuti ogni volta). Ripetere il processo con ogni tampone di lavaggio 2 volte in sequenza a 4 °C. (Buffer B, Buffer C e Buffer D; Tabella 1).
NOTA: Un'alta concentrazione di soluzione SDS può precipitare a basse temperature. Il primo lavaggio deve essere eseguito presso RT. - Metti i tubi sul rack magnetico. Lavare le perline 2x con Buffer D per rimuovere completamente il detersivo residuo. Risospendere le sfere in 100 μL di tampone Tris da 50 mM e aggiungere 5 mM TCEP (concentrazione finale) per incubare per 30 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min.
- Aggiungere 15 mM di iodoacetamide (IAA, concentrazione finale) a ciascuna provetta e incubare per 30 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min al buio (tappo miscelatore).
NOTA: IAA è sensibile alla luce e deve essere fatto fresco 5 minuti prima di questo passaggio. - Aggiungere 5 mM TCEP (concentrazione finale) per estinguere l'eccesso di IAA. Incubare per 10 minuti a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata con agitazione a 1.200 giri/min (tappo miscelatore spento).
- Centrifugare brevemente le provette e posizionarle su una griglia magnetica per 1 minuto per rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 μL di 5 mM TCEP in 50 mM di tampone Tris per risospendere le perle. Aggiungere 1 μg di miscela Tripsina/Lys-C al campione e incubare per 14 ore a 37 °C in un miscelatore a temperatura controllata, agitando a 1.200 giri/min.
- Aggiungere altri 0,2 μg di miscela Tripsina/Lys-C e digerire per 3 ore.
- Ruotare brevemente le provette e metterle su un rack magnetico per 1 minuto. Trasferire il surnatante peptidico per pulire i tubi mentre su un rack magnetico. Lavare le perle con 50 μL di tampone Tris da 50 mM (agitando per 5 minuti) e unire i supernatanti peptidici.
- Aggiungere 30 μL di acido trifluoroacetico al 10% (TFA) al tubo contenente il surnatante peptidico per ottenere pH <3.
6. Dissalazione e frazionamento dei peptidi (2 ore)
- Bagnare la piastra di estrazione in fase solida a fase inversa (solo i pozzetti per l'uso) con 200 μL di metanolo di grado HPLC (MeOH) 3x sul collettore del vuoto. Aggiungere 200 μL di TFA all'1% in acqua di grado HPLC 3x per equilibrare la piastra.
- Caricare i campioni di peptide nella piastra, accendendo lentamente il vuoto per una velocità di flusso inferiore a 3 goccioline / s per ridurre al minimo la perdita del campione.
- Lavare la piastra di estrazione 3x con 200 μL di TFA all'1%. Lavare nuovamente la piastra di estrazione con 200 μL di TFA all'1% contenente il 2% di MeOH (v/v). Mantenere la velocità del flusso inferiore a 3 goccioline/s.
- Sostituire la piastra di raccolta con una piastra di raccolta a 96 pozzetti. Se non è necessario frazionare, eluire i campioni di peptidi 3x con 100 μL di TFA all'1% contenente l'80% di MeOH e combinare in una nuova provetta. Asciugare i campioni di peptidi in un concentratore sottovuoto senza calore.
NOTA: Se si desidera il frazionamento, i campioni di peptide possono essere eluiti in 4 frazioni utilizzando successivamente 200 μL di TFA all'1% contenenti rispettivamente il 15%, 35%, 50% e 90% di MeOH in una piastra di raccolta diversa.
7. Saggio colorimetrico di quantificazione peptidica (facoltativo) (1 ora)
- Risospendere i campioni di peptide in 50 μL di acqua di grado LC-MS e prelevare 20 μL di aliquote per eseguire il test peptidico.
NOTA: Questo passaggio consuma una grande quantità di campione di peptide, ma può fornire una quantificazione accurata della concentrazione di peptidi prima dell'analisi LC-MS. Questo viene in genere condotto solo una volta per tipo di campione per il test prima della preparazione del campione su larga scala. - Preparare diluizioni seriali delle soluzioni peptidiche standard (fornite nel kit di analisi colorimetrica) nell'acqua di grado LC-MS. Preparare il reagente di lavoro mescolando il 50% di reagente A, il 48% di reagente B e il 2% di reagente C.
- Trasferire 20 μL di ciascuna soluzione standard di peptide (tre repliche) e il campione peptidico sconosciuto in una micropiastra da 96 pozzetti. Aggiungere 180 μL del reagente di lavoro a ciascun pozzetto, mescolare bene e incubare la piastra per 30 minuti a RT.
- Leggere l'assorbanza a 480 nm in un lettore di micropiastre e quantificare le concentrazioni di campioni peptidici in base alla curva standard del peptide.
8. Analisi LC-MS
- Risospendere i campioni di peptidi in LC Buffer A (2% acetonitrile e 0,1% acido formico, grado LC-MS). Centrifugare a 16.500 × g per 10 minuti a 4 °C per eliminare eventuali particelle.
- Trasferire il surnatante nei flaconcini di LC-MS. Analizzare i campioni utilizzando uno strumento nanoLC-MS.
NOTA: I parametri dettagliati LC-MS/MS dipendono dallo strumento e sono stati descritti in precedenza22,25,26. - Generare un elenco di esclusione LC-MS personalizzato con una gamma di tempi di ritenzione per picchi peptidici contaminanti altamente abbondanti come streptavidina e tripsina con precisione di massa di 5 ppm 22 (ad esempio, i picchi comuni del peptide streptavidina sono m / z 402.5435 [carica 3], m / z 603.3117 [carica 2], m / z 654.9733 [carica 3], m / z 678.6812 [carica 3], m / z 1017.5182 [carica 2], and so on.; I picchi comuni del peptide tripsina sono M/Z 421.7584 [carica 2], m/z 523.2855 [carica 2] e m/z 737.7062 [carica 3]).
9. Analisi dei dati di proteomica
- Analizza i dati grezzi LC-MS con software di analisi dei dati di proteomica come Proteome Discoverer, MaxQuant27 o MS-Fragger28. Includere due biblioteche FASTA per l'analisi dei dati: 1) una banca dati di riferimento Homo Sapiens di Swissprot; 2) una libreria FASTA di contaminanti universali di nuova generazione (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), che ha dimostrato di migliorare l'identificazione proteomica e ridurre le false scoperte29.
- Impostare i parametri di analisi dei dati di proteomica con un cutoff dell'1% del tasso di falsa scoperta (FDR) per le identificazioni di corrispondenza spettrale di proteine e peptidi (PSM). Selezionare la digestione della tripsina con un massimo di tre scissioni mancate, una modifica fissa della carbamidometilazione della cisteina e una modifica variabile dell'ossidazione della metionina e dell'acetilazione N-terminale della proteina. Utilizzare le intensità di picco del peptide MS1 per una quantificazione senza marcatura. Normalizzare le intensità del peptide alla carbossilasi biotinilata endogenamente, propionil-CoA carbossilasi (PCCA), per ridurre le variazioni di marcatura di prossimità, come descritto in precedenza22.
NOTA: la normalizzazione PCCA può essere selezionata nel software Proteome Discoverer includendo un file FASTA della sequenza proteica PCCA. In alternativa, la normalizzazione PCCA può essere condotta nell'analisi dei dati a valle. - Esportare i risultati a livello proteico dal software di proteomica. Rimuovere le proteine contaminanti prima dell'analisi statistica29. Rimuovere le proteine con solo 1 PSM o nessun risultato di quantificazione. Condurre analisi a termine dell'ontologia genica proteica (GO) con Enrichr30 e analisi della rete proteica con STRING31.
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Representative Results
Questo studio di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma è stato condotto in neuroni umani derivati da iPSC per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in situ nei neuroni vivi. Le morfologie cellulari delle hiPSC e dei neuroni derivati dall'hiPSC in diversi punti temporali sono illustrate nella Figura 2A. Le iPSC umane crescono in colonie in mezzo E8. La differenziazione viene avviata mediante placcatura delle iPSC in un mezzo di induzione neuronale contenente doxiciclina. Le estensioni della neurite diventano più visibili ogni giorno durante la differenziazione di 3 giorni. Dopo il passaggio a piastre rivestite di OLP nel mezzo neuronale, i neuriti formano una rete tra i neuroni e le estensioni assonali diventano più visibili quando i neuroni raggiungono la maturazione in 2 settimane. In i3Neuroni, la localizzazione della sonda APEX è validata mediante microscopia a fluorescenza dopo rapida attivazione di APEX. Le proteine biotinilate sono colorate usando l'anticorpo streptavidina (SA) e i lisosomi sono colorati usando l'anticorpo anti-LAMP1. L'immagine unita convalida la corretta localizzazione di LAMP1-APEX nella proteina esca (Figura 2B).
Il test di titolazione delle perle è fondamentale per determinare il rapporto ottimale perle-proteine in modo che la quantità di perle di streptavidina sia sufficiente ad arricchire tutte le proteine biotinilate ma non così eccessiva da causare una grave contaminazione da streptavidina nella LC-MS. Il volume ottimale di perle necessarie per 50 μg di campione proteico in ingresso viene selezionato sulla base di dove termina il decadimento esponenziale della curva (Figura 3A) Come mostrato nella Figura 3A, i segnali dot-blot del supernatante di incubazione di perline-proteina sono diminuiti man mano che più proteine biotinilate sono state catturate con maggiori quantità di sfere di streptavidina. Per i campioni endogeni di LAMP1-APEX, 5 μL di perle di streptavidina erano ottimali per 50 μg di proteine di input (evidenziate nella Figura 3A). Dopo l'arricchimento, la quantità di proteine catturate dalle perle di streptavidina è sconosciuta. L'eccesso di enzima proteolitico (tripsina) può aumentare l'autodigestione enzimatica, con abbondanti picchi di peptide tripsina in LC-MS. L'eccessiva tripsina può anche digerire più peptidi di streptavidina nei campioni. Pertanto, la quantità di proteasi necessaria per la digestione on-beads dovrebbe essere ottimizzata. Rispetto alla sola tripsina, la digestione on-beads con la miscela Trypsin/Lys-C ha portato all'identificazione di più proteine e peptidi e meno scissioni mancate (Figura 3B). Inoltre, 1-1,5 μg di proteasi per 250 μL di sfere magnetiche di streptavidina sono stati ottimali per ottenere il maggior numero di proteine identificate e la più bassa percentuale di scissioni mancate (Figura 3C). Con un rapporto ottimale perline-proteine, la stessa quantità di perle dovrebbe catturare la stessa quantità di proteine biotinilate. Pertanto, questa quantità ottimizzata di proteasi può essere utilizzata per tutti gli esperimenti che arricchiscono le proteine biotinilate utilizzando le stesse sfere magnetiche di streptavidina.
Gli enzimi di marcatura di prossimità a base di perossidasi sono attivati mediante incubazione di biotina-fenolo e breve trattamento con H 2 O2(1 min). Questo passaggio è una delle principali fonti di variazione nella proteomica della marcatura di prossimità. In precedenza abbiamo scoperto che la normalizzazione alla carbossilasi più abbondante, endogenamente biotinilata, PCCA, può ridurre significativamente le variazioni sperimentali, consentendo il confronto dei dati di proteomica dell'etichettatura di prossimità tra diversi lotti sperimentali (Figura 4) 22. Per i neuroni endogeni LAMP1-APEX, la linea parentale senza espressione della sonda LAMP1-APEX è stata utilizzata come gruppo di controllo. I neuroni di controllo sono stati trattati anche con biotina-fenoloe H 2 O2. La distribuzione dei rapporti proteici di LAMP1-APEX rispetto al gruppo di controllo è illustrata nella Figura 5A. Tutte le carbossilasi endogenamente biotinilate sono state arricchite da perle rivestite di streptavidina ma sono rimaste invariate. Come mostrato nell'analisi GO-term e nell'analisi della rete proteica (Figura 5B,C), sia le proteine stabili della membrana lisosomiale che gli interattori lisosomiali transitori correlati al traffico e al trasporto endolisosomiale sono stati arricchiti nella proteomica LAMP1-APEX32,33,34.
Figura 1: Flusso di lavoro complessivo per la proteomica della marcatura di prossimità del lisosoma nei neuroni derivati dall'hiPSC. Abbreviazioni: hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta dall'uomo; LAMP1 = proteina di membrana associata lisosomiale 1; APEX = ascorbato perossidasi; dox = doxiciclina; BP = biotina-fenolo; DCA = saggio proteico compatibile con detergenti; SA = streptavidina; LC-MS/MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem; PCCA = propionil-CoA carbossilasi, una proteina biotinilata endogenamente. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Imaging microscopico dei neuroni derivati da hiPSC e dell'attività di LAMP1-APEX. (A) Immagini al microscopio in campo chiaro di diversi stadi di hiPSCs e neuroni derivati da hiPSC. (B) Imaging a fluorescenza dell'attività di LAMP1-APEX nel neurone. I segnali biotinilati colorati contro la streptavidina colocalizzano con la colorazione LAMP1 all'esterno del nucleo (HOECHST). Barre della scala = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Abbreviazioni: hiPSC = cellula staminale pluripotente indotta dall'uomo; LAMP1 = proteina di membrana associata lisosomiale 1; APEX = ascorbato perossidasi; SA = streptavidina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: L'ottimizzazione del rapporto tra perline e proteine in ingresso e la digestione enzimatica delle proteine può migliorare l'identificazione delle proteine e ridurre le interferenze . (A) Esempio di saggio di titolazione delle perle risulta da un saggio dot-blot che utilizza 50 μg di proteine in ingresso e diverse quantità di perle di streptavidina. (B) La miscela tripsina/Lys-C ha determinato una migliore identificazione di proteine/peptidi e un minor numero di scissioni mancate rispetto alla sola tripsina. (C) Ottimizzazione della quantità di tripsina/Lys-C per la digestione on-beads. Questa cifra è stata modificata da Frankenfield et al.22. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: La normalizzazione dei dati di proteomica dell'etichettatura di prossimità a una carbossilasi biotinilata endogenamente, PCCA, può ridurre le variazioni di quantificazione tra le repliche biologiche. Questa cifra è stata modificata da Frankenfield et al.22. Abbreviazione: PCCA = propionil-CoA carbossilasi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: La proteomica di marcatura di prossimità dei lisosomi ha arricchito le proteine di membrana lisosomiale e le proteine interagenti lisosomiali nei neuroni . (A) Grafico a dispersione dei rapporti di abbondanza proteica di LAMP1-APEX rispetto a nessun controllo APEX che mostra proteine di membrana lisosomiale arricchite e proteine biotinilate endogenamente immodificate. (B) Analisi a termine dei risultati della proteomica che dimostrano la componente cellulare arricchita al lisosoma. (C) Analisi della rete proteica STRING che mostra che le proteine interagiscono direttamente con la proteina esca (LAMP1), le proteine lisosomiali di membrana e gli interattori lisosomiali come le proteine di traffico di membrana. Questa cifra è stata modificata da Frankenfield et al.22. Abbreviazioni: LAMP1 = proteina di membrana associata lisosomiale 1; APEX = ascorbato perossidasi; GO = ontologia genica. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Medio/Buffer | Componente | Protocollo | ||
| Soluzione di rivestimento a matrice di membrana basale (Matrigel) | 1% matrice di membrana basale grezzo, 99% DMEM/F12 medio | 1.1, 1.2 | ||
| Soluzione di rivestimento di vitronectina | Concentrazione finale di 5 μg/mL in PBS | 1.1 | ||
| E8 mezzo completo con inibitore ROCK | 98% E8 medio, 2% integratore E8, 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Mezzo di induzione neuronale | 97% DMEM/F12 con HEPES, 1% integratore di N2, 1% aminoacidi non essenziali (NEAA), 1% L-glutammina, 2 μg/mL doxiciclina e inibitore ROCK (10 μM Y-27632 o 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Soluzione di rivestimento Neuron PLO | 0,1 mg/mL di poli-L-ornitina (PLO), 100 mM di acido borico, 25 mM di tetraborato di sodio, 75 mM di cloruro di sodio, 1 M di idrossido di sodio | 1.3 | ||
| Neurone medio | 98% neurone corticale medio, supplemento di B27 al 2%, fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) da 10 ng/ml, fattore neurotrofico di derivazione gliale (GDNF) da 10 ng/ml, NT-3 0,2 μg/mL, 2 μg/mL doxiciclina | 1.3 | ||
| Buffer di tempra | 10 mM di azoturo di sodio, 10 mM di ascorbato di sodio, 5 mM di TROLOX in PBS | 2.2 | ||
| Tampone di lisi cellulare | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Tritone, 1 mM Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato (TCEP), 10 mM azide di sodio, 10 mM ascorbato di sodio, 5 mM TROLOX, cocktail inibitore della proteasi | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Buffer A | Buffer SDS al 2% | 5.2 | ||
| Buffer B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer D | 2 M Urea, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabella 1: Composizioni di supporti e buffer utilizzati in questo protocollo.
| Problema | Protocollo | Soluzione/Suggerimento | ||||
| La coltura iPSC si stacca dalla piastra | 1.1 | Aumentare la concentrazione o il tempo del rivestimento di vitronectina. | ||||
| Alcune iPSC non si differenziavano in neuroni | 1.2 | Aumentare il tempo di trattamento della soluzione di distacco cellulare per dissociare completamente le iPSC durante la differenziazione d0. | ||||
| Coltura di neuroni che si stacca dal piatto | 1.3 | Il lavaggio e il cambio del mezzo devono essere delicati e dalla parete laterale della piastra. | ||||
| Le proteine non si dissolvono completamente dopo la precipitazione dell'acetone | 2.7 | Ridurre il tempo di asciugatura del pellet proteico. Aumentare il volume del tampone di lisi e sonicare brevemente per aiutare la dissoluzione. | ||||
| Deboli segnali di colorazione della streptavidina | 3 | Aumentare il tempo di trattamento H 2 O2a 2-3 s e ruotare la piastra per una distribuzione uniforme. | ||||
| Saggio di titolazione a basso segnale delle sfere | 4.2 | Attendere che la membrana sia completamente asciutta e aggiungere più surnatante nello stesso punto (può ripetere fino a 3x) per migliorare l'intensità del segnale. | ||||
| Perle magnetiche non pellet verso cremagliera magnetica | 5 | La mobilità delle sfere magnetiche diminuisce nel tampone non contenente detergente. Una maggiore concentrazione di urea fino a 4 M o detergente compatibile con LC-MS può essere utilizzato nel tampone di lavaggio D. | ||||
| Perdita di perline magnetiche durante il lavaggio delle perline | 5 | Aumentare il tempo di attesa quando le provette vengono posizionate sulle sfere magnetiche (1 minuto o più) prima di prelevare il surnatante dalle provette. | ||||
| Picchi di contaminazione caricati singolarmente in LC-MS | 6 | La pulizia dei peptidi non è sufficiente. Aumentare i volumi e i tempi di lavaggio durante la desalinizzazione dei peptidi. | ||||
| Saggio peptidico segnale basso | 7 | Risospendere i campioni di peptidi in volume inferiore per aumentare la concentrazione di peptidi. | ||||
| Segnali schiaccianti di streptavidina in LC-MS | 8 | Ridurre la quantità di perle di streptavidina. Se anche il picco di tripsina è abbondante, ridurre la quantità di tripsina. | ||||
| Troppi sfondi di etichettatura non specifici | 9 | Il lavaggio delle perline di streptavidina non era sufficiente. Rimuovere tutto il liquido residuo durante ogni fase di lavaggio. Aumentare il tempo e il volume per il lavaggio delle perline. | ||||
Tabella 2: Risoluzione dei problemi e soluzioni.
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Discussion
Utilizzando questa sonda LAMP1-APEX, le proteine sopra e vicino alla membrana lisosomiale sono biotinilate e arricchite. Dato il tipico diametro del lisosoma di 100-1.200 nm, questo metodo fornisce un'eccellente risoluzione intracellulare con un raggio di marcatura di 10-20 nm. LAMP1 è un'abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marker classico per i lisosomi, che funge da eccellente proteina esca per la marcatura lisosomiale APEX a livello di espressione endogena. Tuttavia, esistono limitazioni anche quando si utilizza LAMP1 per colpire i lisosomi, poiché LAMP1 è presente anche negli endosomi tardivi e nei lisosomi non degradativi35. La maggior parte dei marcatori lisosomiali sono espressi anche negli endosomi tardivi, che alla fine maturano in lisosomi. Le proteine esca alternative ai lisosomi bersaglio sono LAMPTOR, LAMP2 e TMEM19235,36,37. È importante notare che i radicali reattivi della biotina non penetrano nella membrana. Pertanto, la maggior parte delle proteine lisosomiali solo lume non sono catturate in questo metodo di proteomica LAMP1-APEX. Le proteine del lume lisosomiale possono essere ottenute mediante isolamento lisosomiale tramite il metodo tradizionale di centrifugazione a gradiente o immunopurificazione lisosomiale 4,38. Tuttavia, le proteine sulla membrana lisosomiale possono essere interrotte durante l'isolamento lisosomiale e perdere le informazioni per interazioni lisosomiali transitorie e dinamiche. Pertanto, la marcatura di prossimità lisosomiale e l'isolamento lisosomiale possono essere combinati per ottenere un'istantanea completa delle attività lisosomiali sia all'esterno che all'interno dei lisosomi.
Per ridurre al minimo la variabilità dalla coltura di neuroni iPSC, la densità di placcatura neuronale deve essere coerente tra tutte le repliche biologiche e i gruppi di confronto. Anche gli stessi livelli di maturazione neuronale e salute sono fondamentali per questo motivo. Durante l'attivazione di APEX, l'aggiunta di biotina-fenolo e H 2 O2alle cellule deve essere effettuata previa miscelazione con terreno di coltura caldo e quindi aggiungendo la miscela alle cellule, seguita da agitazione immediata e delicata per garantire una distribuzione uniforme. L'uso diH 2 O2 solleva anche preoccupazioni sullo stress ossidativo e sulle perturbazioni nel microambiente dinamico della cellula. Sebbene non siano stati riscontrati cambiamenti significativi a livello di abbondanza proteica, più peptidi sono stati modificati con l'ossidazione della metionina nei neuroni H 2 O2trattati rispetto ai neuroni di controllo22. Pertanto, un controllo rigoroso del tempo di attivazione di H 2 O2(1 min) è fondamentale per minimizzare lo stress ossidativo e ridurre la diffusione della nube di biotina per garantire uno specifico raggio di marcatura che circonda la proteina esca.
Per le linee cellulari non polarizzate come HEK e U2OS, le cellule possono essere raccolte mediante pelletting dopo l'etichettatura di prossimità per rimuovere il surnatante contenente biotina libera. Tuttavia, i neuroni devono essere raccolti aggiungendo direttamente tampone di lisi cellulare alla piastra e raschiando nei tubi per evitare danni ai neuriti e perdita di campioni durante la pellettizzazione. La presenza di biotina libera può saturare le perle di streptavidina. La rimozione completa della biotina libera può essere ottenuta mediante lavaggi multipli e incubazione con tampone di tempra nei neuroni e / o precipitazione proteica dopo lisi cellulare. Poiché diverse proteine esca hanno diversi livelli di espressione, è necessario condurre un test dot blot per ogni nuova sonda APEX. Una volta determinato il rapporto ottimale sfere/proteine, la quantità di proteine iniziali e il volume delle perle devono essere coerenti per tutte le repliche per la stessa sonda APEX. Quando si confrontano diverse sonde, come LAMP1-APEX rispetto a citosolic-APEX, si raccomanda di utilizzare lo stesso volume di perle ma variare la quantità di proteine di partenza per riflettere i rapporti ottimali perline/proteine per diverse sonde APEX. Per ridurre ulteriormente le variazioni sperimentali e aumentare la produttività, è possibile condurre una marcatura isotopica stabile mediante amminoacidi in coltura cellulare (SILAC)39. La marcatura isobarica multiplata può anche essere utilizzata per marcare chimicamente i peptidi dopo la digestione delle proteine tramite TMT / iTRAQ / DiLeu tag 20,40,41,42.
L'etichettatura di prossimità è stata ampiamente applicata per catturare il microambiente cellulare e molecolare in vari organismi43. Tuttavia, l'etichettatura di prossimità deve ancora affrontare molte sfide tecniche, come la contaminazione da segnali di streptavidina, l'uso di perossido di idrogeno per l'attivazione enzimatica e la presenza di carbossilasi mitocondriali biogenicamente biotinilate. Pertanto, gli esperimenti di proteomica dell'etichettatura di prossimità richiedono un'attenta pianificazione e controllo di qualità. Per aiutare i ricercatori a risolvere i problemi del loro esperimento di etichettatura di prossimità, forniamo una breve guida per i problemi e le soluzioni comuni nella Tabella 2. Più recentemente, è stato sviluppato un metodo di etichettatura di prossimità cleavable utilizzando la biotina25 tiol-cleavable. Le proteine biotinilate possono quindi essere scisse dalle perle utilizzando un reagente riducente come il TCEP senza la necessità di digestione delle perle. Questo metodo di biotina cleavable può ridurre drasticamente i segnali di interferenza da streptavidina, carbossilasi endogenamente biotinilata e legame non specifico. Gli sforzi in corso applicheranno questo metodo di biotina cleavable alla proteomica LAMP1-APEX per migliorare la specificità e l'accuratezza dell'etichettatura. Le sonde di etichettatura di prossimità possono anche essere progettate per colpire altri compartimenti subcellulari44. La quantità e il tipo di proteine identificate dipendono dalla natura della proteina esca, dal suo ambiente intracellulare e dal livello di espressione della sonda di marcatura di prossimità. Questo metodo endogeno di proteomica LAMP1-APEX fornisce un valido strumento per studiare l'attività lisosomiale dinamica nei neuroni umani. Il protocollo dettagliato e l'ottimizzazione della metodologia sono applicabili anche ad altre sonde di etichettatura di prossimità e alla biotinilazione chimica, fungendo da risorsa utile per la comunità proteomica.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è supportato dalla sovvenzione NIH (R01NS121608). A.M.F. riconosce la borsa di studio ARCS-Metro Washington Chapter e la Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Ringraziamo il laboratorio Michael Ward presso il National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) per il supporto alla biologia molecolare e lo sviluppo della tecnologia i3Neuron.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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