Summary
뉴런 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 뉴런에서 동적 리소좀 미세 환경을 특성화하기 위해 여기에 설명되어 있습니다. 리소좀 막 단백질 및 리소좀과 (안정적으로 또는 일시적으로) 상호 작용하는 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 우수한 세포 내 공간 분해능으로이 방법으로 정확하게 정량화 할 수 있습니다.
Abstract
리소좀은 분해 및 기타 다양한 세포 기능을 달성하기 위해 다양한 생체 분자와 자주 통신합니다. 리소좀은 인간의 뇌 기능에 매우 중요한데, 뉴런은 유사분열 후 세포성이고 세포 항상성을 유지하기 위해 자가포식-리소좀 경로에 크게 의존하기 때문입니다. 다양한 리소좀 기능에 대한 이해의 발전에도 불구하고 리소좀과 다른 세포 구성 요소 간의 매우 역동적인 통신을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 여기서, 최근 발표된 인간 유도만능줄기세포(hiPSC) 유래 뉴런에서의 내인(knock-in) 리소좀 근접표지 단백질체에 대한 상세한 프로토콜이 제공된다.
리소좀 막 단백질과 반경 10-20nm 이내의 리소좀을 둘러싼 단백질은 살아있는 인간 뉴런에서 확실하게 식별하고 정확하게 정량화 할 수 있습니다. 프로토콜의 각 단계, 즉 hiPSC-뉴런 배양, 근접 라벨링, 뉴런 수확, 형광 현미경, 비오틴화 단백질 농축, 단백질 분해, LC-MS 분석 및 데이터 분석에 대해 자세히 설명합니다. 요약하면, 이 독특한 내인성 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 방법은 살아있는 인간 뉴런에서 매우 역동적인 리소좀 활성을 연구하기 위한 고처리량의 강력한 분석 도구를 제공합니다.
Introduction
리소좀은 리소좀-자가포식 경로1을 통해 거대분자를 분해하는 이화작용 소기관입니다. 분해 외에도 리소좀은 신호 전달, 영양소 감지 및 분비 2,3,4와 같은 다양한 세포 기능에 관여합니다. 리소좀 기능의 섭동은 리소좀 저장 장애, 암, 노화 및 신경 퇴행과 관련이 있습니다 3,5,6,7. 유사분열 후 및 고도로 편광된 뉴런의 경우, 리소좀은 뉴런 세포 항상성, 신경 전달 물질 방출 및 축삭 8,9,10,11을 따른 장거리 수송에 중요한 역할을 합니다. 그러나 인간 뉴런에서 리소좀을 조사하는 것은 어려운 작업이었습니다. 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 유래 뉴런 기술의 최근 발전으로 이전에는 접근 할 수 없었던 살아있는 인간 뉴런의 배양이 가능해져 동물 모델과 인간 환자 간의 격차를 해소하여 인간의 뇌를 연구합니다12,13. 특히, 진보 된 i3뉴런 기술은 독시사이클린 유도 성 프로모터 하에서 뉴로 게닌 -2 전사 인자를 iPSC 게놈에 안정적으로 통합하여 iPSC가 2 주 만에 순수한 피질 뉴런으로 분화하도록 유도합니다14,15.
매우 역동적인 리소좀 활성으로 인해 다른 세포 구성 요소와의 리소좀 상호 작용을 캡처하는 것은 특히 고처리량 방식으로 기술적으로 어렵습니다. 근접 라벨링 기술은 탁월한 공간 특이성으로 안정 및 일시적 / 약한 단백질 상호 작용을 모두 캡처 할 수 있기 때문에 이러한 동적 상호 작용을 연구하는 데 적합합니다16,17. 조작된 퍼옥시다아제 또는 비오틴 리가아제는 미끼 단백질에 유전적으로 융합될 수 있습니다. 활성화 시, 반응성이 높은 비오틴 라디칼이 생성되어 이웃 단백질을 공유 표지하고, 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS) 플랫폼 17,18,19,20,21을 통해 다운스트림 상향식 단백질체학을 위한 스트렙타비딘 코팅 비드에 의해 농축될 수 있습니다.
내인성 리소좀 근접 표지 단백질체학 방법이i3뉴런22에서 동적 리소좀 미세환경을 포착하기 위해 최근에 개발되었다. 조작된 아스코르브산 과산화효소(APEX2)는 iPSC의 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1)의 C-말단에 녹인되었으며, 이는 피질 뉴런으로 분화될 수 있습니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이며 고전적인 리소좀 마커23입니다. LAMP1은 또한 리소좀으로 성숙하는 후기 엔도좀에서 발현됩니다. 이러한 후기 엔도솜-리소좀과 비분해성 리소좀은 모두 이 프로토콜에서 리소좀이라고 합니다. 생리학적 수준에서 발현되는 이 내인성 LAMP1-APEX 프로브는 LAMP1 오국소화 및 과발현 인공물을 줄일 수 있습니다. 수백 개의 리소좀 막 단백질과 리소좀 인터랙터는 살아있는 인간 뉴런에서 뛰어난 공간 분해능으로 식별하고 정량화할 수 있습니다.
여기서, 인간 iPSC 유래 뉴런에서 리소좀 근접 표지 단백질체학에 대한 상세한 프로토콜이 최근에 공개된 방법(22)으로부터의 추가적인 개선과 함께 기술된다. 전체 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. 이 프로토콜에는 hiPSC 유래 뉴런 배양, 뉴런의 근접 라벨링 활성화, 형광 현미경을 통한 APEX 활성 검증, 최적의 스트렙타비딘 비드 대 입력 단백질 비율 결정, 비오틴화 단백질 농축, 온비드 단백질 분해, 펩타이드 탈염 및 정량화, LC-MS 분석 및 단백질체학 데이터 분석이 포함됩니다. 문제 해결 지침 및 실험 최적화도 근접 라벨링 품질 관리 및 성능을 개선하기 위해 논의됩니다.
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Protocol
모든 절차는 조지 워싱턴 대학교 생물 안전 및 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용된 배지 및 완충액의 조성은 표 1에 제공된다. 여기에 사용된 상업용 제품 정보는 재료 표에 나와 있습니다.
1. 인간 iPSC 유래 뉴런 배양
- 인간 iPSC 배양 및 LAMP1-APEX 프로브 통합(7일)
- Matrigel 원액을 4°C의 얼음 양동이에 밤새 해동하고, 용액 500μL를 차가운 멸균 튜브에 분취하고, 분취량을 -80°C에서 보관한다. 49.5mL의 차가운 DMEM/F12 배지에 500μL의 매트리겔 스톡을 추가하여 50mL의 코팅 용액을 준비합니다.
알림: Matrigel을 차갑게 유지하고 사전 냉각된 원추형 튜브와 피펫 팁을 사용하여 중합을 방지하십시오. 코팅 용액은 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다. - 10cm 세포 배양 접시를 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 코팅 용액 4mL로 코팅합니다.
참고: 비트로넥틴은 iPSC 배양을 위한 5μg/mL 농도 및 2시간 코팅에서 대체 코팅 용액이 될 수 있습니다. Vitronectin (단일 단백질 성분)은 Matrigel보다 비싸지 만 수많은 세포 외 기질 단백질이있는 마우스 종양에서 추출한 Matrigel보다 배치 변형이 적고 배경 신호가 깨끗합니다. 비트로넥틴 코팅을 위해 처리되지 않은 조직 배양 플레이트가 필요합니다. Matrigel 코팅은 처리된 조직 배양 플레이트와 처리되지 않은 조직 배양 플레이트 모두에 적용됩니다. - ROCK 억제제(최종 농도 10μM Y-27632 또는 50nM Chroman1)가 보충된 8mL의 필수 E8 완전 배지가 미리 로드된 각 코팅된 10cm 접시에 1-3백만 hiPSC를 해동 및 플레이트합니다.
참고: 줄기 세포 배양 배지에 ROCK 억제제(Y-27632 또는 Chroman1)를 추가하면 분열 및 극저온 보존 후 해리로 인한 세포자멸사를 최소화할 수 있습니다. Chroman1은 최근 ROCK1과 ROCK224 모두를 억제하는 데 Y-27632보다 더 강력한 것으로 나타났습니다. - iPSC가 콜로니를 형성한 후(일반적으로 1-2일 후) ROCK 억제제가 없는 E8 완전 배지 10mL로 변경합니다. iPSC 배양물을 E8 완전 배지에 유지하고 상청액을 격일로 신선한 배지로 교체합니다.
- 근접 표지 효소인 조작된 아스코르브산 과산화효소(APEX2)를 CRISPR 게놈 엔지니어링에 의해 내인성 LAMP1 유전자의 C-말단에 통합합니다. 조작된 안정한 세포주를 생성하기 위한 자세한 단계는 이전에 공개된 방법(Frankenfield et al)을 참조하십시오. 22.
- Matrigel 원액을 4°C의 얼음 양동이에 밤새 해동하고, 용액 500μL를 차가운 멸균 튜브에 분취하고, 분취량을 -80°C에서 보관한다. 49.5mL의 차가운 DMEM/F12 배지에 500μL의 매트리겔 스톡을 추가하여 50mL의 코팅 용액을 준비합니다.
- 인간 iPSC-뉴런 분화 (3일)
- 분화하기 전에 37°C 인큐베이터에서 4mL의 Matrigel 코팅 용액으로 10cm 세포 배양 접시를 밤새 코팅합니다.
- ~70% 합류할 때까지 hiPSC를 유지합니다. 인산염 완충 식염수(PBS) 2x로 hiPSC를 부드럽게 세척하여 죽은 세포를 제거합니다. PBS를 흡인하고 세포의 10cm 접시에 Accutase3mL를 추가합니다. 균일한 분포를 위해 플레이트를 흔들고 37°C 인큐베이터에서 8분 동안 배양합니다.
- 2mL의 PBS를 추가하여 플레이트에서 세포를 세척하고 들어 올리고 15mL 원뿔형 튜브에 모든 세포 용액을 수집합니다. 세포를 300 ×g에서 5 분 동안 원 심분리하여 펠릿화한다. 8mL의 따뜻한 뉴런 유도 배지가 미리 로드된 매트리겔 코팅 플레이트에 2-4 × 106 hiPSC를 플레이트합니다(표 1). 세포를 골고루 분배하고 37°C 배양기에 넣는다.
참고: 뉴런 분화는 독시사이클린 유도성 전사 인자인 뉴로게닌-2(NGN2)에 의해 구동되며, 이는 이 안정적인 hiPSC 세포주15에서 과발현되었습니다. - 분화 1일째에 PBS로 hiPSC를 부드럽게 세척하여 죽은 세포 파편을 제거합니다. ROCK 억제제가 없는 따뜻한 유도 배지 10mL로 교체합니다.
- 분화 3일째까지 매일 ROCK 억제제가 없는 따뜻한 유도 배지로 교체합니다.
참고: 뉴런은 뉴런 매질에 다시 도금할 준비가 되었습니다.
- 뉴런 도금 및 뉴런 배양 유지(10일)
- 붕산염 완충액에 0.1mg/mL 폴리-L-오르니틴(PLO) 코팅 용액을 준비합니다(표 1).
- 세포 배양 접시를 PLO 코팅 용액으로 37°C 인큐베이터에서 적어도 1시간 동안 또는 3일째 뉴런 도금 전에 밤새 코팅한다. 접시를 멸균수 4mL로 세 번 씻고 생물 안전 캐비닛 내부에서 완전히 자연 건조시킵니다.
- 각 10cm 접시에서 3일차 뉴런을 Accutase 3mL로 해리하고 따뜻한 피질 뉴런 배지가 미리 로드된 각 10cm PLO 코팅 접시에 8-1천만 개의 세포를 플레이트합니다(표 1).
- 분화 후 2 주 후에 i 3 뉴런이 성숙에 도달 할 때까지 따뜻한 뉴런 배지로2-3일마다 반 매체 변경을 수행하십시오.
2. 현장 근접 라벨링 및 뉴런 용해(2시간)
- 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에서 500mM 비오틴-페놀 (BP) 저장 용액을 준비하고 -20 ° C에서 보관하십시오. 근접 라벨링 당일에 BP 스톡 용액을 따뜻한 뉴런 배지로 희석하고 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 최종 농도 500μM의 뉴런을 처리합니다.
참고: 독시사이클린이 뉴런 배지에 첨가되어 APEX 효소 발현이 활성화됩니다. 독소사이클린은 근접 라벨링 실험 최소 24시간 전에 추가해야 합니다. - 뉴런 배양물에 1mM의 최종 농도로 H2O2를 첨가하여 표지 반응을 시작하고 정확히 1분 동안 배양한다. 즉시 배지를 흡인하고 담금질 완충액으로 3회 헹굽니다(표 1).
참고 : H2 O2 용액은 라벨링 반응 전에 신선하게 만들어야합니다. H2O2활성화는 실험 변동을 줄이고 연장된H2O2처리로 인한 산화 스트레스를 최소화하기 위해 정확히 1분이어야 합니다. - 플레이트를 기울여 모든 잔류 버퍼를 흡입합니다. 얼음처럼 차가운 세포 용해 완충액(표 1)을 뉴런 플레이트에 직접 추가합니다. 100만 개의 뉴런당 100μL의 세포 용해 완충액을 사용합니다. 충분한 세포 용해를 위해 플레이트를 소용돌이 치고 얼음 위에 놓습니다.
- 세포 용해물을 차가운 1.5mL 튜브에 긁어냅니다. 목욕 초음파 처리기 (>100 W)를 사용하여 얼음처럼 차가운 수조에서 40 초, 20 초 오프 사이클을 번갈아 가며 15 분 동안 초음파 처리합니다.
알림: 충분히 용해된 단백질 용액은 펠릿이나 과도한 기포 없이 투명해야 합니다. 세포 용해물의 충분한 초음파 처리는 핵산을 전단하고 세포 용해물의 끈적임을 줄여 다운스트림 절차에서 비특이적 결합을 줄이는 데 중요합니다. 프로브 초음파 처리기를 사용하여 더 강력하고 빠른 세포 용해를 제공할 수도 있지만 교차 오염 및 샘플 손실을 최소화하려면 샘플 사이의 프로브를 세척해야 합니다. - 차가운 아세톤 (-20 ° C)을 4 배 부피의 용해 완충액으로 샘플에 첨가하십시오. 와류를 잠깐 동안 -20 ° C에서 3 시간 동안 배양합니다.
- 16,500 × g 에서 2 °C에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 단백질 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다. 펠릿을 -20°C 아세톤 2x 1mL로 세척하고 원심분리 후 상청액을 제거합니다.
- 단백질 펠릿을 진공 농축기로 1분 동안 건조시킵니다. 펠릿을 완전히 용해시키기 위해 세포 용해 완충액을 추가합니다. 필요한 경우 간단히 초음파 처리합니다. 샘플을 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 아세톤 침전은 샘플에서 잔류물 비오틴-페놀을 제거할 수 있으며, 이는 비오틴화 단백질의 다운스트림 농축을 방해할 수 있습니다.
3. APEX 국소화 및 활성을 검증하기 위한 형광 현미경 검사(1.5일)
- 내인성 LAMP1-APEX를 발현하는i3뉴런을 37°C에서 30분 동안 500μM BP로 인큐베이션한다. 비오틴 클라우드의 확산을 제한하기 위해 단 1초 동안 1mMH2O2처리로 표지를 활성화합니다.
- 담금질 완충액에 4% 파라포름알데히드로 세포를 즉시 고정하고 PBS로 3배를 부드럽게 세척합니다.
알림: 10cm 접시의 경우 충분한 세척을 위해 4-6mL가 필요합니다. - 실온(RT)에서 30분 동안 PBS 중 3% 당나귀 혈청과 0.1% 사포닌을 사용하여 세포를 차단하고 투과화합니다.
- 세포를 1차 항-LAMP1 항체(마우스 단일클론 H3A4, 1:1,000)와 함께 4°C에서 밤새 배양합니다.
- PBS로 뉴런을 3 배 부드럽게 씻으십시오. RT에서 1 시간 동안 항 마우스 AF561 2 차 항체 (1 : 1,000) 및 스트렙타비딘 -680 (1 : 1,000)으로 뉴런을 배양합니다.
- PBS로 2x를 세척하고 Hoechst 또는 4',4- 디아 미디노 -2- 페닐 인돌 (DAPI) 핵 마커로 RT에서 10 분 동안 배양합니다. 세포를 PBS로 2x 헹굽니다.
- 고정된 뉴런을 형광 현미경으로 시각화합니다. 스트렙타비딘으로 염색되고 핵 외부의 LAMP1 염색과 공동 국소화된 비오틴화 단백질을 관찰하여 APEX 활성의 정확한 위치를 검증합니다.
4. 스트렙타비딘 비드 대 입력 단백질 비율 결정(1.5일)
- 세제 호환 단백질 분석(DCA)을 수행하여 세포 용해물의 총 단백질 농도 측정
- 소 혈청 알부민(BSA) 단백질 표준물질을 세포 용해 완충액에 4mg/mL 농도로 용해합니다. 세포 용해 완충액을 사용하여 일련의 BSA 단백질 표준 용액(0.2-2 mg/mL, 5회 희석액)을 준비합니다.
- 각 단백질 샘플, BSA 단백질 표준 용액 및 빈 세포 용해 완충액에서 5μL를 삼중으로 96웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
- 시약 A 1mL당 시약 S 2μL를 추가하여 시약 A'를 얻습니다. 각 웰에 25μL의 시약 A'를 추가합니다. 각 웰에 200μL의 시약 B를 추가합니다. 거품이 있으면 섞고 터뜨립니다.
- 96웰 플레이트를 RT에서 15분 동안 배양하고, 마이크로플레이트 리더에서 750nm에서의 흡광도를 읽고, BSA 표준 곡선을 기반으로 단백질 샘플의 농도를 정량화합니다.
- 비즈 적정 도트 블롯 분석(1.5일)
- 일련의 스트렙타비딘 마그네틱 비드 슬러리(20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL)를 PCR 스트립 튜브로 옮깁니다. PCR 스트립 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 100% SDS 버퍼 100μL로 비드를 3배 세척하고 마그네틱 랙에서 세척 버퍼를 완전히 제거합니다.
- 각 튜브에 50μg의 단백질 샘플을 추가합니다. 총 부피 80μL에 용해 완충액을 더 추가합니다. 각 튜브를 단단히 닫고 4°C에서 밤새 회전합니다.
- PCR 스트립 튜브를 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 잠시 원심분리합니다. PCR 스트립 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 각 튜브에서 2μL의 상층액을 건조한 니트로셀룰로오스 멤브레인에 스팟하고 멤브레인이 완전히 건조되도록 합니다.
알림: 신호 강도가 낮으면 멤브레인에 2μL 이상을 발견할 수 있습니다. 부피는 멤브레인이 각 시간 사이에 공기 건조 된 후 동일한 지점에서 여러 번 스팟함으로써 증가 될 수 있습니다. 바이오 도트 장치도 사용할 수 있습니다. - 멤브레인을 블로킹 버퍼(TBS)에서 1시간 동안 배양합니다. 멤브레인을 스트렙타비딘 Alexa Fluor 680 접합체(블로킹 완충액 중 1:1,000)에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 이어서, 멤브레인을 TBS-T(표 1) 5x로 세척한다.
참고: 도트 블롯 분석의 대안은 스트렙타비딘 항체를 사용하는 웨스턴 블로팅입니다. - 680nm 파장에서 멤브레인의 각 점의 형광 신호를 측정하고 비드 부피에 대한 형광 신호와 함께 산점도를 생성합니다. 곡선의 지수 붕괴가 끝나는 위치를 기준으로 50μg의 입력 단백질 샘플에 필요한 최적의 비드 부피를 선택합니다.
참고: 형광 강도는 상청액에 풍부한 비오티닐화 단백질을 나타내며, 이는 비드의 양이 증가함에 따라 감소해야 합니다.
5. 풍부한 비오틴화 단백질과 온비드 소화(3일)
- -80 °C에서 단백질 용해물 샘플을 옮기고 목욕 초음파 처리기에서 30 초 동안 1.5 mL 튜브에서 샘플을 초음파 처리하여 용액을 신속하게 해동합니다. 와류를 일으키고 샘플 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
- 250μL의 스트렙타비딘(SA) 마그네틱 비드 슬러리를 각 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 1mL의 세척 버퍼 A(2% SDS)로 비드를 3배 세척하고 잔류 버퍼를 제거합니다.
- 도트 블롯 분석 및 DC 단백질 분석의 결과를 바탕으로 스트렙타비딘 마그네틱 비드 슬러리의 250μL에 필요한 단백질 샘플(μg)의 양을 계산합니다.
참고: 이 내인성으로 발현된 LAMP1-APEX 프로브에서는 50μg의 입력 단백질에 대해 5μL의 비드가 필요합니다. 따라서 총 단백질 2.5mg을 비드 250μL에 첨가합니다. 250 μL 미만의 SA 비드가 제한된 입력 샘플 재료에 사용될 수 있습니다. - 자성 비드-용해물 혼합물을 함유하는 튜브에 세포 용해 완충액을 총 부피 1 mL로 첨가하고 4°C에서 밤새 회전시킨다.
참고: 다른 그룹 또는 반복의 샘플은 실험 변동을 줄이기 위해 동일한 단백질 농도, 부피 및 비드 양으로 정규화되어야 합니다. - 벤치탑 마이크로 원심분리기에서 모든 튜브를 잠깐 돌리고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 마그네틱 랙에 있는 동안 상층액을 제거합니다.
알림: 매번 샘플 튜브를 마그네틱 랙에 놓은 후 1분 동안 기다리는 것이 중요합니다. 이것은 보이지 않는 소량의 비드가 여전히 용액의 자석을 향해 움직이기 때문에 비드 손실을 최소화할 수 있습니다. - RT에서 1mL의 세척 버퍼 A로 비드를 2회 세척합니다(매번 5분 회전). 각 세척 완충액을 4°C에서 2x 순차적으로 이 과정을 반복한다. (버퍼 B, 버퍼 C, 및 버퍼 D; 표 1).
알림: 고농도의 SDS 용액은 추운 온도에서 침전 될 수 있습니다. 첫 번째 세척은 RT에서 수행해야합니다. - 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 버퍼 D로 비드를 2배 세척하여 잔류 세제를 완전히 제거합니다. 비드를 50mM 트리스 완충액 100μL에 재현탁하고 5mM TCEP(최종 농도)를 추가하여 온도 제어식 혼합기에서 37°C에서 30분 동안 배양하고 1,200rpm으로 흔들어 줍니다.
- 각 튜브에 15mM 요오도아세트아미드(IAA, 최종 농도)를 추가하고 온도가 제어되는 믹서에서 37°C에서 30분 동안 배양하고 어두운 곳에서 1,200rpm으로 흔들어줍니다(믹서 캡 켜짐).
알림: IAA는 빛에 민감하며이 단계 5 분 전에 새로 만들어야합니다. - 5mM TCEP(최종 농도)를 추가하여 초과 IAA를 냉각합니다. 1,200rpm(믹서 캡 꺼짐)에서 진탕하면서 온도가 제어되는 믹서에서 37°C에서 10분 동안 배양합니다.
- 샘플 튜브를 짧게 원심분리하고 마그네틱 랙에 1분 동안 놓아 상청액을 제거합니다. 50 mM 트리스 완충액에 200 μL의 5 mM TCEP를 첨가하여 비드를 재현탁시킨다. 1μg의 트립신/Lys-C 혼합물을 샘플에 추가하고 1,200rpm으로 흔들면서 온도 제어 믹서에서 37°C에서 14시간 동안 배양합니다.
- 0.2 μg의 트립신/Lys-C 믹스를 추가로 넣고 3시간 동안 분해합니다.
- 샘플 튜브를 잠시 돌리고 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 펩타이드 상청액을 옮겨 마그네틱 랙에 있는 동안 튜브를 청소합니다. 비드를 50 μL의 50 mM 트리스 완충액으로 세척하고(5분 동안 흔들림) 펩티드 상청액을 합친다.
- 펩타이드 상청액이 들어있는 튜브에 10 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA) 30 μL를 추가하여 pH <3을 얻습니다.
6. 펩타이드 탈염 및 분획 (2 시간)
- 역상 고체상 추출 플레이트(사용할 웰만)를 진공 매니폴드에서 200μL의 HPLC 등급 메탄올(MeOH) 3배로 적십니다. 플레이트를 평형화하기 위해 HPLC 등급 물 3x에 1% TFA 200μL를 추가합니다.
- 펩타이드 샘플을 플레이트에 넣고 샘플 손실을 최소화하기 위해 3방울/초 미만의 유속으로 진공을 천천히 켭니다.
- 추출 플레이트를 200μL의 1% TFA로 3회 세척합니다. 2% MeOH(v/v)를 함유한 1% TFA 200μL로 추출 플레이트를 다시 세척합니다. 유속을 3방울/초 미만으로 유지하십시오.
- 수집 플레이트를 96웰 수집 플레이트로 교체합니다. 분획이 필요하지 않은 경우 80% MeOH를 함유한 1% TFA 100μL로 펩타이드 샘플을 3x 용리하고 새 샘플 튜브에서 결합합니다. 펩타이드 샘플을 진공 농축기에서 열이 없는 상태로 건조시킵니다.
참고: 분획이 필요한 경우, 펩타이드 샘플은 다른 수집 플레이트에서 각각 15%, 35%, 50% 및 90% MeOH를 포함하는 1% TFA 200μL를 사용하여 연속적으로 4개의 분획으로 용리될 수 있습니다.
7. 비색 펩타이드 정량 분석 (옵션) (1 시간)
- 50μL의 LC-MS 등급 물에 펩타이드 샘플을 재현탁하고 20μL 분취량을 취하여 펩타이드 분석을 수행합니다.
참고: 이 단계는 많은 양의 펩타이드 샘플을 소비하지만 LC-MS 분석 전에 펩타이드 농도의 정확한 정량화를 제공할 수 있습니다. 이는 일반적으로 대규모 샘플 준비 전에 테스트를 위해 샘플 유형당 한 번만 수행됩니다. - LC-MS 등급 물에서 펩타이드 표준 용액(비색 분석 키트에 제공됨)의 연속 희석액을 준비합니다. 50% 시약 A, 48% 시약 B 및 2% 시약 C를 혼합하여 작업 시약을 준비합니다.
- 각 펩타이드 표준용액 20μL(3회 반복)와 미지 펩타이드 샘플을 96웰 마이크로플레이트에 옮깁니다. 각 웰에 180μL의 작동 시약을 추가하고 잘 혼합한 다음 RT에서 30분 동안 플레이트를 배양합니다.
- 마이크로플레이트 리더에서 480nm에서의 흡광도를 읽고 펩타이드 표준 곡선을 기반으로 펩타이드 샘플의 농도를 정량화합니다.
8. LC-MS 분석
- LC 버퍼 A(2% 아세토니트릴 및 0.1% 포름산, LC-MS 등급)에 펩타이드 샘플을 재현탁합니다. 가능한 미립자를 제거하기 위해 4°C에서 10분 동안 16,500× g 으로 원심분리합니다.
- 상청액을 LC-MS 바이알로 옮깁니다. nanoLC-MS 기기를 사용하여 샘플을 분석합니다.
참고: 자세한 LC-MS/MS 파라미터는 기기에 따라 다르며 이전에 22,25,26에서 설명했습니다. - 5ppm 질량 정확도로 스트렙타비딘 및 트립신과 같은 매우 풍부한 오염 물질 펩타이드 피크에 대한 머무름 시간 범위의 맞춤형 LC-MS 제외 목록생성 22(예: 일반적인 스트렙타비딘 펩타이드 피크는 m/z 402.5435 [충전 3], m/z 603.3117 [충전 2], m/z 654.9733 [충전 3], m/z 678.6812 [충전 3], m/z 1017.5182 [충전 2], 등.; 일반적인 트립신 펩타이드 피크는 m/z 421.7584[전하 2], m/z 523.2855[충전 2] 및 m/z 737.7062[충전 3])입니다.
9. 단백질체학 데이터 분석
- Proteome Discoverer, MaxQuant27 또는 MS-Fragger28과 같은 단백질체학 데이터 분석 소프트웨어로 LC-MS 원시 데이터를 분석합니다. 데이터 분석을 위한 두 개의 FASTA 라이브러리 포함: 1) 스위스프로트 호모 사피엔스 참조 데이터베이스; 2) 단백질체학 식별을 개선하고 잘못된 발견을 감소시키는 것으로 입증된 새로 생성된 범용 오염 물질 FASTA 라이브러리(https://github.com/HaoGroup-ProtContLib)29.
- 단백질 및 펩타이드 스펙트럼 매칭(PSM) 식별을 위해 1% 거짓 발견률(FDR) 컷오프로 단백질체학 데이터 분석 파라미터를 설정합니다. 최대 3 개의 누락 된 절단, 시스테인 카바 미도 메틸화의 고정 변형, 메티오닌 산화 및 단백질 N- 말단 아세틸 화의 가변 변형으로 트립신 소화를 선택하십시오. 펩타이드 MS1 피크 강도를 사용하여 표지 없는 정량화를 수행합니다. 펩티드 강도를 내인성 비오티닐화 카르복실라제, 프로피오닐-CoA 카르복실라제(PCCA)로 정규화하여, 앞서 설명한 바와 같이 근접 표지 변동을 감소시킨다(22).
참고: PCCA 정규화는 PCCA 단백질 서열 FASTA 파일을 포함하여 프로테옴 디스커버러 소프트웨어에서 선택할 수 있습니다. 대안적으로, PCCA 정규화는 다운스트림 데이터 분석에서 수행될 수 있다. - 단백질체학 소프트웨어에서 단백질 수준 결과를 내보냅니다. 통계 분석 전에 오염 단백질을 제거하십시오29. 1 PSM 또는 정량 결과 없이 단백질을 제거합니다. Enrichr30 으로 단백질 유전자 온톨로지(GO) 용어 분석을 수행하고 STRING31을 사용하여 단백질 네트워크 분석을 수행합니다.
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Representative Results
이 리소좀 근접 라벨링 단백질체학 연구는 살아있는 뉴 런에서 동적 리소좀 미세 환경을 포착하기 위해 인간 iPSC 유래 뉴런에서 수행되었습니다. 상이한 시점에서의 hiPSC 및 hiPSC-유래 뉴런의 세포 형태가 도 2A에 예시되어 있다. 인간 iPSC는 E8 배지의 콜로니에서 자랍니다. 분화는 iPSC를 독시사이클린 함유 뉴런 유도 배지로 도금함으로써 시작됩니다. 신경 돌기 확장은 3 일 분화 동안 매일 더 잘 보입니다. 뉴런 배지에서 PLO 코팅 플레이트로 전환 한 후 뉴런은 뉴런 사이에 네트워크를 형성하고 뉴런이 2 주 만에 성숙함에 따라 축삭 확장이 더 잘 보입니다. i3뉴런에서 APEX 프로브의 국소화는 빠른 APEX 활성화 후 형광 현미경으로 검증됩니다. 비오틴화 단백질은 스트렙타비딘(SA) 항체를 사용하여 염색하고, 리소좀은 항-LAMP1 항체를 사용하여 염색합니다. 병합된 이미지는 미끼 단백질에 대한 LAMP1-APEX의 올바른 위치를 검증합니다(그림 2B).
비드 적정 분석은 스트렙타비딘 비드의 양이 모든 비오틴화 단백질을 풍부하게 하기에 충분하지만 LC-MS에서 심각한 스트렙타비딘 오염을 유발할 정도로 과도하지 않도록 최적의 비드 대 단백질 비율을 결정하는 데 중요합니다. 50μg의 입력 단백질 샘플에 필요한 최적의 비드 부피는 곡선의 지수 붕괴가 끝나는 위치를 기준으로 선택됩니다(그림 3A). 그림 3A에서 볼 수 있듯이, 비드-단백질 배양 상청액의 도트 블롯 신호는 스트렙타비딘 비드의 양이 증가하여 더 많은 비오티닐화된 단백질이 포획됨에 따라 감소했습니다. 내인성 LAMP1-APEX 샘플의 경우, 5μL의 스트렙타비딘 비드가 50μg의 입력 단백질에 최적이었습니다(그림 3A에서 강조 표시됨). 농축 후, 스트렙타비딘 비드에 의해 포획된 단백질의 양은 알려져 있지 않습니다. 과도한 단백질 분해 효소(트립신)는 LC-MS에서 풍부한 트립신 펩타이드 피크와 함께 효소 자가소화를 증가시킬 수 있습니다. 과도한 트립신은 또한 샘플에서 더 많은 스트렙타비딘 펩타이드를 소화할 수 있습니다. 따라서 비드 위 분해에 필요한 프로테아제의 양을 최적화해야 합니다. 트립신 단독과 비교하여 트립신/Lys-C 혼합을 사용한 비드 위 분해는 더 많은 단백질과 펩타이드를 식별하고 누락된 절단을 줄였습니다(그림 3B). 또한 스트렙타비딘 마그네틱 비드 250μL당 1-1.5μg의 프로테아제가 확인된 단백질 수가 가장 많고 누락된 절단의 가장 낮은 비율을 얻는 데 최적이었습니다(그림 3C). 최적의 비드 대 단백질 비율을 사용하면 동일한 양의 비드가 동일한 양의 비오틴화 단백질을 포집해야 합니다. 따라서, 이 최적화된 프로테아제 양은 동일한 스트렙타비딘 마그네틱 비드를 사용하여 비오티닐화된 단백질을 풍부하게 하는 모든 실험에 사용될 수 있다.
퍼옥시다아제 기반 근접 표지 효소는 비오틴-페놀 배양 및 간단한H2O2처리(1분)에 의해 활성화됩니다. 이 단계는 근접 표지 단백질체학의 주요 변동 원인입니다. 우리는 이전에 가장 풍부한 내인성 비오틴화 카르복실라제인 PCCA로의 정규화가 실험 변동을 크게 감소시켜 다양한 실험 배치에서 근접 라벨링 단백질체학 데이터를 비교할 수 있음을 발견했습니다(그림 4)22. 내인성 LAMP1-APEX 뉴런의 경우, LAMP1-APEX 프로브 발현이 없는 모선을 대조군으로 사용하였다. 대조군 뉴런은 또한 비오틴-페놀 및H2O2로 처리되었다. 대조군 대비 LAMP1-APEX의 단백질 비율 분포는 그림 5A에 나와 있습니다. 모든 내인성 비오티닐화된 카르복실라제는 스트렙타비딘 코팅 비드에 의해 농축되었지만 변하지 않았습니다. GO-term 분석 및 단백질 네트워크 분석(그림 5B,C)에서 볼 수 있듯이, 안정한 리소좀 막 단백질과 엔도리소좀 트래피킹 및 수송과 관련된 일시적인 리소좀 상호작용체 모두 LAMP1-APEX 단백질체학32,33,34에서 풍부했습니다.
그림 1: hiPSC 유래 뉴런에서 리소좀 근접 라벨링 단백질체학의 전체 워크플로우. 약어 : hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; LAMP1 = 리소좀 관련 막 단백질 1; APEX = 아스코르브산염 퍼옥시다아제; 독스 = 독시사이클린; BP = 비오틴-페놀; DCA = 세제 상용성 단백질 분석; SA = 스트렙타비딘; LC-MS / MS = 액체 크로마토 그래피-탠덤 질량 분석법; PCCA = 프로피 오닐 -CoA 카르 복실 라제, 내인성 비오틴 화 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: hiPSC 유래 뉴런 및 LAMP1-APEX 활성의 현미경 이미징. (A) hiPSC 및 hiPSC 유래 뉴런의 여러 단계에 대한 명시야 현미경 이미지. (B) 뉴런에서 LAMP1-APEX 활성의 형광 이미징. 스트렙타비딘에 대해 염색된 비오티닐화 신호는 핵 외부의 LAMP1 염색(HOECHST)과 함께 국소화됩니다. 스케일 바 = (A) 50 μm, (B) 1 μm. 약어 : hiPSC = 인간 유도 만능 줄기 세포; LAMP1 = 리소좀 관련 막 단백질 1; APEX = 아스코르브산염 퍼옥시다아제; SA = 스트렙타비딘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 비드 대 입력 단백질 비율 및 효소 단백질 분해의 최적화는 단백질 식별을 개선하고 간섭을 줄일 수 있습니다. (A) 비드의 예 - 50 μg의 입력 단백질과 다른 양의 스트렙타비딘 비드를 사용한 도트 블롯 분석의 결과. (B) 트립신/Lys-C 혼합은 트립신 단독보다 단백질/펩타이드 식별이 더 우수하고 누락된 절단이 적었습니다. (C) 비드 분해를 위한 트립신/Lys-C 양의 최적화. 이 수치는 Frankenfield et al.22에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 근접 라벨링 단백질체학 데이터를 내인성 비오티닐화 카르복실라제인 PCCA로 정규화하면 생물학적 복제 간의 정량화 변동을 줄일 수 있습니다. 이 수치는 Frankenfield et al.22에서 수정되었습니다. 약어 : PCCA = 프로피 오닐 -CoA 카르 복실 라제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 리소좀 근접 라벨링 단백질체학은 뉴런에서 풍부한 리소좀 막 단백질과 리소좀 상호 작용 단백질을 제공했습니다. (A) LAMP1-APEX의 단백질 존재비 대 APEX 대조군 없음의 산점도는 풍부한 리소좀 막 단백질과 변하지 않은 내인성 비오틴화 단백질을 보여줍니다. (B) 리소좀에서 풍부한 세포 성분을 증명하는 단백질체학의 GO-term 분석 결과. (C) 단백질이 미끼 단백질 (LAMP1), 리소좀 막 단백질 및 막 트래피 단백질과 같은 리소좀 상호 작용자와 직접 상호 작용한다는 것을 보여주는 STRING 단백질 네트워크 분석. 이 수치는 Frankenfield et al.22에서 수정되었습니다. 약어: LAMP1 = 리소좀 관련 막 단백질 1; APEX = 아스코르브산염 퍼옥시다아제; GO = 유전자 온톨로지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 중간/버퍼 | 구성 요소 | 프로토콜 | ||
| 기저막 매트릭스(Matrigel) 코팅 용액 | 1% 기저막 매트릭스 스톡, 99% DMEM/F12 배지 | 1.1, 1.2 | ||
| 비트로넥틴 코팅액 | PBS의 최종 농도 5μg/mL | 1.1 | ||
| ROCK 억제제가 포함된 E8 완전 배지 | 98% E8 배지, 2% E8 보충제, 10μM Y-27632 또는 50nM 크로만1 | 1.1 | ||
| 뉴런 유도 배지 | HEPES가 포함 된 97 % DMEM / F12, 1 % N2 보충제, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L- 글루타민, 2 μg / mL 독시사이클린 및 ROCK 억제제 (10 μM Y-27632 또는 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| 뉴런 PLO 코팅 용액 | 0.1 mg / mL 폴리 -L- 오르니 틴 (PLO), 100 mM 붕산, 25 mM 나트륨 테트라 보레이트, 75 mM 염화나트륨, 1 M 수산화 나트륨 | 1.3 | ||
| 뉴런 배지 | 98% 피질 뉴런 배지, 2% B27 보충제, 10 ng/mL 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 10 ng/mL 신경교 유래 신경영양 인자(GDNF), 10 ng/mL NT-3, 0.2 μg/mL 라미닌, 2 μg/mL 독시사이클린 | 1.3 | ||
| 담금질 버퍼 | PBS 중 10 mM 아지드화나트륨, 10 mM 아스코르브산나트륨, 5 mM 트롤록스 | 2.2 | ||
| 세포 용해 완충액 | 50 mM 트리스-HCl, 500 mM NaCl, 0.2% SDS, 1% 트리톤, 1 mM 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(TCEP), 10 mM 아지드화나트륨, 10mM 아스코르브산나트륨, 5mM 트롤록스, 프로테아제 억제제 칵테일 | 2.3 | ||
| TBS-T | 0.05% 트윈20, 20 mM 트리스, 150 mM NaCl (pH 7.5) | 4.2 | ||
| 버퍼 A | 2% SDS 버퍼 | 5.2 | ||
| 버퍼 B | 50 mM 트리스-HCl, 500 mM NaCl, 2% 트리톤-X | 5.6 | ||
| 버퍼 C | 50 mM 트리스-HCl, 250 mM NaCl, 0.5% SDS, 0.5% 트리톤-X | 5.6 | ||
| 버퍼 D | 2 M 요소, 50 mM 트리스-HCl | 5.6 | ||
표 1: 이 프로토콜에 사용된 배지 및 완충액의 조성.
| 문제 | 프로토콜 | 해결책/제안 | ||||
| 플레이트에서 벗겨지는 iPSC 배양 | 1.1 | 비트로넥틴 코팅 농도 또는 시간을 증가시킵니다. | ||||
| 일부 iPSC는 뉴런으로 분화되지 않았습니다. | 1.2 | d0 분화 중에 iPSC를 완전히 해리하기 위해 세포 분리 용액 처리 시간을 늘립니다. | ||||
| 접시에서 벗겨지는 뉴런 배양 | 1.3 | 매체를 세척하고 교체하는 것은 부드럽고 판의 측벽에서 이루어져야합니다. | ||||
| 단백질은 아세톤 침전 후 완전히 용해되지 않습니다. | 2.7 | 단백질 펠릿의 건조 시간을 줄입니다. 용해 완충액의 부피를 늘리고 용해를 돕기 위해 짧게 초음파 처리합니다. | ||||
| 약한 스트렙타비딘 염색 신호 | 3 | H2O2처리 시간을 2-3초로 늘리고 균일한 분포를 위해 플레이트를 소용돌이칩니다. | ||||
| 비드 적정 분석의 낮은 신호 | 4.2 | 멤브레인이 완전히 건조 될 때까지 기다렸다가 신호 강도를 향상시키기 위해 동일한 지점에 더 많은 상청액을 추가하십시오 (최대 3 회 반복 가능). | ||||
| 마그네틱 랙을 향해 펠릿이 되지 않는 마그네틱 비드 | 5 | 마그네틱 비드 이동도는 비세제 함유 완충액에서 감소한다. 최대 4M의 더 높은 요소 농도 또는 LC-MS 호환 세제를 세척 완충액 D에 사용할 수 있습니다. | ||||
| 구슬 세척 중 마그네틱 구슬 손실 | 5 | 튜브에서 상청액을 채취하기 전에 샘플 튜브를 마그네틱 비드에 놓을 때(1분 이상) 대기 시간을 늘립니다. | ||||
| LC-MS에서 단일 하전된 오염 피크 | 6 | 펩타이드 클린업이 충분하지 않습니다. 펩타이드 탈염 중 세척량과 시간을 늘립니다. | ||||
| 펩타이드 분석 낮은 신호 | 7 | 펩타이드 농도를 높이기 위해 펩타이드 샘플을 더 낮은 부피로 재현탁합니다. | ||||
| LC-MS의 압도적인 스트렙타비딘 신호 | 8 | 스트렙타비딘 비드의 양을 줄입니다. 트립신 피크도 풍부하면 트립신 양을 줄입니다. | ||||
| 너무 많은 비특이적 라벨링 배경 | 9 | 스트렙타비딘 비드 세척으로는 충분하지 않았다. 각 세척 단계에서 모든 잔류 액체를 제거하십시오. 구슬 세척 시간과 부피를 늘립니다. | ||||
표 2: 문제 해결 및 해결 방법.
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Discussion
이 LAMP1-APEX 프로브를 사용하여 리소좀 막 위와 근처의 단백질이 비오틴화되고 농축됩니다. 100-1,200 nm의 일반적인 리소좀 직경을 감안할 때,이 방법은 10-20 nm 표지 반경으로 우수한 세포 내 분해능을 제공합니다. LAMP1은 풍부한 리소좀 막 단백질이자 리소좀의 고전적인 마커로, 내인성 발현 수준에서 리소좀 APEX 라벨링을 위한 우수한 미끼 단백질 역할을 합니다. 그러나, LAMP1이 후기 엔도솜 및 비분해성 리소좀(35)에도 존재하기 때문에, LAMP1을 리소좀을 표적화하기 위해 사용할 때 한계가 존재한다. 대부분의 리소좀 마커는 후기 엔도좀에서도 발현되며 결국 리소좀으로 성숙합니다. 리소좀을 표적으로 하는 대안적인 미끼 단백질은 LAMPTOR, LAMP2, 및 TMEM19235,36,37이다. 반응성 비오틴 라디칼은 막을 관통하지 않는다는 점에 유의해야합니다. 따라서 대부분의 리소좀 내강 전용 단백질은 이 LAMP1-APEX 단백질체학 방법에서 포획되지 않습니다. 리소좀 내강 단백질은 전통적인 구배 원심분리 방법 또는 리소좀 면역 정제 4,38을 통한 리소좀 분리에 의해 얻을 수 있습니다. 그러나 리소좀 막의 단백질은 리소좀 분리 중에 중단되어 일시적 및 동적 리소좀 상호 작용에 대한 정보를 잃을 수 있습니다. 따라서, 리소좀 근접 표지 및 리소좀 분리를 결합하여 리소좀 외부 및 내부 모두에서 리소좀 활성의 완전한 스냅샷을 얻을 수 있다.
iPSC-뉴런 배양으로 인한 변동성을 최소화하려면 뉴런 도금 밀도가 모든 생물학적 복제 및 비교 그룹에서 일관되어야 합니다. 이러한 이유로 동일한 수준의 신경 성숙과 건강도 중요합니다. APEX 활성화 동안, 세포에 첨가 된 비오틴-페놀 및 H 2 O2는 따뜻한 배양 배지와 사전 혼합 한 다음 혼합물을 세포에 첨가 한 다음 균일 한 분포를 보장하기 위해 즉각적이고 부드러운 흔들림으로 수행해야합니다. H 2 O2의 사용은 또한 세포의 동적 미세 환경에서의 산화 스트레스 및 섭동에 대한 우려를 제기한다. 단백질 풍부도 수준에서 유의한 변화가 발견되지 않았지만, 더 많은 펩티드가H2O2-처리된 대조군 뉴런22에서 메티오닌 산화로 변형되었다. 따라서,H2O2활성화 시간(1분)의 엄격한 제어는 산화 스트레스를 최소화하고 비오틴 클라우미끼 단백질을 둘러싸는 특정 표지 반경을 보장하기 위해 확산을 감소시키는 데 중요하다.
HEK 및 U2OS와 같은 비분극 세포주의 경우, 근접 표지 후 펠렛화하여 세포를 수확하여 유리 비오틴을 함유하는 상청액을 제거할 수 있습니다. 그러나 뉴런은 펠릿화 중 신경돌기 손상 및 샘플 손실을 방지하기 위해 플레이트에 세포 용해 완충액을 직접 추가하고 튜브로 긁어 모아야 합니다. 유리 비오틴의 존재는 스트렙타비딘 비드를 포화시킬 수 있습니다. 유리 비오틴의 완전한 제거는 세포 용해 후 뉴런의 담금질 완충액 및/또는 단백질 침전을 사용한 여러 번의 세척 및 배양을 통해 달성할 수 있습니다. 미끼 단백질마다 발현 수준이 다르기 때문에 각각의 새로운 APEX 프로브에 대해 도트 블롯 분석을 수행해야 합니다. 최적의 비드/단백질 비율이 결정되면 시작 단백질의 양과 비드 부피가 동일한 APEX 프로브에 대한 모든 반복에 대해 일관되어야 합니다. LAMP1-APEX와 cytosolic-APEX와 같은 서로 다른 프로브를 비교할 때는 동일한 부피의 비드를 사용하되 다른 APEX 프로브에 대한 최적의 비드/단백질 비율을 반영하기 위해 출발 단백질의 양을 변경하는 것이 좋습니다. 실험 변동을 더욱 감소시키고 처리량을 증가시키기 위해, 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산에 의한 안정한 동위원소 표지가 수행될 수 있다(39). 멀티플렉스 등압 표지는 또한 TMT/iTRAQ/DiLeu 태그 20,40,41,42를 통해 단백질 분해 후 펩타이드를 화학적으로 표지하는 데 사용할 수 있습니다.
근접 라벨링은 다양한 유기체에서 세포 및 분자 미세환경을 포착하기 위해 널리 적용되었다(43). 그러나 근접 라벨링은 여전히 스트렙타비딘 신호로 인한 오염, 효소 활성화를 위한 과산화수소 사용, 내인성 비오티닐화 미토콘드리아 카르복실라제의 존재와 같은 많은 기술적 과제에 직면해 있습니다. 따라서 근접 라벨링 단백질체 실험에는 신중한 계획과 품질 관리가 필요합니다. 연구원이 근접 라벨링 실험의 문제를 해결하는 데 도움이 되도록 표 2의 일반적인 문제 및 솔루션에 대한 간략한 가이드를 제공합니다. 가장 최근에, 절단가능한 근접 표지 방법이 티올-절단성 비오틴25를 사용하여 개발되었다. 따라서 비오틴화된 단백질은 온비드 분해 없이 TCEP와 같은 환원 시약을 사용하여 비드에서 절단할 수 있습니다. 이 절단 가능한 비오틴 방법은 스트렙타비딘, 내인성 비오티닐화 카르복실라제 및 비특이적 결합의 간섭 신호를 극적으로 줄일 수 있습니다. 지속적인 노력은 라벨링 특이성과 정확성을 개선하기 위해 이 절단 가능한 비오틴 분석법을 LAMP1-APEX 단백질체학에 적용할 것입니다. 근접 라벨링 프로브는 또한 다른 세포하 구획(44)을 표적화하도록 설계될 수 있다. 확인된 단백질의 양과 유형은 미끼 단백질의 특성, 세포 내 환경 및 근접 표지 프로브의 발현 수준에 따라 달라집니다. 이 내인성 LAMP1-APEX 단백질체학 방법은 인간 뉴런에서 동적 리소좀 활성을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 상세한 프로토콜 및 방법론 최적화는 다른 근접 라벨링 프로브 및 화학적 비오티닐화에도 적용할 수 있어 단백질체학 커뮤니티에 유용한 리소스 역할을 합니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 NIH 보조금(R01NS121608)의 지원을 받습니다. AMF는 ARCS-Metro Washington Chapter 장학금과 Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship을 인정합니다. 우리는 분자 생물학 지원과 i3뉴런 기술 개발에 대해 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS)의 마이클 워드 연구소에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
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