Summary
Aquí se describe un protocolo proteómico de etiquetado de proximidad de lisosomas neuronales para caracterizar el microambiente lisosomal dinámico en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. Las proteínas de membrana lisosomal y las proteínas que interactúan con los lisosomas (de forma estable o transitoria) se pueden cuantificar con precisión en este método con una excelente resolución espacial intracelular en neuronas humanas vivas.
Abstract
Los lisosomas frecuentemente se comunican con una variedad de biomoléculas para lograr la degradación y otras funciones celulares diversas. Los lisosomas son críticos para la función cerebral humana, ya que las neuronas son postmitóticas y dependen en gran medida de la vía autofagia-lisosoma para mantener la homeostasis celular. A pesar de los avances en la comprensión de varias funciones lisosomales, capturar las comunicaciones altamente dinámicas entre los lisosomas y otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. Aquí, se proporciona un protocolo detallado para el método proteómico de marcado de proximidad de lisosomas endógeno (knock-in) recientemente publicado en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC).
Tanto las proteínas de la membrana lisosomal como las proteínas que rodean los lisosomas dentro de un radio de 10-20 nm se pueden identificar con confianza y cuantificar con precisión en neuronas humanas vivas. Cada paso del protocolo se describe en detalle, es decir, cultivo de neuronas hiPSC, etiquetado de proximidad, recolección de neuronas, microscopía de fluorescencia, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas, análisis de LC-MS y análisis de datos. En resumen, este método único de proteómica de etiquetado de proximidad lisosomal endógeno proporciona una herramienta analítica robusta y de alto rendimiento para estudiar las actividades lisosomales altamente dinámicas en neuronas humanas vivas.
Introduction
Los lisosomas son orgánulos catabólicos que degradan macromoléculas a través de la vía lisosomal-autofagia1. Además de la degradación, los lisosomas están involucrados en diversas funciones celulares, como la transducción de señalización, la detección de nutrientes y la secreción 2,3,4. Las perturbaciones en la función lisosomal han sido implicadas en trastornos de almacenamiento lisosomal, cáncer, envejecimiento y neurodegeneración 3,5,6,7. Para las neuronas postmitóticas y altamente polarizadas, los lisosomas juegan un papel crítico en la homeostasis celular neuronal, la liberación de neurotransmisores y el transporte a larga distancia a lo largo de los axones 8,9,10,11. Sin embargo, investigar los lisosomas en las neuronas humanas ha sido una tarea difícil. Los avances recientes en las tecnologías de neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido el cultivo de neuronas humanas vivas que antes eran inaccesibles, cerrando la brecha entre los modelos animales y los pacientes humanos para estudiar el cerebro humano12,13. En particular, la avanzada tecnología i3Neuron integra de manera estable el factor de transcripción de neurogenina-2 en el genoma iPSC bajo un promotor inducible por doxiciclina, lo que lleva a las iPSC a diferenciarse en neuronas corticales puras en 2 semanas14,15.
Debido a la actividad lisosomal altamente dinámica, capturar las interacciones lisosomales con otros componentes celulares es técnicamente desafiante, particularmente en una forma de alto rendimiento. La tecnología de etiquetado de proximidad es adecuada para estudiar estas interacciones dinámicas debido a su capacidad para capturar interacciones de proteínas estables y transitorias / débiles con una especificidad espacial excepcional16,17. La peroxidasa modificada o la biotina ligasa pueden fusionarse genéticamente con la proteína del cebo. Tras la activación, se producen radicales de biotina altamente reactivos para marcar covalentemente las proteínas vecinas, que luego pueden enriquecerse con perlas recubiertas de estreptavidina para la proteómica ascendente aguas abajo a través de plataformas de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) 17,18,19,20,21.
Recientemente se desarrolló un método proteómico de marcado de proximidad lisosomal endógeno para capturar el microambiente lisosomal dinámico en i3Neuronas22. La ascorbato peroxidasa diseñada (APEX2) se introdujo en el extremo C de la proteína de membrana asociada lisosomal 1 (LAMP1) en iPSC, que luego se puede diferenciar en neuronas corticales. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador lisosomal clásico23. LAMP1 también se expresa en endosomas tardíos, que maduran en lisosomas; Estos endosomas-lisosomas tardíos y lisosomas no degradativos se conocen como lisosomas en este protocolo. Esta sonda endógena LAMP1-APEX, expresada a nivel fisiológico, puede reducir la mala localización de LAMP1 y los artefactos de sobreexpresión. Cientos de proteínas de membrana lisosomal e interactores lisosomales pueden ser identificados y cuantificados con una excelente resolución espacial en neuronas humanas vivas.
Aquí, se describe un protocolo detallado para la proteómica de marcado de proximidad lisosómica en neuronas humanas derivadas de iPSC con mejoras adicionales del método22 recientemente publicado. El flujo de trabajo general se ilustra en la figura 1. El protocolo incluye cultivo de neuronas derivadas de hiPSC, activación de marcado de proximidad en neuronas, validación de la actividad APEX por microscopía de fluorescencia, determinación de una proporción óptima de perlas de estreptavidina a proteína de entrada, enriquecimiento de proteínas biotiniladas, digestión de proteínas en perlas, desalinización y cuantificación de péptidos, análisis LC-MS y análisis de datos proteómicos. También se discuten las pautas de solución de problemas y las optimizaciones experimentales para mejorar el control de calidad y el rendimiento del etiquetado de proximidad.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité de bioseguridad y ética de la Universidad George Washington. Las composiciones de medios y búferes utilizados en este protocolo se proporcionan en la Tabla 1. La información comercial del producto utilizada aquí se proporciona en la Tabla de materiales.
1. Cultivo de neuronas derivadas de iPSC humanas
- Cultivo iPSC humano e integración de la sonda LAMP1-APEX (7 días)
- Descongele la solución madre de Matrigel en una cubitera a 4 °C durante la noche, alícuota 500 μL de la solución en tubos estériles fríos y almacene las alícuotas a -80 °C. Preparar 50 ml de solución de recubrimiento añadiendo 500 μL de la cepa Matrigel en 49,5 ml de medio DMEM/F12 frío.
NOTA: Mantenga el Matrigel frío y utilice tubos cónicos preenfriados y puntas de pipeta para evitar la polimerización. La solución de recubrimiento se puede almacenar a 4 °C durante 2 semanas. - Cubrir una placa de cultivo celular de 10 cm con 4 ml de solución de recubrimiento durante 1 h en una incubadora a 37 °C.
NOTA: La vitronectina puede ser una solución de recubrimiento alternativa a una concentración de 5 μg/ml y un recubrimiento de 2 h para cultivo de iPSC. La vitronectina (componente de proteína única) es más cara que Matrigel pero tiene menos variaciones de lote y señales de fondo más limpias que Matrigel, que se extrae del tumor de ratón con numerosas proteínas de matriz extracelular. Se necesita una placa de cultivo de tejidos no tratados para el recubrimiento de vitronectina. El recubrimiento Matrigel funciona tanto para placas de cultivo de tejidos tratados como no tratados. - Descongelar y colocar en placa 1-3 millones de hiPSCs en cada plato recubierto de 10 cm precargado con 8 ml de medio completo Essential E8 suplementado con inhibidor ROCK (concentración final 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1).
NOTA: La adición del inhibidor de ROCK (Y-27632 o Chroman1) al medio de cultivo de células madre minimiza la apoptosis inducida por disociación después de la división y la preservación criogénica. Chroman1 ha demostrado recientemente ser más potente que Y-27632 en la inhibición de ROCK1 y ROCK224. - Cambiar a 10 ml de medio completo E8 sin inhibidor de ROCK después de que las iPSC formen colonias, generalmente después de 1-2 días. Mantenga el cultivo iPSC en medio completo E8 y reemplace el sobrenadante con medio fresco cada dos días.
- Integrar la enzima de etiquetado de proximidad, ascorbato peroxidasa diseñada (APEX2), en el extremo C del gen endógeno LAMP1 mediante ingeniería genómica CRISPR. Para conocer los pasos detallados para generar una línea celular estable diseñada, consulte el método publicado anteriormente (Frankenfield et al). 22.
- Descongele la solución madre de Matrigel en una cubitera a 4 °C durante la noche, alícuota 500 μL de la solución en tubos estériles fríos y almacene las alícuotas a -80 °C. Preparar 50 ml de solución de recubrimiento añadiendo 500 μL de la cepa Matrigel en 49,5 ml de medio DMEM/F12 frío.
- Diferenciación iPSC-neurona humana (3 días)
- Cubra una placa de cultivo celular de 10 cm durante la noche con 4 ml de solución de recubrimiento Matrigel en una incubadora a 37 °C antes de la diferenciación.
- Mantenga las hiPSC hasta ~70% de confluencia. Lave suavemente las hiPSC con solución salina tamponada con fosfato (PBS) 2x para eliminar las células muertas. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de Accutase a la placa de 10 cm de células. Agitar el plato para una distribución uniforme e incubar durante 8 minutos en una incubadora a 37 °C.
- Agregue 2 ml de PBS para lavar y levantar las células de la placa y recoja toda la solución celular en un tubo cónico de 15 ml. Granular las células por centrifugación a 300 × g durante 5 min. Placa 2-4 × 106 hiPSCs sobre una placa recubierta de Matrigel precargada con 8 mL de medio de inducción de neuronas calientes (Tabla 1). Distribuir uniformemente las células y colocarlas en una incubadora a 37 °C.
NOTA: La diferenciación neuronal es impulsada por un factor de transcripción inducible por doxiciclina, neurogenina-2 (NGN2), que se sobreexpresó en esta línea celular hiPSC estable15. - Lave las hiPSC suavemente con PBS el día 1 de diferenciación para eliminar los restos de células muertas. Reemplácese con 10 ml de medio de inducción caliente sin inhibidor de ROCK.
- Cambiar con medio de inducción caliente sin inhibidor de ROCK todos los días hasta el día 3 de diferenciación.
NOTA: Las neuronas están listas para ser convertidas en medio neuronal.
- Recubrimiento de neuronas y mantenimiento del cultivo de neuronas (10 días)
- Preparar una solución de recubrimiento de 0,1 mg/ml de poli-L-ornitina (PLO) en tampón de borato (Tabla 1).
- Cubra una placa de cultivo celular con la solución de recubrimiento de PLO en una incubadora de 37 °C durante al menos 1 h o durante la noche anterior a la colocación de las neuronas del día 3. Lave el plato con 4 ml de agua estéril tres veces y déjelo secar completamente al aire dentro del gabinete de bioseguridad.
- Disociar las neuronas del día 3 de cada plato de 10 cm con 3 ml de Accutase y placar 8-10 millones de células en cada plato recubierto con OLP de 10 cm precargado con medio de neurona cortical caliente (Tabla 1).
- Realizar un cambio medio-medio cada 2-3 días con medio neuronal caliente hasta que lasi 3neuronas alcancen la maduración en 2 semanas después de la diferenciación.
2. Etiquetado de proximidad in situ y lisis neuronal (2 h)
- Preparar una solución madre de biotina-fenol (BP) de 500 mM en dimetilsulfóxido (DMSO) y almacenar a -20 °C. El día del etiquetado de proximidad, diluir la solución madre de PA con medio neuronal caliente y tratar las neuronas a una concentración final de 500 μM durante 30 min en una incubadora a 37 °C.
NOTA: La doxiciclina se agrega en el medio neuronal, lo que activará la expresión de la enzima APEX. La doxciclina debe agregarse al menos 24 h antes del experimento de etiquetado de proximidad. - Iniciar la reacción de etiquetado añadiendoH2O2a una concentración final de 1 mM en el cultivo neuronal e incubar durante exactamente 1 min. Aspirar inmediatamente el medio y enjuagar 3 veces con tampón de enfriamiento (Tabla 1).
NOTA: La solución deH2O2debe hacerse fresca antes de la reacción de etiquetado. La activación deH2O2debe ser exactamente de 1 minuto para reducir la variación experimental y minimizar el estrés oxidativo causado por el tratamiento prolongado conH2O2. - Incline la placa para aspirar todo el tampón residual. Agregue un tampón de lisis de células heladas (Tabla 1) directamente sobre la placa neuronal. Use 100 μL de tampón de lisis celular por 1 millón de neuronas. Agite la placa para obtener suficiente lisis celular y colóquela en hielo.
- Raspa los lisados celulares en tubos fríos de 1,5 ml. Sonicar en un baño de agua helada usando un sonicador de baño (>100 W) durante 15 minutos con ciclos alternos de 40 s encendido y apagado de 20 s.
NOTA: La solución de proteína suficientemente lisada debe ser transparente sin pellets ni burbujas excesivas. La sonicación suficiente del lisado celular es crucial para cortar los ácidos nucleicos y reducir la pegajosidad del lisado celular para reducir la unión no específica en los procedimientos posteriores. También se puede usar un sonicador de sonda para proporcionar una lisis celular más fuerte y rápida, pero se requiere lavar la sonda entre muestras para minimizar la contaminación cruzada y la pérdida de muestras. - Añadir acetona fría (-20 °C) a la muestra a un volumen de tampón de lisis 4 veces mayor. Vórtice brevemente e incubar a −20 °C durante 3 h.
- Centrifugadora a 16.500 × g durante 10 min a 2 °C. Retire el sobrenadante sin alterar el pellet de proteína. Lavar el pellet con 1 ml de -20 °C de acetona 2x y retirar el sobrenadante después de la centrifugación.
- Secar el pellet de proteína con un concentrador de vacío durante 1 min. Agregue tampón de lisis celular para disolver completamente el pellet. Sonicate brevemente si es necesario. Conservar las muestras a -80 °C.
NOTA: La precipitación de acetona puede eliminar el residuo de biotina-fenol en la muestra, lo que puede interferir con el enriquecimiento posterior de proteínas biotiniladas.
3. Microscopía de fluorescencia para validar la localización y actividad de APEX (1,5 días)
- Incubar las i3neuronas que expresan LAMP1-APEX endógeno con 500 μM BP durante 30 min a 37 °C. Active el etiquetado con tratamiento de 1 mMH2O2durante solo 1 s para limitar la difusión de la nube de biotina.
- Fije las células inmediatamente con paraformaldehído al 4% en el tampón de enfriamiento y lave suavemente 3 veces con PBS.
NOTA: Para un plato de 10 cm, se necesitan 4-6 ml para un lavado suficiente. - Bloquear y permeabilizar las células usando 3% de suero de burro y 0,1% de saponina en PBS durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Incubar las células con el anticuerpo primario anti-LAMP1 (H3A4 monoclonal de ratón, 1:1.000) durante la noche a 4 °C.
- Lave las neuronas 3 veces suavemente con PBS. Incubar las neuronas con anticuerpo secundario anti-ratón AF561 (1:1.000) y Streptavidin-680 (1:1.000) durante 1 h en RT.
- Lavar 2x con PBS e incubar con el marcador nuclear Hoechst o 4',4-diamidino-2-fenilindol (DAPI) durante 10 min en RT. Enjuague las celdas 2x con PBS.
- Visualice las neuronas fijas bajo un microscopio de fluorescencia. Observar proteínas biotiniladas teñidas con estreptavidina y colocalizadas con tinción LAMP1 fuera del núcleo para validar la correcta ubicación de la actividad APEX.
4. Determinación de la relación perlas-proteína de entrada de estreptavidina (1,5 días)
- Realizar un ensayo de proteínas compatibles con detergentes (DCA) para determinar las concentraciones totales de proteínas en los lisados celulares
- Disuelva el estándar de proteína de albúmina sérica bovina (BSA) en el tampón de lisis celular a una concentración de 4 mg / ml. Preparar una serie de soluciones patrón de proteína BSA (0,2-2 mg/ml, 5 diluciones) utilizando el tampón de lisis celular.
- Transfiera 5 μL de cada muestra de proteína, solución estándar de proteína BSA y tampón de lisis de células blancas por triplicado a cada pocillo en una placa de 96 pocillos.
- Añadir 2 μL de reactivo S por 1 ml de reactivo A para obtener el reactivo A'. Añadir 25 μL de reactivo A' a cada pocillo. Agregue 200 μL de reactivo B a cada pocillo. Mezcle y haga estallar burbujas si están presentes.
- Incubar esa placa de 96 pocillos en RT durante 15 min, leer la absorbancia a 750 nm en un lector de microplacas y cuantificar las concentraciones de muestras de proteínas basadas en la curva estándar BSA.
- Ensayo de valoración de perlas de puntos (1,5 días)
- Transfiera una serie de perlas magnéticas de estreptavidina (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) a tubos de tira de PCR. Coloque los tubos de tira de PCR en una rejilla magnética, lave las perlas 3 veces con 100 μL de tampón SDS al 2% y retire el tampón de lavado completamente mientras está en la rejilla magnética.
- Añadir 50 μg de muestra de proteína a cada tubo. Añadir más tampón de lisis a un volumen total de 80 μL. Cerrar bien cada tubo y girar a 4 °C durante la noche.
- Centrifugar brevemente los tubos de tiras de PCR en una microcentrífuga de sobremesa. Coloque los tubos de tira de PCR en un bastidor magnético durante 1 min. Coloque 2 μL de sobrenadante de cada tubo en una membrana seca de nitrocelulosa y permita que la membrana se seque completamente.
NOTA: Si la intensidad de la señal es baja, se pueden detectar más de 2 μL en la membrana. El volumen se puede aumentar manchando varias veces en el mismo lugar después de que la membrana se seque al aire entre cada vez. También se puede utilizar un aparato Bio-Dot. - Incubar la membrana en tampón de bloqueo (TBS) durante 1 h. Incubar la membrana en Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugado (1:1.000 en tampón de bloqueo) durante 1 h. Luego, lave la membrana con TBS-T (Tabla 1) 5x.
NOTA: Una alternativa al ensayo dot blot es el western blot usando un anticuerpo estreptavidina. - Mida la señal fluorescente de cada punto en la membrana por debajo de 680 nm de longitud de onda y genere un diagrama de dispersión con señal fluorescente sobre el volumen de las perlas. Seleccione el volumen óptimo de perlas necesarias para 50 μg de muestra de proteína de entrada en función de dónde termina la decaimiento exponencial de la curva.
NOTA: La intensidad de fluorescencia representa la abundancia de proteínas biotiniladas en el sobrenadante, que debería disminuir con cantidades crecientes de perlas.
5. Enriquecimiento de proteínas biotiniladas y digestión en perlas (3 días)
- Transfiera muestras de lisado de proteínas de −80 °C y sonicar las muestras en tubos de 1,5 ml durante 30 s en un sonicador de baño para descongelar rápidamente las soluciones. Vortex y coloque los tubos de muestra en hielo.
- Transfiera 250 μL de suspensión de perlas magnéticas de estreptavidina (SA) a cada tubo de 1,5 ml. Coloque los tubos en una rejilla magnética, lave las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de lavado A (2% SDS) y retire el tampón residual.
- Basándose en los resultados del ensayo de transferencia de puntos y el ensayo de proteína DC, calcule la cantidad de muestra de proteína (μg) necesaria para 250 μL de la suspensión de perlas magnéticas de estreptavidina.
NOTA: En esta sonda LAMP1-APEX expresada endógenamente, se necesitan 5 μL de perlas para 50 μg de proteína de entrada. Por lo tanto, se agregan 2,5 mg de proteína total a 250 μL de perlas. Se pueden utilizar menos de 250 μL de perlas SA para material de muestra de entrada limitada. - Añadir tampón de lisis celular al tubo que contiene la mezcla magnética de lisado de perlas hasta un volumen total de 1 ml y rotar a 4 °C durante la noche.
NOTA: Las muestras de diferentes grupos o réplicas deben normalizarse a la misma concentración de proteína, volumen y cantidad de perlas para reducir las variaciones experimentales. - Haga girar todos los tubos brevemente en una microcentrífuga de sobremesa y coloque los tubos en un bastidor magnético durante 1 minuto. Retire el sobrenadante mientras está en la rejilla magnética.
NOTA: Es fundamental esperar 1 minuto después de colocar los tubos de muestra en el bastidor magnético cada vez. Esto puede minimizar la pérdida de perlas debido a la pequeña cantidad invisible de perlas que aún se mueven hacia el imán en la solución. - Lave las perlas 2 veces con 1 ml de tampón de lavado A a RT (rotación de 5 minutos cada vez). Repita el proceso con cada tampón de lavado 2 veces secuencialmente a 4 °C. (Buffer B, Buffer C y Buffer D; Tabla 1).
NOTA: Una alta concentración de solución de SDS puede precipitar a temperaturas frías. El primer lavado debe realizarse en RT. - Coloque los tubos en la rejilla magnética. Lave las perlas 2 veces con Buffer D para eliminar completamente el detergente residual. Resuspender las perlas en 100 μL de tampón Tris de 50 mM y añadir 5 mM TCEP (concentración final) para incubar durante 30 min a 37 °C en un mezclador con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
- Añadir 15 mM de yodoacetamida (IAA, concentración final) a cada tubo e incubar durante 30 min a 37 °C en una batidora con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm en la oscuridad (tapa del mezclador encendida).
NOTA: IAA es sensible a la luz y debe hacerse fresco 5 minutos antes de este paso. - Agregue 5 mM TCEP (concentración final) para calmar el exceso de IAA. Incubar durante 10 min a 37 °C en una batidora con temperatura controlada agitando a 1.200 rpm (tapa del mezclador apagada).
- Centrifugar brevemente los tubos de muestra y colocarlos en una rejilla magnética durante 1 minuto para extraer el sobrenadante. Agregue 200 μL de TCEP de 5 mM en tampón Tris de 50 mM para resuspender las perlas. Añadir 1 μg de mezcla tripsina/Lys-C a la muestra e incubar durante 14 h a 37 °C en una batidora con temperatura controlada, agitando a 1.200 rpm.
- Añadir 0,2 μg adicionales de mezcla de tripsina/Lys-C y digerir durante 3 h.
- Gire brevemente los tubos de muestra y coloque los tubos en una rejilla magnética durante 1 minuto. Transfiera el sobrenadante peptídico para limpiar los tubos mientras está en una rejilla magnética. Lave las perlas con 50 μL de tampón Tris de 50 mM (agitando durante 5 min) y combine los sobrenadantes peptídicos.
- Agregue 30 μL de ácido trifluoroacético (TFA) al 10% al tubo que contiene sobrenadante peptídico para obtener un pH <3.
6. Desalinización y fraccionamiento de péptidos (2 h)
- Mojar la placa de extracción en fase sólida de fase inversa (solo los pocillos para su uso) con 200 μL de metanol de grado HPLC (MeOH) 3x en el colector de vacío. Agregue 200 μL de TFA al 1% en agua de grado HPLC 3x para equilibrar la placa.
- Cargue las muestras de péptidos en la placa, encendiendo lentamente el vacío para una velocidad de flujo inferior a 3 gotas / s para minimizar la pérdida de muestra.
- Lave la placa de extracción 3x con 200 μL de TFA al 1%. Lave de nuevo la placa de extracción con 200 μL de TFA al 1% que contenga 2% de MeOH (v/v). Mantenga la velocidad de flujo inferior a 3 gotas/s.
- Reemplace la placa de recolección con una placa de recolección de 96 pocillos. Si no se necesita fraccionamiento, eluir las muestras de péptidos 3x con 100 μL de TFA al 1% que contiene 80% de MeOH y combinar en un nuevo tubo de muestra. Seque las muestras de péptidos en un concentrador de vacío sin calor.
NOTA: Si se desea el fraccionamiento, las muestras de péptidos se pueden eluir en 4 fracciones posteriormente utilizando 200 μL de TFA al 1% que contiene 15%, 35%, 50% y 90% de MeOH, respectivamente, en una placa de recolección diferente.
7. Ensayo de cuantificación de péptidos colorimétricos (opcional) (1 h)
- Resuspender muestras de péptidos en 50 μL de agua de grado LC-MS y tomar 20 μL de alícuotas para realizar el ensayo peptídico.
NOTA: Este paso consume una gran cantidad de muestra de péptidos, pero puede proporcionar una cuantificación precisa de la concentración de péptidos antes del análisis LC-MS. Por lo general, esto se realiza solo una vez por tipo de muestra para realizar pruebas antes de la preparación de muestras a gran escala. - Preparar diluciones seriadas de las soluciones patrón peptídicas (proporcionadas en el kit de ensayo colorimétrico) en el agua de grado LC-MS. Prepare el reactivo de trabajo mezclando 50% de reactivo A, 48% de reactivo B y 2% de reactivo C.
- Transfiera 20 μL de cada solución patrón peptídica (tres réplicas) y la muestra de péptidos desconocidos a una microplaca de 96 pocillos. Agregue 180 μL del reactivo de trabajo a cada pocillo, mezcle bien e incube la placa durante 30 minutos a RT.
- Lea la absorbancia a 480 nm en un lector de microplacas y cuantifique las concentraciones de muestras de péptidos en función de la curva estándar del péptido.
8. Análisis LC-MS
- Resuspender las muestras de péptidos en LC Buffer A (2% de acetonitrilo y 0,1% de ácido fórmico, grado LC-MS). Centrifugar a 16.500 × g durante 10 min a 4 °C para eliminar cualquier posible partícula.
- Transfiera el sobrenadante a los viales LC-MS. Analizar las muestras utilizando un instrumento nanoLC-MS.
NOTA: Los parámetros detallados de LC-MS/MS dependen del instrumento y se han descrito anteriormente22,25,26. - Generar una lista de exclusión LC-MS personalizada con un rango de tiempos de retención para picos de péptidos contaminantes altamente abundantes como la estreptavidina y la tripsina con una precisión de masa de 5 ppm 22 (por ejemplo, los picos comunes del péptido de estreptavidina son m/z 402.5435 [carga 3], m/z 603.3117 [carga 2], m/z 654.9733 [carga 3], m/z 678.6812 [carga 3], m/z 1017.5182 [carga 2], etc.; Los picos comunes del péptido de tripsina son M/z 421.7584 [carga 2], m/z 523.2855 [carga 2] y m/z 737.7062 [carga 3]).
9. Análisis de datos proteómicos
- Analice los datos sin procesar de LC-MS con software de análisis de datos proteómicos como Proteome Discoverer, MaxQuant27 o MS-Fragger28. Incluir dos bibliotecas FASTA para el análisis de datos: 1) una base de datos de referencia Swissprot Homo Sapiens ; 2) una biblioteca FASTA de contaminantes universales (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib) recién generada, que ha demostrado mejorar la identificación proteómica y disminuir los falsos descubrimientos29.
- Configure los parámetros de análisis de datos proteómicos con un límite de tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1% para las identificaciones de coincidencia espectral de proteínas y péptidos (PSM). Seleccione la digestión de tripsina con un máximo de tres divisiones perdidas, una modificación fija de la carbamidometilación de cisteína y una modificación variable de la oxidación de metionina y la acetilación de proteínas N-terminales. Utilice las intensidades máximas del péptido MS1 para la cuantificación sin etiqueta. Normalizar las intensidades peptídicas a la carboxilasa endógenamente biotinilada, propionil-CoA carboxilasa (PCCA), para reducir las variaciones de etiquetado de proximidad, como se describió anteriormente22.
NOTA: La normalización PCCA se puede seleccionar en el software Proteome Discoverer incluyendo un archivo FASTA de secuencia de proteínas PCCA. Alternativamente, la normalización de PCCA se puede llevar a cabo en el análisis de datos aguas abajo. - Exporte los resultados a nivel de proteína desde el software de proteómica. Eliminar las proteínas contaminantes antes del análisis estadístico29. Eliminar proteínas con solo 1 PSM o sin resultado de cuantificación. Realice análisis a plazo de ontología génica de proteínas (GO) con Enrichr30 y análisis de redes de proteínas con STRING31.
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Representative Results
Este estudio de proteómica de marcado de proximidad lisosómica se realizó en neuronas humanas derivadas de iPSC para capturar el microambiente lisosomal dinámico in situ en neuronas vivas. Las morfologías celulares de las hiPSC y las neuronas derivadas de hiPSC en diferentes puntos de tiempo se ilustran en la Figura 2A. Las iPSCs humanas crecen en colonias en medio E8. La diferenciación se inicia mediante la colocación de iPSCs en un medio de inducción neuronal que contiene doxiciclina. Las extensiones de neuritas se vuelven más visibles cada día durante la diferenciación de 3 días. Después de cambiar a placas recubiertas de PLO en medio neuronal, las neuritas forman una red entre las neuronas, y las extensiones axonales se vuelven más visibles a medida que las neuronas alcanzan la maduración en 2 semanas. En i3neuronas, la localización de la sonda APEX se valida mediante microscopía de fluorescencia después de una rápida activación de APEX. Las proteínas biotiniladas se tiñen con el anticuerpo estreptavidina (SA), y los lisosomas se tiñen con el anticuerpo anti-LAMP1. La imagen combinada valida la localización correcta de LAMP1-APEX a la proteína cebo (Figura 2B).
El ensayo de titulación de perlas es crucial para determinar la proporción óptima de perlas a proteína, de modo que la cantidad de perlas de estreptavidina sea suficiente para enriquecer todas las proteínas biotiniladas, pero no tan excesiva como para causar una contaminación grave de estreptavidina en LC-MS. El volumen óptimo de perlas necesarias para 50 μg de muestra de proteína de entrada se selecciona en función de dónde termina la desintegración exponencial de la curva (Figura 3A) Como se muestra en la Figura 3A, las señales de punto-blot del sobrenadante de incubación de proteínas de perlas disminuyeron a medida que se capturaron más proteínas biotiniladas con mayores cantidades de las perlas de estreptavidina. Para muestras endógenas de LAMP1-APEX, 5 μL de perlas de estreptavidina fueron óptimas para 50 μg de proteína de entrada (resaltado en la Figura 3A). Después del enriquecimiento, se desconoce la cantidad de proteína capturada por las perlas de estreptavidina. El exceso de enzima proteolítica (tripsina) puede aumentar la autodigestión enzimática, con abundantes picos de péptido de tripsina en LC-MS. La tripsina excesiva también puede digerir más péptidos de estreptavidina en las muestras. Por lo tanto, se debe optimizar la cantidad de proteasa necesaria para la digestión de las perlas. En comparación con la tripsina sola, la digestión en perlas con la mezcla de tripsina/Lys-C dio como resultado la identificación de más proteínas y péptidos y menos divisiones perdidas (Figura 3B). Además, 1-1.5 μg de proteasa por 250 μL de perlas magnéticas de estreptavidina fue óptimo para obtener el mayor número de proteínas identificadas y el menor porcentaje de escisiones perdidas (Figura 3C). Con una proporción óptima de perlas a proteína, la misma cantidad de perlas debería capturar la misma cantidad de proteínas biotiniladas. Por lo tanto, esta cantidad optimizada de proteasa se puede utilizar para todos los experimentos que enriquecen proteínas biotiniladas utilizando las mismas perlas magnéticas de estreptavidina.
Las enzimas de marcado de proximidad basadas en peroxidasa se activan mediante incubación de biotina-fenol y un breve tratamiento con H2O2(1 min). Este paso es una fuente importante de variación en la proteómica del etiquetado de proximidad. Anteriormente encontramos que la normalización a la carboxilasa más abundante, endógenamente biotinilada, PCCA, puede reducir significativamente las variaciones experimentales, permitiendo la comparación de los datos de proteómica de etiquetado de proximidad en diferentes lotes experimentales (Figura 4)22. Para las neuronas endógenas LAMP1-APEX, se utilizó la línea parental sin expresión de la sonda LAMP1-APEX como grupo control. Las neuronas de control también fueron tratadas con biotina-fenol yH2O2. La distribución de las proporciones de proteínas de LAMP1-APEX frente al grupo control se ilustra en la Figura 5A. Todas las carboxilasas endógenamente biotiniladas se enriquecieron con perlas recubiertas de estreptavidina, pero permanecieron sin cambios. Como se muestra en el análisis GO-term y en el análisis de redes de proteínas (Figura 5B,C), tanto las proteínas estables de la membrana lisosomal como los interactores lisosomales transitorios relacionados con el tráfico y transporte endolisosomal fueron enriquecidos en proteómica LAMP1-APEX32,33,34.
Figura 1: Flujo de trabajo general para la proteómica de marcado de proximidad lisosómica en neuronas derivadas de hiPSC. Abreviaturas: hiPSC = célula madre pluripotente inducida por humanos; LAMP1 = proteína de membrana lisosomal asociada 1; APEX = ascorbato peroxidasa; dox = doxiciclina; PA = biotina-fenol; DCA = ensayo de proteínas compatibles con detergentes; SA = estreptavidina; LC-MS/MS = cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem; PCCA = propionil-CoA carboxilasa, una proteína endógenamente biotinilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes microscópicas de neuronas derivadas de hiPSC y actividad LAMP1-APEX. (A) Imágenes de microscopía de campo claro de diferentes etapas de hiPSCs y neuronas derivadas de hiPSC. (B) Imágenes de fluorescencia de la actividad LAMP1-APEX en la neurona. Las señales biotiniladas teñidas contra estreptavidina se colocalizan con la tinción LAMP1 fuera del núcleo (HOECHST). Barras de escala = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Abreviaturas: hiPSC = célula madre pluripotente inducida por humanos; LAMP1 = proteína de membrana lisosomal asociada 1; APEX = ascorbato peroxidasa; SA = estreptavidina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La optimización de la relación de perlas a proteína de entrada y la digestión enzimática de proteínas puede mejorar las identificaciones de proteínas y reducir la interferencia. (A) Ejemplo de resultados del ensayo de titulación de perlas del ensayo dot-blot utilizando 50 μg de proteína de entrada y diferentes cantidades de perlas de estreptavidina. (B) La mezcla tripsina/Lys-C dio lugar a una mejor identificación de proteínas/péptidos y menos divisiones perdidas que la tripsina sola. (C) Optimización de la cantidad de tripsina/Lys-C para la digestión de perlas. Esta cifra ha sido modificada de Frankenfield et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La normalización de los datos proteómicos de etiquetado de proximidad a una carboxilasa endógenamente biotinilada, PCCA, puede reducir las variaciones de cuantificación entre las réplicas biológicas. Esta cifra ha sido modificada de Frankenfield et al.22. Abreviatura: PCCA = propionil-CoA carboxilasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Proteómica de etiquetado de proximidad lisosomas enriqueció proteínas de membrana lisosomal y proteínas de interacción lisosomal en neuronas. (A) Diagrama de dispersión de las proporciones de abundancia de proteínas de LAMP1-APEX versus ningún control APEX que muestra proteínas de membrana lisosomal enriquecidas y proteínas endógenamente biotiniladas sin cambios. (B) El análisis a término GO de los resultados proteómicos que demuestran un componente celular enriquecido en el lisosoma. (C) Análisis de la red de proteínas STRING que muestra que las proteínas interactúan directamente con la proteína de cebo (LAMP1), las proteínas de membrana lisosomal y los interactores lisosomales como las proteínas de tráfico de membrana. Esta cifra ha sido modificada de Frankenfield et al.22. Abreviaturas: LAMP1 = proteína de membrana lisosomal asociada 1; APEX = ascorbato peroxidasa; GO = ontología génica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Medio/Buffer | Componente | Protocolo | ||
| Solución de recubrimiento de matriz de membrana basal (Matrigel) | 1% de material de matriz de membrana basal, 99% DMEM / F12 medio | 1.1, 1.2 | ||
| Solución de recubrimiento de vitronectina | Concentración final de 5 μg/ml en PBS | 1.1 | ||
| Medio completo E8 con inhibidor de ROCK | 98% E8 medio, 2% E8 suplemento, 10 μM Y-27632 o 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Medio de inducción neuronal | 97% DMEM/F12 con HEPES, suplemento de N2 al 1%, 1% de aminoácidos no esenciales (NEAA), 1% de L-glutamina, 2 μg/ml de doxiciclina e inhibidor de ROCK (10 μM Y-27632 o 5 nM de croman 1) | 1.2 | ||
| Solución de recubrimiento Neuron PLO | 0,1 mg/ml de poli-L-ornitina (PLO), ácido bórico 100 mM, tetraborato de sodio 25 mM, cloruro de sodio 75 mM, hidróxido de sodio 1 M | 1.3 | ||
| Neurona media | 98% medio de neurona cortical, suplemento de B27 al 2%, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) de 10 ng/ml, factor neurotrófico derivado de glial (GDNF) de 10 ng/ml, NT-3 de 10 ng/ml, laminina de 0,2 μg/ml, 2 μg/ml de doxiciclina | 1.3 | ||
| Búfer de enfriamiento | 10 mM de azida de sodio, 10 mM de ascorbato de sodio, 5 mM de TROLOX en PBS | 2.2 | ||
| Tampón de lisis celular | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-carboxietil)fosfina clorhidrato (TCEP), 10 mM de azida sódica, 10 mM ascorbato de sodio, 5 mM TROLOX, cóctel inhibidor de proteasa | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05% Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Búfer A | 2% de búfer SDS | 5.2 | ||
| Búfer B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Búfer C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Búfer D | 2 M de urea, 50 mM de Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabla 1: Composiciones de medios y buffers utilizados en este protocolo.
| Problema | Protocolo | Solución/Sugerencia | ||||
| Cultivo de iPSC despegando la placa | 1.1 | Aumentar la concentración o el tiempo del recubrimiento de vitronectina. | ||||
| Algunas iPSCs no se diferenciaron en neuronas | 1.2 | Aumentar el tiempo de tratamiento de la solución de desprendimiento celular para disociar completamente las iPSC durante la diferenciación d0. | ||||
| Cultivo neuronal despegando de la placa | 1.3 | El lavado y cambio del medio debe ser suave y desde la pared lateral de la placa. | ||||
| Las proteínas no se disuelven completamente después de la precipitación de acetona | 2.7 | Reducir el tiempo de secado del pellet de proteína. Aumente el volumen del tampón de lisis y sonicar brevemente para ayudar a la disolución. | ||||
| Señales débiles de tinción de estreptavidina | 3 | Aumente el tiempo de tratamiento deH2O2para que sea de 2-3 s y gire la placa para una distribución uniforme. | ||||
| Baja señal del ensayo de titulación de perlas | 4.2 | Espere hasta que la membrana esté completamente seca y agregue más sobrenadante al mismo lugar (puede repetir hasta 3 veces) para mejorar la intensidad de la señal. | ||||
| Perlas magnéticas que no se peletizan hacia la cremallera magnética | 5 | La movilidad de la perla magnética disminuye en el tampón que contiene no detergente. Se puede utilizar una concentración de urea superior de hasta 4 M o detergente compatible con LC-MS en el tampón de lavado D. | ||||
| Pérdida de perlas magnéticas durante el lavado de perlas | 5 | Aumente el tiempo de espera cuando se coloquen tubos de muestra en las perlas magnéticas (1 minuto o más) antes de tomar sobrenadante de los tubos. | ||||
| Picos de contaminación cargados individualmente en LC-MS | 6 | La limpieza de péptidos no es suficiente. Aumente los volúmenes y tiempos de lavado durante la desalinización de péptidos. | ||||
| Ensayo de péptidos de señal baja | 7 | Resuspender muestras de péptidos en menor volumen para aumentar la concentración de péptidos. | ||||
| Señales abrumadoras de estreptavidina en LC-MS | 8 | Reduzca la cantidad de perlas de estreptavidina. Si el pico de tripsina también es abundante, reduzca la cantidad de tripsina. | ||||
| Demasiados antecedentes de etiquetado no específicos | 9 | El lavado de las perlas de estreptavidina no fue suficiente. Retire todo el líquido residual durante cada paso de lavado. Aumente el tiempo y el volumen para el lavado de perlas. | ||||
Tabla 2: Solución de problemas y soluciones.
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Discussion
Usando esta sonda LAMP1-APEX, las proteínas en y cerca de la membrana lisosomal son biotiniladas y enriquecidas. Dado el diámetro típico del lisosoma de 100-1.200 nm, este método proporciona una excelente resolución intracelular con un radio de etiquetado de 10-20 nm. LAMP1 es una proteína de membrana lisosomal abundante y un marcador clásico para lisosomas, que sirve como una excelente proteína de cebo para el marcado lisosomal APEX a nivel de expresión endógena. Sin embargo, también existen limitaciones cuando se utiliza LAMP1 para atacar lisosomas, ya que LAMP1 también está presente en endosomas tardíos y lisosomas no degradativos35. La mayoría de los marcadores lisosomales también se expresan en endosomas tardíos, que eventualmente maduran en lisosomas. Las proteínas de cebo alternativas para atacar los lisosomas son LAMPTOR, LAMP2 y TMEM19235,36,37. Es importante tener en cuenta que los radicales reactivos de biotina no penetran en la membrana. Por lo tanto, la mayoría de las proteínas lisosomales solo de lumen no se capturan en este método proteómico LAMP1-APEX. Las proteínas de la luz lisosomal pueden obtenerse por aislamiento lisosomal mediante el método tradicional de centrifugación por gradiente o inmunopurificación lisosomal 4,38. Sin embargo, las proteínas en la membrana lisosomal pueden interrumpirse durante el aislamiento lisosomal y perder la información para las interacciones lisosomales transitorias y dinámicas. Por lo tanto, el etiquetado de proximidad lisosomal y el aislamiento lisosomal se pueden combinar para obtener una instantánea completa de las actividades lisosomales tanto fuera como dentro de los lisosomas.
Para minimizar la variabilidad del cultivo de neuronas iPSC, la densidad del recubrimiento neuronal debe ser consistente en todas las réplicas biológicas y grupos de comparación. Los mismos niveles de maduración neuronal y salud también son críticos por esta razón. Durante la activación de APEX, la adición de biotina-fenol yH2O2a las células debe llevarse a cabo mezclando previamente con un medio de cultivo caliente y luego agregando la mezcla a las células, seguido de una agitación inmediata y suave para garantizar una distribución uniforme. El uso deH2O2también plantea preocupaciones sobre el estrés oxidativo y las perturbaciones en el microambiente dinámico de la célula. Aunque no se encontraron cambios significativos en el nivel de abundancia de proteínas, se modificaron más péptidos con la oxidación de metionina en las neuronas deH2O2tratadas versus control22. Por lo tanto, el control estricto del tiempo de activación de H2O2(1 min) es fundamental para minimizar el estrés oxidativo y reducir la difusión de la nube de biotina para garantizar un radio de etiquetado específico que rodea la proteína del cebo.
Para líneas celulares no polarizadas como HEK y U2OS, las células se pueden cosechar mediante peletización después del etiquetado de proximidad para eliminar el sobrenadante que contiene biotina libre. Sin embargo, las neuronas deben cosecharse agregando directamente un tampón de lisis celular a la placa y raspando en tubos para evitar el daño de neuritas y la pérdida de muestras durante la peletización. La presencia de biotina libre puede saturar las perlas de estreptavidina. La eliminación completa de la biotina libre se puede lograr mediante múltiples lavados e incubación con tampón de enfriamiento en las neuronas y / o precipitación de proteínas después de la lisis celular. Como las diferentes proteínas de cebo tienen diferentes niveles de expresión, se debe realizar un ensayo de transferencia de puntos para cada nueva sonda APEX. Una vez que se determina la relación óptima de perlas/proteína, la cantidad de proteína inicial y el volumen de perlas debe ser consistente para todas las réplicas para la misma sonda APEX. Al comparar diferentes sondas, como LAMP1-APEX versus APEX citosólico, se recomienda usar el mismo volumen de perlas pero variar la cantidad de proteína inicial para reflejar las proporciones óptimas de perlas/proteínas para diferentes sondas APEX. Para reducir aún más las variaciones experimentales y aumentar el rendimiento, se puede realizar un etiquetado de isótopos estables por aminoácidos en cultivo celular (SILAC)39. El etiquetado isobárico multiplexado también se puede utilizar para etiquetar químicamente péptidos después de la digestión de proteínas a través de etiquetas TMT/iTRAQ/DiLeu 20,40,41,42.
El etiquetado de proximidad ha sido ampliamente aplicado para capturar el microambiente celular y molecular en diversos organismos43. Sin embargo, el etiquetado de proximidad aún enfrenta muchos desafíos técnicos, como la contaminación de las señales de estreptavidina, el uso de peróxido de hidrógeno para la activación de enzimas y la presencia de carboxilasas mitocondriales endógenamente biotiniladas. Por lo tanto, los experimentos proteómicos de etiquetado de proximidad requieren una planificación cuidadosa y un control de calidad. Para ayudar a los investigadores a solucionar problemas de su experimento de etiquetado de proximidad, proporcionamos una breve guía para problemas y soluciones comunes en la Tabla 2. Más recientemente, se desarrolló un método de etiquetado de proximidad escindible utilizando biotina25 esciblable por tiol. Por lo tanto, las proteínas biotiniladas pueden separarse de las perlas utilizando un reactivo reductor como el TCEP sin la necesidad de una digestión en las perlas. Este método de biotina escindible puede reducir drásticamente las señales de interferencia de la estreptavidina, las carboxilasas endógenamente biotiniladas y la unión no específica. Los esfuerzos en curso aplicarán este método de biotina escindible a la proteómica LAMP1-APEX para mejorar la especificidad y precisión del etiquetado. Las sondas de etiquetado de proximidad también pueden diseñarse para apuntar a otros compartimentos subcelulares44. La cantidad y el tipo de proteínas identificadas dependen de la naturaleza de la proteína de cebo, su entorno intracelular y el nivel de expresión de la sonda de etiquetado de proximidad. Este método proteómico endógeno LAMP1-APEX proporciona una herramienta valiosa para estudiar la actividad lisosomal dinámica en las neuronas humanas. El protocolo detallado y la optimización metodológica también son aplicables a otras sondas de etiquetado de proximidad y biotinilación química, sirviendo como un recurso útil para la comunidad proteómica.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio cuenta con el apoyo de la subvención de los NIH (R01NS121608). A.M.F. reconoce la beca ARCS-Metro Washington Chapter y la beca Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Agradecemos al laboratorio Michael Ward en el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS) por el apoyo en biología molecular y el desarrollo de la tecnología i3Neuron.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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