Summary
İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.
Abstract
Lizozomlar, bozunmayı ve diğer çeşitli hücresel fonksiyonları elde etmek için sıklıkla çeşitli biyomoleküllerle iletişim kurar. Lizozomlar insan beyni fonksiyonu için kritik öneme sahiptir, çünkü nöronlar postmitotiktir ve hücresel homeostazı korumak için otofaji-lizozom yoluna büyük ölçüde güvenirler. Çeşitli lizozomal fonksiyonların anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, lizozomlar ve diğer hücresel bileşenler arasındaki son derece dinamik iletişimi yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı nöronlarda proteomik yöntemi etiketleyen yakın zamanda yayınlanan endojen (knock-in) lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.
Hem lizozomal membran proteinleri hem de 10-20 nm yarıçap içindeki lizozomları çevreleyen proteinler, canlı insan nöronlarında güvenle tanımlanabilir ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Protokolün her adımı, yani hiPSC-nöron kültürü, yakınlık etiketleme, nöron hasadı, floresan mikroskopisi, biyotinile protein zenginleştirme, protein sindirimi, LC-MS analizi ve veri analizi gibi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özetle, bu eşsiz endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi, canlı insan nöronlarındaki son derece dinamik lizozomal aktiviteleri incelemek için yüksek verimli ve sağlam bir analitik araç sağlar.
Introduction
Lizozomlar, makromolekülleri lizozomal-otofaji yolu1 yoluyla parçalayan katabolik organellerdir. Bozunmanın yanı sıra, lizozomlar sinyal iletimi, besin algılaması ve sekresyon 2,3,4 gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda rol oynar. Lizozomal fonksiyondaki pertürbasyonlar lizozomal depo bozuklukları, kanser, yaşlanma ve nörodejenerasyon 3,5,6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Postmitotik ve yüksek polarize nöronlar için, lizozomlar nöronal hücresel homeostaz, nörotransmitter salınımı ve aksonlarboyunca uzun mesafeli transportta kritik rol oynar 8,9,10,11. Bununla birlikte, insan nöronlarındaki lizozomları araştırmak zor bir görev olmuştur. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı nöron teknolojilerindeki son gelişmeler, daha önce erişilemeyen canlı insan nöronlarının kültürünü mümkün kılarak hayvan modelleri ile insan hastaları arasındaki boşluğu doldurarak insan beynini incelemiştir12,13. Özellikle, gelişmiş i3Nöron teknolojisi, nörogenin-2 transkripsiyon faktörünü doksisiklin ile indüklenebilir bir promotör altında iPSC genomuna istikrarlı bir şekilde entegre eder ve iPSC'leri 2 hafta içinde saf kortikal nöronlara farklılaşmaya yönlendirir14,15.
Son derece dinamik lizozomal aktivite nedeniyle, diğer hücresel bileşenlerle lizozomal etkileşimleri yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Yakınlık etiketleme teknolojisi, olağanüstü mekansal özgüllük16,17 ile hem kararlı hem de geçici / zayıf protein etkileşimlerini yakalama kabiliyeti nedeniyle bu dinamik etkileşimleri incelemek için çok uygundur. Mühendislik peroksidaz veya biyotin ligaz, genetik olarak yem proteinine kaynaştırılabilir. Aktivasyon üzerine, komşu proteinleri kovalent olarak etiketlemek için oldukça reaktif biyotin radikalleri üretilir, bunlar daha sonra sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) platformları17,18,19,20,21 aracılığıyla aşağı akış aşağıdan yukarıya proteomikler için streptavidin kaplı boncuklarla zenginleştirilebilir.
Yakın zamanda i3Nöronlar22'deki dinamik lizozomal mikro ortamı yakalamak için endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi geliştirilmiştir. Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX2), iPSC'lerde lizozomal ilişkili membran proteini 1'in (LAMP1) C-terminusuna çarptı ve daha sonra kortikal nöronlara farklılaştırıldı. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve klasik bir lizozomal belirteç23'tür. LAMP1 ayrıca lizozomlara olgunlaşan geç endozomlarda da ifade edilir; Bu geç endozozom-lizozomlar ve degradatif olmayan lizozomların hepsi bu protokolde lizozomlar olarak adlandırılır. Fizyolojik düzeyde eksprese edilen bu endojen LAMP1-APEX probu, LAMP1 yanlış lokalizasyonunu ve aşırı ekspresyon artefaktlarını azaltabilir. Yüzlerce lizozomal membran proteini ve lizozomal interaktör, canlı insan nöronlarında mükemmel uzamsal çözünürlükle tanımlanabilir ve ölçülebilir.
Burada, insan iPSC türevi nöronlarında proteomikleri etiketleyen lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol, yakın zamanda yayınlanan yöntem22'den daha fazla iyileştirme ile açıklanmaktadır. Genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Protokol, hiPSC kaynaklı nöron kültürünü, nöronlarda yakınlık etiketleme aktivasyonunu, floresan mikroskobu ile APEX aktivitesinin doğrulanmasını, optimal streptavidin boncuk-giriş protein oranının belirlenmesini, biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesini, boncuk üzerinde protein sindirimini, peptid tuzunu alma ve nicelleştirmeyi, LC-MS analizini ve proteomik veri analizini içerir. Yakınlık etiketleme kalite kontrolünü ve performansını iyileştirmek için sorun giderme yönergeleri ve deneysel optimizasyonlar da tartışılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler George Washington Üniversitesi biyogüvenlik ve etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan ortam ve tampon bileşimleri Tablo 1'de verilmiştir. Burada kullanılan ticari ürün bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.
1. İnsan iPSC kaynaklı nöron kültürü
- İnsan iPSC kültürü ve LAMP1-APEX prob entegrasyonu (7 gün)
- Matrigel stok çözeltisini gece boyunca 4 ° C'de bir buz kovasında çözün, çözeltinin aliquot 500 μL'sini soğuk steril tüplere dökün ve alikotları -80 ° C'de saklayın. 49,5 mL soğuk DMEM/F12 ortamına 500 μL Matrigel stoğu ekleyerek 50 mL kaplama çözeltisi hazırlayın.
NOT: Matrigel'i soğuk tutun ve polimerizasyonu önlemek için önceden soğutulmuş konik tüpler ve pipet uçları kullanın. Kaplama çözeltisi 4 °C'de 2 hafta saklanabilir. - 10 cm'lik bir hücre kültürü kabını, 37 °C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca 4 mL kaplama çözeltisi ile kaplayın.
NOT: Vitronectin, iPSC kültürü için 5 μg/mL konsantrasyonda ve 2 saat kaplamada alternatif bir kaplama çözümü olabilir. Vitronektin (tek protein bileşeni) Matrigel'den daha pahalıdır, ancak çok sayıda hücre dışı matriks proteini ile fare tümöründen ekstrakte edilen Matrigel'den daha az parti varyasyonuna ve daha temiz arka plan sinyallerine sahiptir. Vitronektin kaplama için işlem görmemiş doku kültürü plakasına ihtiyaç vardır. Matrigel kaplama, hem işlenmiş hem de işlenmemiş doku kültürü plakaları için çalışır. - ROCK inhibitörü ile desteklenmiş 8 mL Esansiyel Esansiyel E8 tam ortam (son konsantrasyon 10 μM Y-27632 veya 50 nM Chroman1) ile önceden yüklenmiş her kaplamalı 10 cm'lik çanak üzerinde 1-3 milyon hiPSC çözün ve plakalayın.
NOT: Kök hücre kültürü ortamına ROCK inhibitörü (Y-27632 veya Chroman1) eklenmesi, bölünme ve kriyojenik korumadan sonra ayrışmaya bağlı apoptozu en aza indirir. Chroman1'in son zamanlarda hem ROCK1 hem de ROCK224'ü inhibe etmede Y-27632'den daha güçlü olduğu gösterilmiştir. - iPSC'ler koloniler oluşturduktan sonra, tipik olarak 1-2 gün sonra, ROCK inhibitörü olmadan 10 mL E8 tam ortamına geçin. iPSC kültürünü E8 tam ortamda tutun ve süpernatantı her gün taze ortamla değiştirin.
- CRISPR genom mühendisliği ile askorbat peroksidaz (APEX2) mühendisliği ile yakınlık etiketleme enzimini, endojen LAMP1 geninin C-terminusuna entegre edin. Mühendislik kararlı bir hücre hattı oluşturmak için ayrıntılı adımlar için, daha önce yayınlanmış yönteme bakın (Frankenfield ve ark.). 22.
- Matrigel stok çözeltisini gece boyunca 4 ° C'de bir buz kovasında çözün, çözeltinin aliquot 500 μL'sini soğuk steril tüplere dökün ve alikotları -80 ° C'de saklayın. 49,5 mL soğuk DMEM/F12 ortamına 500 μL Matrigel stoğu ekleyerek 50 mL kaplama çözeltisi hazırlayın.
- İnsan iPSC-nöron farklılaşması (3 gün)
- Farklılaşmadan önce 10 cm'lik bir hücre kültürü kabını 37 °C'lik bir inkübatörde 4 mL Matrigel kaplama çözeltisi ile gece boyunca kaplayın.
- HiPSC'leri ~%70 birleşene kadar koruyun. Ölü hücreleri çıkarmak için hiPSC'leri fosfat tamponlu salin (PBS) 2x ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 10 cm'lik hücre kabına 3 mL Accutase ekleyin. Eşit dağılım için plakayı sallayın ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 8 dakika inkübe edin.
- Hücreleri plakadan yıkamak ve kaldırmak için 2 mL PBS ekleyin ve tüm hücre çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın. Hücreleri 300 × g'da 5 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Plaka 2-4 × 8 mL sıcak nöron indüksiyon ortamı ile önceden yüklenmiş Matrigel kaplı bir plaka üzerine 106 hiPSC (Tablo 1). Hücreleri eşit olarak dağıtın ve 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
NOT: Nöron farklılaşması, bu kararlı hiPSC hücre hattı15'te aşırı eksprese edilen bir doksisiklin ile indüklenebilir transkripsiyon faktörü olan nörogenin-2 (NGN2) tarafından yönlendirilir. - Ölü hücre kalıntılarını gidermek için farklılaşmanın 1. gününde hiPSC'leri PBS ile nazikçe yıkayın. ROCK inhibitörü olmadan 10 mL sıcak indüksiyon ortamı ile değiştirin.
- Farklılaşmanın 3. gününe kadar her gün ROCK inhibitörü olmadan sıcak indüksiyon ortamı ile değiştirin.
NOT: Nöronlar nöronal ortama yeniden yerleştirilmeye hazırdır.
- Nöronların kaplanması ve nöron kültürünün sürdürülmesi (10 gün)
- Borat tamponunda 0.1 mg/mL Poli-L-Ornitin (PLO) kaplama çözeltisi hazırlayın (Tablo 1).
- Bir hücre kültürü kabını, PLO kaplama çözeltisi ile 37 ° C'lik bir inkübatörde, 3. gün nöronlarının kaplanmasından önce en az 1 saat veya bir gecede kaplayın. Bulaşığı üç kez 4 mL steril suyla yıkayın ve biyogüvenlik kabininin içinde tamamen kurumasını bekleyin.
- Her 10 cm'lik çanaktan 3 mL Accutase ve plaka 8-10 milyon hücre içeren günlük 3 nöronları, sıcak kortikal nöron ortamı ile önceden yüklenmiş her 10 cm'lik FK kaplı çanağa ayırın (Tablo 1).
- I3 Nöronları farklılaşmadan sonraki 2 hafta içinde olgunlaşmaya ulaşana kadar sıcak nöron ortamı ile her2-3günde bir yarım orta bir değişiklik yapın.
2. In situ yakınlık etiketleme ve nöron lizisi (2 saat)
- Dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 500 mM biyotin-fenol (BP) stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. Yakınlık etiketleme gününde, BP stok çözeltisini ılık nöron ortamı ile seyreltin ve nöronları 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca 500 μM'lik son bir konsantrasyonda tedavi edin.
NOT: Doksisiklin nöron ortamına eklenir, bu da APEX enzim ekspresyonunu aktive eder. Doxcycline'ın yakınlık etiketleme deneyinden en az 24 saat önce eklenmesi gerekir. - Nöron kültürüne 1 mM'likson konsantrasyondaH2 O 2 ekleyerek etiketleme reaksiyonunu başlatın ve tam olarak 1 dakika boyunca inkübe edin. Ortamı hemen aspire edin ve söndürme tamponu ile 3 kez durulayın (Tablo 1).
NOT: H2O2 çözeltisi, etiketleme reaksiyonundan önce taze yapılmalıdır. Deneyselvaryasyonu azaltmak ve uzun süreli H2 O2 tedavisinin neden olduğu oksidatif stresi en aza indirmek içinH2 O2aktivasyonunun tam olarak 1 dakika olması gerekir. - Tüm kalan tamponu aspire etmek için plakayı eğin. Buz gibi soğuk hücre lizis tamponunu (Tablo 1) doğrudan nöron plakasına ekleyin. 1 milyon nöron başına 100 μL hücre lizis tamponu kullanın. Yeterli hücre lizisi için plakayı döndürün ve buzun üzerine yerleştirin.
- Hücre lizatlarını soğuk 1.5 mL tüplere kazıyın. Alternatif 40 s açık, 20 s kapalı döngüleri ile 15 dakika boyunca bir banyo sonicator (>100 W) kullanarak buz gibi soğuk bir su banyosunda sonicate.
NOT: Yeterince lize protein çözeltisi, pelet veya aşırı kabarcıklar olmadan berrak olmalıdır. Hücre lizatının yeterli sonikasyonu, nükleik asitleri kesmek ve aşağı akış prosedürlerinde spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için hücre lizatının yapışkanlığını azaltmak için çok önemlidir. Daha güçlü ve daha hızlı hücre lizisi sağlamak için bir prob sonicator da kullanılabilir, ancak çapraz kontaminasyonu ve numune kaybını en aza indirmek için probun numuneler arasında yıkanması gerekir. - Numuneye 4 kat hacimli lizis tamponunda soğuk aseton (-20 °C) ekleyin. Vorteks kısaca ve 3 saat boyunca -20 ° C'de kuluçkaya yatırın.
- 2 °C'de 10 dakika boyunca 16.500 × g'da santrifüj. Protein peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Peleti 1 mL -20 °C aseton 2x ile yıkayın ve santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarın.
- Protein peletini 1 dakika boyunca bir vakum yoğunlaştırıcı ile kurutun. Peletin tamamen çözülmesi için hücre lizis tamponu ekleyin. Gerekirse kısaca sonikate. Numuneleri -80 °C'de saklayın.
NOT: Aseton çökeltmesi, numunedeki kalıntı biyotin-fenolünü giderebilir ve bu da biyotinile proteinlerin aşağı yönde zenginleşmesine müdahale edebilir.
3. APEX lokalizasyonunu ve aktivitesini doğrulamak için floresan mikroskobu (1.5 gün)
- EndojenLAMP1-APEX'i eksprese eden i 3 Nöronlarını 500 μM BP ile 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin. Biyotin bulutunun difüzyonunu sınırlamak için etiketlemeyi sadece 1 s için 1 mMH2 O2 işlemi ile etkinleştirin.
- Hücreleri derhal söndürme tamponunda% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve PBS ile 3x'i nazikçe yıkayın.
NOT: 10 cm'lik bir tabak için, yeterli bir yıkama için 4-6 mL gereklidir. - Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca PBS'de% 3 eşek serumu ve% 0.1 saponin kullanarak hücreleri bloke edin ve geçirgenleştirin.
- Hücreleri primer anti-LAMP1 antikoru (fare monoklonal H3A4, 1:1.000) ile gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Nöronları PBS ile 3 x yavaşça yıkayın. RT'de 1 saat boyunca anti-fare AF561 sekonder antikoru (1:1.000) ve Streptavidin-680 (1:1.000) ile nöronları inkübe edin.
- PBS ile 2x yıkayın ve RT'de 10 dakika boyunca Hoechst veya 4',4-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nükleer belirteci ile inkübe edin.
- Sabit nöronları floresan mikroskobu altında görselleştirin. APEX aktivitesinin doğru yerini doğrulamak için streptavidin ile boyanmış ve çekirdeğin dışındaki LAMP1 boyama ile kolokalize biyotinile proteinleri gözlemleyin.
4. Streptavidin boncuk-girdi protein oranının belirlenmesi (1.5 gün)
- Hücre lizatlarındaki toplam protein konsantrasyonlarını belirlemek için deterjanla uyumlu protein testi (DCA) yapın
- Sığır serum albümini (BSA) protein standardını hücre lizis tamponunda 4 mg/mL konsantrasyonda çözün. Hücre lizis tamponunu kullanarak bir dizi BSA protein standart çözeltisi (0.2-2 mg / mL, 5 seyreltme) hazırlayın.
- Her protein örneğinden 5 μL, BSA protein standart çözeltisi ve boş hücre lizis tamponunu 96 delikli bir plakadaki her bir kuyucuğa üçlü olarak aktarın.
- A' reaktifini elde etmek için 1 mL reaktif A başına 2 μL reaktif S ekleyin. Her bir oyuğa 25 μL reaktif A' ekleyin. Her bir oyuğa 200 μL reaktif B ekleyin. Varsa baloncukları karıştırın ve patlatın.
- RT'deki 96 kuyucuklu plakayı 15 dakika boyunca inkübe edin, bir mikroplaka okuyucuda 750 nm'deki absorbansı okuyun ve BSA standart eğrisine dayanarak protein numunelerinin konsantrasyonlarını ölçün.
- Boncuk titrasyonu nokta leke testi (1,5 gün)
- Bir dizi streptavidin manyetik boncuk bulamacını (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) PCR şerit tüplerine aktarın. PCR şerit tüplerini manyetik bir rafa koyun, boncukları 100 μL% 2 SDS tamponuyla 3x yıkayın ve manyetik raftayken yıkama tamponunu tamamen çıkarın.
- Her tüpe 50 μg protein örneği ekleyin. Toplam 80 μL'lik hacme daha fazla lizis tamponu ekleyin. her tüpü sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
- PCR şerit tüplerini tezgah üstü bir mikrosantrifüj üzerinde kısaca santrifüj yapın. PCR şerit tüplerini 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Her tüpten 2 μL süpernatant lekesini kuru bir nitroselüloz membran üzerine yerleştirin ve membranın tamamen kurumasını sağlayın.
NOT: Sinyal yoğunluğu düşükse, membran üzerinde 2 μL'den fazla tespit edilebilir. Membran her seferinde hava ile kurutulduktan sonra aynı noktada birkaç kez lekelenerek hacim arttırılabilir. Bir Bio-Dot Aparatı da kullanılabilir. - Membranı bloke edici tamponda (TBS) 1 saat boyunca inkübe edin. Membranı Streptavidin Alexa Fluor 680 konjugatında (bloke edici tamponda 1:1.000) 1 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra membranı TBS-T (Tablo 1) 5x ile yıkayın.
NOT: Nokta lekesi testine bir alternatif, streptavidin antikoru kullanılarak batı lekelenmesidir. - Membran üzerindeki her bir noktanın floresan sinyalini 680 nm dalga boyunun altında ölçün ve boncukların hacmi üzerinde floresan sinyalli bir dağılım grafiği oluşturun. Eğrinin üstel bozunumunun nerede bittiğine bağlı olarak 50 μg giriş proteini numunesi için gereken en uygun boncuk hacmini seçin.
NOT: Floresan yoğunluğu, süpernatanttaki biyotinile proteinlerin bolluğunu temsil eder ve bu da artan miktarda boncukla azalması gerekir.
5. Biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi ve boncuk üzerinde sindirim (3 gün)
- Protein lizat örneklerini -80 ° C'den aktarın ve çözeltileri hızlı bir şekilde çözmek için numuneleri bir banyo sonikatöründe 30 s boyunca 1.5 mL tüplerde sonikleştirin. Vorteks yapın ve numune tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
- Her 1,5 mL tüpe 250 μL streptavidin (SA) manyetik boncuk bulamacını aktarın. Tüpleri manyetik bir rafa koyun, boncukları 1 mL Yıkama Tamponu A (% 2 SDS) ile 3x yıkayın ve kalan tamponu çıkarın.
- Nokta lekesi testi ve DC protein testinin sonuçlarına dayanarak, streptavidin manyetik boncuk bulamacının 250 μL'si için gereken protein numunesi (μg) miktarını hesaplayın.
NOT: Endojen olarak eksprese edilen bu LAMP1-APEX probunda, 50 μg giriş proteini için 5 μL boncuk gereklidir. Bu nedenle, 250 μL boncuklara 2.5 mg toplam protein eklenir. Sınırlı giriş numune malzemesi için 250 μL'den az SA boncuk kullanılabilir. - Manyetik boncuk-lizat karışımını içeren tüpe hücre lizis tamponunu toplam 1 mL hacme ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de döndürün.
NOT: Farklı gruplardan veya replikalardan alınan numuneler, deneysel varyasyonları azaltmak için aynı protein konsantrasyonuna, hacmine ve boncuk miktarına normalleştirilmelidir. - Tüm tüpleri bir tezgah üstü mikrosantrifüj üzerinde kısaca döndürün ve tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Manyetik raftayken süpernatantı çıkarın.
NOT: Numune tüplerini manyetik rafa her seferinde yerleştirdikten sonra 1 dakika beklemek çok önemlidir. Bu, çözeltideki mıknatısa doğru hareket eden görünmez az miktarda boncuk nedeniyle boncuk kaybını en aza indirebilir. - Boncukları RT'de 1 mL Yıkama Tamponu A ile 2 kat yıkayın (her seferinde 5 dakika dönüş). İşlemi her yıkama tamponu ile 4 °C'de sırayla 2 kat tekrarlayın. (Arabellek B, Arabellek C ve Arabellek D; Tablo 1).
NOT: Yüksek konsantrasyonda bir SDS çözeltisi soğuk sıcaklıklarda çökelebilir. İlk yıkama RT'de yapılmalıdır. - Tüpleri manyetik rafa koyun. Artık deterjanı tamamen çıkarmak için boncukları Buffer D ile 2 kat yıkayın. Boncukları 100 μL 50 mM Tris tamponunda yeniden askıya alın ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe etmek için 5 mM TCEP (son konsantrasyon) ekleyin, 1.200 rpm'de sallayın.
- Her tüpe 15 mM iyodoasetamid (IAA, son konsantrasyon) ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, karanlıkta 1.200 rpm'de sallayın (karıştırıcı kapağı açık).
NOT: IAA ışığa duyarlıdır ve bu adımdan 5 dakika önce taze yapılmalıdır. - Fazla IAA'yı söndürmek için 5 mM TCEP (son konsantrasyon) ekleyin. 1.200 rpm'de sallanan sıcaklık kontrollü bir mikserde 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (mikser kapağı kapalı).
- Numune tüplerini kısaca santrifüj edin ve süpernatanı çıkarmak için 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Boncukları yeniden askıya almak için 50 mM Tris tamponuna 200 μL 5 mM TCEP ekleyin. Numuneye 1 μg Tripsin/Lys-C karışımı ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcıda 1.200 rpm'de çalkalayarak 37 °C'de 14 saat boyunca inkübe edin.
- Ek 0.2 μg Tripsin / Lys-C karışımı ekleyin ve 3 saat boyunca sindirin.
- Numune tüplerini kısaca döndürün ve tüpleri 1 dakika boyunca manyetik bir rafa koyun. Manyetik bir raftayken tüpleri temizlemek için peptid süpernatantını aktarın. Boncukları 50 μL 50 mM Tris tamponu ile yıkayın (5 dakika çalkalayın) ve peptid süpernatantlarını birleştirin.
- pH <3 elde etmek için peptid süpernatant içeren tüpe 30 μL% 10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
6. Peptit tuzdan arındırma ve fraksiyonasyon (2 saat)
- Ters fazlı katı faz ekstraksiyon plakasını (sadece kullanım için kuyucuklar) vakum manifoldu üzerinde 200 μL HPLC sınıfı metanol (MeOH) 3x ile ıslatın. Plakayı dengelemek için HPLC sınıfı suya 3x'te 200 μL% 1 TFA ekleyin.
- Peptit numunelerini plakaya yükleyin, numune kaybını en aza indirmek için vakumu yavaşça açarak 3 damlacık/sn'den daha düşük bir akış hızı elde edin.
- Ekstraksiyon plakasını 200 μL% 1 TFA ile 3x yıkayın. Ekstraksiyon plakasını% 2 MeOH (v / v) içeren 200 μL% 1 TFA ile tekrar yıkayın. Akış hızını 3 damlacık/sn'den düşük tutun.
- Toplama plakasını 96 delikli bir toplama plakasıyla değiştirin. Fraksiyonasyona gerek yoksa, peptid numunelerini% 80 MeOH içeren 100 μL% 1 TFA ile 3x elden çıkarın ve yeni bir numune tüpünde birleştirin. Peptit numunelerini ısı olmadan bir vakum yoğunlaştırıcısında kurutun.
NOT: Fraksiyonasyon istenirse, peptid numuneleri daha sonra farklı bir toplama plakasında sırasıyla% 15,% 35,% 50 ve% 90 MeOH içeren 200 μL% 1 TFA kullanılarak 4 fraksiyona salınabilir.
7. Kolorimetrik peptid niceleme testi (isteğe bağlı) (1 saat)
- Peptit örneklerini 50 μL LC-MS dereceli suda yeniden askıya alın ve peptid testini gerçekleştirmek için 20 μL alikot alın.
NOT: Bu adım büyük miktarda peptid numunesi tüketir, ancak LC-MS analizinden önce peptid konsantrasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayabilir. Bu genellikle büyük ölçekli numune hazırlamadan önce test için numune tipi başına yalnızca bir kez gerçekleştirilir. - LC-MS sınıfı suda peptid standart çözeltilerinin (kolorimetrik tahlil kitinde sağlanan) seri seyreltmelerini hazırlayın. % 50 Reaktif A,% 48 Reaktif B ve% 2 Reaktif C'yi karıştırarak çalışma reaktifini hazırlayın.
- Her peptid standart çözeltisinin 20 μL'sini (üç kopya) ve bilinmeyen peptid örneğini 96 delikli bir mikro plakaya aktarın. Her bir oyuğa 180 μL çalışma reaktifi ekleyin, iyice karıştırın ve plakayı RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir mikroplaka okuyucuda 480 nm'deki absorbansı okuyun ve peptid standart eğrisine dayanarak peptid numunelerinin konsantrasyonlarını ölçün.
8. LC-MS analizi
- Peptit örneklerini LC Tampon A'da yeniden askıya alın (%2 asetonitril ve %0,1 formik asit, LC-MS sınıfı). Olası partiküllerden kurtulmak için 16.500 × g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüj yapın.
- Supernatantı LC-MS şişelere aktarın. Bir nanoLC-MS cihazı kullanarak örnekleri analiz edin.
NOT: Ayrıntılı LC-MS/MS parametreleri cihaza bağlıdır ve daha önce22,25,26 olarak tanımlanmıştır. - 5 ppm kütle doğruluğu 22 ile streptavidin ve tripsin gibi oldukça bol miktarda kirletici peptid pikleri için bir dizi tutma süresine sahip özel bir LC-MS dışlama listesi oluşturun (örneğin, yaygın streptavidin peptid zirveleri m/z 402.5435 [şarj 3], m/z 603.3117 [şarj 2], m/z 654.9733 [şarj 3], m/z 678.6812 [şarj 3], m/z 1017.5182 [şarj 2], ve saire.; yaygın tripsin peptid pikleri m / z 421.7584 [şarj 2], m / z 523.2855 [şarj 2] ve m / z 737.7062 [şarj 3]).
9. Proteomik veri analizi
- LC-MS ham verilerini Proteome Discoverer, MaxQuant27 veya MS-Fragger28 gibi proteomik veri analiz yazılımlarıyla analiz edin. Veri analizi için iki FASTA kütüphanesi ekleyin: 1) bir Swissprot Homo Sapiens referans veritabanı; 2) proteomik tanımlamayı geliştirdiği ve yanlış keşifleri azalttığı kanıtlanan yeni üretilen evrensel bir kirletici FASTA kütüphanesi (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib)29.
- Proteomik veri analizi parametrelerini, protein ve peptid spektral eşleştirme (PSM) tanımlamaları için% 1'lik bir yanlış keşif oranı (FDR) kesimi ile ayarlayın. En fazla üç kaçırılmış bölünme, sistein karbamidometilasyonun sabit bir modifikasyonu ve metiyonin oksidasyonu ve protein N-terminal asetilasyonunun değişken bir modifikasyonu ile tripsin sindirimini seçin. Etiketsiz niceleme için peptid MS1 tepe yoğunluklarını kullanın. Daha önce açıklandığı gibi yakınlık etiketleme varyasyonlarını azaltmak için peptid yoğunluklarını endojen biyotinile karboksilaz, propiyonil-CoA karboksilaz (PCCA) olarak normalleştirin22.
NOT: PCCA normalizasyonu, Proteome Discoverer yazılımında bir PCCA protein dizisi FASTA dosyası eklenerek seçilebilir. Alternatif olarak, PCCA normalizasyonu aşağı akış veri analizinde gerçekleştirilebilir. - Proteomik yazılımdan protein seviyesi sonuçlarını dışa aktarın. İstatistiksel analizden önce kirletici proteinleri çıkarın29. Sadece 1 PSM olan veya nicelleştirme sonucu olmayan proteinleri çıkarın. Enrichr30 ile protein gen ontolojisi (GO) terimi analizi ve STRING31 ile protein ağı analizi yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu lizozom yakınlık etiketleme proteomik çalışması, canlı nöronlarda dinamik lizozomal mikro ortamı in situ olarak yakalamak için insan iPSC türevi nöronlarında gerçekleştirildi. Farklı zaman noktalarındaki hiPSC'lerin ve hiPSC türevi nöronların hücre morfolojileri Şekil 2A'da gösterilmiştir. İnsan iPSC'leri E8 ortamındaki kolonilerde büyür. Farklılaşma, iPSC'lerin doksisiklin içeren nöron indüksiyon ortamına kaplanmasıyla başlatılır. Nörit uzantıları, 3 günlük farklılaşma sırasında her gün daha görünür hale gelir. Nöron ortamında FKÖ kaplı plakalara geçtikten sonra, nöritler nöronlar arasında bir ağ oluşturur ve nöronlar 2 hafta içinde olgunlaşmaya ulaştıkça aksonal uzantılar daha görünür hale gelir. i3Nöronlarında, APEX probunun lokalizasyonu, hızlı APEX aktivasyonunu takiben floresan mikroskobu ile doğrulanır. Biyotinile proteinler streptavidin (SA) antikoru kullanılarak boyanır ve lizozomlar anti-LAMP1 antikoru kullanılarak boyanır. Birleştirilmiş görüntü, LAMP1-APEX'in yem proteinine doğru lokalizasyonunu doğrular (Şekil 2B).
Boncuk titrasyon testi, optimal boncuk-protein oranını belirlemek için çok önemlidir, böylece streptavidin boncuklarının miktarı tüm biyotinile proteinleri zenginleştirmek için yeterlidir, ancak LC-MS'de ciddi streptavidin kontaminasyonuna neden olacak kadar aşırı değildir. 50 μg giriş proteini numunesi için gereken optimal boncuk hacmi, eğrinin üstel bozunumunun nerede sona erdiğine göre seçilir (Şekil 3A) Şekil 3A'da gösterildiği gibi, boncuk-protein inkübasyon süpernatanından gelen nokta-leke sinyalleri, streptavidin boncuklarının artan miktarları ile daha fazla biyotinillenmiş protein yakalandıkça azalmıştır. Endojen LAMP1-APEX örnekleri için, 5 μL streptavidin boncukları, 50 μg giriş proteini için en uygundu (Şekil 3A'da vurgulanmıştır). Zenginleştirmeyi takiben, streptavidin boncukları tarafından yakalanan protein miktarı bilinmemektedir. Aşırı proteolitik enzim (tripsin), LC-MS'de bol miktarda tripsin peptid pikleri ile enzim otosindirimini artırabilir. Aşırı tripsin ayrıca örneklerde daha fazla streptavidin peptidini sindirebilir. Bu nedenle, boncuk üzerinde sindirim için gereken proteaz miktarı optimize edilmelidir. Tek başına tripsin ile karşılaştırıldığında, Tripsin / Lys-C karışımı ile boncuk üzerinde sindirim, daha fazla protein ve peptitin tanımlanmasına ve daha az kaçırılmış bölünmeye neden olmuştur (Şekil 3B). Ek olarak, 250 μL streptavidin manyetik boncuk başına 1-1.5 μg proteaz, en yüksek sayıda tanımlanmış protein ve kaçırılan bölünmelerin en düşük yüzdesini elde etmek için en uygunudur (Şekil 3C). Optimal boncuk-protein oranıyla, aynı miktarda boncuk aynı miktarda biyotinillenmiş proteini yakalamalıdır. Bu nedenle, bu optimize edilmiş proteaz miktarı, aynı streptavidin manyetik boncuklarını kullanarak biyotinile proteinleri zenginleştiren tüm deneyler için kullanılabilir.
Peroksidaz bazlı yakınlık etiketleme enzimleri, biyotin-fenol inkübasyonu ve kısa H2O2tedavisi (1 dakika) ile aktive edilir. Bu adım, yakınlık etiketleme proteomiklerinde önemli bir varyasyon kaynağıdır. Daha önce, en bol bulunan, endojen olarak biyotinile edilmiş karboksilaz olan PCCA'ya normalleşmenin, deneysel varyasyonları önemli ölçüde azaltabileceğini ve farklı deneysel partiler arasında yakınlık etiketleme proteomik verilerinin karşılaştırılmasına izin verdiğini bulmuştuk (Şekil 4)22. Endojen LAMP1-APEX nöronları için, LAMP1-APEX prob ekspresyonu olmayan ebeveyn hattı kontrol grubu olarak kullanıldı. Kontrol nöronları ayrıca biyotin-fenol ve H2O2ile tedaviedildi. LAMP1-APEX'in protein oranlarının kontrol grubuna dağılımı Şekil 5A'da gösterilmiştir. Endojen olarak biyotinile edilmiş tüm karboksilazlar streptavidin kaplı boncuklarla zenginleştirildi, ancak değişmeden kaldı. GO-term analiz ve protein ağı analizinde (Şekil 5B,C) gösterildiği gibi, endizozomal kaçakçılık ve transportla ilgili hem stabil lizozomal membran proteinleri hem de geçici lizozomal interaktörler LAMP1-APEX proteomik32,33,34'te zenginleştirilmiştir.
Şekil 1: HiPSC türevi nöronlarda proteomikleri etiketleyen lizozom yakınlığı için genel iş akışı. Kısaltmalar: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre; LAMP1 = lizozomal ilişkili membran proteini 1; APEX = askorbat peroksidaz; dox = doksisiklin; BP = biyotin-fenol; DCA = deterjan uyumlu protein testi; SA = streptavidin; LC-MS/MS = sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi; PCCA = propiyonil-CoA karboksilaz, endojen olarak biyotinile edilmiş bir proteindir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HiPSC türevi nöronların ve LAMP1-APEX aktivitesinin mikroskobik görüntülemesi. (A) HiPSC'lerin ve hiPSC türevi nöronların farklı aşamalarının Brightfield mikroskopi görüntüleri. (B) Nörondaki LAMP1-APEX aktivitesinin floresan görüntülemesi. Streptavidine karşı boyanmış biyotinile sinyaller, çekirdeğin dışında LAMP1 boyaması (HOECHST) ile kolokalize olur. Ölçek çubukları = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Kısaltmalar: hiPSC = insan kaynaklı pluripotent kök hücre; LAMP1 = lizozomal ilişkili membran proteini 1; APEX = askorbat peroksidaz; SA = streptavidin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Boncuk-giriş protein oranının ve enzimatik protein sindiriminin optimizasyonu, protein tanımlamalarını iyileştirebilir ve paraziti azaltabilir . (A) Boncuk titrasyon testi örneği, 50 μg giriş proteini ve farklı miktarlarda streptavidin boncukları kullanılarak yapılan nokta lekesi tahlilinden elde edilir. (B) Tripsin / Lys-C karışımı, tek başına tripsinden daha iyi protein / peptit tanımlaması ve daha az kaçırılmış bölünme ile sonuçlandı. (C) Boncuk üzerinde sindirim için Tripsin/Lys-C miktarının optimizasyonu. Bu rakam Frankenfield ve ark.22'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Proteomik verilerin endojen olarak biyotinile edilmiş bir karboksilaz olan PCCA'ya yakınlık etiketlemesinin normalleştirilmesi, biyolojik replikalar arasındaki nicelleştirme varyasyonlarını azaltabilir. Bu rakam Frankenfield ve ark.22'den değiştirilmiştir. Kısaltma: PCCA = propiyonil-CoA karboksilaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Proteomiklerin zenginleştirilmiş lizozomal membran proteinlerini ve nöronlarda lizozomal etkileşimli proteinleri etiketleyen lizozom yakınlığı. (A) Zenginleştirilmiş lizozomal membran proteinlerini ve değişmemiş endojen olarak biyotinile proteinleri gösteren hiçbir APEX kontrolüne karşı LAMP1-APEX'in protein bolluk oranlarının saçılma grafiği. (B) Lizozomda zenginleştirilmiş hücresel bileşeni kanıtlayan proteomik sonuçların GO vadeli analizi. (C) Proteinlerin yem proteini (LAMP1), lizozomal membran proteinleri ve membran kaçakçılığı proteinleri gibi lizozomal interaktörlerle doğrudan etkileşime girdiğini gösteren STRING protein ağı analizi. Bu rakam Frankenfield ve ark.22'den değiştirilmiştir. Kısaltmalar: LAMP1 = lizozomal ilişkili membran proteini 1; APEX = askorbat peroksidaz; GO = gen ontolojisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Orta/Tampon | Parça | Protokol | ||
| Bodrum membran matrisi (Matrigel) kaplama çözeltisi | %1 bazal membran matris stoğu, %99 DMEM/F12 orta | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronektin kaplama çözeltisi | PBS'de 5 μg/mL nihai konsantrasyon | 1.1 | ||
| ROCK inhibitörlü E8 komple ortam | %98 E8 orta, %2 E8 takviyesi, 10 μM Y-27632 veya 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Nöron İndüksiyon ortamı | HEPES'li %97 DMEM/F12, %1 N2 takviyesi, %1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), %1 L-glutamin, 2 μg/mL doksisiklin ve ROCK inhibitörü (10 μM Y-27632 veya 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO kaplama çözümü | 0.1 mg/mL Poli-L-Ornitin (PLO), 100 mM borik asit, 25 mM sodyum tetraborat, 75 mM sodyum klorür, 1 M sodyum hidroksit | 1.3 | ||
| Nöron ortamı | %98 kortikal nöron ortamı, %2 B27 takviyesi, 10 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 10 ng/mL glial kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF), 10 ng/mL NT-3, 0.2 μg/mL Laminin, 2 μg/mL doksisiklin | 1.3 | ||
| Söndürme tamponu | PBS'de 10 mM sodyum azid, 10 mM sodyum askorbat, 5 mM TROLOX | 2.2 | ||
| Hücre lizis tamponu | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, %0,2 SDS, %1 Triton, 1 mM Tris(2-karboksiyetil)fosfin hidroklorür (TCEP), 10 mM sodyum azid, 10 mM sodyum askorbat, 5 mM TROLOX, proteaz inhibitörü kokteyli | 2.3 | ||
| TBS-T | %0,05 Ara20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Arabellek A | %2 SDS tampon bellek | 5.2 | ||
| Tampon B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, %2 Triton-X | 5.6 | ||
| Tampon C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, %0,5 SDS, %0,5 Triton-X | 5.6 | ||
| Tampon D | 2 M Üre, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan ortam ve tampon bileşimleri.
| Sorun | Protokol | Çözüm/Öneri | ||||
| iPSC kültürü plakadan soyulması | 1.1 | Vitronektin kaplama konsantrasyonunu veya süresini artırın. | ||||
| Bazı iPSC'ler nöronlara farklılaşmadı | 1.2 | D0 farklılaşması sırasında iPSC'leri tamamen ayırmak için hücre ayrılma çözeltisi tedavi süresini artırın. | ||||
| Nöron kültürü plakadan soyulması | 1.3 | Ortamın yıkanması ve değiştirilmesi nazik olmalı ve plakanın yan duvarından olmalıdır. | ||||
| Aseton çökeltmesinden sonra proteinler tamamen çözünmez | 2.7 | Protein peletinin kuruma süresini kısaltın. Lizis tamponunun hacmini artırın ve çözünmeye yardımcı olmak için kısaca sonikat yapın. | ||||
| Zayıf streptavidin boyama sinyalleri | 3 | H2 O2işlem süresini2-3 s olacak şekilde artırın ve eşit dağılım için plakayı döndürün. | ||||
| Boncuk titrasyon testinin düşük sinyali | 4.2 | Membran tamamen kuruyana kadar bekleyin ve sinyal yoğunluğunu artırmak için aynı noktaya daha fazla süpernatant ekleyin (3x'e kadar tekrarlayabilir). | ||||
| Manyetik rafa doğru peletlenmeyen manyetik boncuklar | 5 | Deterjan içermeyen tamponda manyetik boncuk hareketliliği azalır. 4 M'ye kadar daha yüksek üre konsantrasyonu veya LC-MS uyumlu deterjan, D yıkama tamponunda kullanılabilir. | ||||
| Boncuk yıkama sırasında manyetik boncuk kaybı | 5 | Tüplerden süpernatant almadan önce numune tüpleri manyetik boncukların üzerine yerleştirildiğinde (1 dakika veya daha uzun) bekleme süresini artırın. | ||||
| LC-MS'de tek başına yüklü kontaminasyon pikleri | 6 | Peptit temizliği yeterli değildir. Peptit tuzdan arındırma sırasında yıkama hacimlerini ve sürelerini artırın. | ||||
| Peptit testi düşük sinyal | 7 | Peptit konsantrasyonunu artırmak için peptid örneklerini daha düşük hacimde yeniden askıya alın. | ||||
| LC-MS'de ezici streptavidin sinyalleri | 8 | Streptavidin boncuklarının miktarını azaltın. Tripsin zirvesi de bol ise, tripsin miktarını azaltın. | ||||
| Çok fazla spesifik olmayan etiketleme arka planı | 9 | Streptavidin boncuk yıkama yeterli değildi. Her yıkama adımı sırasında kalan tüm sıvıları çıkarın. Boncuk yıkama süresini ve hacmini artırın. | ||||
Tablo 2: Sorun giderme ve çözümleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu LAMP1-APEX probu kullanarak, lizozomal membran üzerindeki ve yakınındaki proteinler biyotinile edilir ve zenginleştirilir. 100-1.200 nm'lik tipik lizozom çapı göz önüne alındığında, bu yöntem 10-20 nm etiketleme yarıçapı ile mükemmel hücre içi çözünürlük sağlar. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve lizozomlar için klasik bir belirteçtir ve endojen ekspresyon seviyesinde lizozomal APEX etiketlemesi için mükemmel bir yem proteini görevi görür. Bununla birlikte, lizozomları hedeflemek için LAMP1 kullanıldığında da sınırlamalar vardır, çünkü LAMP1 geç endozomlarda ve degradatif olmayan lizozomlarda da bulunur35. Çoğu lizozomal belirteç, sonunda lizozomlara olgunlaşan geç endozomlarda da ifade edilir. Lizozomları hedeflemek için alternatif yem proteinleri LAMPTOR, LAMP2 ve TMEM19235,36,37'dir. Reaktif biyotin radikallerinin zara nüfuz etmediğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, sadece lizozomal lümen proteinlerinin çoğu bu LAMP1-APEX proteomik yönteminde yakalanmaz. Lizozomal lümen proteinleri, geleneksel gradyan santrifüjleme yöntemi veya lizozomal immünosaflaştırma yöntemi ile lizozomal izolasyon yoluyla elde edilebilir 4,38. Bununla birlikte, lizozomal membran üzerindeki proteinler lizozomal izolasyon sırasında bozulabilir ve geçici ve dinamik lizozomal etkileşimler için bilgi kaybedebilir. Bu nedenle, lizozomal yakınlık etiketlemesi ve lizozomal izolasyon, lizozomların hem dışındaki hem de içindeki lizozomal aktivitelerin tam bir görüntüsünü elde etmek için birleştirilebilir.
iPSC-nöron kültüründen değişkenliği en aza indirmek için, nöron kaplama yoğunluğu tüm biyolojik replikasyonlar ve karşılaştırma grupları arasında tutarlı olmalıdır. Aynı nöronal olgunlaşma ve sağlık seviyeleri de bu nedenle kritik öneme sahiptir. APEX aktivasyonu sırasında, hücrelere biyotin-fenol veH2 O2 ilavesi, ılık kültür ortamı ile önceden karıştırılarak ve daha sonra karışımın hücrelere eklenmesiyle, ardından eşit dağılımı sağlamak için hemen, yumuşak sallanarak yapılmalıdır. H2O2'ninkullanımı ayrıca hücrenin dinamik mikro ortamındaki oksidatif stres ve pertürbasyonlar hakkında endişeleri de artırmaktadır. Protein bolluğu seviyesinde önemli bir değişiklik bulunmamasına rağmen, kontrol nöronları 22'ye karşıH2 O 2ile tedavi edilen metiyonin oksidasyonu ile daha fazla peptit modifiyeedilmiştir. Bu nedenle, H2O2aktivasyon süresinin (1 dakika) sıkı kontrolü, oksidatif stresi en aza indirmek ve yem proteinini çevreleyen belirli bir etiketleme yarıçapı sağlamak için biyotin bulutunun difüzyonunu azaltmak için kritik öneme sahiptir.
HEK ve U2OS gibi polarize olmayan hücre hatları için, hücreler, serbest biyotin içeren süpernatantı çıkarmak için yakınlık etiketlemesinden sonra peletlenerek toplanabilir. Bununla birlikte, nöronlar, peletleme sırasında nörit hasarını ve numune kaybını önlemek için plakaya doğrudan hücre lizis tamponu eklenerek ve tüplere kazınarak toplanmalıdır. Serbest biyotin varlığı streptavidin boncuklarını doyurabilir. Serbest biyotinin tamamen uzaklaştırılması, çoklu yıkama ve nöronlarda söndürme tamponu ile inkübasyon ve hücre lizisinden sonra protein çökeltmesi ile sağlanabilir. Farklı yem proteinleri farklı ekspresyon seviyelerine sahip olduğundan, her yeni APEX probu için bir nokta lekesi testi yapılması gerekir. Optimal boncuk/protein oranı belirlendikten sonra, başlangıç proteini miktarı ve boncuk hacmi, aynı APEX probu için tüm replikalar için tutarlı olmalıdır. LAMP1-APEX ve sitozolik-APEX gibi farklı probları karşılaştırırken, aynı miktarda boncuk kullanılması önerilir, ancak farklı APEX probları için en uygun boncuk / protein oranlarını yansıtmak için başlangıç proteini miktarını değiştirin. Deneysel varyasyonları daha da azaltmak ve verimi artırmak için, hücre kültüründeki amino asitler (SILAC) tarafından kararlı izotop etiketlemesi yapılabilir39. Çoklanmış izobarik etiketleme, TMT / iTRAQ / DiLeu etiketleri20,40,41,42 aracılığıyla protein sindiriminden sonra peptitleri kimyasal olarak etiketlemek için de kullanılabilir.
Yakınlık etiketlemesi, çeşitli organizmalarda hücresel ve moleküler mikro çevreyi yakalamak için yaygın olarak uygulanmıştır43. Bununla birlikte, yakınlık etiketlemesi, streptavidin sinyallerinden kaynaklanan kontaminasyon, enzim aktivasyonu için hidrojen peroksit kullanımı ve endojen olarak biyotinile mitokondriyal karboksilazların varlığı gibi birçok teknik zorlukla karşı karşıyadır. Bu nedenle, proteomik deneylerin yakınlık etiketlemesi dikkatli planlama ve kalite kontrol gerektirir. Araştırmacıların yakınlık etiketleme deneylerinde sorun gidermelerine yardımcı olmak için, Tablo 2'deki yaygın sorunlar ve çözümler için kısa bir kılavuz sunuyoruz. Son zamanlarda, tiol-bölünebilir biyotin25 kullanılarak bölünebilir bir yakınlık etiketleme yöntemi geliştirilmiştir. Bu nedenle, biyotinile proteinler, boncuk üzerinde sindirime gerek kalmadan TCEP gibi indirgeyici bir reaktif kullanılarak boncuklardan ayrılabilir. Bu bölünebilir biyotin yöntemi, streptavidin, endojen biyotinile karboksilazlar ve spesifik olmayan bağlanmadan kaynaklanan parazit sinyallerini önemli ölçüde azaltabilir. Devam eden çabalar, etiketleme özgüllüğünü ve doğruluğunu artırmak için bu bölünebilir biyotin yöntemini LAMP1-APEX proteomiklerine uygulayacaktır. Yakınlık etiketleme probları, diğer hücre altı bölmeleri hedeflemek için de tasarlanabilir44. Tanımlanan proteinlerin miktarı ve türü, yem proteininin doğasına, hücre içi ortamına ve yakınlık etiketleme probunun ekspresyon seviyesine bağlıdır. Bu endojen LAMP1-APEX proteomik yöntemi, insan nöronlarındaki dinamik lizozomal aktiviteyi incelemek için değerli bir araç sağlar. Ayrıntılı protokol ve metodoloji optimizasyonu, proteomik topluluğu için yararlı bir kaynak olarak hizmet veren diğer yakınlık etiketleme probları ve kimyasal biyotinilasyon için de geçerlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibesi (R01NS121608) tarafından desteklenmektedir. A.M.F., ARCS-Metro Washington Bölüm Bursu ve Bourbon F. Scribner Bağış Bursu'nu kabul eder. Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü'ndeki (NINDS) Michael Ward laboratuvarına moleküler biyoloji desteği ve i3Nöron teknolojisi gelişimi için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
