Summary
الطرق المناعية الكيميائية مفيدة في أبحاث نحل العسل لاكتشاف وتقييم مستوى موت الخلايا المبرمج والنخر في الغدد الوسطى والبلعومية للنحل البالغ.
Abstract
يتعرض نحل العسل (Apis mellifera L.) داخل الخلية (عمال التمريض ونحل الخلية الآخر) وخارج الخلية (العلافين) للتغيرات المناخية والطقس ، والمبيدات الحشرية المختلفة ، ومسببات الأمراض ، وسوء التغذية ، ويدخل بشكل رئيسي عن طريق الفم ويؤثر بشكل أساسي على الجهاز الهضمي للنحل البالغ. لفهم ومنع آثار هذه الضغوطات الخارجية والداخلية على نحل العسل ، فإن إحدى طرق البحث المفيدة هي الطريقة المناعية. يوصف بروتوكول أساسي لإعداد الأمعاء الوسطى (البطين) والغدد البلعومية (HPGs) للنحل البالغ للتحليل النسيجي. يتم وصف منهجية مفصلة لتقييم مستوى تلف الخلايا والتمييز بين النخر وموت الخلايا المبرمج (موت الخلايا المبرمج) كعملية طبيعية لتجديد الأنسجة. يتم عرض نتائج علاج نحل العسل للبالغين بحمض الأكساليك والمبيدات الحشرية (المبيدات الحشرية والمبيدات الحشرية) وتحديد موت الخلايا في البطين و HPGs. كما تتم مناقشة إيجابيات وسلبيات المنهجية.
Introduction
نحل العسل (Apis mellifera L.) هي ، من بين الملقحات البرية الأخرى ، أهم الملقحات للنباتات الزراعية. على مدى آلاف السنين ، أثرت البيئة المتغيرة على النحل لتكييف مورفولوجيته وعلم وظائف الأعضاء والسلوك والتسامح مع العديد من مسببات الأمراض والطفيليات. لذلك ، طور نحل العسل مجموعة متنوعة للغاية من الأنواع والأنواع الفرعية حول العالم1. تتوافق هذه النتائج مع النتائج السابقة ، أن هناك تباينا وراثيا في بنية الجهاز الهضمي لنحل العسل ، ولكنها تشير أيضا إلى أن التغيرات في الأمعاء الوسطى ترجع إلى عوامل بيئية 2,3.
يتكون الجهاز الهضمي لنحل العسل من ثلاثة أجزاء رئيسية: الأمعاء الأمامية ، الأمعاء الوسطى (البطين) ، والأمعاء الخلفية4. البطين هو عضو أساسي لهضم حبوب اللقاح والرحيق / العسل. في الأمعاء الخلفية ، يحدث التحكم التناضحي من خلال امتصاص الماء والأيونات2. توجد الغدد النفعية البلعومية (HPGs) لعمال نحل العسل في الرأس وتوليف وإفراز مكونات غذاء ملكات النحل لإطعام الحضنة والملكة وأعضاء المستعمرة. يتغير حجمها مع تقدم العمر والمهام ويعتمد على التغذية السليمة (حبوب اللقاح عالية الجودة). يقوم عمال التمريض الذين تتراوح أعمارهم بين 6 و 18 يوما بتربية الحضنة ، ويزيد حجم HPGs 5,6. في نحل العلف ، تتحلل HPGs وتفرز فقط الإنزيمات المهمة لتحويل السكريات المعقدة إلى سكريات بسيطة (α-glucosidases ، leucine arylamidase ، invertase) في العسل7.
يتعرض نحل العسل للعديد من الضغوطات الحيوية وغير الحيوية8 ، ويمكن أن يتأثر الجهاز الهضمي بالعديد من المنشطات السلبية. الحاجز الأول الذي يحمي الكائن الحي من مسببات الأمراض هو الغشاء المحيطي في الأمعاء الوسطى ، والذي يتكون من الغشاء المخاطي المعوي للحماية من مسببات الأمراض4. يعتمد تطور ووظيفة HPGs على النظام الغذائي والعمر وحالة المستعمرة9 ، وتتأثر بالمبيدات الحشرية والمبيدات الحشرية10 ومسببات الأمراض11،12،13. بقايا مبيدات القراد في الخلية بسبب معالجة مكافحة الفاروا والمبيدات الحشرية من البيئة تؤثر على نحل العلف والنحل الممرض14,15. أكبر تهديد لمستعمرات نحل العسل هو مدمر سوس الفاروا ، كناقل للفيروسات التي تساهم في خسائر المستعمرة16 وكمستهلك لجسم المضيف الدهني (عضو حيوي مهم في نحل العسل) ، مما يؤثر بالتالي على جسم الفرد ووظائف المستعمرة17.
ومع ذلك ، يمكن أن توفر موائل الأراضي الزراعية المكثفة إمدادات غذائية قصيرة الأجل لنحل العسل. لذلك ، يجب أن تعزز المخططات الزراعية البيئية توافر زهور العسل في المناظر الطبيعية الزراعية18. لتقييم مورفولوجيا الأنواع الفرعية المختلفة6،19،20،21 أو التأثيرات شبه المميتة لهذه العوامل على مستوى الخلية أو الأنسجة ، وخاصة الأمعاء الوسطى و HPGs ، فإن الطرق النسيجية والكيميائية المناعية عملية ودقيقة بما يكفي لاستخدامها في أبحاث الأنسجة في نحل العسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الأنسجة الأساسية لأبحاث نحل العسل
- تشريح أنسجة نحل العسل
ملاحظة: لتشريح النحل العامل ، استخدم مجهر تشريح مع مصدر ضوء LED. التكبير الأكثر فائدة هو ~ 20x.- التلاعب والتشريح
- خذ بعناية نحلة عاملة بالملقط وضعها على الثلج (أو في الفريزر عند -20 درجة مئوية) لمدة دقيقتين لشل حركتها22. ثبت النحلة على طبق بتري قطريا من خلال الجزء الخلفي العلوي من الصدر مرتين ، من اليسار إلى اليمين ومن اليمين إلى اليسار.
- صب الحشرات المالحة لتغطية الجسم. ضع طبق بتري تحت المجهر ، وقم بالتركيز ، واضبطه.
- قم بإعداد الأدوات (انظر جدول المواد).
- تشريح الأمعاء الوسطى
- ابدأ بالبطن عن طريق إدخال نقطة واحدة من المقص تحت tergite A5 (الشكل 1) في وسط الجانب الأيمن من جسم النحل. قطع إلى tergite A2.
- حافظ على الشفرة الداخلية للمقص موازية لجانب الجسم لتجنب إتلاف الأعضاء الداخلية. اقلب المقص إلى اليسار وقم بعمل قطع واحد ؛ انعطف يمينا وقم بإجراء قطع آخر. افتح الجزء الأيسر من البطن برفق وقم بتثبيته. كرر على الجانب الآخر.
- باستخدام ملقط بيد واحدة ، اسحب معدة نحل العسل برفق لأعلى ، ومع مقص في اليد الأخرى ، قطع في نهاية المريء. سحب المعدة والأمعاء الوسطى بعيدا عن البطن وقطع في المستقيم. استخدم ماصة بمحلول ملحي للحشرات وقم بإزالة أي براز أو أجزاء من الأنسجة.
- تشريح قوات الدفاع الشعبي
- شل حركة نحلة عاملة على الجليد كما هو موضح في الخطوة 1.1.1. اقطع الرأس وضعه على اللوحة الأصغر مع توجيه الهوائيات لأعلى. ثبت الرأس بدبابيس: أحدهما من خلال العين المركبة اليسرى والثاني من خلال العين المركبة اليمنى.
- قم بعمل قطع عبر العين المركبة الأولى على الجانب الداخلي من المسامير ، واستمر إلى الشفا ، ثم قم بعمل قطع آخر على الجانب الآخر عبر العين المركبة الثانية (الشكل 2).
- قطع الهوائيات. ارفع القناع واقطعه حيث لا يزال متصلا. خذ الملقط وقم بإزالة الغدد بعناية مع الدماغ وجزء من العيون المركبة.
- التلاعب والتشريح
- التثبيت والجفاف وتضمين البارافين
ملاحظة: ارتد قفازات واقية.- ضع المنديل في زجاجات البنسلين ، مملوءة 3/4 مع 10 ٪ من الفورمالين. يحفظ في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية.
- بعد 24 ساعة ، قم بتجفيف الأنسجة في سلسلة من الكحول: 70٪ ، 80٪ ، 90٪ ، 100٪ ، لمدة 1 ساعة لكل منهما ، 100٪ 2-بروبانول لمدة 1 ساعة ، 100٪ 2-بروبانول لمدة 12 ساعة ، وأخيرا 100٪ 2-بروبانول لمدة 1 ساعة.
- ضع الأنسجة في المنسجات. ضع علامة عليها وضعها في الغرف الزجاجية مع 2-بروبانول وبارافين (1: 1) في حاضنة عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- انقل المنسجات إلى غرفة أخرى مع البارافين (I.) لمدة 24 ساعة أخرى. كرر الإجراء مع البارافين الطازج مرتين أخريين (II و III) ، لمدة 24 ساعة.
- أخيرا ، قم بإعداد محطة التركيب وابدأ في تضمين الأنسجة في الشمع.
- افتح كل علبة منسجية وقم بإزالة الغطاء. املأ القالب بالشمع وضع الأنسجة بعناية مع ملقط دافئ في منتصف القالب.
- ضع الكاسيت على القالب وقم بتغطيته قليلا بالشمع. ضع القالب على الفور على السطح البارد لمحطة التركيب لبضع ثوان ، ثم ضعه على اللوحة الباردة لبضع دقائق حتى يصلب الشمع وينفصل عن القالب معا والهيستوكاسيت.
- تخزين العينات النهائية في صندوق ، بعيدا عن الغبار والحرارة.
- قطع أقسام رقيقة 4 ميكرومتر على ميكروتوم: أولا ، قسمان متصلان ببعضهما البعض ثم قسم واحد على حدة. انقل المقاطع بالملقط واتركها تطفو على الماء المقطر (42 درجة مئوية) ، ثم اجمعها على شرائح نظيفة عن طريق وضع قسمين معا على الجانب الأيسر من الزجاج الموضوعي والثالث على الجانب الأيمن ، مع البقاء منفصلين بشكل واضح. اترك الشرائح المميزة طوال الليل على جهاز التسخين وقم أخيرا بتخزينها في صندوق مخصص لعينات الأنسجة.
- إزالة الشمع والإماهة
ملاحظة: ارتد قفازات واقية.- قم بإعداد تسعة برطمانات كوبلين ووضع الأقسام في سلسلة من عوامل المقاصة (I. ، II. ، III.) لمدة 5 دقائق لكل منها.
- توضع في 2-بروبانول ، الإيثانول 96 ٪ (I. ، II.) ، الكحول 90 ٪ و 80 ٪ ، والماء المقطر لمدة 3 دقائق لكل منهما.
- الصباغة مع الهيماتوكسيلين ويوزين
ملاحظة: ارتد قفازات واقية.- تحضير ستة الجرار كوبلن.
- لتلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) ، ضع الأجزاء المنزوعة الشمع والمعاد ترطيبها في الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ، ثم ضعها بعناية تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 2 دقيقة. ثم ضعها في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة ويوزين لمدة 4 دقائق (بالنسبة لليوزين ، جرة كوبلين ليست ضرورية).
- ضع الشرائح في الإيثانول 96٪ لمدة 1 دقيقة ، ثم 2-بروبانول لمدة دقيقتين ، وأخيرا في عامل المقاصة لمدة دقيقتين.
- أضف وسيط التثبيت وغطاء زجاجي واتركه يجف. مراقبة تحت المجهر الضوئي.
الشكل 1: منظر ظهري لجسم نحل العسل. A1-A7 tergites. يمكن العثور على التعليمات التفصيلية حول تشريح نحل العسل في Carreck et al.24. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: المنظر الظهري ل HPGs ، أجزاء من العيون المركبة المتصلة بالدماغ (غير مرئية). نحلة عاملة شابة تتراوح أعمارها بين 5 و 6 أيام لديها HPGs بيضاء ممتلئة الجسم وكريمية. تقع الأسيني على الدماغ وتملأ منطقة الرأس بفروع تصل إلى الجزء الخلفي من الدماغ. في النحل العلف ، تتقلص هذه الغدد إلى حد كبير ولا تترك سوى بقايا رقيقة تشبه الخيوط. لهذا السبب ، من الأفضل إزالة الغدد مع الدماغ لتسهيل الإجراءات الإضافية لتجنب فقدان الأنسجة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
2. الكشف عن موت الخلايا في أقسام الأنسجة
- مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج (الفحص أ)
ملاحظة: اتبع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).- تحضير الجرار كوبلن.
- بعد إزالة الشمع وإعادة الإماهة (انظر الخطوة 1.3) ، اغمر الشرائح في محلول كلوريد الصوديوم 0.85٪ ، ثم في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (5 دقائق).
- ضع الشرائح في 4٪ بارافورمالدهيد 2 × 15 دقيقة.
- ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وأضف 100 ميكرولتر من محلول Proteinase K (20 ميكروغرام / مل) ، ثم اتركها لمدة 10-30 دقيقة.
- ضع الشرائح في PBS (5 دقائق).
- ضع الشرائح في 4٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني (5 دقائق).
- اغمر الشرائح في PBS (2 × 5 دقائق).
- ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية ، وأضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوازن ، واتركها لمدة 5-10 دقائق.
- أضف 100 ميكرولتر من مزيج تفاعل TdT. ضع مناشف ورقية داخل الحاوية ، حول الشرائح ، بلل المناشف بالماء ، ثم غطيها بغلاف بلاستيكي. احتضان الشرائح لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- ضع الشرائح مرة أخرى في رف التلوين وانغمس في 2x سترات الصوديوم المالحة (SSC) لمدة 15 دقيقة.
- اغمر الشرائح 3 × 5 دقائق في PBS ، ثم في 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 3-5 دقائق ، ثم في PBS مرة أخرى ، 3 × 5 دقائق.
- مرة أخرى ، ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية ، وأضف 100 ميكرولتر من Streptavidin HRP (بيروكسيديز الفجل) ، واتركها لمدة 30 دقيقة (غطيها بغلاف بلاستيكي).
- اغمر الشرائح 3 × 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
- ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وأضف 100 ميكرولتر من محلول 3,3'-diaminobenzidine (DAB). ابحث عن خلفية بنية فاتحة.
- أعد الشرائح إلى الرف واغسلها عدة مرات في الماء (مقطر مزدوج).
- قم بتركيب الشرائح تحت أغطية زجاجية في وسط التثبيت واتركها مسطحة حتى تجف.
- مراقبة تحت المجهر الضوئي.
- مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا المبرمج (الفحص ب)
ملاحظة: اتبع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).- تحضير الجرار كوبلن.
- تحضير بروتيناز K (20 ميكروغرام / مل مخفف في برنامج تلفزيوني).
- بعد إزالة الشمع وإعادة ترطيب الأقسام (الخطوة 1.3) ، ضع الشرائح في PBS لمدة 5 دقائق.
- ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وأضف Proteinase K (20 ميكروغرام / مل ، 60 ميكرولتر لكل عينة 5 سم²).
- اغسل الشرائح 2 × 2 دقيقة في الماء المقطر.
- إخماد في البيروكسيديز الداخلي (في 3٪ بيروكسيديز الهيدروجين) في درجة حرارة الغرفة.
- شطف الشرائح 2 × 5 دقائق مع PBS أو الماء.
- ضع الشرائح بشكل مسطح في الحاوية وقم بتطبيق مخزن التوازن المؤقت (75 ميكرولتر / 5 سم2) لمدة 10 ثوان في درجة حرارة الغرفة.
- امسح بعناية حول الأنسجة.
- أضف إنزيم TdT (ترانسفيراز ديوكسي نيوكليوتيد النهائي) إلى كل قسم واحتضانه في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. ضع مناشف ورقية داخل الدرج ، حول الشرائح ، بلل المناشف بالماء ، وقم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي.
- بعد الحضانة ، ضع العينات في الرف واتركها في مخزن مؤقت للإيقاف / الغسيل (10 دقائق).
- قم بتسخين الاقتران المضاد للديجوكسيجينين إلى درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح في PBS (3 × 1 دقيقة).
- امسح بعناية حول المنديل.
- أضف قطرتين من مترافق Anti-Digoxigenin-Peroxidase (65 ميكرولتر / 5 سم²) إلى الأقسام واحتضانها لمدة 30 دقيقة في وعاء مرطب.
- بعد الغسيل في PBS 4 × 2 دقيقة ، قم بإعداد ركيزة البيروكسيديز القوية للعمل ، واضغط برفق على السائل الزائد واستنشق حول القسم.
- قم بتغطية الأقسام بركيزة البيروكسيديز (75 ميكرولتر / 5 سم²) وصمة عار لمدة 5 دقائق. ضع شريحة تحت المجهر وحدد وقت التلوين الأمثل.
- اغسل الشرائح في رف تلطيخ بالماء المقطر (3 × 1 دقيقة).
- احتضان الشرائح في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
- مضاد للبقع باستخدام الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة.
- ضع الشريحة تحت ماء الصنبور الجاري لمدة 3 دقائق.
- اغسل الشريحة بالماء المقطر.
- قم بتركيب الشرائح تحت أغطية زجاجية في وسط التثبيت واتركها مسطحة حتى تجف.
- مراقبة تحت المجهر الضوئي.
- مجموعة الكشف عن موت الخلايا المبرمج (الفحص C)
ملاحظة: اتبع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).- تحضير الجرار كوبلن.
- إزالة الشمع وإعادة ترطيب أقسام الأنسجة (انظر الخطوة 1.3).
- احتضان الأنسجة مع Proteinase K (15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية).
- ضع الشرائح مرة أخرى على الرف واشطفها 2x في PBS.
- قم بتغطيتها ب 50 ميكرولتر من "خليط تفاعل TUNEL". ضع مناشف ورقية مبللة داخل الحاوية ، وقم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي ، واتركها لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- شطف 3x مع برنامج تلفزيوني.
- ضع الشرائح في الحاوية وجفف المنطقة المحيطة بعينة الأنسجة.
- أضف 50 ميكرولتر من Converter-AP إلى العينة واحتضانها في حاوية مرطبة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- شطف 3x في برنامج تلفزيوني.
- أضف 50-100 ميكرولتر من محلول الركيزة واتركه لمدة 10 دقائق في الظلام.
ملاحظة: راقب التلوين تحت المجهر الضوئي. - شطف الشرائح 3x مع برنامج تلفزيوني.
- مضاد للبقع عن طريق نقل المقاطع إلى الهيماتوكسيلين لمدة 2 دقيقة ثم يشطف بعناية في ماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق.
- قم بتركيب الشرائح تحت أغطية زجاجية في وسط تركيب مائي واتركها مسطحة حتى تجف.
- مراقبة تحت المجهر الضوئي. قم بتقييم الخلايا المصابة (الإيجابية) عن طريق عد 70 إلى 100 خلية في كل عينة من الأمعاء الوسطى أو HPGs تحت المجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كشف موت الخلايا في الأمعاء الوسطى
تمت معالجة النحل العامل الناشئ حديثا (Apis mellifera carnica) من المنحل التجريبي في المعهد الزراعي في سلوفينيا في ليوبليانا بشكل فردي بحمض الأكساليك 3٪ (OA)23. كثيرا ما يستخدم الزراعة العضوية في تربية النحل للتحكم في مدمر الفاروا . بعد العلاج ، تم تجميد النحل العامل (ثلاثة من كل مجموعة) على الجليد. تم تشريح الأمعاء الوسطى وتثبيتها في 10 ٪ من الفورمالين. ثم تم تجفيف الأنسجة في سلسلة من محاليل الكحول وأخيرا تم تضمينها في شمع البارافين. بعد تقطيعها باستخدام ميكروتوم إلى أقسام رقيقة 7 ميكرومتر ، تم تحضير عينات الأنسجة للتحليل. باستخدام المجهر الضوئي ، تم حساب النسبة المئوية للخلايا المصابة (70-100 خلية من كل عينة من عينات الأمعاء الوسطى الثلاث). أشارت النتائج مع الفحص B إلى أن العلاج بالزراعة العضوية أثر بشكل كبير على الخلايا الموجودة في الأمعاء الوسطى (الشكل 3). أظهر الفحص A عدم وجود فرق بين النحل المعالج والتحكم. كان معدل موت الخلايا أقل من 10٪. في النحل الضابط ، شراب السكر المغذي فقط ، لم يتأثر مورفولوجيا الأمعاء الوسطى وحفظها جيدا.
الشكل 3: الأمعاء الوسطى . (أ) تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. (ب) التلوين المناعي (الفحص ج) للأمعاء الوسطى. يتم تلطيخ أحمر مكثف في نوى خلايا الأمعاء الوسطى. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الكشف عن موت الخلايا في قوات الدفاع الشعبي
في التجربة التالية ، أجريت التجربة ، واختيار ثلاث مستعمرات خالية من الأمراض (Apis mellifera L.). تم وضع الأمشاط ذات الحضنة المغطاة في حاضنة (34.5 درجة مئوية) ، وتم تمييز النحل العامل الناشئ حديثا ببقعة على الصدر لتحديد عمره. تم تكرار هذا الإجراء ثلاث مرات للحصول على نحل مختلف العمر. تم وضع علامة على النحل وعاد إلى مستعمرته. تم أخذ عينات من النحل بعد 30 يوما من بداية التجربة. أخيرا ، تم وضعهم في قفص اكتناز 7.5 سم × 4 سم × 4 سم ، مع شبكة سلكية على جانب واحد والاحتفاظ بها في حاضنة عند 28 درجة مئوية.
عولج العمال بالمبيدات الحشرية (إيميداكلوبريد) أو مبيد القراد (كومافوس) ، وكلاهما محاليل بجرعات دون مميتة ، أو شراب السكر كمجموعة تحكم10. تم تجميد النحل من مجموعات مختلفة وتشريح قوات الدفاع الشعبي. تألفت العينة من ثلاثة إلى خمسة عمال من نفس المجموعة للحصول على أكبر عدد ممكن من الخلايا. تم تقييم الخلايا المصابة باستخدام طرق الأنسجة المناعية. تم الكشف عن منتجات التفاعل الأحمر (الفحص C) والبني (Assay B) في نوى موت الخلايا المبرمج ل HPGs. تم تحديد النوى الحمراء الإيجابية بعد علاج إيميداكلوبريد أو كومافوس في غالبية الخلايا الغدية (الشكل 4) ، وأظهرت نوى الخلايا المتفرقة فقط منتج تفاعل بني من نفس المجموعات المعالجة. لم يكن لدى المجموعة الضابطة خلايا HPG تالفة.
الشكل 4: الغدد البلعومية . (أ) تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين. (ب) التلوين المناعي (الفحص ج). تلطيخ أحمر موضعي في نوى الخلايا. (ج) التلوين المناعي (الفحص ب). يشير ناتج التفاعل البني إلى نوى الخلية الموجبة. قضبان المقياس = 50 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في الكائنات الحية ، يعرف موت الخلايا بأنه موت الخلايا المبرمج أو النخر25 ويمكن أن يكون مصحوبا بالالتهام الذاتي26. الفرق بين الخلايا المبرمج والخلايا الميتة هو أن موت الخلايا المبرمج هو شكل من أشكال موت الخلايا المبرمج ويظهر في الخلايا الطبيعية ، بينما يحدث النخر بسبب الظروف المميتة (على سبيل المثال ، حادث ، مرض)27,28. يمكن الكشف عن موت الخلايا المبرمج باستخدام مجموعات الفحص بناء على تقنية TUNEL (الكشف عن تجزئة الحمض النووي عن طريق تسمية 3′-هيدروكسيل تيرميني في فواصل الحمض النووي مزدوجة الشريط المتولدة أثناء موت الخلايا المبرمج). توفر المجموعات المختلفة عدة مستويات من الحساسية في اكتشاف حذف الخلايا.
أحد المقايسات (الفحص C) حساس للغاية ويكتشف كلا من موت الخلايا المبرمج والنخر29 ؛ يظهر الفحص الآخر (B) حساسية أعلى للكشف عن موت الخلايا المبرمج30. مبدأ الفحص C هو الكشف عن فواصل الحمض النووي في المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج. بعد تثبيت الخلايا المبرمج واختراقها ، يتم تحضين الأنسجة بمزيج تفاعل TUNEL. وفي الوقت نفسه ، يتمثل دور TdT في تحفيز إضافة fluorescein-dUTP في مجموعات 3′-OH الحرة في الحمض النووي. بعد غسل الأنسجة ، يحدد الجسم المضاد للفلوريسئين الملصق في الأجزاء التالفة من الحمض النووي. مبدأ الجسم المضاد هو الالتصاق بإنزيم الفوسفاتيز القلوي الذي يعمل كمراسل. أخيرا ، يمكن رؤية AP كنتيجة لهذا التفاعل المحدد31.
يعد تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين للأعضاء طريقة مباشرة ومفيدة للتحليل المورفولوجي باستخدام المجهر الضوئي. يوصى بتضمين هذه الخطوة أولا لمراقبة أي تغييرات مورفولوجية للخلايا. للكشف عن المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج في الأجزاء الرقيقة من أنسجة نحل العسل ، تتوفر مجموعتان على الأقل للتحليل الكيميائي المناعي (انظر جدول المواد). كلاهما يحول نوى الخلية المبرمج إلى اللون البني الداكن ويتم تصورهما باستخدام الفحص المجهري الضوئي. باستخدام الفحص A (تقنية TUNEL) ، يترافق Streptavidin HRP (بيروكسيديز الفجل) مع النيوكليوتيدات الحيوية ، وتتحول نوى موت الخلايا المبرمج إلى اللون البني بعد تفاعل DAB (ديامينوبنزيدين ، كروموجين مستقر). يميز الفحص B تلف الخلايا عن طريق الكشف عن انشقاق الحمض النووي والكروماتين المكثف ، وهو علامة على موت الخلايا المبرمج المبكر.
في الكائن الحي السليم ، يمكن عادة تقييم مستوى تجديد الخلايا بنسب صغيرة32,33. زاد موت الخلايا في الأمعاء الوسطى بعد علاج الزراعة العضوية ، مما يشير إلى أن استخدام الزراعة العضوية له تأثير ضار على الأمعاء الوسطى للنحل العامل في التجارب المعملية. كشفت مجموعة النحل المعالجة بإيميداكلوبريد وكومافوس عن زيادة موت الخلايا (النوى الحمراء) في الغدد الغذائية10 ، مما يشير إلى تلف الخلايا أو نخرها. تم العثور على موت الخلايا المبرمج عند مستوى منخفض (نوى بنية)10. ومع ذلك ، تم العثور على موت الخلايا الميتة وموت الخلايا المبرمج بمستويات عالية ، خاصة بعد العلاج بإيميداكلوبريد. في مجموعة النحل غير المعالج ، لم يكن مستوى موت الخلايا المبرمج في قوات الدفاع الشعبي أكثر من 10 ٪ ، وهو ما يتوافق مع دوران الأنسجة الطبيعي32.
تم الكشف عن موت الخلايا ، سواء بسبب الضرر أو موت الخلية المبرمج ، بواسطة كلا الفحصين (B و C) وأدى إلى حساسية مختلفة. الأول يكتشف موت الخلايا الميتة والمبرمجة11. كما تم تأكيده في العمال الأصحاء (المجموعة الضابطة) ، اكتشف كلا المقايستين خلايا إيجابية متفرقة10 فقط. تبين أن فحوصات موت الخلايا المبرمج والكشف عن النخر المستخدمة في التحليل المناعي الكيميائي لأنسجة نحل العسل هي طريقة قوية لاستكشاف التأثيرات شبه المميتة للمواد المختلفة على نحل العسل.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول:
بعد قطعها باستخدام ميكروتوم ، يجب وضع أقسام الأنسجة على الزجاج الموضوعي على طبق دافئ (طاولة التسطيح ، انظر جدول المواد) طوال الليل. من الضروري تجفيف العينات جيدا للخطوات المستقبلية في البروتوكولات. عندما لا يتم ربط الأنسجة جيدا بالزجاج ، يمكن أن تنفصل عن السطح في إجراء الكشف عن موت الخلايا. ينصح باستخدام المجهر الضوئي للتحقق من وجود الأنسجة المطلوبة. بعد ذلك ، من المفيد صبغ الشريحة الأولى باستخدام H&E للتحقق من القسم الصحيح مع العديد من الخلايا (خاصة الأنسجة الغدية) وإعداد خلايا جديدة في حالة عدم ملاءمة قسم الأمعاء الوسطى. قد يكون العثور على HPGs أمرا صعبا للغاية ، لذلك يجب توخي الحذر لعدم قطع الكثير من الأقسام ؛ خلاف ذلك ، سوف تضيع الغدد.
تعد إضافة التحكم الإيجابي للكشف عن تكسر الحمض النووي مفيدة ولكنها اختيارية. من المهم معالجة الشرائح بشكل منفصل لتجنب تلطيخ الخلفية العالية في الشرائح التجريبية. في الفحص B ، يتم تضمين الضوابط الإيجابية في بعض المجموعات (انظر جدول المواد) ؛ يجب شراء الآخرين بشكل منفصل.
الطريقة لها قيود في طولها ودقتها. الحفاظ على الأنسجة في وسط تركيب مائي هو قصير الأجل فقط (أقل من 3 أشهر). إذا كان الحفظ الأطول مطلوبا (غير مستحسن بسبب التغييرات المحتملة في اللون) ، فهناك وسائط أخرى ، لكن النتائج ليست موثوقة.
يعد استخدام هاتين الطريقتين (موت الخلايا المبرمج واكتشاف النخر) مفيدا جدا في وقت واحد لمقارنة التأثيرات المختلفة للمبيدات الحشرية على أنسجة نحل العسل ، خاصة بالنسبة للتأثيرات شبه المميتة. الطريقة البديلة هي مراقبة نشاط البحث عن الطعام وتأثيره على الإدراك المعرفي للنحل العامل المتأثر بالمبيدات الحشرية. ستكون هذه الطريقة أسرع في اكتشاف التأثيرات شبه المميتة على أنشطة النحل البالغ ، ولكنها لن تجيب على أي أسئلة تتعلق بمدى الضرر الداخلي الذي يمكن أن يغير السلوك في المرحلة المبكرة ، كما هو الحال في النحل الصغير (الممرض).
يعد التحليل النسيجي للتشكل البسيط لأنسجة نحل العسل أساسا متينا للتعامل مع وجهات نظر بحثية مختلفة في تلف الخلايا أو موت الخلايا المبرمج أو التشوهات. يمكن أن تكون أسباب استخدام المبيدات الحشرية في البيئة أو معالجة المستعمرات بسبب الطفيليات والآفات ضارة وتؤثر بشكل كبير على عمر نحل العسل وبقاء المستعمرة. الأمعاء الوسطى و HPGs هي أعضاء أساسية في نحل العسل ولديها القدرة والغرض من الاستجابة بسرعة لأي نوع من العوامل الخارجية السلبية التي تؤثر على أنشطة النحل المرتبطة بالعمر. تنخفض HPGs في الحجم وقدرات الإفراز ، وتستجيب الخلايا الظهارية في الأمعاء الوسطى بزيادة موت الخلايا. تعد طرق الكيمياء الهيستولوجية المناعية ، مثل الدراسات في الموقع ، أدوات مفيدة للكشف عن موت الخلايا المبرمج في أنسجة النحل. كما أنها تظهر إمكانية تنفيذها في دراسات الآثار الضارة المحتملة على نحل العسل والحشرات المفيدة الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلف أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
أقر بامتنان بدعم وكالة الأبحاث السلوفينية ، المنحة رقم P4-133.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Propanol | |||
| ApopTag Peroxidase kit (ApopTag Peroxidase In Situ Apoptosis Detection) | Sigma-Aldrich | S7100 | Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Positive controls included in S7101 |
| Covers | |||
| DeadEnd Colorimetric TUNEL system | Promega | G7360 | Assay A, https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 |
| Dissecting microscope (for bee dissection) | Zeiss | ||
| Distilled water | |||
| Embedding cassette | |||
| EnVision System alkaline phosphatase kit | Dako | ||
| Eosin Y Solution | Sigma-Aldrich | alcoholic | |
| Ethanol | 95% (or less pure), 90%, 80% | ||
| Faramount mounting medium, aqueous | Dako | mounting medium | |
| Flattening table | Leica | HI1220 | |
| Forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 11294-00 | Standard #4 |
| Formalin 10% | Formaldehyde | ||
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | ||
| HistoChoice Clearing Agent | Sigma-Aldrich | clearing agent | |
| Hydrogen peroxidase 3% | |||
| Incubator | BioRad | ||
| Insect pins (for bee dissection) | Entosphinx | 44594 | Insect pins stainless steel – white, size 2 |
| ISCDDK, AP (In Situ Cell Death Detecteion Kit, Alkaline Phosphatase) | Roche | 11684809910 | Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf |
| KH2PO4 | |||
| Lab clock | |||
| Light microscope | Leica | ||
| Microscope slides | Box with the slides must be preserved in a plastic wrap to prevent dust | ||
| Microtome | Leica | ||
| Modular tissue embedding station | Leica | ||
| Na2HPO4 | |||
| NaCl | |||
| Paraformaldehyde 4% | |||
| Paraplast | Leica | ||
| Pasteur pipettes | 1.5 mL; 3 mL | ||
| PBS | |||
| Petri dish (for bee dissection) | Filled with condensation silicon (Xantoprene L blue and Universal liquid plus activator) | ||
| Proteinase K | Merck | 21627 | |
| Ringers' solution (for bee dissection) | 7.5 g NaCL, 2.38 g Na2HPO4, 2.72 g KH2PO4, 1 L distilled water | ||
| Scissors (for bee dissection) | Fine science tools | 1406-09, 14061-09 | Straight and curved, 9 cm |
| Universal liquid plus activator (for bee dissection) | Kulzer | ||
| Watchmaker’s forceps (for bee dissection) | Fine science tools | 91100-12 | |
| Water bath | Leica | ||
| Watercolor brush | 2x | ||
| Xantoprene L blue (for bee dissection) | Kulzer |
References
- Ruttner, F. Naturgeschichte der Honigbienen. , Ehrenwirth. München. (1992).
- Jordan, R. Kleine Bienenkunde. Österreichischer Agrarverlag Wien München. , 41-45 (1964).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. The Hive and the Honey Bee. , Dadant and Sons. 111-113 (1975).
- Snodgrass, R. E. The Anatomy of the Honey Bee. , Cornell University Press. (2004).
- Hrassnigg, N., Crailsheim, K. Adaptation of hypopharyngeal gland development to the brood status of honeybee (Apis mellifera L.) colonies. Journal of Insect Physiology. 44 (10), 929-939 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Characteristics of hypopharyngeal glands in honeybees (Apis mellifera carnica) from a nurse colony. Slovenian Veterinary Research. 52 (2), 67-74 (2015).
- Kubo, T. Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role. Journal of Biochemistry. 119 (2), 291-295 (1996).
- Sammataro, D., Yoder, J. A. Honey bee colony health: Challenges and sustainable solutions. , Taylor & Francis Group. 302 (2012).
- Crailsheim, K., Stolberg, E. Influence of diet, age and colony condition upon intestinal proteolytic activity and size of the hypopharyngeal glands in the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of Insect Physiology. 35 (8), 595-602 (1998).
- Smodiš Škerl, M. I., Gregorc, A. Heat shock proteins and cell death in situ localisation in hypopharyngeal glands of honeybee (Apis mellifera carnica) workers after imidacloprid or coumaphos treatment. Apidologie. 41 (1), 73-86 (2010).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. The histochemical characterisation of cell death in honeybee larvae midgut after treatment with Paenibacillus larvae, Amitraz and Oxytetracycline. Cell Biology International. 24 (5), 319-324 (2000).
- Higes, M., et al. Apoptosis in the pathogenesis of Nosema ceranae (Microsporidia: Nosematidae) in honey bees (Apis mellifera). Environmental Microbiology Reports. 5 (4), 530-536 (2013).
- Kurze, C., et al. Infection dynamics of Nosema ceranae in honey bee midgut and host cell apoptosis. Journal of Invertebrate Pathology. 154, 1-4 (2018).
- Johnson, R. M. Honey bee toxicology. Annual Review of Entomology. 60 (1), 415-434 (2005).
- Gashout, H. A., Guzman-Novoa, E., Goodwin, P. H. Synthetic and natural acaricides impair hygienic and foraging behaviors of honey bees. Apidologie. 51 (6), 1155-1165 (2020).
- McMenamin, A. J., Genersch, E. Honey bee colony losses and associated viruses. Current Opinion in Insect Science. 8, 121-129 (2015).
- Ramsey, S. D., et al. Varroa destructor feeds primarily on honey bee fat body tissue and not hemolymph. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 116 (5), 1792-1801 (2019).
- Requier, F., et al. Honey bee diet in intensive farmland habitats reveals an unexpectedly high flower richness and a major role of weeds. Ecological Applications. 25 (4), 881-890 (2015).
- Santos, C., Serrão, J. Histology of the ileum in bees (Hymenoptera, Apoidea). Brazilian Journal of Morphological Sciences. 23 (3), 405-413 (2006).
- Suwannapong, G., Saichon, C., Benbow, M. Histochemical comparison of the hypopharyngeal gland in Apis cerana Fabricius, 1793 workers and Apis mellifera Linnaeus, 1758 workers. Psyche: A Journal of Entomology. , (2010).
- Ceylan, A., Sevin, S., Özgenç, Ö Histomorphological and histochemical structure of the midgut and hindgut of the Caucasian honey bee (Apis mellifera caucasia). Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences. 43 (6), 747-753 (2019).
- Human, H., et al. Miscellaneous standard methods for Apis mellifera research. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-53 (2013).
- Gregorc, A., Smodiš Škerl, M. I. Toxicological and immunohistochemical testing of honeybees after oxalic and rotenone treatments. Apidologie. 38 (3), 296-305 (2007).
- Carreck, N. L., et al. Standard methods for Apis mellifera anatomy and dissection. Journal of Apicultural Research. 52 (4), 1-40 (2013).
- Bowen, I. D., Bowen, S. M., Jones, A. H. Mitosis and apoptosis: Matters of Life and Death. , Chapman & Hall. London. (1998).
- Eisenberg-Lerner, A., et al. Life and death partners: apoptosis, autophagy and the cross-talk between them. Cell Death and Differentiation. 16 (7), 966-975 (2009).
- Bowen, I. D., Mullarkey, K., Morgan, S. M. Programmed cell death in the salivary gland of the blow fly Calliphora vomitoria. Microscopy Research Techniques. 34, 202-207 (1996).
- D'Arcy, M. S. Cell death: a review of the major forms of apoptosis, necrosis and autophagy. Cell Biology International. 43 (6), 582-592 (2019).
- Matylevitch, N. P., et al. Apoptosis and accidental cell death in cultured human keratinocytes after thermal injury. American Journal of Pathology. 153 (2), 567-577 (1998).
- Perry, S. W., Epstein, L. G., Gelbard, H. A. Simultaneous in situ detection of apoptosis and necrosis in monolayer cultures by TUNEL and trypan blue staining. BioTechniques. 22 (6), 1102-1106 (1997).
- Cuello-Carrion, F. D., Ciocca, D. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 837-839 (1999).
- Gregorc, A., Bowen, I. D. Programmed cell death in the honeybee (Apis mellifera L.) larvae midgut. Cell Biology International. 21 (3), 151-158 (1997).
- Gregorc, A., Pogačnik, A., Bowen, I. D. Cell death in honey bee (Apis mellifera) larvae treated with oxalic or formic acid. Apidologie. 35 (5), 453-460 (2004).
