Summary
O presente protocolo descreve um método de injeção de embriões de carrapatos. A injeção embrionária é a técnica preferida para manipulação genética para gerar linhas transgênicas.
Abstract
Os carrapatos podem transmitir vários patógenos virais, bacterianos e protozoários e, portanto, são considerados vetores de importância médica e veterinária. Apesar da crescente carga de doenças transmitidas por carrapatos, a pesquisa sobre carrapatos ficou atrás dos vetores de doenças de insetos devido aos desafios na aplicação de ferramentas de transformação genética para estudos funcionais à biologia única dos carrapatos. As intervenções genéticas vêm ganhando atenção para reduzir as doenças transmitidas por mosquitos. No entanto, o desenvolvimento de tais intervenções requer uma transformação estável da linha germinativa através da injeção de embriões. Tal técnica de injeção de embriões está faltando para queliceratos, incluindo carrapatos. Vários fatores, como uma camada externa de cera espessa em embriões de carrapatos, córion duro e alta pressão intra-oval, são alguns obstáculos que anteriormente impediam o desenvolvimento do protocolo de injeção embrionária em carrapatos. O presente trabalho superou esses obstáculos, e uma técnica de injeção de embriões para o carrapato de patas pretas, Ixodes scapularis, é descrita aqui. Esta técnica pode ser usada para fornecer componentes, como CRISPR / Cas9, para transformações estáveis da linha germinativa.
Introduction
Os carrapatos são vetores de importância médica e veterinária, capazes de transmitir uma variedade de patógenos virais, bacterianos, protozoários e nematoides 1,2. No leste dos Estados Unidos, o carrapato-de-patas-pretas, Ixodes scapularis, é um importante vetor do patógeno da doença de Lyme (DL), a espiroqueta Borrelia burgdorferi. Mais de 400.000 casos de DL são relatados a cada ano nos Estados Unidos, tornando-se a principal doença infecciosa transmitida por vetores nos EUA1. Além de B. burgdorferi, seis outros microrganismos são transmitidos por I. scapularis, incluindo quatro bactérias (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamotoi e Ehrlichia muris eauclarensis), um protozoário parasita (Babesia microti) e um vírus (Powassan virus), tornando esta espécie de carrapato uma grande preocupação de saúde pública3 . Embora as doenças transmitidas por carrapatos tenham se tornado mais prevalentes nos últimos anos, a pesquisa sobre carrapatos ficou para trás de outros vetores artrópodes, como mosquitos, devido à biologia única dos carrapatos e aos desafios associados à aplicação de ferramentas genômicas genéticas e funcionais 4,5.
Técnicas de edição de genes, particularmente CRISPR/Cas9, agora tornaram os estudos de genômica funcional viáveis em organismos não modelo. Para a criação de mutações hereditárias em um organismo, a injeção embrionária continua sendo o método preferido para fornecer construções para alterar a linha germinativa 6,7,8,9. No entanto, atérecentemente 4, os ovos de carrapatos eram considerados muito difíceis ou mesmo impossíveis de injetar sem matar o embrião10,11. Uma espessa camada de cera nos ovos, córion duro e alta pressão intra-oval foram alguns dos principais obstáculos que impediram a injeção de embriões em carrapatos. Adulto, alimentado com sangue I. scapularis depositar uma única ninhada de até 2.000 ovos12 ao longo de 3-4 semanas (aproximadamente 100 ovos / dia). Os ovos são postos isoladamente, e cada ovo é revestido com cera que é secretada por saliências ou "chifres" do órgão glandular de Gené13,14,15 da mãe. Esta cera protege os ovos da dessecação e contém compostos antimicrobianos15. Para injetar com sucesso ovos de carrapatos, é importante remover a camada de cera, suavizar o córion e dessecar os ovos para diminuir a pressão intraoval para que a injeção não danifique irreversivelmente o ovo. Compreendendo a importância crítica das injeções de embriões para o sucesso da transformação da linha germinativa, é desenvolvido um protocolo para I. scapularis, que pode ser usado para fornecer uma construção CRISPR/Cas9 e gerar mutações estáveis na linha germinativa4. Além de sua contribuição para a pesquisa de I. scapularis, este protocolo também poderia ser otimizado para outras espécies de carrapatos.
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Protocol
Ixodes scapularis adultos foram comprados da Oklahoma State University (OSU) ou criados na Universidade de Nevada, Reno (UNR) (protocolo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparação de carrapatos fêmeas para a coleta de embriões
NOTA: Para coletar ovos de idade apropriada, é importante sincronizar a postura de ovos. Embora as pistas de postura de ovos em carrapatos permaneçam obscuras, sob as condições insetárias padrão (temperatura de 27 °C e umidade relativa (UR) de >90%), as fêmeas de I. scapularis começam a botar ovos aproximadamente 8 dias após o descolamento do hospedeiro. Esta linha do tempo pode ser alongada armazenando fêmeas repletas a 4 °C. Armazenamos fêmeas alimentadas com sangue a 4 °C até 8 semanas sem qualquer efeito negativo na postura de ovos. Essas condições podem precisar ser modificadas para cada insetário.
- Armazenar todas as fêmeas repletas a 4 °C com >90% de UR numa caixa de plástico de 6 litros forrada com papel de filtro húmido até ser utilizada para microinjecções.
- Uma semana antes das injecções, transferir as fêmeas de 4 °C para uma incubadora de 27 °C para o início da postura de ovos.
- Quando as fêmeas começarem a botar ovos (3-4 dias depois de movê-los para 27 °C), remova todos os ovos usando um pincel de ponta fina e prepare as fêmeas para a ablação do órgão de Gené (glândula de cera).
NOTA: O órgão de Gené se estende da área entre o escudo e o capítulo (base dorsal das partes bucais), as partes bucais se dobram sobre a superfície corporal ventral (paralela à superfície) e o órgão estendido do gene reveste os ovos assim que os ovos são postos (Figura 1). Os ovos colocados antes da remoção do órgão de Gené ou esvaziamento da cera terão um revestimento de cera e não são adequados para injeções e devem ser descartados. - Para remover ou esvaziar o órgão de Gené, use argila para posicionar a fêmea ingurgitada em uma lâmina de vidro sob um microscópio orientado para que as partes bucais sejam visíveis nos lados ventral e dorsal (Figura 1B,C).
- Cuidadosamente cutuque a área exatamente entre o escudo e as partes bucais usando pinça fina e agulhas de tungstênio feitas em laboratório usando fio de tungstênio seguindo um protocolo publicado anteriormente16 (as agulhas também podem ser compradas comercialmente e anexadas a uma sonda de microdissecação, consulte Tabela de Materiais).
- Trabalhando o caminho para dentro com a agulha de tungstênio, puxe a glândula de cera para fora (Figura 1D,E). Pode levar vários minutos para remover a glândula. Limpe qualquer secreção de cera líquida usando lenços umedecidos de laboratório.
NOTA: A glândula também pode ser removida do lado ventral logo abaixo das partes bucais; alcançando as costas em direção ao escudo com uma agulha e pinça. A aplicação de cola de silício ao redor das partes bucais também bloqueia a eversão de órgãos de Gene e pode ser usada em vez de remover ou esvaziar a cera (comunicação pessoal com o Dr. Ladislav Simo, INRAE, França). Os carrapatos ingurgitados não permanecerão em fita dupla face. Usar argila para "enrolar" o carrapato ajuda a mantê-los no lugar durante a manipulação. Use fórceps para segurar o carrapato e a agulha de tungstênio para dissecação. A parte ventral é mais fácil de perfurar com uma agulha e preferida pelos autores.
- Para esvaziar a glândula, organize o carrapato gravídico conforme mencionado na etapa 1.4. Puncione cuidadosamente a área atrás das partes bucais no lado dorsal e aplique pressão no lado ventral usando pinça.
NOTA: Alternativamente, não é necessário remover a glândula de cera; esvaziar a glândula de cera durará vários dias. As fêmeas que põem ovos têm uma área branca ao redor das partes da boca que indica a localização da glândula de cera e pode ser usada como referência.- Coloque a borda de uma limpeza de laboratório sem fiapos e remova a cera líquida que sai do local da punção. Certifique-se de evitar a secreção de hemolinfa, que é um líquido claro em comparação com a cera viscosa ligeiramente amarelada. Pode levar de 5 a 10 minutos até que a maior parte da cera seja removida.
- Após a manipulação, coloque as fêmeas em uma incubadora a 27 °C (>90% UR) e deixe-as se recuperar por 1-2 dias.
NOTA: As fêmeas tratadas geralmente levam 1-2 dias para se recuperar e começar a botar ovos novamente. - Quando as fêmeas começarem a botar ovos novamente, use um pincel fino para coletar ovos recém-depositados (0-18 h após a postura dos ovos) e coloque-os em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
NOTA: Se usar ovos da mesma fêmea ao longo do tempo, este procedimento deve ser repetido após 4-5 dias de postura de ovos, se as glândulas não foram removidas.
2. Tratamento embrionário para microinjeções
- Adicionar ~200 μL (ou volume suficiente para cobrir os ovos, dependendo do número de ovos) de 5% (peso/volume) de cloreto de benzalcónio/água (ver Tabela de Materiais) no tubo contendo ovos de 0-18 h de idade. Gire suavemente os ovos com o pincel por 5 minutos para evitar que os ovos se depositem no fundo do tubo (para detalhes, ver Sharma et al.4). Remova o sobrenadante usando uma micropipeta, deixando os ovos para trás em tubo.
CUIDADO: O cloreto de benzalcónio é corrosivo para a pele e os olhos, use luvas e proteção ocular. - Adicione ~200 μL de água destilada (DI) ao tubo que contém ovos, gire com um pincel e remova a água do tubo de microcentrífuga usando uma micropipeta. Repita a lavagem com água DI mais uma vez.
- Após a lavagem com água DI, adicione ~200 μL de cloreto de sódio (NaCl) a 5% (p/v) e gire suavemente com um pincel por 5 min. Retire a solução do tubo após 5 min e lave os ovos duas vezes com água DI.
- Adicionar ~100 μL de solução de NaCl a 1% (p/v) no tubo de microcentrífuga contendo ovos. Manter os ovos em solução de NaCl a 1% (p/v) até que sejam utilizados para preparações injetáveis.
- Inicie as microinjeções após cerca de uma hora. Esta linha do tempo ajuda na dessecação adequada dos ovos e evita que eles estourem.
NOTA: Os ovos podem ser mantidos em solução de NaCl a 1% (p/v) por 7-8 h sem afetar significativamente a sobrevida. Se os ovos forem difíceis de injetar ou estourar, os ovos não são dessecados o suficiente e podem ser tratados com 5% (p/v) de NaCl por mais 5 minutos.
3. Preparação de agulhas de injeção
- Insira um vidro capilar de aluminossilicato (com filamento, consulte Tabela de Materiais) no puxador da agulha seguindo as instruções do fabricante.
- Ajuste o extrator da agulha para as seguintes configurações: Calor: 575, Puxar: 20, Velocidade: 50, Tempo: 200 e Pressão: 700.
- Ative a função de tração do extrator da agulha e repita o processo para agulhas adicionais.
- Armazene as agulhas puxadas colando-as em linhas de argila do modelador em uma placa de Petri limpa.
- Carregue a agulha com a mistura de injeção usando uma ponta de micro carregador (consulte Tabela de materiais).
NOTA: A comparação das agulhas utilizadas para injeção de embriões de carrapatos e mosquitos é mostrada na Figura 2.
4. Configuração da lâmina para as microinjeções
- Usando fita adesiva dupla face, cole duas lâminas de microscópio de vidro juntas, deixando um espaço de cerca de 0,5 cm para apoiar o alinhamento dos ovos e impedi-los de rolar durante as injeções (Figura 3A).
- Aplique um pedaço de curativo de filme transparente (consulte Tabela de materiais) na fita dupla face no espaço entre os slides. Certifique-se de alinhar o curativo do filme perfeitamente com o vão.
5. Microinjeções embrionárias
- Alinhe de 8 a 10 ovos de cada vez na configuração do slide (acima) usando um pincel de pelo único.
NOTA: Os ovos alinhados com o eixo mais longo perpendicular (Figura 3B) à borda deslizante são mais fáceis de injetar do que os ovos cujo eixo longitudinal está alinhado paralelamente à borda (Figura 3C). Ovos na orientação perpendicular (Figura 3B) podem suportar melhor a injeção, resultando em maior sobrevida. - Coloque a lâmina com ovos alinhados no estágio de um microscópio composto. Use um pedaço de limpeza sem fiapos para remover a solução de NaCl a 1% na qual eles estão armazenados.
- Ligue a agulha de injeção cheia a um microinjetor ligado a um micromanipulador (ver Tabela de Materiais).
- Abra a agulha esfregando-a suavemente contra a superfície do ovo usando uma configuração de alta pressão no microinjetor (>5.000 hPa).
- Depois que a agulha for aberta, reduza a pressão (1.000-2.500 hPa) do microinjetor, dependendo da abertura da agulha.
NOTA: Uma abertura pequena exigirá uma pressão comparativamente maior, enquanto uma abertura maior exigirá uma pressão mais baixa. Isto é para controlar o volume da construção injetada. Dependendo do tamanho da abertura da agulha, o volume de injeção irá variar de 1-5 pL. - Injete todos os ovos na lâmina em um ângulo de 10°-15° o mais rápido possível e mova imediatamente a lâmina para condições de alta umidade em uma placa de Petri forrada com papel úmido. Assim que os ovos são injetados, eles começam a dessecar.
NOTA: Injetar um pequeno número de ovos de cada vez aumenta o sucesso da injeção e a probabilidade de sobrevivência. As agulhas ficam entupidas pelo refluxo embrionário. Se a ponta ainda estiver afiada, para limpar as agulhas entupidas, mova a agulha para uma pequena gota de 1% de NaCl adicionada à borda da lâmina. A ação capilar desalojará o pequeno tamanco. Se a agulha já estiver contundente, troque-a.
6. Cuidados pós-injeção de embriões
- Coloque a lâmina contendo embriões injetados em uma placa de Petri grande forrada com papel de filtro úmido.
NOTA: É fundamental não perturbar os ovos por pelo menos 5-6 h. Isso permite que a ferida de injeção sele corretamente. A ferida injetável pode se abrir quando agitada e o citoplasma pode começar a escorrer, resultando em mortalidade por ovos. - Após 5-6 h, adicione uma pequena gota de água DI ao curativo de filme transparente com embriões injetados anexados. Usando um pincel, desloque suavemente os ovos. Transfira os ovos para uma pequena placa de Petri (10 cm) e submerja-os em água DI.
NOTA: O curativo de filme permite a fácil remoção de ovos após injeções. No momento em que uma gota de água é adicionada ao curativo do filme, os ovos começarão a se mover junto com a água. - Mantenha os ovos submersos em água e coloque a placa de Petri em uma caixa de plástico de 6 litros em uma incubadora a 27 °C e >90% UR.
- Verifique os ovos regularmente, diariamente nos primeiros dias e, em seguida, a cada 3-4 dias até que as larvas comecem a eclodir.
NOTA: Se um grande número de ovos for danificado durante as microinjeções, drenar suavemente a água DI após uma semana impedirá o crescimento de fungos nos ovos mortos. - Quando as larvas começarem a eclodir dos embriões injetados (21-25 dias após a injeção para a configuração de laboratório atual), verifique-as diariamente e transfira as larvas eclodidas para frascos de vidro com uma tela no topo. As larvas podem eclodir debaixo d'água e sobreviver por ~ 1-2 semanas.
- Rastreie as larvas4 se os ovos foram injetados com uma construção que pode resultar em um fenótipo visível.
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Representative Results
Um protocolo de injeção embrionária bem-sucedido para I. scapularis é descrito neste artigo. As fêmeas que põem ovos foram mantidas em alta umidade para evitar a dessecação de ovos parcialmente encerados. A camada de cera foi removida para injetar embriões de carrapatos por ablação do órgão do gene (glândula de cera) da fêmea gravídica (Figura 1A-E). Foram utilizadas agulhas de vidro de aluminossilicato com pescoço mais curto (Figura 2). Esta forma era ideal para a injeção de ovo de carrapato, pois podia tolerar a pressão melhor do que a agulha de pescoço longo (cônica) usada para injeções de ovos de insetos. A forma esférica dos ovos de carrapatos requer uma plataforma deslizante nos bastidores (Figura 3A) para evitar rolar o ovo para fora da lâmina durante a inserção da agulha. O desenvolvimento embrionário inicial de I. scapularis é desconhecido, de modo que o momento e a localização da formação de células germinativas também são desconhecidos. Portanto, optou-se por injetar ovos no início do desenvolvimento (12-18 h de idade) e verificou-se que alinhar o eixo mais longo do ovo perpendicular à borda da lâmina resulta em maior sobrevida (Figura 3B,C). Usando este protocolo, vários milhares de ovos foram injetados. Desses ovos injetados, até 8,5% sobreviveram e as larvas eclodiram (Tabela 1). Os ovos tratados, mas não injetados, tiveram uma sobrevida muito maior (até 70%), sugerindo que a melhora nas injeções (seja pelo tempo, local de injeção ou agulha) pode melhorar a sobrevivência dos ovos. Este protocolo foi desenvolvido para a injeção de óvulos no início da embriogênese (12-18 h de idade); no entanto, isso pode ser usado para ovos de até 10 dias de idade com tratamento mais longo com NaCl e cloreto de benzalcônio.
Figura 1: Manipulação do órgão de I. scapularis Gené . (A) Diagrama do órgão de Gene. Topo: Órgão do gene sob o escudo. Fundo: glândula evertida e partes bucais dobradas para baixo. (B) Uma fêmea repleta sob o microscópio presa por argila. (C) Uma fêmea move suas partes bucais na superfície ventral durante a postura de ovos para estender o órgão de Gene. As setas amarelas mostram manchas brancas e podem ser usadas como referência para a localização do órgão de Gene. Estas áreas são visíveis em fêmeas que põem ovos por 2-3 semanas. (D,E) O órgão do gene (uma pequena bolha em D e estendida em E) é visível entre o escudo e o capítulo. Os chifres do órgão de Gené se estendem à medida que as partes bucais se dobram para baixo (E). A seta azul mostra o local para inserir uma agulha de tungstênio para remover a glândula. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Comparação da forma das agulhas de injeção de vidro. O meio é usado para embriões de carrapatos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alinhamento do ovo para preparações injetáveis . (A) Configuração da lâmina de vidro utilizada para injeções de embriões. As lâminas de vidro do microscópio são anexadas, deixando uma lacuna usando fita dupla face, e o curativo de filme transparente é colocado na fita. Os ovos são alinhados na borda da lâmina. (B) Alinhamento óptimo dos ovos com um longo eixo perpendicular à borda da lâmina. (C) Alinhamento menos eficaz dos ovos com o eixo longo paralelo à borda da configuração da lâmina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Construto injetado | Tempo após a postura dos ovos | Número de ovos injetados | Número de larvas eclodidas | Porcentagem de sobrevivência |
| sgRNA + Cas9 | ≤12 h | 2,396 | 147 | 6.14 |
| Gene 1 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 h | 3, 135 | 269 | 8.58 |
| Gene 2 | ||||
| sgRNA + Cas94 | ≤12 h | 2, 460 | 139 | 5.65 |
| Gene 3 | ||||
| Wolbachia | ≥ 24 h (24-36 h) | 1, 765 | 72 | 4.08 |
| sgRNA + Cas9 | 48-60 h | 191 | 5 | 2.62 |
| Gene 2 |
Tabela 1: Injeção de ovos bem-sucedida e eclosão larval em Ixodes scapularis.
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Discussion
Este é o primeiro protocolo desenvolvido para injetar embriões de carrapatos precoces com sucesso. Uma taxa de sobrevivência de ~4%-8% foi alcançada, o que é comparável à injeção de embriões em outros modelos de insetos bem estabelecidos5.
Como este é o protocolo inicial, prevê-se que este protocolo seja ainda mais refinado e especializado para espécies individuais de carrapatos. Em particular, o tempo de injeção varia de espécie para espécie, dependendo da embriogênese, especialmente o tempo de celularização. Os dados preliminares sugerem que os ovos de I. scapularis não passam por rápida divisão nuclear nas primeiras 24 h após a postura e a celularização ocorre alguns dias depois (dados não publicados). Já utilizamos este protocolo para a entrega de plasmídeos 4, knockout4 do gene mediado por CRISPR e entrega de bactérias (Wolbachia) (Tabela 1). Espera-se que este protocolo de injeção de embriões proporcione oportunidades para gerar carrapatos transgênicos e torne os estudos de nocaute e knock-in de genes viáveis em qualquer laboratório. Isso será valioso para acelerar os estudos que exploram a biologia do carrapato e as interfaces carrapato-patógeno-hospedeiro.
Etapas críticas dentro do protocolo
É importante coletar os ovos dentro de 24 h após a postura, pois esse protocolo foi padronizado para embriões precoces. Se os ovos forem coletados após esse período, é necessário um tratamento mais longo do cloreto de benzalcônio e NaCl, e a sobrevida é menor em ovos mais velhos (Tabela 1). O córion endurece com o tempo, dificultando a dessecação controlada para microinjeções em ovos com mais de 24 h. Observou-se que injetar menos ovos de cada vez ajuda na sobrevivência, porque os ovos tratados tendem a dessecar rapidamente quando removidos da solução de NaCl a 1%. Se os ovos dessecarem demais, eles morrerão, mas estourarão durante a microinjeção se não forem dessecados adequadamente. Portanto, otimizar o tempo de dessecação apropriado é necessário para diferentes espécies de carrapatos ou cepas. Além disso, manter os ovos intactos após microinjeções em condições de alta umidade é fundamental.
Limitações e direções futuras
Uma vez que os embriões são desparafinados, eles tendem a desidratar rapidamente, de modo que o processo de alinhá-los na lâmina e injetá-los deve ser conduzido rapidamente. A rápida melhoria na velocidade e precisão só pode ser alcançada através da prática constante e paciência. Nosso trabalho futuro será focado em melhorar a porcentagem de sobrevivência dos embriões após a injeção e identificar o momento da formação de células germinativas para garantir mutações hereditárias.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Channa Aluvihare e Yonus Gebermicale, ITF, UMD, por insights e apoio durante a fase inicial de desenvolvimento do protocolo. As agulhas de tungstênio foram um presente generoso de David O'Brochta, ITF, UMD. Somos gratos ao Dr. Ladislav Simo por testar este protocolo em I. ricinus e por discussões perspicazes. Este projeto foi financiado pelo NIH-NIAID R21AI128393 e Plymouth Hill Foundation, NY para MG-N, fundos de inicialização da Universidade de Nevada para AN, o National Science Foundation Grant No. 2019609 para MG-N e AN, e um Peer-to-Peer Grant da IGTRCN para AS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum silicate capillaries, with filament | Sutter instruments | AF100-64-10 | Embryo injection |
| Benzalkonium chloride 50% in water, 25 g | TCI-America | B0414 | Embryo treatment, 25 g is approximately 25 mL |
| Filter paper | Whatman | 1001-090 | Post-injection care |
| Forceps | Thomas Scientific | 300-101 | Gene`s organ manipulation |
| Lab Wipes | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Loading the pulled needles |
| Micromanipulator | Sutter instruments | ROE-200 | Embryo injection |
| Microscopic slides- plain, ground edges | Genesee Scientific | 29-100 | Embryo alignment, ground edges are preferred, beveled edges could obscure the eggs from view |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Embryo treatment |
| Needle Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Double sided tape | Scotch | 34-8716-3417-5 | Embryo alignment |
| Petri plates | Genesee Scientific | 32-107G | Post-injection care |
| Tegaderm/ Transparent film dressing | 3M Healthcare | 1628 | Embryo alignment |
| Tungsten needles | Fine Science Tools | 10130-10 | Gene`s organ manipulation |
| Tungsten Wire | Amazon | B08DNT7ZK3 | Gene`s organ manipulation |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter instruments | MPC-200 | Embryo injection |
References
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