Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt den Aufbau von 3D-On-Top-Kulturen einer nicht transformierten Brustepithelzelllinie, MCF10A, die modifiziert wurde, um die durch den Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) induzierte Transformation zu untersuchen. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um die Transformation zu bewerten und wird ausführlich diskutiert.
Abstract
Mehrere Modelle wurden entwickelt, um Krebs zu untersuchen, wie Nagetiermodelle und etablierte Zelllinien. Studien mit diesen Modellen lieferten wertvolle Einblicke in die Karzinogenese. Zelllinien haben ein Verständnis für die Deregulation der molekularen Signalübertragung im Zusammenhang mit der Brusttumorgenese geliefert, während Nagetiermodelle häufig verwendet werden, um zelluläre und molekulare Eigenschaften von Brustkrebs in vivo zu untersuchen. Die Etablierung von 3D-Kulturen von Brustepithel- und Krebszellen hilft, die Lücke zwischen In-vivo- und In-vitro-Modellen zu schließen, indem die In-vivo-Bedingungen in vitro nachgeahmt werden. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Deregulation komplexer molekularer Signalereignisse und die zellulären Eigenschaften während der Brustkarzinogenese zu verstehen. Hier wird ein 3D-Kultursystem modifiziert, um eine Phospholipid-Mediator-induzierte (Platelet Activating Factor, PAF) Transformation zu untersuchen. Immunmodulatoren und andere sezernierte Moleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression in der Brust. In der vorliegenden Studie werden 3D-Azinuskulturen von Brustepithelzellen PAF-Transformationsmerkmalen wie Polaritätsverlust und veränderten zellulären Eigenschaften ausgesetzt. Dieses 3D-Kultursystem wird dazu beitragen, genetische und / oder epigenetische Störungen zu beleuchten, die durch verschiedene niedermolekulare Einheiten in der Tumormikroumgebung induziert werden. Darüber hinaus wird dieses System auch eine Plattform für die Identifizierung neuer sowie bekannter Gene bieten, die am Transformationsprozess beteiligt sein könnten.
Introduction
Eine Vielzahl von Modellen steht zur Verfügung, um das Fortschreiten von Krebs zu untersuchen, von denen jedes einzigartig ist und einen Subtyp dieser komplexen Krankheit darstellt. Jedes Modell bietet einzigartige und wertvolle Einblicke in die Krebsbiologie und hat die Mittel verbessert, um den tatsächlichen Krankheitszustand nachzuahmen. Etablierte Zelllinien, die als Monoschicht gezüchtet wurden, haben wertvolle Einblicke in lebenswichtige Prozesse in vitro wie Proliferation, Invasivität, Migration und Apoptosegeliefert 1. Obwohl die zweidimensionale (2D) Zellkultur das traditionelle Werkzeug war, um die Reaktion von Säugetierzellen auf mehrere Umweltstörungen zu untersuchen, scheint die Extrapolation dieser Ergebnisse zur Vorhersage von Reaktionen auf Gewebeebene nicht überzeugend genug zu sein. Die Haupteinschränkung der 2D-Kulturen besteht darin, dass sich die erzeugte Mikroumgebung stark von der des Brustgewebes selbst unterscheidet2. Der 2D-Kultur fehlt die Interaktion der Zellen mit der extrazellulären Matrix, die für das Wachstum jedes Gewebes unerlässlich ist. Auch Zugkräfte, denen die Zelle in Monoschichtkulturen ausgesetzt ist, behindern die Polarität dieser Zellen und verändern so die Zellsignalisierung unddas Verhalten 3,4,5. Dreidimensionale (3D) Kultursysteme haben mit ihrer Fähigkeit, die in vivo Bedingungen in vitro nachzuahmen, einen neuen Weg im Bereich der Krebsforschung eröffnet. Viele wichtige Hinweise auf die Mikroumgebung, die in der 2D-Zellkultur verloren gehen, könnten mithilfe von 3D-Kulturen der lamininreichen extrazellulären Matrix (lrECM) wiederhergestellt werden6.
Verschiedene Studien haben die Bedeutung der Tumormikroumgebung bei der Karzinogenese identifiziert 7,8. Entzündungsassoziierte Faktoren sind ein wichtiger Teil der Mikroumgebung. Der Thrombozytenaktivierungsfaktor (PAF) ist ein von verschiedenen Immunzellen sezernierter Phospholipidmediator, der mehrere Immunantworten vermittelt 9,10. Hohe PAF-Spiegel werden von verschiedenen Brustkrebszelllinien sezerniert und sind mit einer erhöhten Proliferation assoziiert11. Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass die längere Anwesenheit von PAF in Azinuskulturen zur Transformation von Brustepithelzellen führt12. PAF aktiviert den PAF-Rezeptor (PAFR) und aktiviert die PI3K/Akt-Signalachse13. Es wird auch berichtet, dass PAFR mit EMT, Invasion und Metastasierung assoziiert ist14.
Das vorliegende Protokoll zeigt ein Modellsystem zur Untersuchung der PAF-induzierten Transformation unter Verwendung von 3D-Kulturen von Brustepithelzellen, wie sie zuvor von Chakravarty et al.12 beschrieben wurde. Die Brustepithelzellen, die auf der extrazellulären Matrix (3D-Kulturen) wachsen, neigen dazu, polarisierte wachstumshemmende Sphäroide zu bilden. Diese werden Acini genannt und ähneln stark den Acini des Brustgewebes, der kleinsten funktionellen Einheit der Brustdrüse, in vivo15. Diese Sphäroide (Abbildung 1A,B) bestehen aus einer Monoschicht dicht gepackter polarisierter Epithelzellen, die ein hohles Lumen umgeben und an der Basalmembran befestigt sind (Abbildung 1C). Dieser Prozess der Morphogenese wurde in Literatur16 gut beschrieben. Wenn sie auf lrECM ausgesät werden, durchlaufen die Zellen eine Teilung und Differenzierung, um einen Zellhaufen zu bilden, der dann ab Tag 4 polarisiert. Am Tag 8 bestehen die Acini aus einer Gruppe polarisierter Zellen, die in direktem Kontakt mit der extrazellulären Matrix stehen, und einem Cluster von unpolarisierten Zellen, die in den äußeren polarisierten Zellen eingeschlossen sind, ohne Kontakt zur Matrix. Es ist bekannt, dass diese unpolarisierten Zellen am 12. Tag der Kultur Apoptose durchlaufen und ein hohles Lumen bilden. Am Tag 16 bilden sich wachstumshemmende Strukturen16.
Abbildung 1: Zellkerne in Acini, die mit einer Kernfärbung gefärbt sind . (A) 3D-Konstruktion der Acini. (B) Phasenkontrastbild von MCF10A acini, das 20 Tage lang auf Matrigel gezüchtet wurde. (C) Der mittlere Abschnitt zeigt das Vorhandensein eines hohlen Lumens. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Im Gegensatz zu 2D-Kulturen helfen Azinuskulturen bei der Unterscheidung normaler und transformierter Zellen durch offensichtliche Morphologieänderungen. Nicht transformierte Brustepithelzellen bilden Acini mit einem hohlen Lumen, das die normalen menschlichen Brustacini nachahmt. Diese Sphäroide zeigen bei der Transformation eine gestörte Morphologie, die durch einen starken Polaritätsverlust (eines der Kennzeichen von Krebs), das Fehlen eines Lumens oder eine Störung des Hohllumens (aufgrund der Umgehung der Apoptose) gekennzeichnet ist, die aufgrund einer Deregulation verschiedener Gene induziert werden kann17,18,19,20 . Diese Transformationen können mit häufig verwendeten Techniken wie Immunfluoreszenz untersucht werden. Somit kann das 3D-Zellkulturmodell als einfache Methode dienen, um den Prozess der Brust-Azinus-Morphogenese und Brustkarzinogenese zu untersuchen. Die Einrichtung eines 3D-Kultursystems, um die Wirkung eines Phospholipidmediators, PAF, zu verstehen, wird das präklinische Arzneimittelscreening mit hohem Durchsatz unterstützen.
Diese Arbeit hat das 3D-On-Top-Kulturprotokoll16,21 für die Untersuchung der durch PAF 22 induzierten Transformation angepasst. Die phänotypischen Veränderungen, die durch die Exposition der Acini gegenüber dem Phospholipidmediator induziert wurden, wurden mittels Immunfluoreszenz untersucht. In der Studie wurden verschiedene Polaritäts- und epitheliale zu mesenchymale Übergangsmarker (EMT)12,16 verwendet. Tabelle 1 erwähnt ihre normale Lokalisation und ihren erwarteten Phänotyp bei der Transformation.
| Antikörper | Zeichen | Normale Lokalisierung | Transformierter Phänotyp |
| α6-Integrin | Basolateral | Basal mit schwacher lateraler Färbung | Starker lateraler / apikaler Fleck |
| β-Catenin | Zell-Zell-Übergang | Basolateral | Abnorme / nukleäre oder zytoplasmatische Lokalisation |
| Vimentin | Emt | Fehlende / schwache Präsenz | Hochregulierung |
Tabelle 1: In der Studie verwendete Marker. Verschiedene Marker, die mit ihrer Lokalisation in Gegenwart und Abwesenheit einer PAF-Behandlung verwendet werden.
Diese Methode kann am besten verwendet werden, um plausible Medikamente und Zielgene für verschiedene Brustkrebs-Subtypen zu untersuchen / zu screenen. Dies kann Daten zur Arzneimittelreaktion liefern, die näher am In-vivo-Szenario liegen, was zu einer schnelleren und zuverlässigeren Arzneimittelentwicklung beiträgt. Dieses System kann auch verwendet werden, um die molekulare Signalübertragung zu untersuchen, die mit Arzneimittelreaktion und Arzneimittelresistenz verbunden ist.
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Protocol
1. Aussaat von MCF10A-Zellen in lrECM
- Halten Sie MCF10A-Zellen (adhärente Brustepithelzellen) im Wachstumsmedium. Durchgang der Zellen alle 4 Tage.
HINWEIS: Zusammensetzung des Wachstumsmediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat mit Pferdeserum (5%), Insulin (10 μg/ml), Hydrocortison (0,5 μg/ml), epidermaler Wachstumsfaktor, EGF (20 ng/ml), Choleratoxin (100 ng/ml) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten/ml) (siehe Materialtabelle). - Auftauen von lrECM (siehe Materialtabelle) auf Eis 20 min vor Beginn des Experiments. Der Tag der Aussaat der Zellen wird im Allgemeinen als Tag 0 betrachtet.
- Um die Zellen zu trypsinisieren, saugen Sie das Medium ab und waschen Sie es mit 2 ml PBS. Fügen Sie 900 μL 0,05% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für ~15 min oder bis die Zellen vollständig trypsinisiert sind.
- Bereiten Sie ein Bett aus lrECM in acht Vertiefungen eines Kammerdeckglasobjektträgers vor (siehe Materialtabelle).
- Wenn die Zellen trypsinisieren, beschichten Sie jede Vertiefung mit 60 μL lrECM und legen Sie sie für maximal 15 min in einen 37 °C CO2-Inkubator.
- Bereiten Sie die Zellsuspension gemäß den folgenden Schritten vor.
- Nach der vollständigen Entfernung der Zellen werden 5 ml Resuspensionsmedium hinzugefügt, um die Trypsinaktivität zu löschen, und die Zellen bei 112 x g für 10 min bei 25 °C drehen.
HINWEIS: Zusammensetzung des Resuspensionsmediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit Pferdeserum (20%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml). - Saugen Sie das verbrauchte Medium ab und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml Assay-Medium. Mischen Sie die Suspension gut, um die Bildung einer einzelligen Suspension sicherzustellen.
HINWEIS: Zusammensetzung des Assaymediums: DMEM mit hohem Glukosegehalt ohne Natriumpyruvat, ergänzt mit Pferdeserum (2%), Hydrocortison (0,5 μg / ml), Choleratoxin (100 ng / ml), Insulin (10 μg / ml) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml). - Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, die benötigt wird, um 6 x 103 Zellen in jeder Vertiefung zu säen.
HINWEIS: Es wird im Allgemeinen bevorzugt, eine zusätzliche Vertiefung in die Berechnung einzubeziehen, um etwaige Pipettierfehler zu berücksichtigen. - Je nach Anzahl der erforderlichen Vertiefungen die Zellsuspension in Overlay-Medium verdünnen.
HINWEIS: Die Zusammensetzung des Overlay-Mediums für eine einzelne Vertiefung ist wie folgt: 400 μL Assaymedium, 8 μL lrECM (2% endgültig) und 0,02 μL 100 μg/ml EGF (5 ng/ml endgültig).
- Nach der vollständigen Entfernung der Zellen werden 5 ml Resuspensionsmedium hinzugefügt, um die Trypsinaktivität zu löschen, und die Zellen bei 112 x g für 10 min bei 25 °C drehen.
- Führen Sie das Seeding der Zellen durch.
- 400 μL der verdünnten Zellsuspension in die vorbereiteten lrECM-Betten geben (Schritt 1.4), wobei darauf zu achten ist, dass das lrECM-Bett nicht gestört wird. Inkubieren bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Inkubator .
2. PAF-Behandlung
- Fügen Sie PAF 3 h nach der Aussaat der Zellen hinzu. Bereiten Sie einen PAF-Vorrat von 100 μM in PBS vor und fügen Sie das erforderliche Volumen von 0,2 μL in jede Vertiefung hinzu (was 200 nM entspricht).
- Fügen Sie bei jedem Medienwechsel die gleiche PAF-Konzentration hinzu.
3. Nachfütterung mit frischen Medien
- Füllen Sie die Zellen alle 4 Tage mit frischem Medium auf (dh Tag 4, Tag 8, Tag 12 und Tag 16).
4. Immunfluoreszenzstudie zum Nachweis phänotypischer Veränderungen, die durch längere PAF-Exposition induziert werden
- Nach 20 Tagen Kultivierung pipetten Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung heraus und waschen Sie die Vertiefungen mit 400 μL vorgewärmtem PBS.
- Fixieren Sie die acinarus Strukturen durch Zugabe von 400 μL 4% Paraformaldehyd (frisch zubereitet durch Verdünnen von 16% Paraformaldehyd in 1x PBS) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur.
- Die Vertiefungen einmal mit eiskaltem PBS abspülen und mit PBS mit 0,5% Triton X-100 für 10 min bei 4 °C permeabilisieren.
- Nach 10 min sofort aber vorsichtig die Triton-X 100 Lösung pipetten und mit 400 μL PBS-Glycin abspülen (frisch zubereitet durch Zugabe einer Prise Glycin in 1x PBS). Dies wird dreimal für jeweils 15 Minuten wiederholt.
- 400 μL der primären Blockierungslösung, bestehend aus 10% Ziegenserum (siehe Materialtabelle), in Immunfluoreszenzpuffer (IF) zugeben und bei Raumtemperatur 60 min inkubieren.
HINWEIS: Zusammensetzung des IF-Puffers: 0,05% Natriumazid, 0,1% BSA, 0,2% Triton-X 100 und 0,05% Tween (20 in 1 PBS). - Entfernen Sie die primäre Blockierungslösung, fügen Sie 200 μL 2% sekundär blockierenden Antikörper (F(ab')2 Fragment des in Ziege gegen Mausantigen erhöhten Antikörpers, siehe Tabelle der Materialien) in primärer Blockierungslösung hinzu und lassen Sie es 45-60 min bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie den primären Antikörper (siehe Materialtabelle) in 2%iger sekundär blockierender Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:100 vor. Nach dem Entfernen der sekundären Blockierungslösung den frisch zubereiteten Antikörper zugeben und über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Der vorherige Schritt kann eine Verflüssigung der Basalmembran hervorrufen. Bevor Sie mit dem Experiment fortfahren, warten Sie, bis der Objektträger Raumtemperatur erreicht hat. Die primäre Antikörperlösung vorsichtig pipetten und dreimal mit 400 μL ZF-Puffer waschen.
- Während der letzten Wäsche mit IF-Puffer wird eine 1:200-Verdünnung des fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers (siehe Materialtabelle) in der primären Blockierungslösung hergestellt. Inkubieren Sie die Objektträger in der sekundären Antikörperlösung für 40-60 min bei Raumtemperatur.
- Spülen Sie die Objektträger mit 400 μL ZF-Puffer für 20 min, gefolgt von zwei Waschgängen mit PBS für jeweils 10 min.
- Die Kerne mit PBS, das 0,5 ng/ml Kernfärbung enthält (siehe Materialtabelle), 5-6 min bei Raumtemperatur gegenfärben. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 400 μL PBS, um überschüssigen Fleck zu entfernen.
- Pipette vorsichtig das gesamte PBS heraus und stelle sicher, dass die Restlösung entfernt wird. Fügen Sie einen Tropfen Montagereagenz (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und lassen Sie sie über Nacht bei Raumtemperatur stehen.
- Lagern Sie die Dias bei Raumtemperatur und machen Sie so schnell wie möglich ein Bild von den Dias.
- Aufnahme unter 40- oder 63-facher Vergrößerung auf einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) mit optischen Z-Schnitten von 0,6 mm Schrittweite (NA = 1,4).
- Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Bildbearbeitungssoftware (siehe Materialtabelle). Demonstrieren Sie die morphologischen Unterschiede anhand von 3D-Projektionen.
HINWEIS: Der mittlere optische Z-Schnitt kann am besten verwendet werden, um Unterschiede in der Lokalisierung von Polaritätsmarkern zu zeigen. Diese können manuell quantifiziert werden, um den Prozentsatz der Sphäroide darzustellen, die dieses spezifische Färbemuster aufweisen. - Um Unterschiede in der Expression von Proteinen zu veranschaulichen, führen Sie eine semiquantitative Analyse durch, die den mittleren Grauwert misst oder die korrigierte Gesamtzellfluoreszenz (CTCF) berechnet23. Stellen Sie die Daten als Violin- oder Punktdiagramme dar.
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Representative Results
MCF10A-Zellen bilden nach Exposition gegenüber PAF-Behandlung Azinusstrukturen mit sehr unterschiedlichen Phänotypen. Es wurde festgestellt, dass α6-Integrin mit apikaler Färbung fehllokalisiert war. Einige Acini zeigten auch diskontinuierliche Färbungen (Abbildung 2A). Beide Phänotypen weisen auf den Verlust der basalen Polarität hin, wie aus der Literatur24,25 hervorgeht. Frühere Berichte weisen auf die umstrittene Rolle von α6-Integrin bei Krebsmetastasen hin. α6-Integrin liegt als Dimer mit β1- oder β4-Integrin vor. Es wurde festgestellt, dass die α6β4-Untereinheit eine bedeutende Rolle bei der Bildung von Hemidesmosomen in Epithelzellenspielt 26. Die Herunterregulierung dieses Integrins wurde in der Prostata und einigen Fällen von Brustkrebs gefunden, wobei der Verlust von α6β4-Integrin beim duktalen Karzinom der Brust (Grad III) gefunden wurde. Der Verlustphänotyp wird in den Zellen beobachtet, die in das Parenchym und die Pleurahöhle metastasieren27,28,29. GM130 ist ein cis-Golgi-lokalisiertes Protein; Golgi-Körper sind apikal in MCF10A-Azinuskulturenlokalisiert 16,30. Die PAF-Behandlung führte zur Fehllokalisierung von GM130, was auf eine Störung der apikalen Polarität hindeutet (Abbildung 2B). Vimentin ist ein intermediäres Filament, das an der Zellmigration beteiligt ist; es wird hochreguliert, wenn Epithelzellen einen epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) durchlaufen31. Die PAF-Behandlung von MCF10A-Azinuskulturen führte zu erhöhten Vimentinspiegeln, wie durch die Färbeintensität beobachtet (Abbildung 2C), was auf EMT hindeutet.
Abbildung 2: PAF stört die Polarität und induziert EMT-ähnliche Veränderungen in MCF10A Brustacini. MCF10A-Zellen wurden als 3D-"on top"-Kulturen in lrECM gezüchtet. Die Kulturen wurden an Tag 0, 4, 8, 12 und 16 mit PAF behandelt. Die Kulturen wurden 20 Tage lang gehalten und dann auf α6-Integrin (grün) und Kernfärbung (blau) (A), (B) GM130 (grün), einen Marker für apikale Polarität, und (C) Vimentin (rot), einen EMT-Marker, immungefärbt. Der mittlere Stapel der jeweiligen Acini wurde gezeigt. Die repräsentativen Daten beziehen sich auf 40-50 Acini aus drei biologisch unabhängigen Experimenten. Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Etablierte Zelllinien-basierte Modelle werden häufig verwendet, um den Prozess der Karzinogenese zu untersuchen. Monoschichtkulturen von Zellen liefern weiterhin Einblicke in die verschiedenen molekularen Signalwege, die charakteristische Veränderungen in Krebszellen vermitteln32. Studien zur Rolle bekannter Onkogene wie Ras, Myc und mutiertem p53 wurden erstmals unter Verwendung von Monoschichtkulturen als Modellsystem33,34,35,36 berichtet. Dem 2D-Kulturmodell fehlen jedoch viele wichtige strukturelle und funktionelle Parameter, die in vivo vorhanden sind. Wirkstoff-Screening-Studien in 2D-Kulturen zeigen oft eine signifikante Reaktion (Zelltod oder Zielhemmung), selbst bei niedrigeren Konzentrationen, während sie bei Mäusen keine signifikante Wirkung zeigen37. Ein Hauptgrund dafür ist die unterschiedliche Verfügbarkeit und Aufnahme von Medikamenten in einer 2D-Monoschichtkultur vs. 3D-Kultur38.
Das Konzept der 3D-Kulturen hat sich in den letzten zehn Jahren zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Untersuchung des Fortschreitens von Krebs entwickelt. Bei 3D-Kulturen wachsen Zellen auf einer extrazellulären Matrix, was zur Bildung von Strukturen führt, die funktionellen Einheiten ähneln, die im Gewebe in vivo vorhanden sind 16. 3D-Kulturen ahmen die in vivo Mikroumgebung weitgehend nach und überwinden so die Einschränkungen von 2D-Kulturen39. Da die in 3D gezüchteten Zellen menschlichen Ursprungs sind und das System für die Untersuchung früher Ereignisse besser geeignet ist, ist es einfacher und eleganter als die Nagetiermodelle.
Mit dieser Plattform wird ein Modell zur Untersuchung des Transformationsprozesses nach Exposition gegenüber einem Phospholipidmediator wie PAF demonstriert. Studien aus unserem Labor haben gezeigt, dass die PAF-Behandlung die nicht-tumorigene Brustepithelzelllinie MCF10A12 transformieren kann. Diese Methode ist optimiert, um die Zellen kontinuierlich PAF auszusetzen, ähnlich dem In-vivo-Szenario , in dem PAF in der Mikroumgebung vorhanden ist.
MCF10A-Zellen, wenn sie in 2D gezüchtet werden, müssen alle 4 Tage durchlaufen werden. Wenn sie nicht gemäß dem Protokoll gepflegt werden, verhalten sie sich sehr unterschiedlich, was nur sichtbar ist, wenn sie auf ECM16 angebaut werden. Die Durchgangszahl der Zellen muss so gering wie möglich gehalten werden. Diese Methode hat auch Einschränkungen aufgrund der Variation der Proteinkonzentration in verschiedenen Chargen von lrECM. Dies kann überwunden werden, indem die verschiedenen Chargen getestet werden, indem einfach Zellen auf einem lrECM-Bett plattiert und die Größenverteilung der Acini beobachtet wird. Wenn es keine große Variabilität in der Größe gibt, kann der lrECM-Batch als für Experimente geeignet angesehen werden.
Die Beurteilung der Transformation erfolgt in der Regel durch Immunfluoreszenz, was im Video demonstriert wird. Bei der Durchführung der Immunfluoreszenz sind die Schritte der Inkubation bei 4 °C kritisch; Das Auspipettieren der Lösung, wenn sich die lrECM-Schicht in flüssigem Zustand befindet, macht die Schicht uneben, was zu einem Verlust von Azinusstrukturen führt. Eine Möglichkeit, das Problem der Unebenheiten zu lösen, besteht darin, die Dias über Nacht bei 4 °C auf einer ebenen Plattform zu speichern oder die Vergrößerung zu ändern, bei der die Bildgebung erfolgt. Um ein Auspipettieren der Azinusstrukturen zu vermeiden, entfernen Sie die Kammer vorsichtig aus dem 4 °C-Lager, entfernen Sie drei Viertel des zunächst hinzugefügten Volumens, um den Rest bei den anschließenden Wäschen herauszunehmen.
Ein weiteres großes Problem ist der hohe Hintergrund durch lrECM. Um dieses Problem zu überwinden, kann man einen 2% sekundären blockierenden Antikörper anstelle von 1% verwenden. Eine zunehmende sekundäre Blockierung dient jedoch nicht dazu, apikale Marker und E-Cadherin zu färben. In solchen Fällen ist es ratsam, das Kammerdeckglas nach Tag 20 für 15 min bei 4 °C PBS-EDTA auszusetzen und dann die Acini nach dem gleichen Protokoll wie im Video zu fixieren. PBS-EDTA löst das lrECM teilweise auf und reduziert so den Hintergrund. Wenn jedoch die Inkubationszeit überschritten wird, kann diese Behandlung zu einem Strukturverlust beim Auspipettieren der Lösung führen. Daher ist bei der Durchführung dieses Verfahrens äußerste Sorgfalt geboten. Es wurde auch beobachtet, dass das Speichern der Dias über längere Zeiträume zu einer Erhöhung des Hintergrundsignals führen kann. Daher muss die Bildgebung so schnell wie möglich erfolgen. Es ist ratsam, mindestens 15 Acini pro Experiment abzubilden, um eine Veränderung des Phänotyps zu bestimmen.
3D-Azinuskulturen haben bestimmte Einschränkungen, wie z.B. Schwierigkeiten bei der Verfolgung einzelner Zellen während der Bildgebung lebender Zellen. Bestimmte Studien, wie z. B. Auswirkungen auf den Zellzyklus, müssen mit Lebendzellbildgebung durchgeführt werden, um räumliche und zeitliche Informationen zu erhalten. Aufgrund ständiger Strukturänderungen ist es jedoch schwierig, solche Parameter in 3D-Azinuskulturen mit regulären konfokalen Mikroskopen zu verfolgen. Dies rechtfertigt den Einsatz fortschrittlicher mikroskopischer Techniken wie Super-Resolution-Mikroskopie oder Airyscan-Mikroskopie. Es würde auch die Entfernung der acinaren Strukturen für bestimmte Transformationsassays wie Wundheilung, verankertes Wachstum und In-vivo-Tumorigenitätstests erfordern. Diese Verdrängung würde zum Verlust wichtiger räumlicher und zeitlicher Informationen führen. Proteinlysate, die aus den Kulturen gesammelt werden, werden aufgrund des Vorhandenseins von IrECM oft verdünnt, was Probleme mit der Beladung einer ausreichenden Menge an Lysaten aufwirft. Dies kann jedoch in größerem Maße überwunden werden, indem die Acini-Strukturen entfernt und vor der Lyse gesammelt werden.
Hier wurde ein Modellsystem gezeigt, um die Phospholipid-Mediator/immunassoziierte faktorinduzierte Transformation zu untersuchen. Dieses Modell kann genetische und/oder epigenetische Signalwege aufklären, die dereguliert werden können, was zu drastischen Veränderungen in der Morphologie führt. Diese Methode kann auch verwendet werden, um potenzielle Therapeutika zu screenen. Solche Drogenscreening-Studien werden einen besseren Erfolg bringen als Screenings, die in 2D-Kulturen durchgeführt werden38. Ein wesentliches Highlight dieser Methode ist die Anpassungsfähigkeit gemäß den Anforderungen der Studie. Das Behandlungsschema und die Analysemethoden können bei Bedarf angepasst werden. Darüber hinaus kann diese Methode Einblicke in die molekulare Signalgebung geben, die bei der Behandlung40 betroffen ist. Die Technik wird auch helfen, das mögliche Auftreten von Arzneimittelresistenzen vorherzusagen. Darüber hinaus wird es auch dazu beitragen, den Mechanismus der Arzneimittelresistenz aufzuklären und plausible Ziele für deren Überwindung zu identifizieren. Studien haben Möglichkeiten der Co-Kultivierung mehrerer Zelltypen in 3D aufgezeigt, die weiter modifiziert werden können, um das Behandlungsschemaanzupassen 41. Solche Möglichkeiten werden einen besseren Einblick in die Eigenschaften und molekularen Veränderungen geben, die in vivo während der Initiierung und des Fortschreitens von Brustkrebs auftreten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine potenziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken der IISER Pune Microscopy Facility für den Zugang zu Ausrüstung und Infrastruktur und die Unterstützung der Experimente. Diese Studie wurde durch einen Zuschuss des Department of Biotechnology (DBT), der indischen Regierung (BT / PR8699 / MED / 30 / 1018 / 2013), des Science and Engineering Research Board (SERB), der indischen Regierung (EMR / 2016 / 001974) und teilweise durch IISER, Pune Core-Finanzierung unterstützt. A. K. wurde durch das CSIR-SRF-Stipendium finanziert, L.A. wurde durch das DST-INSPIRE-Stipendium finanziert, V.C. wurde durch DBT finanziert (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
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