Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הקמתן של תרביות תלת-ממדיות 'על גבי' של קו תאי אפיתל שד ללא טרנספורמציה, MCF10A, ששונה כדי לחקור טרנספורמציה המושרה על-ידי גורם מפעיל טסיות (PAF). אימונו-פלואורסצנציה שימשה להערכת השינוי ונדונה בפירוט.
Abstract
מספר מודלים פותחו כדי לחקור סרטן, כגון מודלים של מכרסמים וקווי תאים מבוססים. תובנות חשובות על קרצינוגנזה סופקו על ידי מחקרים המשתמשים במודלים אלה. קווי תאים סיפקו הבנה של דה-רגולציה של איתותים מולקולריים הקשורים לגידולי שד, בעוד שמודלים של מכרסמים נמצאים בשימוש נרחב לחקר מאפיינים תאיים ומולקולריים של סרטן השד in vivo. הקמת תרביות תלת-ממד של אפיתל השד ותאים סרטניים מסייעת לגשר על הפער בין מודלים in vivo ו- in vitro על ידי חיקוי תנאי in vivo במבחנה. ניתן להשתמש במודל זה כדי להבין את הדה-רגולציה של אירועי איתות מולקולריים מורכבים ואת המאפיינים התאיים במהלך סרטן השד. כאן, מערכת תרבית תלת-ממדית משתנה כדי לחקור טרנספורמציה המושרה על-ידי מתווך פוספוליפידים (גורם מפעיל טסיות, PAF). אימונומודולטורים ומולקולות מופרשות אחרות ממלאים תפקיד מרכזי בייזום הגידול ובהתקדמותו בשד. במחקר הנוכחי, תרביות אצינאר תלת-ממדיות של תאי אפיתל בשד נחשפות למאפייני טרנספורמציה של PAF כגון אובדן קוטביות ושינויים בתכונות התאים. מערכת תרבית תלת-ממדית זו תסייע לשפוך אור על הפרעות גנטיות ו/או אפיגנטיות המושרות על-ידי ישויות שונות של מולקולות קטנות במיקרו-סביבה של הגידול. בנוסף, מערכת זו תספק גם פלטפורמה לזיהוי גנים חדשים וידועים שעשויים להיות מעורבים בתהליך הטרנספורמציה.
Introduction
מספר עצום של מודלים זמינים כדי לחקור את התקדמות הסרטן, כל אחד מהם להיות ייחודי ומייצג תת סוג של מחלה מורכבת זו. כל מודל מספק תובנות ייחודיות ובעלות ערך על הביולוגיה של הסרטן ושיפר את האמצעים לחקות את מצב המחלה בפועל. קווי תאים מבוססים שגודלו כחד-שכבתיים סיפקו תובנות חשובות על תהליכים חיוניים במבחנה, כגון התפשטות, פולשות, נדידה ואפופטוזיס1. אף על פי שתרבית תאים דו-ממדית (2D) היא הכלי המסורתי לחקור את התגובה של תאי יונקים למספר הפרעות סביבתיות, אקסטרפולציה של ממצאים אלה כדי לחזות תגובות ברמת הרקמה אינה נראית משכנעת מספיק. המגבלה העיקרית של התרביות הדו-ממדיות היא שהמיקרו-סביבה שנוצרת שונה במידה רבה מזו של רקמת השד עצמה2. תרבית דו-ממדית חסרה את האינטראקציה של התאים עם המטריצה החוץ-תאית, החיונית לצמיחה של כל רקמה. כמו כן, כוחות מתיחה שחווה התא בתרביות חד-שכבתיות מעכבים את הקוטביות של תאים אלה, ובכך משנים את האיתות וההתנהגות של התא 3,4,5. מערכות תרבית תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) פתחו אפיק חדש בתחום חקר הסרטן עם יכולתן לחקות את תנאי ה-in vivo במבחנה. רמזים מיקרו-סביבתיים חיוניים רבים שאבדו בתרבית תאים דו-ממדית יכולים להתבסס מחדש באמצעות תרביות תלת-ממדיות של מטריצה חוץ-תאית עשירה בלמינין (lrECM)6.
מחקרים שונים זיהו את החשיבות של מיקרו-סביבה של הגידול בסרטן 7,8. גורמים הקשורים לדלקת הם חלק מרכזי מהמיקרו-סביבה. גורם מפעיל טסיות (PAF) הוא מתווך פוספוליפידים המופרש על ידי תאי חיסון שונים המתווך תגובות חיסוניות מרובות 9,10. רמות גבוהות של PAF מופרשות על ידי קווי תאים שונים של סרטן השד וקשורות לשגשוג מוגבר11. מחקרים מהמעבדה שלנו הראו כי נוכחות ממושכת של PAF בתרביות אצנר מובילה לשינוי של תאי אפיתל השד12. PAF מפעיל את קולטן ה-PAF (PAFR), ומפעיל את ציר האיתות PI3K/Akt13. דווח כי PAFR קשור גם ל-EMT, פלישה וגרורות14.
הפרוטוקול הנוכחי מדגים מערכת מודל לחקר טרנספורמציה המושרה על ידי PAF, תוך שימוש בתרביות תלת-ממדיות של תאי אפיתל השד, כפי שתואר בעבר על ידי Chakravarty et al.12. תאי אפיתל השד הגדלים על המטריצה החוץ-תאית (תרביות תלת-ממדיות) נוטים ליצור ספרואידים מקוטבים שנעצרו על-ידי צמיחה. אלה נקראים acini ודומים מאוד acini של רקמת השד, היחידה הפונקציונלית הקטנה ביותר של בלוטת החלב, in vivo15. הספרואידים האלה (איור 1A,B) מורכבים ממונו-שכבה של תאי אפיתל מקוטבים צפופים שמקיפים לומן חלול ומחוברים לקרום המרתף (איור 1C). תהליך זה של מורפוגנזה תואר היטב בספרות16. כאשר הם נזרעים על lrECM, התאים עוברים חלוקה והתמיינות כדי ליצור אשכול תאים, אשר לאחר מכן מקטבים מיום 4 ואילך. עד יום 8, האצ'יני מורכב מקבוצה של תאים מקוטבים הנמצאים במגע ישיר עם המטריצה החוץ-תאית וצביר של תאים לא מקוטבים הסגורים בתוך התאים המקוטבים החיצוניים, ללא מגע עם המטריצה. ידוע כי תאים לא מקוטבים אלה עוברים אפופטוזיס עד יום 12 של התרבית, ויוצרים לומן חלול. עד יום 16, מבנים שנעצרו על ידי צמיחה נוצרים16.
איור 1: גרעינים של תאים באצ'יני המוכתמים בכתם גרעיני . (A) בנייה תלת-ממדית של האצ'יני. (B) תמונת ניגודיות פאזה של MCF10A acini שגדלה על Matrigel במשך 20 יום. (C) החלק המרכזי ביותר מראה נוכחות של לומן חלול. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
שלא כמו תרביות דו-ממדיות, תרביות אצ'ינאר מסייעות להבחין בין תאים נורמליים לתאים שעברו טרנספורמציה באמצעות שינויים מורפולוגיים לכאורה. תאי אפיתל שד שאינם מותמרים יוצרים acini עם לומן חלול, המחקה את אציני השד האנושי הרגיל. ספרואידים אלה, עם הטרנספורמציה, מראים מורפולוגיה משובשת המאופיינת באובדן גדול של קוטביות (אחד מסימני ההיכר של סרטן), היעדר לומן, או שיבוש של לומן חלול (עקב התחמקות מאפופטוזיס) שעלול להיגרם עקב הסרת רגולציה של גנים שונים17,18,19,20 . ניתן לחקור טרנספורמציות אלה באמצעות טכניקות נפוצות כגון אימונופלואורסצנציה. לפיכך, מודל תרבית התאים התלת-ממדית יכול לתפקד כשיטה פשוטה לחקור את התהליך של מורפוגנזה של אצנר השד וסרטן השד. הקמת מערכת תרבית תלת-ממדית להבנת ההשפעה של מתווך פוספוליפידים, PAF, תסייע בבדיקת תרופות פרה-קלינית בתפוקה גבוהה.
עבודה זו התאימה את פרוטוקול התרבות התלת-ממדית 'על גבי' 16,21 לחקר טרנספורמציה המושרה על ידי PAF 22. השינויים הפנוטיפיים הנגרמים על ידי חשיפה של האציני למתווך הפוספוליפידים נחקרו באמצעות אימונופלואורסצנציה. במחקר נעשה שימוש בסמני קוטביות ואפיתל שונים למעבר מזנכימלי (EMT). טבלה 1 מזכירה את הלוקליזציה הרגילה שלהם ואת הפנוטיפ הצפוי שלהם בעת הטרנספורמציה.
| נוגדנים | סימני | לוקליזציה רגילה | פנוטיפ מותמר |
| α6-אינטגרין | בזולטרלי | בזל עם כתם רוחבי חלש | כתם רוחבי / אפיקלי חזק |
| β-קטנין | צומת תא-תא | בזולטרלי | לוקליזציה חריגה / גרעינית או ציטופלסמית |
| וימנטין | EMT | נוכחות נעדרת / חלשה | אפ-רגולציה |
טבלה 1: סמנים ששימשו במחקר. סמנים שונים המשמשים עם לוקליזציה שלהם בנוכחות והיעדר טיפול PAF.
ניתן להשתמש בשיטה זו בצורה הטובה ביותר כדי לחקור/לסנן תרופות סבירות ולמקד גנים עבור תתי-סוגים שונים של סרטן השד. זה יכול לספק נתוני תגובה לתרופות קרוב יותר לתרחיש in vivo , ולסייע בפיתוח תרופות מהיר ואמין יותר. כמו כן, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לחקור את האיתות המולקולרי הקשור לתגובה לתרופות ולעמידות לתרופות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. זריעת תאי MCF10A ב-lrECM
- לשמור על תאי MCF10A (תאי אפיתל שד דבק) במדיום הצמיחה. מעבירים את התאים כל 4 ימים.
הערה: הרכב הצמיחה בינוני: DMEM גבוה ללא נתרן פירובט המכיל סרום סוסים (5%), אינסולין (10 מיקרוגרם למ"ל), הידרוקורטיזון (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), גורם גדילה אפידרמלי, EGF (20 ננוגרם/מ"ל), רעלן כולרה (100 ננוגרם/מ"ל) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל) (ראו טבלת חומרים). - הפשרה lrECM (ראו טבלת חומרים) על קרח 20 דקות לפני תחילת הניסוי. יום זריעת התאים נחשב בדרך כלל ליום 0.
- עבור טריפסינזציה של התאים, לשאוף את המדיום, ולשטוף עם 2 מ"ל של PBS. יש להוסיף 900 μL של 0.05% טריפסין-EDTA ולדגור ב 37 °C במשך ~ 15 דקות או עד התאים הם טריפסינזציה לחלוטין.
- הכינו מצע של lrECM בשמונה בארות של שקופית זכוכית עם כיסוי קאמרית (ראו טבלת חומרים).
- כאשר התאים עוברים טריפסיניזציה, מצפים כל באר עם 60 μL של lrECM ומניחים אותו באינקובטור 37 °C CO2 למשך 15 דקות לכל היותר.
- הכן את השעיית התא לפי השלבים הבאים.
- לאחר פירוק מלא של תאים, להוסיף 5 מ"ל של מדיום השעיה מחדש כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולסובב את התאים ב 112 x g במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
הערה: הרכב של מתלה מחדש בינוני: DMEM גלוקוז גבוה ללא נתרן פירובט, בתוספת סרום סוסים (20%) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות למ"ל). - לשאוף את המדיום בילה ולהשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של מדיום בדיקה. מערבבים היטב את המתלים כדי להבטיח היווצרות של השעיה של תא בודד.
הערה: הרכב הבדיקה בינונית: DMEM גבוה ללא נתרן פירובט, בתוספת סרום סוסים (2%), הידרוקורטיזון (0.5 מיקרוגרם/מ"ל), רעלן כולרה (100 ננוגרם/מ"ל), אינסולין (10 מיקרוגרם/מ"ל) ופניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות/מ"ל). - לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולחשב את נפח תרחיף התא הדרוש כדי לזרוע 6 x 103 תאים בכל באר.
הערה: בדרך כלל עדיף לכלול באר אחת נוספת בחישוב כדי להסביר שגיאות צנרת. - על פי מספר הבארות הנדרשות, לדלל את השעיית התא במדיום כיסוי.
הערה: הרכב בינוני כיסוי עבור באר יחידה הוא כדלקמן: 400 μL של מדיום בדיקה, 8 μL של lrECM (2% סופי), ו 0.02 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של EGF (5 ng / mL סופי).
- לאחר פירוק מלא של תאים, להוסיף 5 מ"ל של מדיום השעיה מחדש כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולסובב את התאים ב 112 x g במשך 10 דקות ב 25 מעלות צלזיוס.
- בצע זריעה של התאים.
- הוסף 400 μL של מתלה התא המדולל למיטות lrECM המוכנות (שלב 1.4), תוך הקפדה קפדנית שלא להפריע למיטת lrECM. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה 5% CO2 .
2. טיפול PAF
- הוסף PAF 3 שעות לאחר זריעת תאים. הכן מלאי של 100 μM של PAF ב- PBS והוסף את הנפח הנדרש של 0.2 μL בכל באר (המתאימה ל -200 ננומטר).
- הוסף את אותו ריכוז של PAF במהלך כל שינוי מדיה.
3. האכלה מחדש עם מדיה טרייה
- יש לחדש את התאים במדיום טרי כל 4 ימים (כלומר, יום 4, יום 8, יום 12 ויום 16).
4. מחקר אימונופלואורסצנציה לזיהוי שינויים פנוטיפיים הנגרמים על ידי חשיפה ממושכת ל-PAF
- לאחר 20 יום של תרבות, בזהירות pipette החוצה את המדיום מכל באר ולשטוף את הבארות עם 400 μL של PBS מחומם מראש.
- תקן את מבני האצינר על ידי הוספת 400 μL של 4% paraformaldehyde (מוכן טרי על ידי דילול 16% paraformaldehyde ב 1x PBS) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- שוטפים את הבארות פעם אחת עם PBS קר כקרח ומחלחלים עם PBS המכיל 0.5% טריטון X-100 למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר 10 דקות, מיד אך בזהירות הוציאו את תמיסת Triton-X 100 ושטפו עם 400 מיקרו-ליטר של PBS-גליצין (מוכן טרי על ידי הוספת קמצוץ גליצין ב-PBS אחד). זה חוזר על עצמו שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
- יש להוסיף 400 μL מתמיסת החסימה העיקרית הכוללת 10% סרום עיזים (ראו טבלת חומרים) במאגר אימונופלואורסצנטי (IF) ולדגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
הערה: הרכב מאגר IF: 0.05% נתרן אזיד, 0.1% BSA, 0.2% טריטון-X 100 ו-0.05% טווין (20 ב-1 PBS). - הסר את תמיסת החסימה העיקרית, הוסף 200 μL של נוגדן חוסם משני 2% (F(ab')2 שבר של נוגדן שגדל באנטיגן עז נגד עכבר, ראה טבלת חומרים) שהוכנה בתמיסת חסימה ראשונית, והשאר אותה למשך 45-60 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכן את הנוגדן העיקרי (ראה טבלת חומרים) בתמיסת נוגדנים חוסמת משנית של 2% בדילול של 1:100. לאחר הסרת תמיסת החסימה המשנית, מוסיפים את הנוגדן הטרי והדגימה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- השלב הקודם עשוי לעורר הנזלה של קרום המרתף. לפני שתמשיך בניסוי, המתן עד שהשקופית תגיע לטמפרטורת החדר. בזהירות pipette את תמיסת הנוגדנים העיקרית ולשטוף אותו שלוש פעמים עם 400 μL של חיץ IF.
- במהלך השטיפה האחרונה עם חיץ IF, הכינו דילול של 1:200 של הנוגדן המשני המצומד לפלואורופור (ראו טבלת חומרים) בתמיסת החסימה הראשונית. דגרו את השקופיות בתמיסת הנוגדנים המשנית למשך 40-60 דקות בטמפרטורת החדר.
- שטפו את השקופיות עם 400 μL של חיץ IF למשך 20 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות עם PBS למשך 10 דקות כל אחת.
- הכתימו את הגרעינים ב-PBS המכיל 0.5 ננוגרם/מ"ל של כתם גרעיני (ראו טבלת חומרים) למשך 5-6 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם 400 מיקרון ויטר PBS כדי להסיר כתמים עודפים.
- בזהירות pipette החוצה את כל PBS ולהבטיח הסרת הפתרון שיורי. הוסיפו טיפה אחת של מגיב הרכבה (ראו טבלת חומרים) לכל באר ואפשרו לה לעמוד בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
- אחסן את השקופיות בטמפרטורת החדר וצלם את השקופיות בהקדם האפשרי.
- תמונה בהגדלה של 40x או 63x במיקרוסקופ קונפוקלי (ראו טבלת חומרים), תוך צילום מקטעי Z אופטיים בגודל צעד של 0.6 מ"מ (NA = 1.4).
- פתח את התמונות שנרכשו באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים). הדגם את ההבדלים המורפולוגיים באמצעות תחזיות תלת-ממדיות.
הערה: ניתן להשתמש בצורה הטובה ביותר במקטע Z האופטי המרכזי ביותר כדי להראות הבדלים בלוקליזציה של סמני קוטביות. ניתן לכמת אותם באופן ידני כדי לייצג את אחוז הספרואידים המראים את דפוס הכתמים הספציפי הזה. - כדי להמחיש הבדלים בביטוי של חלבונים, בצע ניתוח כמותי למחצה המודד את הערך האפור הממוצע או חישוב פלואורסצנציה של תאים כוללים מתוקנים (CTCF)23. מייצגים את הנתונים ככינור או כתחילי נקודות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי MCF10A, עם החשיפה לטיפול ב-PAF, יוצרים מבנים אסינאריים עם פנוטיפים מובחנים מאוד. α6-integrin נמצא בטעות עם כתמים אפיקליים יותר. כמה אצ'יני גם הראו כתמים בלתי פוסקים (איור 2A). שני הפנוטיפים הללו מצביעים על אובדן הקוטביות הבסיסית, כפי שמעידה ספרות24,25. דיווחים מוקדמים יותר מצביעים על התפקיד השנוי במחלוקת של α6-integrin בגרורות סרטניות. α6-integrin קיים כדימר עם β1- או β4-integrin. תת-היחידה α6β4 נמצאה כממלאת תפקיד משמעותי ביצירת המידסמוזומים בתאי אפיתל26. הירידה בוויסות של אינטגרין זה נמצאה בערמונית ובמקרים מסוימים של סרטן השד, כאשר אובדן של α6β4-integrin נמצא בקרצינומה דוקטלית של השד (דרגה III). פנוטיפ האובדן נראה בתאים השולחים גרורות לפרנכימה ולחלל הצדר27,28,29. GM130 הוא חלבון מקומי של ציס-גולג'י; גופי גולג'י ממוקמים באופן אפי בתרביות ACINAR MCF10A16,30. טיפול ב-PAF הוביל למיסלוקליזציה של GM130, מה שמרמז על שיבוש קוטביות אפית (איור 2B). וימנטין הוא נימה בינונית המעורבת בנדידת תאים; הוא מווסת כאשר תאי אפיתל עוברים מעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT)31. טיפול PAF בתרביות אצנר MCF10A הוביל לרמות גבוהות של וימנטין כפי שנצפו על-ידי עוצמת הכתמים (איור 2C), מה שמרמז על EMT.
איור 2: PAF משבש את הקוטביות וגורם לשינויים דמויי EMT באצ'יני השד MCF10A. תאי MCF10A גודלו כתרביות תלת-ממדיות 'על גבי' ב-lrECM. התרביות טופלו ב-PAF ביום 0, 4, 8, 12 ו-16. התרביות נשמרו במשך 20 יום ולאחר מכן הוכתמו עבור α6-integrin (ירוק) וכתם גרעיני (כחול) (A), (B) GM130 (ירוק), סמן לקוטביות אפית, ו-(C) Vimentin (אדום), סמן EMT. הערימה המרכזית ביותר של האצ'יני בהתאמה הוצגה. הנתונים המייצגים הם עבור 40-50 acini משלושה ניסויים בלתי תלויים ביולוגית. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודלים מבוססים המבוססים על קווי תאים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את תהליך הסרטן. תרביות חד-שכבתיות של תאים ממשיכות לספק תובנות על מסלולי האיתות המולקולריים השונים המתווכים שינויים אופייניים בתאים סרטניים32. מחקרים על תפקידם של אונקוגנים ידועים כגון Ras, Myc ו-p53 שעברו מוטציה דווחו לראשונה באמצעות תרביות חד-שכבתיות כמערכת המודל 33,34,35,36. עם זאת, מודל התרבות הדו-ממדית חסר הרבה פרמטרים מבניים ופונקציונליים חשובים הקיימים ב- in vivo. מחקרי סינון תרופות בתרביות דו-ממדיות מראים לעתים קרובות תגובה משמעותית (מוות תאי או עיכוב מטרה), אפילו בריכוזים נמוכים יותר, בעוד שאינם מראים השפעה משמעותית כאשר הם מופיעים בעכברים37. סיבה מרכזית לכך היא הזמינות והקליטה השונות של תרופות בתרבית חד-ממדית לעומת תרבות תלת מימד38.
הרעיון של תרבויות תלת-ממד התגלה ככלי רב עוצמה לחקר התקדמות הסרטן בעשור האחרון. תרביות תלת-ממדיות מערבות גידול תאים על מטריצה חוץ-תאית, וכתוצאה מכך נוצרים מבנים הדומים ליחידות פונקציונליות הנמצאות ברקמה in vivo16. תרביות תלת-ממד מחקות במידה רבה את המיקרו-סביבה in vivo ובכך מתגברות על המגבלות של תרביות דו-ממד39. יתר על כן, מכיוון שהתאים הגדלים בתלת-ממד הם ממקור אנושי והמערכת נוחה יותר לחקר אירועים מוקדמים, היא פשוטה ואלגנטית יותר ממודלים של מכרסמים.
באמצעות פלטפורמה זו מודגם מודל לחקר תהליך הטרנספורמציה בעקבות חשיפה למתווך פוספוליפידים כגון PAF. מחקרים מהמעבדה שלנו זיהו כי טיפול PAF יכול לשנות את קו תאי אפיתל השד שאינם סרטניים, MCF10A12. שיטה זו ממוטבת כדי לחשוף את התאים באופן רציף ל-PAF, בדומה לתרחיש in vivo , שבו PAF נמצא במיקרו-סביבה.
תאי MCF10A, כאשר הם גדלים בדו-ממד, צריכים לעבור כל 4 ימים. אם הם לא נשמרים לפי הפרוטוקול, הם מתנהגים בצורה שונה מאוד, אשר גלוי רק כאשר גדל על ECM16. יש לשמור על מספר המעבר של התאים נמוך ככל האפשר. לשיטה זו יש גם מגבלות בשל השונות בריכוז החלבון בקבוצות שונות של lrECM. ניתן להתגבר על כך על ידי בדיקת האצוות השונות פשוט על ידי ציפוי תאים על מצע lrECM והתבוננות בהתפלגות הגודל של האצ'יני. אם אין שונות גדולה בגודל, אצווה lrECM יכול להיחשב מתאים לניסויים.
הערכת הטרנספורמציה נעשית בדרך כלל על ידי אימונופלואורסצנציה, המודגמת בסרטון. בעת ביצוע אימונופלואורסצנציה, השלבים הכוללים דגירה ב -4 מעלות צלזיוס הם קריטיים; ניתור התמיסה כאשר שכבת lrECM נמצאת במצב נוזלי הופך את השכבה ללא אחידה, מה שמוביל לאובדן מבנים אצ'ינאריים. אחת הדרכים להתמודד עם בעיית חוסר האחידות היא לאחסן את השקופיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על פלטפורמה אחידה למשך הלילה או לשנות את ההגדלה שבה מתבצעת ההדמיה. כדי להימנע מניקוז החוצה את מבני האסינאר, הסר בזהירות את התא מהאחסון של 4 מעלות צלזיוס והסר שלושה רבעים מהנפח שנוסף בתחילה, ולאחר מכן הוצא את השאר במהלך השטיפות הבאות.
בעיה מרכזית נוספת העומדת בפני היא הרקע הגבוה עקב lrECM. כדי להתגבר על בעיה זו ניתן להשתמש בנוגדן חוסם משני 2% במקום 1%. עם זאת, הגדלת החסימה המשנית אינה משרתת את המטרה של צביעת סמנים אפיקליים ו- E-cadherin. במקרים כאלה, מומלץ להכפיף את זכוכית כיסוי התא לאחר יום 20 ל- PBS-EDTA למשך 15 דקות ב -4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לתקן את האצ'יני בעקבות אותו פרוטוקול כפי שמוצג בסרטון. PBS-EDTA ממיס חלקית את ה-lrECM, ובכך מקטין את הרקע. עם זאת, אם זמן הדגירה הוא חריגה, טיפול זה יכול לגרום לאובדן מבנים תוך כדי pipetting החוצה את התמיסה. לפיכך, יש לנקוט בזהירות מרבית בעת ביצוע הליך זה. כמו כן, נצפה כי אחסון השקופיות לתקופות ארוכות יותר יכול להוביל לעלייה באות הרקע. לכן, הדמיה חייבת להיעשות בהקדם האפשרי. מומלץ לדמות מינימום של 15 acini לכל ניסוי כדי לקבוע שינוי בפנוטיפ.
לתרביות אקסינאר תלת-ממדיות יש מגבלות מסוימות, כגון קושי במעקב אחר תאים בודדים במהלך הדמיית תאים חיים. מחקרים מסוימים, כגון השפעות על מחזור התא, צריכים להתבצע באמצעות הדמיה של תאים חיים כדי לשמור על מידע מרחבי וזמני. עם זאת, בשל שינויים מתמידים במבנה, קשה לעקוב אחר פרמטרים כאלה בתרביות acinar 3D באמצעות מיקרוסקופים confocal רגיל. זה מצדיק שימוש בטכניקות מיקרוסקופיות מתקדמות כגון מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה או מיקרוסקופיה Airyscan. זה גם ידרוש פירוק של מבנים acinar עבור מבחני טרנספורמציה מסוימים כגון ריפוי פצעים, צמיחה עצמאית עוגן, ו in vivo tumorigenicity מבחנים. התנתקות זו תגרום לאובדן מידע מרחבי וזמני חשוב. ליזטים חלבוניים שנאספו מהתרביות מדוללים לעתים קרובות בשל נוכחות של IrECM, מה שמציב בעיות עם העמסה של כמות מספקת של lysates. עם זאת, ניתן להתגבר על כך במידה רבה יותר על ידי פירוק מבני האציני ואיסוף אותם לפני התזה.
כאן, הוכח כי מערכת מודל חוקרת טרנספורמציה של מתווך פוספוליפידים/גורמים הקשורים למערכת החיסון. מודל זה יכול להבהיר מסלולים גנטיים ו/או אפיגנטיים שעלולים לקבל דה-ויסות, מה שיוביל לשינויים דרסטיים במורפולוגיה. שיטה זו יכולה לשמש גם לסינון טיפולים פוטנציאליים. מחקרי סינון תרופות כאלה יספקו הצלחה טובה יותר מאשר הקרנות שבוצעו בתרביות דו-ממדיות38. גולת הכותרת העיקרית של שיטה זו היא ההסתגלות בהתאם לדרישת המחקר. ניתן לשנות את משטר הטיפול ושיטות הניתוח לפי הצורך. יתר על כן, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האיתות המולקולרי המושפע מטיפול40. הטכניקה גם תעזור לחזות את המופע האפשרי של עמידות לסמים. יתר על כן, הוא גם יסייע להבהיר את המנגנון הכרוך בעמידות לתרופות ולזהות מטרות סבירות להתגברות על אותו הדבר. מחקרים קבעו אפשרויות של התרבות משותפת של סוגי תאים מרובים בתלת-ממד, אשר ניתן לשנות עוד יותר כדי להתאים למשטר הטיפול41. הזדמנויות כאלה יספקו תובנות רבות יותר על המאפיינים והשינויים המולקולריים המתרחשים in vivo במהלך ההתחלה וההתקדמות של סרטן השד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים פוטנציאליים.
Acknowledgments
אנו מודים למתקן המיקרוסקופיה IISER פונה על הגישה לציוד ותשתיות ותמיכה בניסויים. מחקר זה נתמך על ידי מענק מהמחלקה לביוטכנולוגיה (DBT), ממשלת הודו (BT/PR8699/MED/30/1018/2013), מועצת המחקר למדע והנדסה (SERB), ממשלת הודו (EMR/2016/001974) ובחלקו על ידי IISER, מימון Pune Core. א. ק. מומן על ידי מלגת CSIR-SRF, לוס אנג'לס מומנה באמצעות מלגת DST-INSPIRE, V.C מומנה על ידי DBT (BT/PR8699/MED/30/1018/2013).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 16% paraformaldehyde | Alfa Aesar | AA433689M | |
| Anti Mouse Alexa Flour 488 | Invitrogen | A11029 | |
| Anti Rabbit Alexa Flour 488 | Invitrogen | A-11008 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Chamber Coverglass | Nunc | 155409 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052-1MG | 1 mg/mL in dH2O |
| Confocal Microscope | Leica | Leica SP8 | |
| DMEM | Gibco | 11965126 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EGF | Sigma | E9644-0.2MG | 100 mg/mL in dH2O |
| F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| GM130 antibody | Abcam | ab52649 | |
| Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| Hoechst | Invitrogen | 33258 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050122 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | 1 mg/mL in ethanol |
| Image Processing Software | ImageJ | ||
| Insulin | Sigma | I1882 | 10 mg/mL stock dH2O |
| lrECM (Matrigel) | Corning | 356231 | |
| Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) | Invitrogen | S36937 | |
| Nuclear Stain (Hoechst) | Invitrogen | 33258 | |
| PAF | Cayman Chemicals | 91575-58-5 | Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Tris Base | Sigma | B9754 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| α6-integrin antibody | Millipore | MAB1378 |
References
- Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
- Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
- Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
- Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
- Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
- Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
- Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
- Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
- Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
- Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
- Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
- Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
- Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
- Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
- Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
- Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
- Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
- Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
- Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
- Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
- Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
- McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
- Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
- Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).
