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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ प्रेरित तीन आयामी संस्कृतियों में परिवर्तन

Published: July 27, 2022 doi: 10.3791/64146
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research, 2Department of Biology, Center for Genomics and Systems Biology, New York University, 3Enveda Therapeutics India Pvt Ltd.

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक गैर-रूपांतरित स्तन उपकला सेल लाइन, एमसीएफ 10 ए की 3 डी 'ऑन टॉप' संस्कृतियों की स्थापना का वर्णन करता है, जिसे प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया गया है। परिवर्तन का आकलन करने के लिए इम्यूनो-प्रतिदीप्ति का उपयोग किया गया है और विस्तार से चर्चा की गई है।

Abstract

कैंसर का अध्ययन करने के लिए कई मॉडल विकसित किए गए हैं, जैसे कृंतक मॉडल और स्थापित सेल लाइनें। इन मॉडलों का उपयोग करके अध्ययन द्वारा कार्सिनोजेनेसिस में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की गई है। सेल लाइनों ने स्तन ट्यूमरजेनेसिस से जुड़े आणविक सिग्नलिंग के विनियमन की समझ प्रदान की है, जबकि कृंतक मॉडल का व्यापक रूप से विवो में स्तन कैंसर की सेलुलर और आणविक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। स्तन उपकला और कैंसर कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों की स्थापना इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करके विवो और इन विट्रो मॉडल के बीच की खाई को पाटने में सहायता करती है। इस मॉडल का उपयोग जटिल आणविक सिग्नलिंग घटनाओं और स्तन कार्सिनोजेनेसिस के दौरान सेलुलर विशेषताओं के विनियमन को समझने के लिए किया जा सकता है। यहां, फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ-प्रेरित (प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर, पीएएफ) परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को संशोधित किया गया है। इम्यूनोमोड्यूलेटर और अन्य स्रावित अणु स्तन में ट्यूमर दीक्षा और प्रगति में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। वर्तमान अध्ययन में, स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी एसिनार संस्कृतियों को पीएएफ के संपर्क में लाया जाता है, जो ध्रुवीयता के नुकसान और परिवर्तित सेलुलर विशेषताओं जैसे परिवर्तन विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं। यह 3 डी संस्कृति प्रणाली ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट में विभिन्न छोटे अणु संस्थाओं द्वारा प्रेरित आनुवंशिक और / या एपिजेनेटिक गड़बड़ी पर प्रकाश डालने में सहायता करेगी। इसके अतिरिक्त, यह प्रणाली उपन्यास के साथ-साथ ज्ञात जीनों की पहचान के लिए एक मंच भी प्रदान करेगी जो परिवर्तन की प्रक्रिया में शामिल हो सकते हैं।

Introduction

कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए असंख्य मॉडल उपलब्ध हैं, उनमें से प्रत्येक अद्वितीय है और इस जटिल बीमारी के उपप्रकार का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक मॉडल कैंसर जीव विज्ञान में अद्वितीय और मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और वास्तविक बीमारी की स्थिति की नकल करने के साधनों में सुधार किया है। मोनोलेयर के रूप में विकसित स्थापित सेल लाइनों ने इन विट्रो में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है, जैसे कि प्रसार, आक्रामकता, प्रवासन और एपोप्टोसिस1. यद्यपि दो आयामी (2 डी) सेल संस्कृति कई पर्यावरणीय गड़बड़ी के लिए स्तनधारी कोशिकाओं की प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए पारंपरिक उपकरण रहा है, ऊतक-स्तरीय प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने के लिए इन निष्कर्षों का एक्सट्रपलेशन पर्याप्त रूप से आश्वस्त नहीं लगता है। 2 डी संस्कृतियों की प्रमुख सीमा यह है कि बनाया गया माइक्रोएन्वायरमेंट स्तन ऊतक से काफी हद तक भिन्न होता है2. 2 डी संस्कृति में बाह्य मैट्रिक्स के साथ कोशिकाओं की बातचीत का अभाव है, जो किसी भी ऊतक के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, मोनोलेयर संस्कृतियों में सेल द्वारा अनुभव की जाने वाली तन्यता बल इन कोशिकाओं की ध्रुवीयता में बाधा डालती हैं, इस प्रकार सेल सिग्नलिंग और व्यवहार 3,4,5 को बदल देती हैं। त्रि-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों ने इन विट्रो में विवो स्थितियों की नकल करने की अपनी क्षमता के साथ कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक नया एवेन्यू खोला है। 2 डी सेल संस्कृति में खो जाने वाले कई महत्वपूर्ण माइक्रोएनवायरनमेंटल संकेतों को लैमिनिन समृद्ध बाह्य मैट्रिक्स (एलआरईसीएम) 6 की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके फिर से स्थापित किया जा सकता है।

विभिन्न अध्ययनों ने कार्सिनोजेनेसिस 7,8 में ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के महत्व की पहचान की है। सूजन से जुड़े कारक माइक्रोएन्वायरमेंट का एक प्रमुख हिस्सा हैं। प्लेटलेट एक्टिवेटिंग फैक्टर (पीएएफ) विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ है जो कई प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 9,10 की मध्यस्थता करता है। पीएएफ के उच्च स्तर विभिन्न स्तन कैंसर सेल लाइनों द्वारा स्रावित होते हैं और बढ़े हुए प्रसार11 से जुड़े होते हैं। हमारी प्रयोगशाला के अध्ययनों से पता चला है कि एसिनार संस्कृतियों में पीएएफ की लंबे समय तक उपस्थिति स्तन उपकला कोशिकाओं के परिवर्तन की ओर ले जाती है12. पीएएफ पीएएफ रिसेप्टर (पीएएफआर) को सक्रिय करता है, पीआई 3 के / एक्ट सिग्नलिंग अक्ष13 को सक्रिय करता है। पीएएफआर को ईएमटी, आक्रमण और मेटास्टेसिस14 से भी जुड़ा होने की सूचना है।

वर्तमान प्रोटोकॉल स्तन उपकला कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों का उपयोग करके पीएएफ-प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली को प्रदर्शित करता है, जैसा कि पहले चक्रवर्ती एट अल द्वारा वर्णित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स (3 डी संस्कृतियों) पर उगाई जाने वाली स्तन उपकला कोशिकाएं ध्रुवीकृत विकास-गिरफ्तार स्फेरॉइड बनाती हैं। इन्हें एसिनी कहा जाता है और विवो15 में स्तन ग्रंथि की सबसे छोटी कार्यात्मक इकाई स्तन ऊतक के एसिनी से मिलता-जुलता है। इन स्फेरॉइड (चित्रा 1 ए, बी) में एक खोखले लुमेन के आसपास बारीकी से पैक ध्रुवीकृत उपकला कोशिकाओं का एक मोनोलेयर होता है और तहखाने झिल्ली (चित्रा 1 सी) से जुड़ा होता है। मॉर्फोजेनेसिस की इस प्रक्रिया को साहित्य16 में अच्छी तरह से वर्णित किया गया है। जब एलआरईसीएम पर वरीयता प्राप्त होती है, तो कोशिकाएं कोशिकाओं का एक समूह बनाने के लिए विभाजन और भेदभाव से गुजरती हैं, जो तब दिन 4 से ध्रुवीकरण करती हैं। दिन 8 तक, एसिनी में ध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है जो बाह्य मैट्रिक्स के सीधे संपर्क में होते हैं और बाहरी ध्रुवीकृत कोशिकाओं के भीतर संलग्न अध्रुवीकृत कोशिकाओं का एक समूह होता है, जिसमें मैट्रिक्स से कोई संपर्क नहीं होता है। इन अध्रुवीकृत कोशिकाओं को संस्कृति के दिन 12 तक एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए जाना जाता है, जिससे एक खोखला लुमेन बनता है। दिन 16 तक, विकास-गिरफ्तार संरचनाएं16 बनती हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एसीनी में कोशिकाओं के नाभिक एक परमाणु दाग के साथ दाग. (ए) एसिनी का 3 डी निर्माण। (बी) 20 दिनों के लिए मैट्रिगेल पर उगाए गए एमसीएफ 10 ए एसिनी की चरण विपरीत छवि। (सी) केंद्र का सबसे महत्वपूर्ण खंड एक खोखले लुमेन की उपस्थिति को दर्शाता है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2 डी संस्कृतियों के विपरीत, एसिनार संस्कृतियां स्पष्ट आकृति विज्ञान परिवर्तनों के माध्यम से सामान्य और परिवर्तित कोशिकाओं को अलग करने में सहायता करती हैं। गैर-रूपांतरित स्तन उपकला कोशिकाएं एक खोखले लुमेन के साथ एसिनी बनाती हैं, जो सामान्य मानव स्तन एसिनी की नकल करती हैं। ये स्फेरॉइड, परिवर्तन पर, ध्रुवीयता (कैंसर की पहचान में से एक), लुमेन की अनुपस्थिति, या खोखले लुमेन के विघटन (एपोप्टोसिस की चोरी के कारण) के एक बड़े नुकसान की विशेषता वाली एक बाधित आकृति विज्ञान दिखाते हैं जो विभिन्न जीनों के विनियमन के कारण प्रेरित हो सकता है 17,18,19,20 . इन परिवर्तनों का अध्ययन आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकों जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया जा सकता है। इस प्रकार, 3 डी सेल संस्कृति मॉडल स्तन एसिनार मॉर्फोजेनेसिस और स्तन कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया की जांच करने के लिए एक सरल विधि के रूप में कार्य कर सकता है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ, पीएएफ के प्रभाव को समझने के लिए एक 3 डी संस्कृति प्रणाली की स्थापना, उच्च थ्रूपुट प्रीक्लिनिकल ड्रग स्क्रीनिंग में सहायता करेगी।

इस काम ने पीएएफ 22 द्वारा प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए 3 डी 'ऑन टॉप' संस्कृति प्रोटोकॉल 16,21 को अनुकूलित किया है। फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ के लिए एसिनी के संपर्क से प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों का अध्ययन इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके किया गया था। अध्ययन में मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) मार्करों12,16 के लिए विभिन्न ध्रुवीयता और उपकला का उपयोग किया गया था। तालिका 1 में परिवर्तन पर उनके सामान्य स्थानीयकरण और उनके अपेक्षित फेनोटाइप का उल्लेख है।

एंटीबॉडी चिह्न सामान्य स्थानीयकरण रूपांतरित फेनोटाइप
α6-एकीकृत बेसोलेटरल कमजोर पार्श्व दाग के साथ बेसल मजबूत पार्श्व / एपिकल दाग
β-कैटेनिन सेल-सेल जंक्शन बेसोलेटरल परमाणु या साइटोप्लाज्मिक स्थानीयकरण
विमेंटिन ईएमटी अनुपस्थित / कमजोर उपस्थिति अप-रेगुलेशन

तालिका 1: अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मार्कर। पीएएफ उपचार की उपस्थिति और अनुपस्थिति में उनके स्थानीयकरण के साथ उपयोग किए जाने वाले विभिन्न मार्कर।

इस पद्धति का उपयोग प्रशंसनीय दवाओं का अध्ययन / स्क्रीन करने और विभिन्न स्तन कैंसर उपप्रकारों के लिए जीन को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। यह विवो परिदृश्य के करीब एक दवा प्रतिक्रिया डेटा प्रदान कर सकता है, जो तेजी से और अधिक विश्वसनीय दवा विकास में सहायता करता है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग दवा प्रतिक्रिया और दवा प्रतिरोध से जुड़े आणविक सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

1. एलआरईसीएम में एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं को बोना

  1. विकास माध्यम में एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं (पक्षपाती स्तन उपकला कोशिकाओं) को बनाए रखें। हर 4 दिनों में कोशिकाओं को पारित करें।
    नोट: विकास माध्यम की संरचना: घोड़े के सीरम (5%), इंसुलिन (10 μg / एमएल), हाइड्रोकार्टिसोन (0.5 μg / एमएल), एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर, ईजीएफ (20 एनजी / एमएल), हैजा विष (100 एनजी / एमएल), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों / एमएल) युक्त सोडियम पाइरूवेट के बिना उच्च ग्लूकोज डीएमईएम ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्रयोग की शुरुआत से 20 मिनट पहले बर्फ पर पिघलना एलआरईसीएम ( सामग्री की तालिका देखें)। कोशिकाओं को बोने का दिन आमतौर पर दिन 0 माना जाता है।
  3. कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करने के लिए, माध्यम को एस्पिरेट करें, और पीबीएस के 2 एमएल के साथ धो लें। 0.05% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 900 μL जोड़ें और ~ 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं या जब तक कोशिकाओं को पूरी तरह से ट्रिप्सिनाइज्ड नहीं किया जाता है।
  4. एक कक्षीय कवर ग्लास स्लाइड के आठ कुओं में एलआरईसीएम का एक बिस्तर तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    1. जब कोशिकाएं ट्रिप्सिनाइजिंग कर रही हैं, तो एलआरईसीएम के 60 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कोट करें और इसे अधिकतम 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
  5. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सेल निलंबन तैयार करें।
    1. कोशिकाओं के पूर्ण विघटन के बाद, ट्रिप्सिन गतिविधि को बुझाने के लिए पुन: निलंबन माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 112 एक्स जी पर कोशिकाओं को स्पिन करें।
      नोट: पुन: निलंबन माध्यम की संरचना: सोडियम पाइरूवेट के बिना उच्च ग्लूकोज डीएमईएम, घोड़े के सीरम (20%) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों /
    2. खर्च मध्यम की आकांक्षा और परख माध्यम के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित। एक एकल सेल निलंबन के गठन को सुनिश्चित करने के लिए निलंबन को अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: परख माध्यम की संरचना: सोडियम पाइरूवेट के बिना उच्च ग्लूकोज डीएमईएम, घोड़े के सीरम (2%), हाइड्रोकार्टिसोन (0.5 μg / एमएल), हैजा विष (100 एनजी / एमएल), इंसुलिन (10 μg / एमएल), और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 इकाइयों / एमएल) के साथ पूरक।
    3. एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें और प्रत्येक कुएं में 6 x 103 कोशिकाओं को बीज करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें।
      नोट: आम तौर पर किसी भी पाइपिंग त्रुटियों के लिए खाते में गणना में एक अतिरिक्त अच्छी तरह से शामिल करना पसंद किया जाता है।
    4. आवश्यक कुओं की संख्या के अनुसार, ओवरले माध्यम में सेल निलंबन को पतला करें।
      नोट: एक एकल कुएं के लिए ओवरले मध्यम संरचना निम्नानुसार है: परख माध्यम के 400 μL, LRECM के 8 μL (2% अंतिम), और ईजीएफ के 100 μg / एमएल के 0.02 μL (5 एनजी /
  6. कोशिकाओं की बीजारोपण करें।
    1. तैयार एलआरईसीएम बेड (चरण 1.4) में पतला सेल निलंबन के 400 μL जोड़ें, सावधानीपूर्वक एलआरईसीएम बिस्तर को परेशान न करें। एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

2. पीएएफ उपचार

  1. कोशिकाओं के बीजारोपण के बाद पीएएफ 3 घंटे जोड़ें। पीबीएस में पीएएफ का 100 μM स्टॉक तैयार करें और प्रत्येक कुएं में 0.2 μL की आवश्यक मात्रा जोड़ें (जो 200 एनएम से मेल खाती है)।
  2. प्रत्येक मीडिया परिवर्तन के दौरान पीएएफ की एक ही एकाग्रता जोड़ें।

3. ताजा मीडिया के साथ फिर से खिलाना

  1. हर 4 दिनों में ताजा माध्यम के साथ कोशिकाओं को फिर से भरें (यानी, दिन 4, दिन 8, दिन 12 और दिन 16)।

4. लंबे समय तक पीएएफ एक्सपोजर द्वारा प्रेरित फेनोटाइपिक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन

  1. संवर्धन के 20 दिनों के बाद, ध्यान से प्रत्येक कुएं से माध्यम से विंदुक करें और पूर्व-गर्म पीबीएस के 400 μL के साथ कुओं को धो लें।
  2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 400 μL जोड़कर एसीनार संरचनाओं को ठीक करें (1x पीबीएस में 16% पैराफॉर्मलडिहाइड को पतला करके ताजा तैयार किया गया) और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ कुओं को एक बार कुल्ला और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 युक्त पीबीएस के साथ पारगम्य करें।
  4. 10 मिनट के बाद, तुरंत लेकिन ध्यान से ट्राइटन-एक्स 100 समाधान से बाहर पिपेट और पीबीएस-ग्लाइसिन के 400 μL के साथ कुल्ला (ताजा 1x पीबीएस में ग्लाइसिन की एक चुटकी जोड़कर तैयार)। यह प्रत्येक 15 मिनट के लिए तीन बार दोहराया जाता है।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) बफर में 10% बकरी सीरम ( सामग्री की तालिका देखें) वाले प्राथमिक अवरुद्ध समाधान के 400 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    नोट: आईएफ बफर की संरचना: 0.05% सोडियम एजाइड, 0.1% बीएसए, 0.2% ट्राइटन-एक्स 100, और 0.05% ट्वीन (1 पीबीएस में 20)।
  6. प्राथमिक अवरुद्ध समाधान निकालें, प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में तैयार 2% माध्यमिक अवरुद्ध एंटीबॉडी (एफ (एबी') 2 माउस एंटीजन के खिलाफ बकरी में उठाए गए एंटीबॉडी के 200 μL जोड़ें, सामग्री की तालिका देखें), और इसे कमरे के तापमान पर 45-60 मिनट के लिए छोड़ दें।
  7. 1:100 कमजोर पड़ने में 2% माध्यमिक अवरुद्ध एंटीबॉडी समाधान में प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें। माध्यमिक अवरुद्ध समाधान को हटाने के बाद, ताजा तैयार एंटीबॉडी जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
  8. पिछला चरण तहखाने झिल्ली के द्रवीकरण को प्राप्त कर सकता है। प्रयोग के साथ आगे बढ़ने से पहले, स्लाइड कमरे के तापमान तक पहुंचने तक प्रतीक्षा करें। ध्यान से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान विंदुक और अगर बफर के 400 μL के साथ तीन बार धो लें।
  9. आईएफ बफर के साथ अंतिम धोने के दौरान, प्राथमिक अवरुद्ध समाधान में फ्लोरोफोर-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिका देखें) का 1: 200 कमजोर पड़ना तैयार करें। कमरे के तापमान पर 40-60 मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में स्लाइड सेते हैं।
  10. 20 मिनट के लिए आईएफ बफर के 400 μL के साथ स्लाइड कुल्ला, प्रत्येक 10 मिनट के लिए पीबीएस के साथ दो धोने के द्वारा पीछा किया।
  11. कमरे के तापमान पर 5-6 मिनट के लिए परमाणु दाग के 0.5 एनजी / एमएल युक्त पीबीएस के साथ नाभिक को काउंटर-दाग दें ( सामग्री की तालिका देखें)। अतिरिक्त दाग को हटाने के लिए पीबीएस के 400 μL के साथ तीन बार स्लाइड धो लें।
  12. ध्यान से पूरे पीबीएस बाहर विंदुक और अवशिष्ट समाधान को हटाने सुनिश्चित करें। प्रत्येक कुएं में बढ़ते अभिकर्मक ( सामग्री की तालिका देखें) की एक बूंद जोड़ें और इसे रात भर कमरे के तापमान पर खड़े होने की अनुमति दें।
  13. कमरे के तापमान पर स्लाइड स्टोर करें और जितनी जल्दी हो सके स्लाइड्स को चित्रित करें।
  14. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर 40x या 63x आवर्धन के तहत छवि ( सामग्री की तालिका देखें), 0.6 मिमी चरण आकार (एनए = 1.4) के ऑप्टिकल जेड-सेक्शन लेते हुए।
  15. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहित छवियों को खोलें ( सामग्री की तालिका देखें)। 3 डी अनुमानों का उपयोग करके रूपात्मक मतभेदों का प्रदर्शन करें।
    नोट: सबसे केंद्र ऑप्टिकल जेड-सेक्शन का उपयोग ध्रुवीयता मार्करों के स्थानीयकरण में अंतर दिखाने के लिए सबसे अच्छा किया जा सकता है। इन्हें उस विशिष्ट धुंधला पैटर्न को दिखाने वाले स्फेरॉइड के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करने के लिए मैन्युअल रूप से मात्रा निर्धारित की जा सकती है।
  16. प्रोटीन की अभिव्यक्ति में अंतर को स्पष्ट करने के लिए, औसत ग्रे मान को मापने या सही कुल सेल प्रतिदीप्ति (सीटीसीएफ) 23 की गणना करने के लिए एक अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण करें। वायलिन या डॉट भूखंडों के रूप में डेटा का प्रतिनिधित्व करें।

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Representative Results

एमसीएफ 10 ए कोशिकाएं, पीएएफ उपचार के संपर्क में आने पर, बहुत अलग फेनोटाइप के साथ एसीनार संरचनाएं बनाती हैं। α6-इंटीग्रिन को अधिक एपिकल धुंधला होने के साथ गलत पाया गया। कुछ एसिनी ने असंतत धुंधला (चित्रा 2 ए) भी दिखाया। ये दोनों फेनोटाइप बेसल ध्रुवीयता के नुकसान का संकेत देते हैं, जैसा कि साहित्य24,25 से स्पष्ट है। पहले की रिपोर्टों में कैंसर मेटास्टेसिस में α6-इंटीग्रिन की विवादास्पद भूमिका का संकेत मिलता है। α6-पूर्णांक एक डिमर के रूप में या तो β1- या β4-पूर्णांक के साथ मौजूद है। उपकला कोशिकाओं में हेमिडेस्मोसोम बनाने में α6β4 सबयूनिट को महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए पाया गयाहै 26. इस इंटीग्रिन का डाउनरेगुलेशन प्रोस्टेट और स्तन कैंसर के कुछ उदाहरणों में पाया गया है, जिसमें स्तन के डक्टल कार्सिनोमा (ग्रेड III) में α6β4-इंटीग्रिन का नुकसान पाया गया था। हानि फेनोटाइप उन कोशिकाओं में देखा जाता है जो पैरेन्काइमा और फुफ्फुस गुहा 27,28,29 को मेटास्टेसाइज करते हैं। जीएम 130 एक सीआईएस-गोल्गी स्थानीयकृत प्रोटीन है; गोल्गी निकायों को एमसीएफ 10 ए एसिनार संस्कृतियों16,30 में स्थानीयकृत किया जाता है। पीएएफ उपचार ने जीएम 130 के मिसलोकलाइजेशन का नेतृत्व किया, एपिकल ध्रुवीयता व्यवधान (चित्रा 2 बी) का सुझाव दिया। विमेंटिन एक मध्यवर्ती फिलामेंट है जो सेल माइग्रेशन में शामिल है; यह अपग्रेड किया जाता है जब उपकला कोशिकाएं मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) 31 के उपकला से गुजरती हैं। एमसीएफ 10 ए एसिनार संस्कृतियों के पीएएफ उपचार ने ईएमटी का सुझाव देते हुए धुंधला तीव्रता (चित्रा 2 सी) द्वारा देखे गए ऊंचे विमेंटिन स्तरों का नेतृत्व किया।

Figure 2
चित्रा 2: पीएएफ ध्रुवीयता को बाधित करता है और एमसीएफ 10 ए स्तन एसिनी में ईएमटी जैसे परिवर्तनों को प्रेरित करता है। एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं को एलआरईसीएम में 3 डी 'ऑन टॉप' संस्कृतियों के रूप में उगाया गया था। संस्कृतियों को दिन 0, 4, 8, 12 और 16 पर पीएएफ के साथ इलाज किया गया था। संस्कृतियों को 20 दिनों के लिए बनाए रखा गया था और फिर α6-इंटीग्रिन (हरा) और परमाणु दाग (नीला) (ए), (बी) जीएम 130 (हरा), एपिकल ध्रुवीयता के लिए एक मार्कर, और (सी) विमेंटिन (लाल), एक ईएमटी मार्कर के लिए इम्यूनोस्टेन किया गया था। संबंधित एसिनी का सबसे केंद्र ढेर दिखाया गया है। प्रतिनिधि डेटा तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों से 40-50 एसिनी के लिए है। स्केल बार = 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

कार्सिनोजेनेसिस की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए स्थापित सेल लाइन-आधारित मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। कोशिकाओं की मोनोलेयर संस्कृतियां विभिन्न आणविक सिग्नलिंग मार्गों में अंतर्दृष्टि प्रदान करना जारी रखती हैं जो कैंसर कोशिकाओं में विशिष्ट परिवर्तनों की मध्यस्थता करतीहैं 32. रास, माइक और उत्परिवर्तित पी 53 जैसे प्रसिद्ध ऑन्कोजीन की भूमिका पर अध्ययन पहली बार मॉडल सिस्टम33,34,35,36 के रूप में मोनोलेयर संस्कृतियों का उपयोग करके रिपोर्ट किया गया था। हालांकि, 2 डी संस्कृति मॉडल में विवो में मौजूद बहुत सारे महत्वपूर्ण संरचनात्मक और कार्यात्मक मापदंडों का अभाव है। 2 डी संस्कृतियों में ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन अक्सर एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया (कोशिका मृत्यु या लक्ष्य निषेध) दिखाते हैं, यहां तक कि कम सांद्रता पर भी, जबकि चूहों37 में मिश्रित होने पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव दिखाने में विफल रहते हैं। इसका एक प्रमुख कारण 2 डी मोनोलेयर संस्कृति बनाम में अलग-अलग दवा की उपलब्धता और तेज है। 3 डी संस्कृति38.

3 डी संस्कृतियों की अवधारणा पिछले दशक में कैंसर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभरी है। 3 डी संस्कृतियों में एक बाह्य मैट्रिक्स पर बढ़ती कोशिकाएं शामिल होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप संरचनाओं का निर्माण होता है जो विवो16 में ऊतक में मौजूद कार्यात्मक इकाइयों से मिलते जुलते हैं। 3 डी संस्कृतियां काफी हद तक इन विवो माइक्रोएनवायरनमेंट की नकल करती हैं और इस प्रकार 2 डी संस्कृतियों 39 की सीमाओं को दूरकरती हैं। इसके अलावा, चूंकि 3 डी में उगाई गई कोशिकाएं मानव मूल की हैं और सिस्टम प्रारंभिक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अधिक उत्तरदायी है, इसलिए यह कृंतक मॉडल की तुलना में सरल और अधिक सुरुचिपूर्ण है।

इस मंच का उपयोग करके, पीएएफ जैसे फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ के संपर्क में आने के बाद परिवर्तन प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल का प्रदर्शन किया जाता है। हमारी प्रयोगशाला के अध्ययनों ने पहचान की है कि पीएएफ उपचार गैर-ट्यूमरजेनिक स्तन उपकला सेल लाइन, एमसीएफ 10 ए12 को बदल सकता है। इस विधि को लगातार पीएएफ में कोशिकाओं को उजागर करने के लिए अनुकूलित किया गया है, विवो परिदृश्य के समान, जहां पीएएफ माइक्रोएन्वायरमेंट में मौजूद है।

एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं, जब 2 डी में उगाया जाता है, तो हर 4 दिनों में पारित किया जाना चाहिए। यदि उन्हें प्रोटोकॉल के अनुसार बनाए नहीं रखा जाता है, तो वे बहुत अलग तरीके से व्यवहार करते हैं, जो केवल ईसीएम16 पर उगाए जाने पर दिखाई देता है। कोशिकाओं की मार्ग संख्या को यथासंभव कम रखा जाना चाहिए। एलआरईसीएम के विभिन्न बैचों में प्रोटीन एकाग्रता में भिन्नता के कारण इस पद्धति की सीमाएं भी हैं। यह केवल एक एलआरईसीएम बिस्तर पर कोशिकाओं को चढ़ाना और एसिनी के आकार वितरण का अवलोकन करके विभिन्न बैचों का परीक्षण करके दूर किया जा सकता है। यदि आकार में कोई बड़ी परिवर्तनशीलता नहीं है, तो एलआरईसीएम बैच को प्रयोगों के लिए उपयुक्त माना जा सकता है।

परिवर्तन का आकलन आमतौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा किया जाता है, जिसे वीडियो में प्रदर्शित किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस करते समय, 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन से जुड़े कदम महत्वपूर्ण हैं; जब एलआरईसीएम परत तरल अवस्था में होती है तो समाधान को पाइप करना परत को असमान बनाता है, जिससे एसिनार संरचनाओं का नुकसान होता है। असमानता की समस्या से निपटने के तरीकों में से एक स्लाइड को रात भर एक समान मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करना है या उस आवर्धन को बदलना है जिस पर इमेजिंग की जाती है। एसीनार संरचनाओं को पाइप करने से बचने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण से कक्ष को सावधानीपूर्वक हटा दें और शुरू में जोड़ी गई मात्रा के तीन-चौथाई को हटा दें, फिर बाद के धोने के दौरान बाकी को बाहर निकालें।

सामना की जाने वाली एक और बड़ी समस्या एलआरईसीएम के कारण उच्च पृष्ठभूमि है। इस समस्या को दूर करने के लिए कोई भी 1% के बजाय 2% माध्यमिक अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग कर सकता है। हालांकि, माध्यमिक अवरुद्ध बढ़ने से एपिकल मार्कर और ई-कैडरिन धुंधला होने का उद्देश्य पूरा नहीं होता है। ऐसे मामलों में, 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीबीएस-ईडीटीए के लिए दिन 20 के बाद चैंबर कवर ग्लास के अधीन करने की सलाह दी जाती है, और फिर वीडियो में दिखाए गए समान प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एसिनी को ठीक करें। पीबीएस-ईडीटीए आंशिक रूप से एलआरईसीएम को भंग कर देता है, इस प्रकार पृष्ठभूमि को कम करता है। हालांकि, यदि इनक्यूबेशन समय पार हो जाता है, तो इस उपचार के परिणामस्वरूप समाधान को पाइप करते समय संरचनाओं का नुकसान हो सकता है। इसलिए इस प्रक्रिया को अंजाम देते समय अत्यंत सावधानी बरतनी होगी। यह भी देखा गया है कि स्लाइड्स को लंबे समय तक संग्रहीत करने से पृष्ठभूमि सिग्नल में वृद्धि हो सकती है। इसलिए, इमेजिंग को जल्द से जल्द किया जाना चाहिए। फेनोटाइप में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए प्रति प्रयोग कम से कम 15 एसिनी की छवि बनाने की सलाह दी जाती है।

3 डी एसिनार संस्कृतियों की कुछ सीमाएं हैं, जैसे कि लाइव-सेल इमेजिंग के दौरान एकल कोशिकाओं को ट्रैक करने में कठिनाई। कुछ अध्ययन, जैसे कि सेल चक्र पर प्रभाव, स्थानिक और लौकिक जानकारी बनाए रखने के लिए लाइव-सेल इमेजिंग का उपयोग करके किए जाने की आवश्यकता है। हालांकि, संरचना में निरंतर परिवर्तन के कारण, नियमित कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके 3 डी एसिनार संस्कृतियों में ऐसे मापदंडों को ट्रैक करना मुश्किल है। यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी या एयरिस्कैन माइक्रोस्कोपी जैसी उन्नत सूक्ष्म तकनीकों का उपयोग करके वारंट करता है। इसके लिए घाव भरने, लंगर-स्वतंत्र विकास और विवो ट्यूमरजेनेसिटी परख जैसे कुछ परिवर्तन परखों के लिए एसिनार संरचनाओं को हटाने की भी आवश्यकता होगी। इस विघटन के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण स्थानिक और लौकिक जानकारी का नुकसान होगा। संस्कृतियों से एकत्र किए गए प्रोटीन लाइसेट्स अक्सर आईआरईसीएम की उपस्थिति के कारण पतला हो जाते हैं, जिससे पर्याप्त मात्रा में लाइसेट्स की लोडिंग के साथ समस्याएं पैदा होती हैं। हालांकि, एसिनी संरचनाओं को विस्थापित करके और लिसिस से पहले उन्हें इकट्ठा करके इसे काफी हद तक दूर किया जा सकता है।

यहां, फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ / प्रतिरक्षा से जुड़े कारक-प्रेरित परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली का प्रदर्शन किया गया है। यह मॉडल आनुवंशिक और / या एपिजेनेटिक मार्ग (ओं) को स्पष्ट कर सकता है जो डी-विनियमित हो सकते हैं, जिससे आकृति विज्ञान में भारी परिवर्तन हो सकते हैं। इस विधि का उपयोग संभावित चिकित्सीय स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है। इस तरह के ड्रग स्क्रीनिंग अध्ययन 2 डी संस्कृतियों38 में किए गए स्क्रीनिंग की तुलना में बेहतर सफलता प्रदान करेंगे। इस पद्धति का एक प्रमुख आकर्षण अध्ययन की आवश्यकता के अनुसार अनुकूलनशीलता है। उपचार आहार और विश्लेषण विधियों को आवश्यकतानुसार संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, यह विधि उपचार40 पर प्रभावित आणविक सिग्नलिंग में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है। तकनीक दवा प्रतिरोध की संभावित घटना की भविष्यवाणी करने में भी मदद करेगी। इसके अलावा, यह दवा प्रतिरोध में शामिल तंत्र को स्पष्ट करने और उसी पर काबू पाने के लिए प्रशंसनीय लक्ष्यों की पहचान करने में भी मदद करेगा। अध्ययनों ने 3 डी में कई सेल प्रकारों को सह-संवर्धन करने की संभावनाएं स्थापित की हैं, जिन्हें उपचार आहार41 को समायोजित करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है। इस तरह के अवसर स्तन कैंसर की दीक्षा और प्रगति के दौरान विवो में होने वाली विशेषताओं और आणविक परिवर्तनों में अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान करेंगे।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के किसी भी संभावित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

हम उपकरण और बुनियादी ढांचे तक पहुंच और प्रयोगों के लिए समर्थन के लिए आईआईएसईआर पुणे माइक्रोस्कोपी सुविधा को धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जैव प्रौद्योगिकी विभाग (डीबीटी), भारत सरकार (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013), विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड (एसईआरबी), भारत सरकार (ईएमआर / 2016/001974) और आंशिक रूप से आईआईएसईआर, पुणे कोर फंडिंग द्वारा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। एके को सीएसआईआर-एसआरएफ फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था, एलए को डीएसटी-इंस्पायर फैलोशिप के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, वीसी को डीबीटी (बीटी / पीआर 8699 / एमईडी / 30/1018/2013) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA Invitrogen 25300062
16% paraformaldehyde Alfa Aesar AA433689M
Anti Mouse Alexa Flour 488 Invitrogen A11029
Anti Rabbit Alexa Flour 488 Invitrogen A-11008
BSA Sigma A7030
Chamber Coverglass Nunc 155409
Cholera Toxin Sigma C8052-1MG 1 mg/mL in dH2O
Confocal Microscope Leica Leica SP8
DMEM Gibco 11965126
EDTA Sigma E6758
EGF Sigma E9644-0.2MG 100 mg/mL in dH2O
F(ab’)2 fragment of antibody raised in goat against mouse antigen Jackson Immunoresearch 115-006-006
GM130 antibody Abcam ab52649
Goat Serum Abcam ab7481
Hoechst Invitrogen 33258
Horse Serum Gibco 16050122
Hydrocortisone Sigma H0888 1 mg/mL in ethanol
Image Processing Software ImageJ
Insulin Sigma I1882 10 mg/mL stock dH2O
lrECM (Matrigel) Corning 356231
Mounting reagent (Slow fade Gold Anti-fade) Invitrogen S36937
Nuclear Stain  (Hoechst) Invitrogen 33258
PAF Cayman Chemicals 91575-58-5 Methylcarbamyl PAF C-16, procured as a 10 mg/mL in ethanol
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E
Sodium Azide Sigma S2002
Tris Base Sigma B9754
Triton X-100 Sigma T8787
Tween 20 Sigma P9416
Vimentin antibody Abcam ab92547
α6-integrin antibody Millipore MAB1378

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References

  1. Lacroix, M., Leclercq, G. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update. Breast Cancer Research and Treatment. 83 (3), 249-289 (2004).
  2. Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nature Reviews Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
  3. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  4. Streuli, C. H., Bailey, N., Bissell, M. J. Control of mammary epithelial differentiation: basement membrane induces tissue-specific gene expression in the absence of cell-cell interaction and morphological polarity. Journal of Cell Biology. 115 (5), 1383-1395 (1991).
  5. Streuli, C. H., et al. Laminin mediates tissue-specific gene expression in mammary epithelia. Journal of Cell Biology. 129 (3), 591-603 (1995).
  6. Bissell, M. J., Kenny, P. A., Radisky, D. C. Microenvironmental regulators of tissue structure and function also regulate tumor induction and progression: the role of extracellular matrix and its degrading enzymes. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 70, 343-356 (2005).
  7. Heinrich, E. L., et al. The inflammatory tumor microenvironment, epithelial mesenchymal transition and lung carcinogenesis. Cancer Microenvironment. 5 (1), 5-18 (2012).
  8. Gonda, T. A., Tu, S., Wang, T. C. Chronic inflammation, the tumor microenvironment and carcinogenesis. Cell Cycle. 8 (13), 2005-2013 (2009).
  9. Berdyshev, E. V., Schmid, P. C., Krebsbach, R. J., Schmid, H. H. Activation of PAF receptors results in enhanced synthesis of 2-arachidonoylglycerol (2-AG) in immune cells. The FASEB Journal. 15 (12), 2171-2178 (2001).
  10. Rola-Pleszczynski, M., Stankova, J. Cytokine gene regulation by PGE(2), LTB(4) and PAF. Mediators of Inflammation. 1 (2), 5-8 (1992).
  11. Bussolati, B., et al. PAF produced by human breast cancer cells promotes migration and proliferation of tumor cells and neo-angiogenesis. The American Journal of Pathology. 157 (5), 1713-1725 (2000).
  12. Chakravarty, V., et al. Prolonged exposure to platelet activating factor transforms breast epithelial cells. Frontiers in Genetics. 12, 634938 (2021).
  13. Chen, J., et al. Platelet-activating factor receptor-mediated PI3K/AKT activation contributes to the malignant development of esophageal squamous cell carcinoma. Oncogene. 34 (40), 5114-5127 (2015).
  14. Chen, J., et al. Feed-forward reciprocal activation of PAFR and STAT3 regulates epithelial-mesenchymal transition in non-small cell lung cancer. Cancer Research. 75 (19), 4198-4210 (2015).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods in Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  17. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  18. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  19. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 9 (4), 297-310 (2004).
  20. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochemistry and Cell Biology. 74 (6), 833-851 (1996).
  21. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  22. Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells. BMC Cancer. 14, 287 (2014).
  23. Banerjee, A., et al. A rhodamine derivative as a "lock" and SCN− as a "key": visible light excitable SCN− sensing in living cells. Chemical Communications. 49 (25), 2527-2529 (2013).
  24. Ren, G., et al. Reduced basal nitric oxide production induces precancerous mammary lesions via ERBB2 and TGFbeta. Scientific Reports. 9 (1), 6688 (2019).
  25. Anandi, L., Chakravarty, V., Ashiq, K. A., Bodakuntla, S., Lahiri, M. DNA-dependent protein kinase plays a central role in transformation of breast epithelial cells following alkylation damage. Journal of Cell Science. 130 (21), 3749-3763 (2017).
  26. Sonnenberg, A., et al. Integrin alpha 6/beta 4 complex is located in hemidesmosomes, suggesting a major role in epidermal cell-basement membrane adhesion. Journal of Cell Biology. 113 (4), 907-917 (1991).
  27. Pignatelli, M., Cardillo, M. R., Hanby, A., Stamp, G. W. Integrins and their accessory adhesion molecules in mammary carcinomas: loss of polarization in poorly differentiated tumors. Human Pathology. 23 (10), 1159-1166 (1992).
  28. Natali, P. G., et al. Changes in expression of alpha 6/beta 4 integrin heterodimer in primary and metastatic breast cancer. British Journal of Cancer. 66 (2), 318-322 (1992).
  29. Davis, T. L., Cress, A. E., Dalkin, B. L., Nagle, R. B. Unique expression pattern of the alpha6beta4 integrin and laminin-5 in human prostate carcinoma. Prostate. 46 (3), 240-248 (2001).
  30. Liu, J. S., Farlow, J. T., Paulson, A. K., Labarge, M. A., Gartner, Z. J. Programmed cell-to-cell variability in Ras activity triggers emergent behaviors during mammary epithelial morphogenesis. Cell Reports. 2 (5), 1461-1470 (2012).
  31. Liu, C. Y., Lin, H. H., Tang, M. J., Wang, Y. K. Vimentin contributes to epithelial-mesenchymal transition cancer cell mechanics by mediating cytoskeletal organization and focal adhesion maturation. Oncotarget. 6 (18), 15966-15983 (2015).
  32. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures-a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  33. Schulze, A., Lehmann, K., Jefferies, H. B., McMahon, M., Downward, J. Analysis of the transcriptional program induced by Raf in epithelial cells. Genes & Development. 15 (8), 981-994 (2001).
  34. McCarthy, S. A., Samuels, M. L., Pritchard, C. A., Abraham, J. A., McMahon, M. Rapid induction of heparin-binding epidermal growth factor/diphtheria toxin receptor expression by Raf and Ras oncogenes. Genes & Development. 9 (16), 1953-1964 (1995).
  35. Willis, A., Jung, E. J., Wakefield, T., Chen, X. Mutant p53 exerts a dominant negative effect by preventing wild-type p53 from binding to the promoter of its target genes. Oncogene. 23 (13), 2330-2338 (2004).
  36. Haupt, S., Raghu, D., Haupt, Y. Mutant p53 drives cancer by subverting multiple tumor suppression pathways. Frontiers in Oncology. 6, 12 (2016).
  37. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
  38. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  39. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  40. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
  41. Saraiva, D. P., Matias, A. T., Braga, S., Jacinto, A., Cabral, M. G. Establishment of a 3D co-culture with MDA-MB-231 breast cancer cell line and patient-derived immune cells for application in the development of immunotherapies. Frontiers in Oncology. 10, 1543 (2020).

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कैंसर अनुसंधान अंक 185 फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ एमसीएफ 10 ए कोशिकाओं तीन आयामी संस्कृतियों परिवर्तन पीएएफ
फॉस्फोलिपिड मध्यस्थ प्रेरित तीन आयामी संस्कृतियों में परिवर्तन
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Kuttanamkuzhi, A., Anandi, L.,… More

Kuttanamkuzhi, A., Anandi, L., Chakravarty, V., Lahiri, M. Phospholipid Mediator Induced Transformation in Three-Dimensional Cultures. J. Vis. Exp. (185), e64146, doi:10.3791/64146 (2022).

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