Summary
تصف المقالة طريقة عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة المشروطة من كليتي الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن فيروس thermolabile simian 40 والميتوكوندريا القابلة للتنشيط الضوئي ، PhAMالمستأصلة. نصف إجراء عزل الكبيبات من الكلى الكاملة باستخدام الخرز وخطوات الهضم والبذر واستزراع GECs-CD31 الإيجابي.
Abstract
يمكن أن يؤدي خلل الخلايا البطانية الكبيبية (GEC) إلى انهيار حاجز الترشيح الكبيبي والمساهمة فيه. تم اقتراح زيادة الإجهاد التأكسدي للميتوكوندريا كآلية تؤدي إلى خلل وظيفي في GEC في التسبب في بعض أمراض الكبيبات. تاريخيا ، كانت عزلة GECs من النماذج الحية صعبة للغاية بسبب الصعوبات في عزل الثقافات النقية عن الكبيبات. GECs لديها متطلبات نمو معقدة في المختبر وعمر محدود للغاية. هنا ، نصف الإجراء الخاص بعزل وزراعة GECs الخالدة المشروطة بالميتوكوندريا الفلورية ، مما يتيح تتبع أحداث انشطار الميتوكوندريا والاندماج. تم عزل GECs من كليتي فأر مزدوج معدل وراثيا يعبر عن thermolabile SV40 TAg (من Immortomouse) ، مما يعزز الانتشار المشروط وقمع تمايز الخلايا ، وبروتين فلوري قابل للتحويل الضوئي (Dendra2) في جميع الميتوكوندريا (من فأر الميتوكوندريا القابل للتنشيط الضوئي [PhAMexcised]). يسمح خط الخلية المستقر الذي تم إنشاؤه بتمايز الخلايا بعد تعطيل جين SV40 TAg التخليدي والتنشيط الضوئي لمجموعة فرعية من الميتوكوندريا مما يتسبب في تحول التألق من الأخضر إلى الأحمر. يسمح استخدام mitoDendra2-GECs بالتصوير المباشر لتوزيع الميتوكوندريا الفلورية والاندماج وأحداث الانشطار دون تلطيخ الخلايا.
Introduction
الكبيبة ضرورية لترشيح الدم عن طريق تقييد مرور الجزيئات الكبيرة عبر حاجز الترشيح الكبيبي 1,2. تحتوي الكبيبة على أربعة أنواع من الخلايا: الخلايا الظهارية الجدارية ، والخلايا الظهارية (الخلايا الظهارية الحشوية) ، والخلايا البطانية الكبيبية (GEC) ، والخلايا المتوسطة3. تتميز البطانة الكبيبية ببنية وعائية فريدة من نوعها ، وفقا لوجود fenestrae المطلوبة لأحجام الترشيح الكبيرة4. السطح القمي للبطانة الكبيبية مغطى بطبقة جليكوكاليكس سالبة الشحنة وطبقة تسمى الطبقة السطحية البطانية التي تخلق مسافة بين البطانة والدم. يوفر هذا الهيكل انتقائية عالية الشحنة تقيد مرور الجزيئات سالبة الشحنة مثل الألبومين وتمنع التصاق الكريات البيض والصفائح الدموية5.
GECs حساسة للغاية للتغيرات الأيضية ، مثل ارتفاع السكر في الدم المرتبط ببيئة السكري. في الواقع ، يؤدي مرض السكري إلى زيادة الدورة الدموية للمواد الضارة ، وتشبع مسارات استقلاب الجلوكوز ، وتوازن الأكسدة والاختزال الخلويالمضطرب 3,6. علاوة على ذلك ، فإن الزيادة في أنواع الأكسجين التفاعلية تؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا ، مما يؤثر على وظيفة البطانة7.
الهدف العام للبروتوكول الحالي هو عزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة مع ميزات الميتوكوندريا الفلورية. في الواقع ، فإن زراعة الخلايا في GECs الأولية لها دورة تكاثرية محدودة وشيخوخة مبكرة8. بالإضافة إلى ذلك ، يساعد وجود الميتوكوندريا الفلورية في فحص أحداث الانشطار والاندماج استجابة لارتفاع السكر في الدم أو أي علاج آخر. كطريقة بديلة ، استخدمت مختبرات أخرى h-TERT لتخليد الخلايا في المختبر9.
تسمح الطريقة الموضحة هنا بعزل الخلايا البطانية الكبيبية mitoDendra2 الخالدة بشكل مشروط من الحيوانات التي يبلغ عمرها 4-6 أسابيع (الشكل 1). يصف هذا البروتوكول المفصل استخدام الفئران المعدلة وراثيا (H-2K b-tsA58) التي تؤوي فيروس سيميان 40 مستضد الورم الكبير (SV40 TAg) الجين10,11 لتوليد خلايا خلدة مشروطة حراريا. يعمل منتج الجين tsA58 TAg عند درجة حرارة متساهلة تبلغ 33 درجة مئوية تحت سيطرة المروج الجانبي 5 'للفأر H-2Kb ، والذي يزداد فوق المستويات القاعدية عند التعرض لإنترفيرون جاما (IFNγ) ، وبالتالي الحفاظ على النمط الظاهريللانتشار الشرطي 12. يتحلل H-2Kb بسرعة عند درجة حرارة غير متساهلة تبلغ 37 درجة مئوية في غياب IFNγ ، مما يزيل وظيفة تخليد tsA58Tag في الخلايا ويسمح للخلايا بتطوير نمط ظاهري أكثر تمايزا13،14،15. يسمح العبور الاختياري للفئران المعدلة وراثيا H-2Kb-tsA58 مع فئران PhAM ، والتي تعبر عن ميتوكوندريا خاصة (الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم ج أوكسيديز) Dendra2-green ، بالكشف الحي عن الميتوكوندرياالفلورية 16. يتحول مضان Dendra2 الأخضر إلى مضان أحمر بعد التعرض لليزر 405 نانومتر16. عندما تندمج الميتوكوندريا بعد تبديل الصور ، فإنها تشكل أشكالا ممدودة تظهر صفراء من تبادل المواد الخضراء والصفراء أو تظهر حمراء عندما تخضع للانشطار 7,17. تعد mitoDendra2-GECs أداة رائعة لدراسة الاستجابات الخلوية للميتوكوندريا GEC للمحفزات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الموصوفة هنا من قبل IACUC في كلية إيكان للطب في جبل سيناء. استخدمنا ثلاثة فئران ذكور (H-2Kb-tsA58 الفئران المعدلة وراثيا مع الميتوكوندريا القابلة للتنشيط الضوئي [PhAM]) تم شراؤها من مختبر جاكسون وحافظنا على نظام غذائي طبيعي للتشاو.
1. ظروف العمل والاستعدادات
- نظف مساحة العمل داخل غطاء التدفق الصفحي باستخدام 70٪ من الإيثانول وضوء UV-C.
- تحضير مخازن الغسيل حبة. اصنع buffer-1 باستخدام 0.1 M فوسفات الصوديوم عند درجة الحموضة 7.4-8.0 ، buffer-2 باستخدام 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم المكمل بمستضد مصل البقر 0.1٪ (BSA) ، 3 mM EDTA ، pH 7.4 ، و buffer-3 باستخدام 0.2 M Tris مع 0.1٪ BSA ، درجة الحموضة 8.5.
2. مكثف الجسيمات المغناطيسية
- تحضير الخرز المغناطيسي
- في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، امزج برفق 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (4 × 108 خرزات) مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -1.
ملاحظة: إعداد 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي لكل فأر 1 يوم قبل حصاد الأنسجة. سيتم استخدام الخرز لحصاد الكبيبات. - ضع الأنبوب في مكثف الجسيمات المغناطيسية لمدة 1 دقيقة ، ثم استنشق المادة الطافية بعناية. أخرج الأنبوب من المغناطيس وأعد تعليق الخرز المغسول في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -1.
- ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخرزات المغناطيسية في مكثف الجسيمات المغناطيسية لمدة 1 دقيقة واستنشق المادة الطافية برفق.
- قم بإلغاء تنشيط مجموعات tosyl المجانية عن طريق غسل الخرز المغناطيسي 2x ، 5 دقائق لكل منهما ، باستخدام 200 ميكرولتر من buffer-2 عن طريق وضع الأنبوب في مكثف الجسيمات المغناطيسية والتخلص من المخزن المؤقت.
- احتضان الخرز المغناطيسي في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -3 لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية ، أو لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية ، لتعطيل مجموعات التوسيل الحرة المتبقية. ضع الأنبوب في المكثف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة ، واستنشق المادة الطافية برفق ، وتخلص منها.
- اغسل الخرز المغناطيسي 1x مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -2 لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. ضع الأنبوب مرة أخرى في المكثف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة واستنشاق الطافت برفق. قم بإزالة الأنبوب من المكثف المغناطيسي وأعد تعليق الحبيبات المغناطيسية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -2 للحصول على 4 × 108 خرز / مل.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، من الممكن ترك الخرز عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما.
- في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، امزج برفق 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي (4 × 108 خرزات) مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت -1.
3. عزل الخلايا الكبيبية الكلى الفأر
- تحضير مادة التروية: حقنة 30 مل ، 25 غرام إبرة فراشة. تحضير مادة العزل: طبق معقم 10 سم ، مشرط ، مكثف جسيمات مغناطيسي ، مصفاة خلية 40 ميكرومتر ، مصفاة خلية 100 ميكرومتر.
- قم بإعداد 100 مل من محلول الملح المتوازن 1x Hank (HBSS) المكمل بمضادات حيوية بنسبة 1٪ واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.35. قم بتصفية المحلول بفلتر 0.2 ميكرومتر واحتفظ به تحت الغطاء لتجنب التلوث.
- امزج 200 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي من الخطوة 2.1.6 مع 20 مل من 1x HBSS.
ملاحظة: لكل ماوس ، ستكون هناك حاجة إلى 200 ميكرولتر من الخرز المخفف في 20 مل من HBSS 1x. - تحضير 1 مل من حصص كولاجيناز من النوع الثاني (125 CDU / mg) عند 1 مجم / مل في محلول HBSS واحد ، درجة الحموضة 7.35. قم بتسخين RPMI مسبقا باستخدام 10٪ FCS وسط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. قم بتسخين وسط زراعة الخلايا البطانية مسبقا عند 37 درجة مئوية (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل).
ملاحظة: سيتم استخدام RPMI لتحييد الكولاجيناز. - قم بتغطية بئرين من صفيحة مكونة من 6 آبار مسبقا ب 2 مل من 10 ميكروغرام / مل كولاجين IV (1 مل / بئر) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل اللوحة 3x مع 1x PBS لإزالة حمض الخليك المستخدم لتخفيف الكولاجين. استخدم الألواح المطلية على الفور أو قم بتخزينها في درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
ملاحظة: يفضل ختم اللوحة (اللوحات) بغشاء شفاف لمنع الجفاف. يسهل طلاء الكولاجين ربط الخلايا باللوحة. - قم بتنظيف وتعقيم جميع الأدوات الجراحية في الشكل 2 باستخدام 70٪ من الإيثانول ثم تعقيمها لمدة 30 دقيقة. نظف مساحة العمل الجراحية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
- تخدير الفئران بحقن الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق (10 ملغ / مل كيتامين و 1 ملغ / مل زيلازين). للتأكد من أن الحيوان قد تم تخديره بالكامل ، تحقق من منعكس قرصة إصبع القدم.
- إصلاح الكفوف من الماوس مع 19 غرام الإبر لتثبيته في مكانه على منصة تشريح. نظف الصدر والبطن بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وافتح البطن على طول الصدر بالمقص أ (الشكل 2).
- أدخل إبرة فراشة في البطين الأيسر (الشكل 3 أ) وحقن حوالي 100 ميكرولتر من محلول الخرزة (من الخطوة 1.2) لتوسيع الدورة الدموية.
- كسر بعناية الوريد الأجوف السفلي أسفل الكلى بإبرة 19 G (الشكل 3A). استمر في التروية التي بدأت في الخطوة 3.9.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مضخة صغيرة بسرعة: 18.0+ ، الوقت: 5 دقائق. التروية الجيدة مهمة لحصاد عدد كبير من الكبيبات التي تحمل حبات مغناطيسية. هذا إجراء غير البقاء على قيد الحياة / النهائي. - قم بإزالة الأنسجة الدهنية برفق باستخدام ملاقط واستأصل كلتا الكليتين بمقص جراحي رفيع ج (الشكل 2) وضعه في طبق به 1 مل من 1x HBSS على الثلج. فرم الكلى بالمقص ب (الشكل 2) ثم بمشرط معقم إلى قطع صغيرة 1 مم كما هو موضح في الشكل 3 ب.
- بعد ذلك ، احتضن الكلى المفرومة ب 1 مل من كولاجيناز من النوع الثاني من الخطوة 3.4 لمدة 35 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع إمالة لطيفة باستخدام شاكر أفقي. يجب هضم النسيج بالكامل بعد هذه الخطوة، كما هو موضح في الشكل 3 ج.
- أضف 4 مل من RPMI مع 10٪ FBS (من الخطوة 3.4) لتحييد الكولاجيناز. قم بتصفية الأنسجة المهضومة من خلال مصفاة خلية معقمة 100 ميكرومتر في أنبوب سعة 50 مل. استخدم الجزء السفلي من أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 1.5 مل لتحريك الأنسجة المهضومة ضد المصفاة للسماح للكبيبات بالمرور.
- اشطف مصفاة الخلية ب 15 مل من 1x HBSS ثم قم بالطرد المركزي للتدفق عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. عند هذه النقطة ، تحتوي الحبيبات على ثلاث طبقات. تظهر الخرز مع الكبيبات في الطبقة الوسطى من الأنبوب ، وتتكون الطبقة العليا من هياكل أصغر مثل الأنابيب ، والطبقة السفلية عبارة عن حطام (الشكل 3 د).
- يستنشق بعناية الطاف والطبقة البيضاء العليا. تحتوي الحبيبات المتبقية على الخرز الذي يحمل الكبيبات والحطام (الشكل 3 د). أعد تعليق الحبيبات باستخدام 1.5 مل من 1x HBSS وانقلها إلى أنبوب سعة 2 مل.
- ضع الأنبوب في المكثف المغناطيسي (الشكل 3E) ، واستنشق المادة الطافية ، ثم اغسل الخرز 2x مع 1 مل من 1x HBSS ؛ في هذه المرحلة ، ضع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية على شريحة للتحقق من وجود الكبيبات تحت المجهر (الشكل 3F ؛ الكبيبة [السهم الأسود] ، وبعض الخرز [الأسهم الصفراء] في التعليق).
- قم بشفط المادة الطافية بعناية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط نمو الخلايا البطانية (جدول المواد) ، وانقلها إلى أنبوب نظيف سعة 2 مل. أضف 2 ميكرولتر من IFNγ (100 وحدة / مل) إلى الأنبوب وقم بلوحة الخلايا على بئر واحد من لوحة 6 آبار. احتضان الخلايا عند 33 درجة مئوية.
- بعد 3 أيام من الثقافة ، قم بتغيير الوسيط بعناية عن طريق سحب 1 مل من الوسط واستبداله ب 1 مل من الوسائط الطازجة. في هذه المرحلة ، تكون الخلايا غير متجانسة مع مزيج من الخلايا الكبيبية (الشكل 4G).
ملاحظة: في الثقافة المتضخمة ، سيكون هناك مزيج من الخلايا الكبيبية وبعض الخرز المغناطيسي (الشكل 4G). لاحظ أن جميع الخلايا يجب أن تظهر الميتوكوندريا الخضراء الفلورية. - بعد 7 أيام من المزرعة ، استنشق الوسط تماما واستبدله ب 2 مل جديدة من وسط نمو الخلايا البطانية المكمل ب IFNγ (100 وحدة / مل). في هذه المرحلة ، تبدأ الخلايا في التكاثر ولكنها لا تزال غير متجانسة (الشكل 4 أ).
- بعد 10 أيام من الثقافة عندما تصل الخلايا إلى التقاء ~ 80٪ ، قم بتمرير الخلايا باستخدام التربسين كما هو موضح في الخطوة 5.1 ثم نقلها إلى قارورة T25 مغلفة بالكولاجين الوريدي.
- بعد 1 أسبوع (مجموع ~ 21 يوما من الثقافة) ، قم بتمرير الخلايا إلى قارورة T75 المغلفة بالكولاجين IV.
4. تحضير الخرز لعزل الخلايا البطانية
- ابدأ بطلاء حبات الأغنام المضادة للفئران بجسم مضاد للفأر CD31 مضاد للفأر3،18،19. استخدم 10 ميكرولتر من الخرز لكل دورق T75.
- اغسل 10 ميكرولتر من الخرز 3x مع 200 ميكرولتر من 1x PBS المكمل ب 0.1٪ BSA ، 2 mM EDTA ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. ضع الأنبوب في مغناطيس المكثف لماصة المخزن المؤقت للغسيل في كل مرة.
- أعد تعليق الخرز في 200 ميكرولتر من PBS ، 1٪ BSA ، 2 mM EDTA ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. أضف 4.8 ميكرولتر من الجسم المضاد CD31 المضاد للفأر7،18،19 ، ضع الأنبوب على شاكر أفقي واخلطه برفق لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، ثم احتفظ بالأنبوب عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
5. عزل الخلايا البطانية الكبيبية بالخرز المطلي ب CD31
- أضف 3 مل من 0.25٪ تربسين إلى دورق T75 واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين مع 3 مل من وسط النمو البطاني ، ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل ، ثم الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق.
- نضح الطافي وغسل الخلايا في 1 مل من PBS تحتوي على 1٪ BSA ، 2 mM EDTA ، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من الخرز المطلي المحضر في الخطوة 4 ، وأضف 800 ميكرولتر من PBS تحتوي على 1٪ BSA ، 2 mM EDTA ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة مع الاهتزاز المستمر عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- ضع الأنبوب في المكثف المغناطيسي واغسل الخلايا 4x مع 1x PBS تحتوي على 1٪ BSA ، 2 mM EDTA ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين. أعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط النمو البطاني المكمل ب 100 وحدة / مل IFNγ.
- لوحة 1.5 مل من الخلايا / بئر في آبار الكولاجين المغلفة IV على لوحة 6 آبار. زراعة الخلايا في ظل ظروف متساهلة عند 33 درجة مئوية.
ملاحظة: تعبر الخلايا المعزولة عن مستضد T الكبير tsA58 لفيروس سيميان 40 (SV40) ، مما يتيح تنشيط الانتشار المستمر عند 33 درجة مئوية (حالة متساهلة). - بعد 4 أيام في المزرعة ، قم بإزالة 750 ميكرولتر من الوسط واستبدله بنفس الحجم من الوسط الطازج المكمل ب 100 وحدة / مل IFNγ.
- بعد 10 أيام إلى 14 يوما من الاستزراع ، تحقق من نمو مستعمرات GECs الإيجابية CD31 (الشكل 4C) التي تعبر عن الميتوكوندريا الفلورية باستخدام مجهر فوق الفلور مع مرشح 488 نانومتر.
- بعد 21 يوما من الثقافة ، قد تكون الخلايا قد وصلت إلى 80٪ -90٪ من التقاء. نقلها إلى قارورة T25. بعد الوصول إلى نقطة التقاء ، يمكن الحفاظ على الخلايا بمتوسط نمو RPMI و 10٪ FCS.
ملاحظة: قبل الوصول إلى نقطة التقاء، قد تبدو الخلايا غير متجانسة (الشكل 4 ب). ومع ذلك ، بمجرد أن يتقاربوا ، يكتسبون مورفولوجيا مرصوفة بالحصى. - في هذه المرحلة ، يمكن حفظ الخلايا بالتبريد. عند الوصول إلى 80٪ التقاء ، أضف 3 مل من 0.25٪ تربسين إلى الخلايا واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين مع حجم متساو من وسط النمو تستكمل مع 10 ٪ FBS.
- جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط التجميد (RPMI ، 20٪ FBS ، 10٪ DMSO). توزيع الخلايا في أنابيب التبريد وتخزينها في درجة حرارة بخار النيتروجين السائل.
6. زراعة ميتوديندرا 2-GECs
- قم بإذابة الخلايا من القسمة البردية ، من الخطوة 5.10 ، في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ونقلها إلى أنبوب سعة 15 مل مع 10 مل من وسط النمو البطاني قبل التسخين.
- جهاز طرد مركزي للتعليق عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة الوسط ، وانقل الحبيبات إلى قارورة زراعة الخلايا T25 سم2 المغلفة بالكولاجين مع وسط نمو الخلايا البطانية قبل التسخين المكمل ب 100 وحدة / مل IFNγ واحتضانها عند 33 درجة مئوية.
- قم بتغيير الوسيط في اليوم التالي. عندما تصل الخلايا إلى 70٪ -80٪ التقاء ، عادة بعد 5 أيام ، قم بنقلها إلى قارورة زراعة الخلايا T75 سم2 .
- لتمييز الخلايا إلى النمط الظاهري البطاني ، انقل الخلايا إلى ظروف غير متساهلة عند 37 درجة مئوية في وسط النمو بدون IFNγ.
7. تمرير ميتوديندرا 2-GECs
- قم بإزالة الوسط ، واغسل الخلايا باستخدام PBS ، وأضف 3 مل من محلول التربسين-EDTA الدافئ بنسبة 0.25٪ (T75 سم2 قارورة) ، واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- عندما يتم فصل الخلايا ، أضف 5 مل من وسط النمو والماصة لأعلى ولأسفل. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وانقل الخلايا إلى دورق أو صفيحة جديدة مغلفة بالكولاجين IV.
ملاحظة: يجب أن يتم التمرير مرة واحدة في الأسبوع بنسبة 1: 4.
8. توصيف ميتوديندرا 2-GECs
- إجراء تلطيخ المناعي ل CD31 على الخلايا المتمايزة7،18،19،20 (الشكل 4D). استخدم علامات أخرى مثل vWF و Isolectin-B4 وكذلك20.
- لتأكيد خصوصية الميتوكوندريا في Dendra2 ، قم بتسمية الخلايا بعلامات خاصة بالميتوكوندريا عن طريق احتضان الخلايا في وسط نمو يحتوي على 100 نانومتر من متعقب الميتوكوندريا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2.
- قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا برفق باستخدام وسط دافئ مسبقا بدون الفينول الأحمر لأداء التصوير الحي.
ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تثبيت الخلايا باستخدام مثبتات الفورمالديهايد (4٪) لمدة 30 دقيقة متبوعة بالغسيل عدة مرات في برنامج تلفزيوني. يمكن تخزين الخلايا الثابتة عند 4 درجات مئوية في 1x PBS حتى الاستخدام. من الممكن أيضا تأكيد قياس التدفق الخلوي: تسمية الخلايا بمضادات CD31 ومكافحة PECAM ومكافحة CD45. يجب أن تكون GECs سلبية لعلامات podocyte (synaptopodin ، Nphs1 ، Podxl) ، علامات الخلايا المتوسطة (PDGFRβ ، angiotensinogen) ، وعلامات الخلايا الأنبوبية (Aquaporin ، Aminopeptidase-N). هذه العلامات بمثابة ضوابط سلبية. نظرا لتعبير Dendra2 الخاص بالميتوكوندريا لهذه الخلايا ، تجنب استخدام قناة FITC.
9. تصوير الخلايا الحية للتغيرات الهيكلية للميتوكوندريا استجابة للإجهاد التأكسدي أو ارتفاع نسبة الجلوكوز
- لوحة 1 × 105 GECs على طبق ذو قاع زجاجي 35 مم مغطى بالكولاجين الوريدي باستخدام وسط نمو الخلايا البطانية (جدول المواد). بعد 24 ساعة ، قم بالتغيير إلى متوسط بدون الفينول الأحمر. تحتوي الخلايا على ميتوكوندريا خضراء فلورية.
- اضبط الغرفة البيئية على 37 درجة مئوية ، ورطوبة 5٪ ، و 5٪ CO2 1 ساعة قبل بدء التجربة.
- تحت المجهر متحد البؤر ، استخدم هدف 40x / 1.2 W لضبط التركيز وتحديد المنطقة محل الاهتمام. احتضان الخلايا ب 2 مل من 5 مليمول أو 25 مليمول من الجلوكوز لمدة 60 دقيقة.
- تعريض الخلايا لليزر 405 نانومتر (4٪ طاقة الليزر) لتحويل مجموعة فرعية من الميتوكوندريا من الأخضر إلى الأحمر (الشكل 5A-B ، D-E).
- استخدم ليزر 561 نانومتر لإثارة Dendra2 في الحالة غير المحولة لتصور التألق الأحمر. راجع بروتوكول تبديل الصور المفصل كما هو موضح سابقا16. تظهر أحداث الاندماج على شكل مضان أصفر بعد عدة دقائق بسبب المصفوفة الخضراء واندماج المصفوفة الحمراء (الشكل 4C ، F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في هذه المقالة ، تم وصف بروتوكول مفصل لعزل الخلايا البطانية الكبيبية الخالدة المشروطة مع الميتوكوندريا الفلورية المستقرة (mitoDendra2-GECs) (الشكل 1). يعد استخدام الفئران الصغيرة التي تتراوح أعمارها بين 6 و 10 أسابيع أمرا ضروريا للحصول على عدد كبير من الخلايا السليمة. بعد 3 أيام من المزرعة ، تبدأ الخلايا في النمو ببطء من الكبيبات المعزولة ، كما هو موضح في الشكل 3G. بعد 7 أيام ، تكون الخلايا غير متجانسة ، وتظهر أنواعا أخرى من الخلايا الكبيبية ، مثل الخلايا البودية والخلايا الظهارية الجدارية والخلايا المتوسطة (الشكل 4 أ). بعد الوصول إلى التقاء 70٪ إلى 80٪ ، تمت إزالة الخلايا الكبيبية الأخرى باستخدام مجموعة إيجابية من الخلايا البطانية مع حبات CD31 المغناطيسية (الشكل 4B-C). عبرت mitoDendra2-GECs عن CD31 (الشكل 4D) وكانت سلبية لعلامة podocyte كما هو موضح في تلطيخ synaptopodin السلبي (الشكل 4E-F).
تسمح ميزة الميتوكوندريا الفلورية في mitoDendra2-GECs بدراسة مورفولوجيا الميتوكوندريا في ظل ظروف مختلفة في المختبر. هنا ، اختبرنا تأثير الجلوكوز العالي (25mM) على بنية الميتوكوندريا في mitoDendra2-GECs (الشكل 5D-F). مقارنة بالميتوكوندريا الممدودة المرئية في الخلايا تحت الجلوكوز الطبيعي (5mM; الشكل 5A-C) ، تجزئة أو انشطار الميتوكوندريا الناجم عن الجلوكوز كما لوحظ بواسطة الميتوكوندريا البارزة على شكل كروية (الشكل 5E). علاوة على ذلك ، استخدمنا ليزر 405 نانومتر لتحويل مجموعة فرعية مختارة من الميتوكوندريا في ميتوديندرا 2-GEC حي واحد (الشكل 5 أ ، د). في الشكل 5B والشكل 5E ، يتم تقديم تبديل الصور الناجح للميتوكوندريا من الأخضر (488 نانومتر) إلى الأحمر (561 نانومتر) في المنطقة المحددة. الأهم من ذلك ، أنه سمح بمشاهدة أحداث الاندماج في mitoDendra2-GECs المزروعة تحت الجلوكوز الطبيعي ، كما يمكن ملاحظته من خلال التألق الأصفر والأخضر والأحمر المدمج نتيجة اندماج مصفوفة الميتوكوندريا (الشكل 5C). في المقابل ، في mitoDendra2-GEC عالي المعالجة بالجلوكوز ، كانت الميتوكوندريا مجزأة وكانت حمراء بشكل أساسي (الشكل 5F) ، مما يشير إلى أنه في الإطار الزمني الذي تم اختباره ، تأخرت أحداث الانشطار / الاندماج أو تم تثبيطها بسبب الضرر الناجم عن علاج الجلوكوز العالي ، وهذا يتوافق مع التقارير السابقة18,19.
الشكل 1: وصف تمثيلي لعزل GEC للفئران. يمثل الرسم البياني الخطوات المهمة لعزل GEC ، بدءا من تخلل قلب الفئران بالخرز المغناطيسي لعزل كبيبات الكلى ، وهضم الكولاجين ، وثقافة الخلايا الكبيبية ، وأخيرا ، تنقية GEC باستخدام الخرز المطلي ب CD31. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: وصف تشريح الكلى. صورة تمثيلية لجميع الأدوات الجراحية المعقمة اللازمة للتشريح. هناك حاجة إلى مقص (أ) لفتح جلد الفأر ، وهناك حاجة إلى مقص منفصل (ب ، ج) لعزل الكلى. هناك حاجة إلى ملاقط (د) و (ه) لتثبيت الجلد. هناك حاجة إلى الملقط (و) لجمع الكلى تشريح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: وصف حصاد الكبيبات. أ: استخدم البطين الأيسر بمحلول حبات HBSS باستخدام محقنة سعة 20 مل. ثقب الوريد الأجوف السفلي بإبرة 19 غرام. (ب) بعد التروية ، قم بإزالة الدهون من الكلى وقطعها إلى قطع 1 مم. ج: هضم الأنسجة باستخدام كولاجيناز النوع الثاني. (د) بعد الهضم والطرد المركزي ، تتشكل ثلاث طبقات ؛ توجد الخرز التي تحمل الكبيبات في الطبقة الوسطى ، كما هو موضح بالسهم الأسود. ه: افصل الخرزات المعزولة التي تحمل الكبيبات باستخدام المكثف المغناطيسي. (و) صورة تمثيلية للكبيبات المعزولة حديثا. (ز) نمو الخلايا من الكبيبات المعزولة بعد 3 أيام. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: مقايسة الميتوكوندريا في المختبر. أ: الخلايا الكبيبية بعد 3 أيام من الزرع. (ب) GEC بعد 7 أيام. (د) تنقية GEC بالخرز المسمى CD31. التصوير المجهري لتلطيخ CD31. ه: GECs سالبة للسينابتوبودين. (F) Podocytes ملطخة ب synaptopodin (488 نانومتر ، مضان أخضر) كعنصر تحكم سلبي. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: التصوير المجهري لاندماج الميتوكوندريا الفلورية في المختبر. تم الحصول على الصور باستخدام مجهر متحد البؤر باستخدام هدف مائي 40x. (أ-ب) تمت إضاءة المنطقة المحددة (الدائرة الحمراء) بخط 405 نانومتر (طاقة ليزر 4٪) لتكرار تبييض 300 بسرعة 6.3-12.61 / بكسل ، كما هو موضح سابقا16. (أ - ج) الخلايا في وسط النمو التي تحتوي على 5 mM الجلوكوز. يظهر التألق الأخضر (488 نانومتر) الميتوكوندريا الصحية. (ب، ه) تم تحويل الميتوكوندريا إلى اللون الأحمر (567 نانومتر). (ج) يكتشف التألق الأصفر حدث اندماج نشط ل GEC المعالج بجلوكوز 5mM. د: عولجت الخلايا بجلوكوز مرتفع 25 mM لمدة 30 دقيقة. يظهر التألق الأخضر الميتوكوندريا المجزأة و (ه) الجزء الذي تم تحويله إلى اللون الأحمر. (و) يوضح الشكل انخفاض حدث الاندماج كما هو موضح من خلال انخفاض التألق الأصفر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الميتوكوندريا ضرورية لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، والتوازن ، واستجابات الإجهاد ، ويرتبط اختلالها الوظيفي بالعديد من الأمراض ، بما في ذلك أمراض الكلى. الميتوكوندريا لها دور في التوليد المرضي لأنواع الأكسجين التفاعلية المفرطة (ROS) ، وتنظيم مستويات الكالسيوم داخل الخلايا ، ومسارات موت الخلايا ، وديناميكيات الهيكل الخلوي21،22،23.
يمثل عزل GECs الفئران تحديا بسبب صغر عددها وحجمها وعوامل المصفوفة وطبيعتها المترابطة مع الخلايا الكبيبية الأخرى الضرورية لبقائها. تقدم المقالة الحالية بروتوكولا مفصلا لعزل GEC للماوس. على وجه التحديد ، استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا كأداة للحصول على خطوط خلايا خالدة مشروطة ذات إمكانات انتشار عالية. تتيح الفئران المعدلة وراثيا ، التي تعبر عن مستضد T الكبير tsA58 لفيروس سيميان 40 (SV40) ، تنشيط الانتشار المستمر في ظل ظروف متساهلة عند 33 درجة مئوية وتم عبورها هنا مع الفئران المستأصلة PHAM التي تعبر عن مضان خاص بالميتوكوندريا. قدمت الفئران المعدلة وراثيا المزدوجة أداة ممتازة لدراسة بنية الميتوكوندريا. في الواقع ، تحمل الفئران المستأصلة PHAM الخاصة بالميتوكوندريا (الوحدة الفرعية الثامنة من السيتوكروم ج أوكسيديز) Dendra2 الأخضر ، مما يسمح بالكشف الحي عن الميتوكوندريا الفلورية ومراقبة أحداث الانشطار والاندماج من خلال تبديل الصور باللون الأخضر والأحمر16.
يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات مهمة: استخراج الكبيبات باستخدام الخرز ، وتكاثر الخلايا الكبيبية ، والتنقية اللاحقة ل GEC باستخدام حبات CD31 بمجرد أن تكون الخلايا في الثقافة. استخدام هضم واحد فقط مع كولاجيناز يكفي لعزل الخلايا الكبيبية. تستخدم البروتوكولات الأخرى عملية هضم ثانية مع DNAse و proteinase24. ومع ذلك ، فقد لاحظنا إنتاجية أفضل للخلايا مع خطوة هضم واحدة فقط. قد يظل الحمض النووي نشطا ويبطئ تكاثر الخلايا. علاوة على ذلك ، يمكن عزل GEC باستخدام الغربلة التفاضلية كما هو موضح سابقا20 ، وهو ليس بالأمر السهل دائما عند استخدام كلى الفئران.
من الضروري تعقيم جميع الأدوات الجراحية قبل البدء في عزل الكلى والكبيبات لتجنب التلوث. علاوة على ذلك ، من المهم تصفية واستكمال المحاليل بالمضادات الحيوية للقضاء على أي مصدر للملوثات. في الواقع ، قد تسبب عدوى الميكوبلازما أمراضا خلوية تتداخل بالتالي مع كل معلمة تقاس في زراعة الخلايا25.
يعتمد عزل الكبيبات على نضح الخرز داخل القلب. بالتأكيد ، التروية البطيئة مع 20 مل من الخرز المحتوي على 1x HBSS ضروري لحصاد عدد كبير من الكبيبات. سيتم حبس الخرز في الكبيبات ، مما يسهل تنقيتها باستخدام مكثف مغناطيسي. يمكن تحضير الخرزات وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 15 يوما قبل استخدامها لتسهيل الإجراء التجريبي.
علاوة على ذلك ، فإن هضم الكبيبات مع الاهتزاز المستمر أمر بالغ الأهمية لفصل عدد كبير من الكبيبات عن الكلى. من ناحية أخرى ، فإن عزل GECs الفئران يمثل تحديا بسبب صغر حجمها ووجود خلايا كبيبية أخرى. لذلك ، فإن العزل التدريجي للكبيبات ، ونمو جميع الخلايا الكبيبية في الثقافة ، والاستخدام اللاحق للخرز المطلي ب CD31 لتنقية الخلايا البطانية أمر حيوي ، وتحديدا للحصول على أعداد أكبر من GECs القابلة للحياة والتكاثرية المشروطة. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى التحقق من نقاء الخلايا مع تلطيخ المناعة وقياس التدفق الخلوي.
بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول توصيف النمط الظاهري GEC ومقايسة اندماج / انشطار الميتوكوندريا في المختبر. تعد mitoDendra2-GECs أداة ممتازة لدراسة الاستجابات الخلوية للميتوكوندريا GEC للمحفزات المختلفة في المختبر دون الحاجة إلى النقل أو التلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة للإعلان عنها.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون البروفيسور سيجيانغ هي والدكتور فو جيا على رؤيتهم في عزل الخلايا البطانية للفئران ويشكرون البروفيسور مون زيدي على توفير الفئرانالمستأصلة والمناقشات القيمة. يود المؤلفون أيضا أن يعربوا عن تقديرهم ل Microscopy CORE في كلية Icahn للطب في Mount Sinai والموظفين على التوجيه الذي تلقيناه. تم دعم هذا العمل من خلال منح من منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK097253 ومنحة وزارة الدفاع CDMRP E01 W81XWH2010836 إلى I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
