Summary
Artiklen beskriver metoden til isolering af betinget udødeliggjorte glomerulære endotelceller fra nyrerne hos transgene mus, der udtrykker den termolabile simianvirus 40 og fotoaktiverbare mitokondrier, PhAMudskåret. Vi beskriver proceduren for glomeruli-isolering fra hele nyrer ved hjælp af perler, fordøjelsestrin, såning og dyrkning af GECs-CD31-positive.
Abstract
Glomerulær endotelcelle (GEC) dysfunktion kan initiere og bidrage til glomerulær filtreringsbarrierenedbrydning. Øget mitokondriel oxidativ stress er blevet foreslået som en mekanisme, der resulterer i GEC-dysfunktion i patogenesen af nogle glomerulære sygdomme. Historisk set har isoleringen af GEC'er fra in vivo-modeller været notorisk udfordrende på grund af vanskeligheder med at isolere rene kulturer fra glomeruli. GEC'er har komplekse vækstkrav in vitro og en meget begrænset levetid. Her beskriver vi proceduren for isolering og dyrkning betinget udødeliggjorte GEC'er med fluorescerende mitokondrier, hvilket muliggør sporing af mitokondriefission og fusionshændelser. GEC'er blev isoleret fra nyrerne hos en dobbelt transgen mus, der udtrykte den termolabile SV40 TAg (fra Immortomouse), betinget fremme proliferation og undertrykkelse af celledifferentiering og et fotokonvertibelt fluorescerende protein (Dendra2) i alle mitokondrier (fra den fotoaktiverbare mitokondrier [PhAMudskåret] mus). Den genererede stabile cellelinje giver mulighed for celledifferentiering efter inaktivering af det udødeliggørende SV40 TAg-gen og fotoaktivering af en delmængde af mitokondrier, der forårsager en skift i fluorescens fra grøn til rød. Brugen af mitoDendra2-GEC'er giver mulighed for levende billeddannelse af fluorescerende mitokondriers fordeling, fusion og fissionshændelser uden at farve cellerne.
Introduction
Glomerulus er kritisk for blodfiltrering ved at begrænse passagen af store molekyler gennem den glomerulære filtreringsbarriere 1,2. Glomerulus indeholder fire celletyper: parietale epitelceller, podocytter (viscerale epitelceller), glomerulære endotelceller (GEC) og mesangialceller3. Det glomerulære endotel er kendetegnet ved en unik vaskulær struktur i henhold til tilstedeværelsen af fenestrae, der kræves til store filtreringsvolumener4. Den apikale overflade af det glomerulære endotel er dækket af et negativt ladet glycocalyxlag og et lag kaldet endoteloverfladelaget, der skaber et mellemrum mellem endotelet og blodet. Denne struktur tilvejebringer høj ladningsselektivitet, der begrænser passagen af negativt ladede molekyler såsom albumin og forhindrer leukocyt- og blodpladeadhæsion5.
GEC'er er meget følsomme over for metaboliske ændringer, såsom hyperglykæmi forbundet med diabetisk miljø. Faktisk fører diabetes til øget cirkulation af skadelige stoffer, mætning af glukosemetabolismeveje og forstyrret cellulær redoxbalance 3,6. Desuden inducerer stigningen i reaktive iltarter mitokondriel dysfunktion, som påvirker endotelfunktionen7.
Det overordnede mål med den nuværende protokol er at isolere udødeliggjorte glomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondriefunktioner. Faktisk har cellekulturen af primære GEC'er en begrænset proliferativ cyklus og tidlig ældning8. Derudover hjælper tilstedeværelsen af fluorescerende mitokondrier med at undersøge fissions- og fusionshændelser som reaktion på hyperglykæmi eller anden behandling. Som en alternativ metode brugte andre laboratorier h-TERT til at udødeliggøre celler in vitro9.
Metoden beskrevet her tillader isolering af betinget udødeliggjort mitoDendra2 glomerulære endotelceller fra 4-6 uger gamle dyr (figur 1). Denne detaljerede protokol beskriver brugen af transgene mus (H-2K b-tsA58), der huser simianvirus 40 stort tumorantigen (SV40 TAg) gen10,11 til generering af termolabile betinget udødeliggjorte celler. TsA58 TAg-genproduktet er funktionelt ved den tilladte temperatur på 33 °C under kontrol af den inducerbare 5' flankerende promotor af musens H-2Kb-gen, som øges over basale niveauer ved eksponering for interferon gamma (IFNγ), og opretholder derfor den betingede proliferationsfænotype12. H-2Kb nedbrydes hurtigt ved den ikke-tilladte temperatur på 37 °C i fravær af IFNγ, hvilket fjerner den udødeliggørende funktion af tsA58Tag i celler og gør det muligt for cellerne at udvikle en mere differentieret fænotype13,14,15. Valgfri krydsning af H-2Kb-tsA58 transgene mus med PhAM-mus, som udtrykker en mitokondrie-specifik (underenhed VIII af cytokrom c oxidase) Dendra2-grøn, tillader levende påvisning af fluorescerende mitokondrier16. Dendra2 grøn fluorescens skifter til rød fluorescens efter eksponering for en 405 nm laser16. Når mitokondrier smelter sammen efter fotoskift, danner de aflange former, der ser gule ud fra udveksling af grønt og gult materiale eller ser røde ud, når de gennemgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC'erne er et godt værktøj til at studere de cellulære reaktioner fra GEC-mitokondrier på forskellige stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet her blev godkendt af IACUC på Icahn School of Medicine på Mount Sinai. Vi brugte tre hanmus (H-2Kb-tsA58 transgene mus med fotoaktiverbare mitokondrier [PhAM]) købt fra Jackson lab og holdt på en normal chow-diæt.
1. Arbejdsvilkår og forberedelser
- Rengør arbejdsområdet inde i den laminære flowhætte ved hjælp af 70 % ethanol og UV-C-lys.
- Forbered perlens vaskebuffere. Lav buffer-1 ved hjælp af 0,1 M natriumphosphat ved pH 7,4-8,0, buffer-2 ved anvendelse af 1x phosphatbufferet saltvand (PBS) uden calcium og magnesium suppleret med 0,1% bovin serumantigen (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 og buffer-3 ved anvendelse af 0,2 M Tris med 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Magnetisk partikelkoncentrator
- Forberedelse af magnetiske perler
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes forsigtigt 200 μL magnetiske perler (4 x 108 perler) med 200 μL buffer-1.
BEMÆRK: Forbered 200 μL magnetiske perler pr. Mus 1 dag før vævshøst. Perlerne vil blive brugt til at høste glomeruli. - Placer røret i en magnetisk partikelkoncentrator i 1 minut, og opsug derefter forsigtigt supernatanten. Fjern røret fra magneten, og suspender de vaskede perler igen i 200 μL buffer-1.
- Anbring røret indeholdende magnetperlerne i magnetpartikelkoncentratoren i 1 minut og opsug forsigtigt supernatanten.
- Inaktiver de frie tosylgrupper ved at vaske magnetperlerne 2x, 5 min hver, ved hjælp af 200 μL buffer-2 ved at placere røret i den magnetiske partikelkoncentrator og kassere bufferen.
- De magnetiske perler inkuberes i 200 μL buffer-3 i 24 timer ved 4 °C eller i 4 timer ved 37 °C for at inaktivere de resterende frie tosylgrupper. Anbring røret i den magnetiske koncentrator i 1 min., opsug forsigtigt supernatanten, og kassér den.
- Magnetperlerne vaskes 1x med 200 μL buffer-2 i 5 minutter ved 4 °C. Placer røret tilbage i den magnetiske koncentrator i 1 minut og opsæt forsigtigt supernatanten. Røret fjernes fra den magnetiske koncentrator, og magnetperlerne genoptages i 200 μL buffer-2 for at opnå 4 x 108 perler/ml.
BEMÆRK: På dette tidspunkt er det muligt at lade perlerne stå ved 4 °C i op til 15 dage.
- I et 1,5 ml mikrocentrifugerør blandes forsigtigt 200 μL magnetiske perler (4 x 108 perler) med 200 μL buffer-1.
3. Isolering af mus nyre glomerulære celler
- Forbered perfusionsmaterialet: 30 ml sprøjte, 25 G sommerfuglnål. Forbered isoleringsmaterialet: steril 10 cm skål, skalpel, magnetisk partikelkoncentrator, 40 μm cellesi, 100 μm cellesi.
- Forbered 100 ml 1x Hank's Balanced saltopløsning (HBSS) suppleret med 1% antibiotika og juster pH til 7,35. Opløsningen filtreres med et 0,2 μm filter, og holdes under emhætten for at undgå forurening.
- Bland 200 μL magnetiske perler fra trin 2.1.6 med 20 ml 1x HBSS.
BEMÆRK: For hver mus vil der være behov for 200 μL perler fortyndet i 20 ml HBSS 1x. - Der fremstilles en 1 ml aliquot af collagenase type II (125 CDU/mg) ved 1 mg/ml i 1x HBSS-opløsning, pH 7,35. Forvarm omdrejningstallet med 10% FCS-medium i et vandbad ved 37 °C. Forvarm endotelcellekulturmediet ved 37 °C (se materialetabel for detaljer).
BEMÆRK: RPMI vil blive brugt til at neutralisere collagenasen. - Forovertræk to brønde af en 6-brønds plade med 2 ml 10 μg / ml kollagen IV (1 ml / brønd) i 45 minutter ved stuetemperatur. Pladen vaskes 3x med 1x PBS for at fjerne eddikesyren, der bruges til at fortynde kollagenet. Brug de overtrukne plader med det samme, eller opbevar dem ved 2-8 °C i op til 4 uger.
BEMÆRK: Forsegling af pladen (e) med en gennemsigtig film foretrækkes for at forhindre udtørring. Kollagenbelægningen letter fastgørelsen af celler til pladen. - Rengør og steriliser alle de kirurgiske instrumenter i figur 2 ved at bruge 70% ethanol og derefter autoklavere dem i 30 min. Rengør det kirurgiske arbejdsområde med 70% ethanol.
- Anæstetiser musene med en intraperitoneal injektion af ketamin/xylazin (10 mg/ml ketamin og 1 mg/ml xylazin). For at bekræfte, at dyret er fuldt bedøvet, skal du kontrollere tåspidsrefleksen.
- Fastgør musens poter med 19 G nåle for at holde den på plads på en dissektionsplatform. Rengør brystet og maven med 70% ethanol, og åbn maven langs brystet med saks a (figur 2).
- Indsæt en sommerfuglnål i venstre ventrikel (figur 3A) og injicer ca. 100 μL af perleopløsningen (fra trin 1.2) for at udvide blodcirkulationen.
- Bryd forsigtigt den ringere vena cava under nyrerne med en 19 G nål (figur 3A). Fortsæt den perfusion, der blev indledt i trin 3.9.
BEMÆRK: Alternativt kan en minipumpe bruges ved hastighed: 18,0+, tid: 5 min. God perfusion er vigtig for at høste et stort antal glomerulibærende magnetiske perler. Dette er en ikke-overlevelse / terminal procedure. - Fjern forsigtigt fedtvævet med pincet og skær begge nyrer med tynd kirurgisk saks c (figur 2) og læg dem i en plade med 1 ml 1x HBSS på is. Hak nyren med saks b (figur 2) og derefter med en steril skalpel til 1 mm små stykker som vist i figur 3B.
- Derefter inkuberes den hakkede nyre med 1 ml collagenase type II fra trin 3.4 i 35 minutter ved 37 °C med blid hældning ved hjælp af en vandret ryster. Vævet skal fordøjes fuldstændigt efter dette trin, som vist i figur 3C.
- Tilsæt 4 ml RPMI med 10% FBS (fra trin 3.4) for at neutralisere collagenasen. Filtrer det fordøjede væv gennem en steril 100 μm cellesi i et 50 ml rør. Brug bunden af et sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerør til at røre det fordøjede væv mod silen for at lade glomeruli gå igennem.
- Skyl cellesilen med 15 ml 1x HBSS og centrifuger derefter gennemstrømningen ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. På dette tidspunkt indeholder pelleten tre lag; perlerne med glomeruli er synlige i rørets midterste lag, det øverste lag består af mindre strukturer såsom rør, og bundlaget er snavs (figur 3D).
- Opsæt forsigtigt supernatanten og det øverste hvide lag. Den resterende pellet indeholder perlerne med glomeruli og snavs (figur 3D). Resuspender pelleten med 1,5 ml 1x HBSS og overføres til et 2 ml rør.
- Placer røret i den magnetiske koncentrator (figur 3E), opsæt supernatanten, og vask derefter perlerne 2x med 1 ml 1x HBSS; på dette stadium sættes 20 μL af cellesuspensionen på et dias for at verificere tilstedeværelsen af glomeruli under mikroskopet (figur 3F; en glomerulus [sort pil] og nogle perler [gule pile] i suspensionen).
- Opsæt forsigtigt supernatanten, suspender pelleten i endotelcellevækstmedium (materialetabel), og overfør den til et rent 2 ml rør. Der tilsættes 2 μL IFNγ (100 U/ml) til røret og cellerne hældes på en brønd i en 6-brønds plade. Inkubere cellerne ved 33 °C.
- Efter 3 dages dyrkning ændres mediet forsigtigt ved at pipettere 1 ml af mediet ud og erstatte det med 1 ml friske medier. På dette stadium er cellerne heterogene med en blanding af glomerulære celler (figur 4G).
BEMÆRK: I den voksende kultur vil der være en blanding af glomerulære celler og nogle magnetiske perler (figur 4G). Bemærk, at alle cellerne skal vise grønne, fluorescerende mitokondrier. - Efter 7 dages dyrkning aspireres mediet fuldstændigt og erstattes med et frisk 2 ml endotelcellevækstmedium suppleret med IFNγ (100 U / ml). På dette stadium begynder cellerne at sprede sig, men er stadig heterogene (figur 4A).
- Efter 10 dages dyrkning, når cellerne når ~ 80% sammenløb, skal du passere cellerne ved hjælp af trypsin som beskrevet i trin 5.1 og derefter overføre dem til en T25-kolbe belagt med kollagen IV.
- Efter 1 uge (i alt ~ 21 dages kultur) passerer cellerne til en T75-kolbe belagt med kollagen IV.
4. Forberedelse af perler til endotelcelleisolering
- Start med at belægge fåreanti-rotteperlerne med et rotteanti-mus CD31-antistof 3,18,19. Brug 10 μL perler til hver T75-kolbe.
- Vask 10 μL perler 3x med 200 μL 1x PBS suppleret med 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Placer røret i koncentratormagneten for at pipettere vaskebufferen hver gang.
- Resuspender perlerne i 200 μL PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Der tilsættes 4,8 μL CD31-antistof mod mus til rotter 7,18,19, røret anbringes på en vandret ryster og blandes forsigtigt i 1 time ved stuetemperatur, og derefter holdes røret ved 4 °C natten over.
5. Isolering af de glomerulære endotelceller med CD31-belagte perler
- Der tilsættes 3 ml 0,25% trypsin til en T75-kolbe og cellerne inkuberes ved 37 °C i 5 min. Neutraliser trypsinen med 3 ml endotelvækstmedium, overfør cellerne til et 15 ml rør, og centrifuger derefter ved 200 x g i 5 minutter.
- Supernatanten aspireres og cellerne vaskes i 1 ml PBS indeholdende 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Centrifuge ved 200 x g i 5 min.
- Pelleten gensuspenderes i 200 μL overtrukne perler tilberedt i trin 4, og der tilsættes 800 μL PBS indeholdende 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Cellerne inkuberes i 45 minutter med kontinuerlig omrystning ved 37 °C, 5 % CO2.
- Anbring røret i den magnetiske koncentrator og vask cellerne 4x med 1x PBS indeholdende 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Resuspender cellerne i 3 ml endotelvækstmedium suppleret med 100 U / ml IFNγ.
- Plade 1,5 ml celler/brønd i kollagen IV-belagte brønde på en 6-brønds plade. Dyrkning af cellerne under tilladelige forhold ved 33 °C.
BEMÆRK: De isolerede celler udtrykker simian virus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, hvilket muliggør aktivering af kontinuerlig proliferation ved 33 ° C (tilladelig tilstand). - Efter 4 dage i dyrkning fjernes 750 μL af mediet, og det erstattes med samme volumen frisk medium suppleret med 100 U/ml IFNγ.
- Efter 10 dage til 14 dages dyrkning skal du kontrollere, om der er voksende CD31-positive GECs-kolonier (figur 4C), der udtrykker fluorescerende mitokondrier ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med et 488 nm filter.
- Efter 21 dages kultur kan cellerne have nået 80% -90% sammenløb; overfør dem til en T25-kolbe. Efter at have nået sammenløb kan celler opretholdes med RPMI-vækstmedium og 10% FCS.
BEMÆRK: Før cellerne når sammenløb, kan de se heterogene ud (figur 4B). Men når de er sammenflydende, får de en brostensmorfologi. - På dette stadium kunne cellerne kryopræserveres. Når du når 80% sammenløb, tilsættes 3 ml 0,25% trypsin til cellerne og inkuberes dem ved 37 ° C i 5 minutter. Neutraliser trypsin med et lige stort volumen vækstmedium suppleret med 10% FBS.
- Centrifuge ved 200 x g i 5 min. Kassér supernatanten og suspender cellerne i 3 ml frysemedium (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot cellerne i kryorør og opbevar dem i flydende nitrogendamptemperatur.
6. Dyrkning af mitoDendra2-GECs
- Optø cellerne fra kryoalikvoten fra trin 5.10 i et vandbad ved 37 ° C og overfør dem til et 15 ml rør med 10 ml forvarmet endotelvækstmedium.
- Centrifuger suspensionen ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Mediet fjernes, og pelleten overføres til den kollagen IV-belagte T25 cm 2-cellekulturkolbe med forvarmet endotelcellevækstmedium suppleret med 100 U/ml IFNγ og inkuberes ved 33 °C.
- Skift mediet næste dag. Når cellerne når 70% -80% sammenløb, normalt efter 5 dage, overføres dem til en T75 cm2 cellekulturkolbe.
- For at differentiere cellerne til endotelfænotype overføres cellerne til ikke-tilladte forhold ved 37 °C i vækstmedier uden IFNγ.
7. Passaging af mitoDendra2-GECs
- Mediet fjernes, cellerne vaskes med PBS, og der tilsættes 3 ml varm 0,25% trypsin-EDTA-opløsning (T75 cm2 kolbe), inkuberes ved 37 °C i 5 min.
- Når cellerne er løsrevet, tilsættes 5 ml vækstmedium og pipetter op og ned. Suspensionen centrifugeres ved 200 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, og cellerne overføres til en ny kollagen IV-belagt kolbe eller plade.
BEMÆRK: Passaging skal udføres en gang om ugen i forholdet 1: 4.
8. Karakterisering af mitoDendra2-GECs
- Udfør immunfluorescensfarvning for CD31 på differentierede celler 7,18,19,20 (figur 4D). Brug andre markører som vWF og Isolectin-B4 samt20.
- For at bekræfte mitokondriespecificitet af Dendra2 skal du mærke celler med mitokondriespecifikke markører ved at inkubere cellerne i vækstmedium indeholdende 100 nM mitokondrietracker i 30 minutter ved 37 °C, 5% CO2.
- Fjern mediet, og vask cellerne forsigtigt med forvarmet medium uden phenolrødt for at udføre levende billeddannelse.
BEMÆRK: Alternativt kan celler fastgøres ved hjælp af formaldehydfikseringsmidler (4%) i 30 minutter efterfulgt af vask flere gange i PBS. Faste celler kan opbevares ved 4 °C i 1x PBS indtil brug. En bekræftelse med flowcytometri er også mulig: etiketceller med anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. GEC'er bør plette negativt for podocytmarkører (synaptopodin, Nphs1, Podxl), mesangialcellemarkører (PDGFRβ, angiotensinogen) og rørformede cellemarkører (Aquaporin, Aminopeptidase-N). Disse markører tjener som negative kontroller. På grund af den mitokondriespecifikke Dendra2-ekspression af disse celler skal du undgå at bruge FITC-kanalen.
9. Levende cellebilleddannelse af mitokondrier strukturelle ændringer som reaktion på oxidativ stress eller høj glukose
- Plade 1 x 105 GEC'er på et 35 mm glasbundet fad belagt med kollagen IV ved hjælp af endotelcellevækstmedium (materialetabel). Efter 24 timer ændres til medium uden phenolrød. Celler har grønne, fluorescerende mitokondrier.
- Miljøkammeret indstilles til 37 °C, 5 % luftfugtighed og 5 % CO2 1 time før forsøgets start.
- Under et konfokalmikroskop skal du bruge et 40x/1,2 W-mål til at justere fokus og vælge interesseområdet. Inkuber cellerne med 2 ml 5 mM eller 25 mM glucose i 60 min.
- Udsæt cellerne for en 405 nm laser (4% lasereffekt) for at fotokonvertere en underpopulation af mitokondrier fra grøn til rød (figur 5A-B, D-E).
- Brug 561 nm laseren til at begejstre Dendra2 i ukonverteret tilstand for at visualisere den røde fluorescens. Se den detaljerede fotoskifteprotokol som tidligere beskrevet16. Fusionsbegivenhederne vises som gul fluorescens efter flere minutter på grund af grøn matrix og rød matrixfusion (figur 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne artikel beskrives en detaljeret protokol til isolering af betinget udødeliggjorte glomerulære endotelceller med stabile fluorescerende mitokondrier (mitoDendra2-GEC'er) (figur 1). Brugen af unge 6-10 uger gamle mus er afgørende for at opnå et betydeligt antal sunde celler. Efter 3 dages dyrkning begynder cellerne at vokse langsomt fra de isolerede glomeruli, som vist i figur 3G. Efter 7 dage er cellerne heterogene og viser andre glomerulære celletyper, såsom podocytter, parietale epitelceller og mesangialceller (figur 4A). Efter at have nået 70% til 80% sammenløb blev andre glomerulære celler fjernet ved hjælp af et positivt udvalg af endotelceller med magnetiske CD31-mærkede perler (figur 4B-C). MitoDendra2-GEC'erne udtrykte CD31 (figur 4D) og var negative for podocytmarkør som vist ved synaptopodinnegativ farvning (figur 4E-F).
Den fluorescerende mitokondriefunktion i mitoDendra2-GEC'erne giver mulighed for at studere mitokondrier morfologi under forskellige forhold in vitro. Her testede vi effekten af høj glukose (25mM) på mitokondriernes struktur af mitoDendra2-GEC'er (figur 5D-F). Sammenlignet med de aflange mitokondrier, der er synlige i celler under normal glukose (5mM; Figur 5A-C), høj glucoseinduceret fragmentering eller fission af mitokondrier som observeret af fremtrædende sfæroidformede mitokondrier (figur 5E). Desuden brugte vi en 405 nm laser til at fotokonvertere en udvalgt delpopulation af mitokondrier i en enkelt levende mitoDendra2-GEC (figur 5A, D). I figur 5B og figur 5E præsenteres vellykket fotoskift af mitokondrier fra grøn (488 nm) til rød (561 nm) i det valgte område. Det er vigtigt, at det tillod at være vidne til fusionsbegivenhederne i mitoDendra2-GEC'er dyrket under normal glukose, som det kan observeres af den gule fusionerede grønne og røde fluorescens som følge af mitokondrier matrixfusion (figur 5C). I modsætning hertil var mitokondrierne i den høje glukosebehandlede mitoDendra2-GEC fragmenterede og var hovedsageligt røde (figur 5F), hvilket tyder på, at fissions-/fusionshændelserne i den testede tidsramme blev forsinket eller hæmmet på grund af skaden forårsaget af den høje glukosebehandling, og dette er i overensstemmelse med tidligere rapporter18,19.
Figur 1: Repræsentativ beskrivelse af murine GEC isolation. Diagrammet repræsenterer de væsentlige trin i GEC-isolering, startende fra perfusering af musehjerte med magnetiske perler for at isolere nyreglomeruli, fordøjelsen af collagenase, kulturen af glomerulære celler og endelig rensningen af GEC ved hjælp af CD31-belagte perler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Beskrivelse af nyredissektion. Repræsentativt billede af alle de sterile kirurgiske instrumenter, der er nødvendige for dissektionen. Saks (a) er nødvendige for at åbne musens hud, og et separat par saks (b, c) er nødvendige for at isolere nyrerne. Pincet (d) og (e) er nødvendige for at holde huden. Pincet (f) er nødvendig for at samle den dissekerede nyre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Beskrivelse af høst af glomeruli . (A) Gennemsæt venstre ventrikel med HBSS-perleopløsningen ved hjælp af en 20 ml sprøjte. Perforer den ringere vena cava med en 19 G nål. (B) Efter perfusion fjernes fedtet fra nyrerne og skæres i 1 mm stykker. (C) Vævet fordøjes med collagenase type II. (D) Efter fordøjelse og centrifugering dannes tre lag; Perlerne med glomeruli er i mellemlaget, som angivet med den sorte pil. (E) Adskil de isolerede perler, der bærer glomeruli, ved hjælp af den magnetiske koncentrator. (F) Repræsentativt billede af frisk isolerede glomeruli. (G) Voksende celler fra isolerede glomeruli efter 3 dage. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Mitokondrieanalyse in vitro. (A) Glomerulære celler efter 3 dages dyrkning. (B) GEC efter 7 dage. (D) Oprensning af GEC med CD31-mærkede perler. Mikroskopisk billeddannelse af CD31-farvning. (E) GEC'er er negative for synaptopodin. (F) Podocytter farvet med synaptopodin (488 nm, grøn fluorescens) som en negativ kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Mikroskopisk billeddannelse af fluorescerende mitokondriefusion in vitro. Billeder blev erhvervet med et konfokalt mikroskop ved hjælp af et 40x vandmål. (A-B) Udvalgt område (rød cirkel) blev oplyst med en 405 nm linje (4% lasereffekt) til 300 blegning iterationer med en hastighed på 6,3-12,61 / pixel, som tidligere beskrevet16. (A-C) Celler i vækstmedier indeholdende 5 mM glucose; Grøn fluorescens (488 nm) viser sunde mitokondrier. (B,E) Mitokondrier blev foto-skiftet til rødt (567 nm). (C) Gul fluorescens detekterer en aktiv fusionshændelse af GEC behandlet med 5mM glucose. (D) Celler blev behandlet med høj glucose 25 mM i 30 min. Grøn fluorescens viser fragmenterede mitokondrier og (E) en del, der blev fotoskiftet til rød. (F) Figuren viser en nedsat fusionshændelse som vist ved reduceret gul fluorescens. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrier er kritiske for cellulær metabolisme, homeostase og stressrespons, og deres dysfunktion er forbundet med mange sygdomme, herunder nyresygdom. Mitokondrier har en rolle i den patologiske generering af overdreven reaktiv iltart (ROS), reguleringen af intracellulære calciumniveauer, celledødsveje og cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen af murine GEC'er er udfordrende på grund af deres lille antal, størrelse, matrixfaktorer og indbyrdes afhængige natur med andre glomerulære celler, der er afgørende for deres overlevelse. Den aktuelle artikel præsenterer en detaljeret protokol for mus GEC isolation. Specifikt brugte vi transgene mus som et værktøj til at opnå betinget udødeliggjorte cellelinjer med højt spredningspotentiale. De transgene mus, der udtrykker simianvirus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, muliggør aktivering af kontinuerlig proliferation under tilladelige forhold ved 33 °C og blev her krydset med de PHAM-udskårne mus, der udtrykker mitokondriespecifik fluorescens. De dobbelte transgene mus tilbød et glimrende værktøj til at studere mitokondrier struktur. Faktisk bærer PHAM-udskårne mus mitokondriespecifik (underenhed VIII af cytokrom c oxidase) Dendra2 grøn, hvilket muliggør levende påvisning af fluorescerende mitokondrier og observation af fissions- og fusionshændelser gennem grøn-rød fotoskift16.
Protokollen består af tre væsentlige trin: ekstraktion af glomeruli ved hjælp af perler, spredning af glomerulære celler og efterfølgende oprensning af GEC ved hjælp af CD31-perler, når cellerne er i kultur. Anvendelsen af kun en fordøjelse med collagenase er tilstrækkelig til at isolere glomerulære celler. Andre protokoller gør brug af en anden fordøjelse med DNAse og proteinase24. Vi har dog bemærket bedre celleudbytter med kun et fordøjelsestrin. DNAse kan forblive aktivt og bremse spredningen af cellerne. Desuden kunne GEC isoleres ved hjælp af differentiel sigtning som tidligere beskrevet20, hvilket ikke altid er let, når man bruger mus nyrer.
Det er afgørende at autoklave alle de kirurgiske værktøjer, inden isoleringen af nyrerne og glomeruli påbegyndes for at undgå forurening. Desuden er det vigtigt at filtrere og supplere opløsningerne med antibiotika for at eliminere enhver kilde til forurenende stoffer. Faktisk kan mycoplasmainfektioner forårsage cytopatologi, der følgelig interfererer med alle parametre målt i cellekultur25.
Isoleringen af glomeruli er afhængig af intra-hjerte perfusion af perler. Bestemt er langsom perfusion med 20 ml 1x HBSS-holdige perler afgørende for at høste et stort antal glomeruli. Perlerne vil blive fanget i glomeruli, hvilket letter deres rensning ved hjælp af en magnetisk koncentrator. Perlerne kan tilberedes og opbevares ved 4 °C i op til 15 dage, før de anvendes for at lette den eksperimentelle procedure.
Desuden er fordøjelse af glomeruli med kontinuerlig omrystning afgørende for at adskille et stort antal glomeruli fra nyrerne. På den anden side er isoleringen af murine GEC'er udfordrende på grund af deres lille størrelse og tilstedeværelsen af andre glomerulære celler. Derfor er den trinvise isolering af glomeruli, væksten af alle glomerulære celler i kultur og den efterfølgende anvendelse af CD31-belagte perler til rensning af endotelceller afgørende, specifikt for at opnå et mere signifikant antal levedygtige og betinget proliferative GEC'er. Ikke desto mindre er det nødvendigt at validere renheden af celler med immunostaining og flowcytometri.
Derudover beskriver protokollen karakteriseringen af GEC-fænotypen og mitokondriernes fusions-/fissionsassay in vitro. MitoDendra2-GEC'erne er et glimrende værktøj til at studere de cellulære reaktioner fra GEC-mitokondrier på forskellige stimuli in vitro uden behov for transfektion eller farvning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende økonomiske interesser at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne takker professor Cijiang He og Dr. Fu Jia for deres indsigt i museendotelcelleisolering og takker professor Mone Zaidi for at givePhAM-udskårne mus og værdifulde diskussioner. Forfatterne vil også gerne anerkende mikroskopi CORE på Icahn School of Medicine på Mount Sinai og personale for den vejledning, vi modtog. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health grant R01DK097253 og Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 til I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
