Summary
Het artikel beschrijft de methode voor het isoleren van voorwaardelijk onsterfelijke glomerulaire endotheelcellen uit de nieren van transgene muizen die het thermolabiele simianvirus 40 en foto-activeerbare mitochondriën tot expressie brengen, PhAMweggesneden. We beschrijven de procedure voor glomeruli-isolatie van hele nieren met behulp van kralen, spijsverteringsstappen, zaaien en kweken van GECs-CD31-positief.
Abstract
Glomerulaire endotheelcel (GEC) disfunctie kan glomerulaire filtratiebarrièreafbraak initiëren en eraan bijdragen. Verhoogde mitochondriale oxidatieve stress is gesuggereerd als een mechanisme dat resulteert in GEC-disfunctie in de pathogenese van sommige glomerulaire ziekten. Historisch gezien is de isolatie van GEC's van in vivo modellen notoir uitdagend vanwege moeilijkheden bij het isoleren van zuivere culturen uit glomeruli. GEC's hebben complexe groeivereisten in vitro en een zeer beperkte levensduur. Hier beschrijven we de procedure voor het isoleren en cultiveren van voorwaardelijk vereeuwigde GEC's met fluorescerende mitochondriën, waardoor mitochondriale splijting en fusiegebeurtenissen kunnen worden gevolgd. GEC's werden geïsoleerd uit de nieren van een dubbele transgene muis die de thermolabiele SV40 TAg (van de Immortomouse) tot expressie bracht, voorwaardelijk proliferatie bevorderde en celdifferentiatie onderdrukte, en een foto-converteerbaar fluorescerend eiwit (Dendra2) in alle mitochondriën (van de foto-activeerbare mitochondriën [PhAMweggesneden] muis). De gegenereerde stabiele cellijn maakt celdifferentiatie mogelijk na inactivatie van het vereeuwigende SV40 TAg-gen en fotoactivering van een subset van mitochondriën die een omschakeling in fluorescentie van groen naar rood veroorzaken. Het gebruik van mitoDendra2-GEC's maakt live beeldvorming mogelijk van de distributie, fusie en splijting van fluorescerende mitochondriën zonder de cellen te kleuren.
Introduction
De glomerulus is van cruciaal belang voor bloedfiltratie door de doorgang van grote moleculen door de glomerulaire filtratiebarrièrete beperken 1,2. De glomerulus bevat vier celtypen: pariëtale epitheelcellen, podocyten (viscerale epitheelcellen), glomerulaire endotheelcellen (GEC) en mesangiale cellen3. Het glomerulaire endotheel wordt gekenmerkt door een unieke vasculaire structuur, volgens de aanwezigheid van fenestrae die nodig is voor grote filtratievolumes4. Het apicale oppervlak van het glomerulaire endotheel is bedekt met een negatief geladen glycocalyxlaag en een laag die de endotheeloppervlaklaag wordt genoemd en die een ruimte creëert tussen het endotheel en bloed. Deze structuur biedt een selectiviteit met een hoge lading die de doorgang van negatief geladen moleculen zoals albumine beperkt en leukocyten- en bloedplaatjesadhesievoorkomt 5.
GEC's zijn erg gevoelig voor metabole veranderingen, zoals de hyperglycemie geassocieerd met het diabetische milieu. Inderdaad, diabetes leidt tot een verhoogde circulatie van schadelijke stoffen, de verzadiging van glucosemetabolismeroutes en een verstoorde cellulaire redoxbalans 3,6. Bovendien induceert de toename van reactieve zuurstofsoorten mitochondriale disfunctie, die de endotheelfunctie beïnvloedt7.
Het algemene doel van het huidige protocol is om onsterfelijk gemaakte glomerulaire endotheelcellen te isoleren met fluorescerende mitochondriale kenmerken. Inderdaad, de celcultuur van primaire GEC's heeft een beperkte proliferatieve cyclus en vroege senescentie8. Bovendien helpt de aanwezigheid van fluorescerende mitochondriën bij het onderzoeken van splijtings- en fusiegebeurtenissen als reactie op hyperglykemie of een andere behandeling. Als alternatieve methode gebruikten andere laboratoria h-TERT om cellen in vitro te vereeuwigen 9.
De hier beschreven methode maakt de isolatie mogelijk van voorwaardelijk vereeuwigde mitoDendra2 glomerulaire endotheelcellen van 4-6 weken oude dieren (figuur 1). Dit gedetailleerde protocol beschrijft het gebruik van transgene muizen (H-2K b-tsA58) die het simian virus 40 large tumor antigen (SV40 TAg) gen10,11 herbergen voor het genereren van thermolabiele voorwaardelijk vereeuwigde cellen. Het tsA58 TAg-genproduct is functioneel bij de permissieve temperatuur van 33 °C onder controle van de induceerbare 5'-flankerende promotor van het H-2Kb-gen van de muis, dat bij blootstelling aan interferongamma (IFNγ) boven basale niveaus wordt verhoogd, waardoor het voorwaardelijke proliferatiefenotype12 behouden blijft. H-2Kb wordt snel afgebroken bij de niet-permissieve temperatuur van 37 °C in afwezigheid van IFNγ, waardoor de onsterfelijkheidsfunctie van de tsA58Tag in cellen wordt verwijderd en de cellen een meer gedifferentieerd fenotype 13,14,15 kunnen ontwikkelen. Optionele kruising van H-2Kb-tsA58 transgene muizen met PhAM-muizen, die een mitochondria-specifieke (subeenheid VIII van cytochroom c-oxidase) Dendra2-green tot expressie brengen, maakt de live detectie van fluorescerende mitochondriënmogelijk 16. Dendra2 groene fluorescentie schakelt over naar rode fluorescentie na blootstelling aan een 405 nm laser16. Wanneer mitochondriën fuseren na het wisselen van foto's, vormen ze langwerpige vormen die geel lijken door de uitwisseling van groen en geel materiaal of rood lijken wanneer ze splijting ondergaan 7,17. De mitoDendra2-GEC's zijn een geweldig hulpmiddel voor het bestuderen van de cellulaire reacties van GEC-mitochondriën op verschillende stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de IACUC aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï. We gebruikten drie mannelijke muizen (H-2Kb-tsA58 transgene muizen met foto-activeerbare mitochondriën [PhAM]) gekocht bij Jackson lab en hielden een normaal chow-dieet.
1. Arbeidsomstandigheden en voorbereidingen
- Reinig de werkruimte in de laminaire stromingskap met 70% ethanol en UV-C-licht.
- Bereid de wasbuffers van de kraal voor. Maak buffer-1 met 0,1 M natriumfosfaat bij pH 7,4-8,0, buffer-2 met 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder calcium en magnesium aangevuld met 0,1% runderserumantigeen (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 en buffer-3 met 0,2 M Tris met 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Magnetische deeltjesconcentrator
- Bereiding van magnetische kralen
- Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voorzichtig 200 μL magnetische kralen (4 x 108 kralen) met 200 μL buffer-1.
OPMERKING: Bereid 200 μL magnetische kralen per muis 1 dag voor het oogsten van het weefsel. De kralen zullen worden gebruikt om de glomeruli te oogsten. - Plaats de buis gedurende 1 minuut in een magnetische deeltjesconcentrator en zuig het supernatant vervolgens voorzichtig aan. Verwijder de buis van de magneet en resuspenseer de gewassen kralen in 200 μL buffer-1.
- Plaats de buis met de magnetische kralen gedurende 1 minuut in de magnetische deeltjesconcentrator en zuig het supernatant voorzichtig aan.
- Inactiveer de vrije tosylgroepen door de magnetische kralen 2x, 5 min elk te wassen, met behulp van 200 μL buffer-2 door de buis in de magnetische deeltjesconcentrator te plaatsen en de buffer weg te gooien.
- Incubeer de magnetische kralen in 200 μL buffer-3 gedurende 24 uur bij 4 °C, of gedurende 4 uur bij 37 °C, om de resterende vrije tosylgroepen te inactiveren. Plaats de buis gedurende 1 minuut in de magnetische concentrator, zuig het supernatant voorzichtig aan en gooi het weg.
- Was de magnetische kralen 1x met 200 μL buffer-2 gedurende 5 min bij 4 °C. Plaats de buis terug in de magnetische concentrator gedurende 1 min en zuig het supernatant voorzichtig aan. Verwijder de buis uit de magnetische concentrator en resuspenseer de magnetische kralen in 200 μL buffer-2 om 4 x 108 kralen / ml te verkrijgen.
OPMERKING: In dit stadium is het mogelijk om de kralen maximaal 15 dagen bij 4 °C te laten.
- Meng in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voorzichtig 200 μL magnetische kralen (4 x 108 kralen) met 200 μL buffer-1.
3. Isolatie van glomerulaire cellen van muizennieren
- Bereid het perfusiemateriaal voor: 30 ml spuit, 25 G vlindernaald. Bereid het isolatiemateriaal voor: steriele schaal van 10 cm, scalpel, magnetische deeltjesconcentrator, 40 μm celzeef, 100 μm celzeef.
- Bereid 100 ml 1x Hank's Balanced salt solution (HBSS) aangevuld met 1% antibiotica en pas de pH aan op 7,35. Filtreer de oplossing met een filter van 0,2 μm en bewaar deze onder de kap om verontreiniging te voorkomen.
- Meng 200 μL magnetische kralen uit stap 2.1.6 met 20 ml 1x HBSS.
OPMERKING: Voor elke muis is 200 μL kralen verdund in 20 ml HBSS 1x nodig. - Bereid een aliquot van 1 ml collagenase type II (125 CDU/mg) bij 1 mg/ml in 1x HBSS-oplossing, pH 7,35. Verwarm de RPMI met 10% FCS medium in een waterbad bij 37 °C. Verwarm het endotheelcelkweekmedium voor bij 37 °C (zie Materiaaltabel voor meer informatie).
OPMERKING: De RPMI zal worden gebruikt om het collagenase te neutraliseren. - Bekleed twee putjes van een 6-wells plaat vooraf met 2 ml collageen IV (1 ml / put) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was de plaat 3x met 1x PBS om het azijnzuur te verwijderen dat wordt gebruikt om het collageen te verdunnen. Gebruik de gecoate platen onmiddellijk of bewaar ze bij 2-8 °C gedurende maximaal 4 weken.
OPMERKING: Het afdichten van de plaat(en) met een transparante film heeft de voorkeur om uitdroging te voorkomen. De collageencoating vergemakkelijkt de hechting van cellen aan de plaat. - Reinig en steriliseer alle chirurgische instrumenten in figuur 2 door 70% ethanol te gebruiken en vervolgens gedurende 30 minuten te autoclaveren. Reinig de chirurgische werkruimte met 70% ethanol.
- Verdoof de muizen met een intraperitoneale injectie van ketamine/xylazine (10 mg/ml ketamine en 1 mg/ml xylazine). Om te bevestigen dat het dier volledig verdoofd is, controleert u op de teenknijpreflex.
- Bevestig de poten van de muis met naalden van 19 G om hem op zijn plaats te houden op een dissectieplatform. Reinig de borst en de buik met 70% ethanol en open de buik langs de borst met een schaar a (figuur 2).
- Steek een vlindernaald in de linker ventrikel (figuur 3A) en injecteer ongeveer 100 μL van de kraaloplossing (vanaf stap 1.2) om de bloedcirculatie uit te breiden.
- Breek de inferieure vena cava onder de nieren voorzichtig met een naald van 19 G (figuur 3A). Ga verder met de perfusie die is geïnitieerd in stap 3.9.
OPMERKING: Als alternatief kan een minipomp worden gebruikt op snelheid: 18,0+, tijd: 5 min. Een goede perfusie is belangrijk om een groot aantal glomeruli met magnetische kralen te oogsten. Dit is een non-survival/ terminale procedure. - Verwijder het vetweefsel voorzichtig met een pincet en snijd beide nieren weg met een dunne chirurgische schaar c (figuur 2) en leg ze in een plaat met 1 ml 1x HBSS op ijs. Gehakt de nier met een schaar b (figuur 2) en vervolgens met een steriel scalpel tot 1 mm kleine stukjes zoals weergegeven in figuur 3B.
- Incubeer vervolgens de gehakte nier met 1 ml collagenase type II uit stap 3.4 gedurende 35 minuten bij 37 °C met voorzichtig kantelen met behulp van een horizontale schudder. Het weefsel moet na deze stap volledig worden verteerd, zoals weergegeven in figuur 3C.
- Voeg 4 ml RPMI toe met 10% FBS (uit stap 3.4) om het collagenase te neutraliseren. Filter het verteerde weefsel door een steriele celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml. Gebruik de bodem van een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml om het verteerde weefsel tegen de zeef te roeren om de glomeruli door te laten.
- Spoel de celzeef af met 15 ml 1x HBSS en centrifugeer vervolgens de doorstroom bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Op dit punt bevat de pellet drie lagen; de kralen met glomeruli zijn zichtbaar in de middelste laag van de buis, de bovenste laag bestaat uit kleinere structuren zoals buisjes en de onderste laag is puin (figuur 3D).
- Zuig het supernatant en de bovenste witte laag voorzichtig aan. De resterende pellet bevat de kralen met de glomeruli en puin (figuur 3D). Resuspendeer de pellet met 1,5 ml 1x HBSS en breng over in een buis van 2 ml.
- Plaats de buis in de magnetische concentrator (figuur 3E), aspirateer het supernatant en was de kralen vervolgens 2x met 1 ml 1x HBSS; plaats in dit stadium 20 μL van de celsuspensie op een dia om de aanwezigheid van glomeruli onder de microscoop te verifiëren (figuur 3F; een glomerulus [zwarte pijl] en enkele kralen [gele pijlen] in de suspensie).
- Zuig het supernatant voorzichtig aan, resuspendeer de pellet in endotheelcelgroeimedium (Tabel met materialen) en breng het over naar een schone buis van 2 ml. Voeg 2 μL IFNγ (100 U/ml) toe aan de buis en plaats de cellen op een putje van een 6-wells plaat. Incubeer de cellen bij 33 °C.
- Na 3 dagen cultuur, verander het medium voorzichtig door 1 ml van het medium uit te pipetteren en te vervangen door 1 ml verse media. In dit stadium zijn de cellen heterogeen met een mengsel van glomerulaire cellen (figuur 4G).
OPMERKING: In de ontgroeiende cultuur zal er een mix van glomerulaire cellen en enkele magnetische kralen zijn (figuur 4G). Merk op dat alle cellen groene, fluorescerende mitochondriën moeten vertonen. - Na 7 dagen kweek, aspirateer het medium volledig en vervang het door een verse 2 ml endotheelcelgroeimedium aangevuld met IFNγ (100 U / ml). In dit stadium beginnen de cellen zich te vermenigvuldigen, maar zijn ze nog steeds heterogeen (figuur 4A).
- Na 10 dagen cultuur wanneer de cellen ~ 80% confluency bereiken, passeert u de cellen met behulp van trypsine zoals beschreven in stap 5.1 en brengt u ze vervolgens over in een T25-kolf bedekt met collageen IV.
- Na 1 week (totaal ~ 21 dagen cultuur), passeren de cellen naar een T75-kolf bedekt met collageen IV.
4. Voorbereiding van kralen voor endotheelcelisolatie
- Begin met het coaten van de schapen anti-rat kralen met een rat anti-muis CD31 antilichaam 3,18,19. Gebruik 10 μL kralen voor elke T75 kolf.
- Was 10 μL kralen 3x met 200 μL 1x PBS aangevuld met 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilline/streptomycine. Plaats de buis in de concentratormagneet om de wasbuffer elke keer te pipetteren.
- Resuspendeer de kralen in 200 μL PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilline /streptomycine. Voeg 4,8 μL rat anti-muis CD31 antilichaam 7,18,19 toe, plaats de tube op een horizontale shaker en meng voorzichtig gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en houd de tube dan een nacht op 4 °C.
5. Het isoleren van de glomerulaire endotheelcellen met CD31-gecoate kralen
- Voeg 3 ml 0,25% trypsine toe aan een T75-kolf en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 minuten. Neutraliseer het trypsine met 3 ml endotheelgroeimedium, breng de cellen over naar een buis van 15 ml en centrifugeer vervolgens bij 200 x g gedurende 5 minuten.
- Aspirateer het supernatant en was de cellen in 1 ml PBS met 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilline / streptomycine. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de pellet in 200 μL gecoate kralen bereid in stap 4 en voeg 800 μL PBS toe met 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilline / streptomycine. Incubeer de cellen gedurende 45 minuten met continu schudden bij 37 °C, 5% CO2.
- Plaats de tube in de magnetische concentrator en was de cellen 4x met 1x PBS met 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilline/streptomycine. Resuspendeer de cellen in 3 ml endotheel groeimedium aangevuld met 100 U / ml IFNγ.
- Plaat 1,5 ml cellen/put in collageen IV-gecoate putten op een 6-wells plaat. Kweek de cellen onder permissieve omstandigheden bij 33 °C.
OPMERKING: De geïsoleerde cellen brengen simian virus 40 (SV40) groot T-antigeen tsA58 tot expressie, waardoor de activering van continue proliferatie bij 33 °C (permissieve toestand) mogelijk is. - Verwijder na 4 dagen in cultuur 750 μL van het medium en vervang het door hetzelfde volume vers medium aangevuld met 100 U/ml IFNγ.
- Controleer na 10 dagen tot 14 dagen cultuur op groeiende CD31-positieve GECs-kolonies (figuur 4C) die fluorescerende mitochondriën tot expressie brengen met behulp van een epifluorescentiemicroscoop met een 488 nm-filter.
- Na 21 dagen cultuur kunnen de cellen 80% -90% samenvloeiing hebben bereikt; breng ze over in een T25-kolf. Na het bereiken van confluency kunnen cellen worden onderhouden met RPMI-groeimedium en 10% FCS.
OPMERKING: Voordat de cellen samenvloeiing bereiken, kunnen ze er heterogeen uitzien (figuur 4B). Zodra ze echter samenvloeien, krijgen ze een geplaveide morfologie. - In dit stadium kunnen de cellen worden gecryopreserveerd. Voeg bij het bereiken van 80% samenvloeiing 3 ml 0,25% trypsine toe aan de cellen en incubeer ze bij 37 °C gedurende 5 minuten. Neutraliseer het trypsine met een gelijk volume groeimedium aangevuld met 10% FBS.
- Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 3 ml vriesmedium (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot de cellen in cryo-buizen en sla ze op in vloeibare stikstofdamptemperatuur.
6. Het cultiveren van de mitoDendra2-GECs
- Ontdooi de cellen uit het cryoaliquot, vanaf stap 5.10, in een waterbad bij 37 °C en breng ze over in een buis van 15 ml met 10 ml voorverwarmd endotheel groeimedium.
- Centrifugeer de suspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het medium en breng de pellet over in de met collageen IV gecoate T25 cm2 celkweekkolf met voorverwarmd endotheelcelgroeimedium aangevuld met 100 U/ml IFNγ en incubeer bij 33 °C.
- Verander het medium de volgende dag. Wanneer de cellen 70% -80% confluency bereiken, meestal na 5 dagen, breng ze over naar een T75 cm2 celkweekkolf.
- Om de cellen te differentiëren tot endotheelfenotype, brengen de cellen over naar niet-permissieve omstandigheden bij 37 °C in groeimedia zonder IFNγ.
7. Passaging van mitoDendra2-GEC's
- Verwijder het medium, was de cellen met PBS en voeg 3 ml warme 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (T75 cm2 kolf) toe, incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.
- Wanneer de cellen zijn losgemaakt, voeg dan 5 ml groeimedium toe en pipetteer op en neer. Centrifugeer de suspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en breng de cellen over naar een nieuwe collageen IV-gecoate kolf of plaat.
OPMERKING: Passaging moet eenmaal per week worden gedaan in een verhouding van 1: 4.
8. Karakterisering van mitoDendra2-GEC's
- Voer immunofluorescentiekleuring uit voor CD31 op gedifferentieerde cellen 7,18,19,20 (figuur 4D). Gebruik ook andere markers zoals vWF en Isolectine-B420.
- Om de mitochondriale specificiteit van Dendra2 te bevestigen, labelt u cellen met mitochondriaal-specifieke markers door de cellen in groeimedium met 100 nM mitochondriale tracker gedurende 30 minuten bij 37 °C, 5% CO2 te incuberen.
- Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig met voorverwarmd medium zonder fenolrood om live beeldvorming uit te voeren.
OPMERKING: Als alternatief kunnen cellen worden gefixeerd met behulp van formaldehyde-fixeermiddelen (4%) gedurende 30 minuten, gevolgd door meerdere keren te wassen in PBS. Vaste cellen kunnen tot gebruik bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard. Een bevestiging met flowcytometrie is ook mogelijk: label cellen met anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. GEC's moeten negatief kleuren voor podocytmarkers (synaptopodine, Nphs1, Podxl), mesangiale celmarkers (PDGFRβ, angiotensinogeen) en tubulaire celmarkers (Aquaporine, Aminopeptidase-N). Deze markers dienen als negatieve controles. Vanwege de mitochondriaal-specifieke Dendra2-expressie van deze cellen, vermijd het gebruik van het FITC-kanaal.
9. Live cell imaging van mitochondriale structurele veranderingen als reactie op oxidatieve stress of hoge glucose
- Plaat 1 x 105 GEC's op een 35 mm glazen bodem schotel bedekt met collageen IV met behulp van endotheelcel groeimedium (Tabel van materialen). Na 24 uur, verander naar medium zonder fenol rood. Cellen hebben groene, fluorescerende mitochondriën.
- Stel de omgevingskamer in op 37 °C, 5% vochtigheid en 5% CO2 1 uur voor aanvang van het experiment.
- Gebruik onder een confocale microscoop een objectief van 40x/1,2 W om de focus aan te passen en het interessegebied te selecteren. Incubeer de cellen met 2 ml van 5 mM of 25 mM glucose gedurende 60 minuten.
- Stel de cellen bloot aan een 405 nm laser (4% laservermogen) om een subpopulatie van mitochondriën van groen naar rood om te zetten (figuur 5A-B, D-E).
- Gebruik de 561 nm laser om Dendra2 in de onbekeerde toestand te prikkelen om de rode fluorescentie te visualiseren. Zie het gedetailleerde protocol voor het schakelen tussen foto's zoals eerder beschreven16. De fusiegebeurtenissen verschijnen na enkele minuten als gele fluorescentie vanwege groene matrix- en rode matrixfusie (figuur 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor de isolatie van voorwaardelijk onsterfelijk vereeuwigde glomerulaire endotheelcellen met stabiele fluorescerende mitochondriën (mitoDendra2-GEC's) (figuur 1). Het gebruik van jonge muizen van 6-10 weken oud is essentieel om een aanzienlijk aantal gezonde cellen te verkrijgen. Na 3 dagen kweken beginnen cellen langzaam te groeien uit de geïsoleerde glomeruli, zoals weergegeven in figuur 3G. Na 7 dagen zijn cellen heterogeen en vertonen ze andere glomerulaire celtypen, zoals podocyten, pariëtale epitheelcellen en mesangiale cellen (figuur 4A). Na het bereiken van 70% tot 80% confluentie, werden andere glomerulaire cellen verwijderd met behulp van een positieve selectie van endotheelcellen met magnetische CD31-gelabelde kralen (figuur 4B-C). De mitoDendra2-GEC's brachten CD31 tot expressie (figuur 4D) en waren negatief voor podocytmarker zoals aangetoond door synaptopodine negatieve kleuring (figuur 4E-F).
De fluorescerende mitochondriale functie in de mitoDendra2-GECs maakt het mogelijk om mitochondriale morfologie onder verschillende omstandigheden in vitro te bestuderen. Hier hebben we het effect van hoge glucose (25mM) op de mitochondriale structuur van mitoDendra2-GECs getest (figuur 5D-F). Vergeleken met de langwerpige mitochondriën zichtbaar in cellen onder normale glucose (5mM; Figuur 5A-C), hoge glucose-geïnduceerde fragmentatie of splijting van mitochondriën zoals waargenomen door prominente sferoïde-vormige mitochondriën (figuur 5E). Bovendien gebruikten we een 405 nm-laser om een geselecteerde subpopulatie van mitochondriën om te zetten in een enkele levende mitoDendra2-GEC (figuur 5A, D). In figuur 5B en figuur 5E wordt succesvolle foto-switching van mitochondriën van groen (488nm) naar rood (561 nm) in het geselecteerde gebied weergegeven. Belangrijk is dat het mogelijk was om getuige te zijn van de fusiegebeurtenissen in mitoDendra2-GEC's gekweekt onder normale glucose, zoals kan worden waargenomen door de geel samengevoegde groene en rode fluorescentie als gevolg van mitochondriale matrixfusie (figuur 5C). Daarentegen waren in de met hoge glucose behandelde mitoDendra2-GEC de mitochondriën gefragmenteerd en waren ze voornamelijk rood (figuur 5F), wat suggereert dat, in het geteste tijdsbestek, de splijtings- / fusiegebeurtenissen werden vertraagd of geremd als gevolg van de schade veroorzaakt door de hoge glucosebehandeling, en dit komt overeen met eerdere rapporten18,19.
Figuur 1: Representatieve beschrijving van murine GEC isolatie. Het diagram vertegenwoordigt de belangrijke stappen van GEC-isolatie, te beginnen met het perfuseren van muizenhart met magnetische kralen om de nierglomeruli te isoleren, de vertering van collagenase, de cultuur van glomerulaire cellen en ten slotte de zuivering van GEC met behulp van CD31-gecoate kralen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beschrijving van nierdissectie. Representatief beeld van alle steriele chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de dissectie. Een schaar (a) is nodig om de huid van de muis te openen en een aparte schaar (b,c) is nodig om de nier te isoleren. Pincetten (d) en (e) zijn nodig om de huid vast te houden. Pincet (f) is nodig om de ontleedde nier te verzamelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Beschrijving van het oogsten van glomeruli. (A) Perfuseer de linker ventrikel met de HBSS-kralenoplossing met behulp van een spuit van 20 ml. Perforeer de inferieure vena cava met een naald van 19 G. (B) Verwijder na perfusie het vet uit de nier en snijd het in stukjes van 1 mm. (C) Vergist het weefsel met collagenase type II. (D) Na vertering en centrifugatie worden drie lagen gevormd; de kralen met de glomeruli bevinden zich in de middelste laag, zoals aangegeven door de zwarte pijl. (E) Scheid de geïsoleerde kralen met de glomeruli met behulp van de magnetische concentrator. (F) Representatief beeld van vers geïsoleerde glomeruli. (G) Groeiende cellen uit geïsoleerde glomeruli na 3 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Mitochondriale assay in vitro. (A) Glomerulaire cellen na 3 dagen kweek. (B) GEC na 7 dagen. (D) Zuivering van GEC met CD31-gelabelde kralen. Microscopische beeldvorming van CD31-kleuring. (E) GEC's zijn negatief voor synaptopodine. (F) Podocyten gekleurd met synaptopodine (488 nm, groene fluorescentie) als een negatieve controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Microscopische beeldvorming van fluorescerende mitochondriale fusie in vitro. Beelden werden verkregen met een confocale microscoop met behulp van een 40x waterobjectief. (A-B) Geselecteerd gebied (rode cirkel) werd verlicht met een 405 nm-lijn (4% laservermogen) voor 300 bleek-iteraties met een snelheid van 6,3-12,61 / pixel, zoals eerder beschreven16. (A-C) Cellen in groeimedia die 5 mM glucose bevatten; groene fluorescentie (488 nm) toont gezonde mitochondriën. (B,E) Mitochondriën werden met foto's overgeschakeld naar rood (567 nm). (C) Gele fluorescentie detecteert een actieve fusiegebeurtenis van GEC behandeld met 5mM glucose. (D) Cellen werden behandeld met hoge glucose 25 mM gedurende 30 minuten. Groene fluorescentie toont gefragmenteerde mitochondriën en (E) een deel dat met foto's in rood werd omgezet. (F) De figuur toont een verminderde fusiegebeurtenis zoals blijkt uit verminderde gele fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitochondriën zijn van cruciaal belang voor cellulair metabolisme, homeostase en stressreacties, en hun disfunctie is gekoppeld aan vele ziekten, waaronder nierziekten. Mitochondriën spelen een rol bij de pathologische generatie van overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS), de regulatie van intracellulaire calciumspiegels, celdoodroutes en cytoskeletale dynamica 21,22,23.
De isolatie van muizengele GEC's is een uitdaging vanwege hun kleine aantal, grootte, matrixfactoren en onderling afhankelijke aard met andere glomerulaire cellen die essentieel zijn voor hun overleving. Het huidige artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor muis GEC-isolatie. In het bijzonder gebruikten we transgene muizen als een hulpmiddel om voorwaardelijk vereeuwigde cellijnen met een hoog proliferatiepotentieel te verkrijgen. De transgene muizen, die simian virus 40 (SV40) groot T-antigeen tsA58 tot expressie brengen, maken de activering van continue proliferatie onder permissieve omstandigheden bij 33 °C mogelijk en werden hier gekruist met de PHAM-weggesneden muizen die mitochondriaal-specifieke fluorescentie tot expressie brachten. De dubbele transgene muizen boden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van de mitochondriale structuur. Inderdaad, PHAM-weggesneden muizen dragen mitochondriaal-specifieke (subeenheid VIII van cytochroom c-oxidase) Dendra2 groen, waardoor de live detectie van fluorescerende mitochondriën en de observatie van splijtings- en fusiegebeurtenissen door groen-rode foto-switching16 mogelijk is.
Het protocol bestaat uit drie belangrijke stappen: het extraheren van glomeruli met behulp van kralen, de proliferatie van glomerulaire cellen en de daaropvolgende zuivering van GEC met behulp van CD31-kralen zodra de cellen in cultuur zijn. Het gebruik van slechts één spijsvertering met collagenase is voldoende om glomerulaire cellen te isoleren. Andere protocollen maken gebruik van een tweede vertering met DNAse en proteïnase24. We hebben echter betere celopbrengsten opgemerkt met slechts één verteringsstap. De DNAse kan actief blijven en de proliferatie van de cellen vertragen. Bovendien kan GEC worden geïsoleerd met behulp van differentieel zeven zoals eerder beschreven20, wat niet altijd gemakkelijk is bij het gebruik van muizennieren.
Het is cruciaal om alle chirurgische hulpmiddelen te autoclaaf maken voordat u begint met de isolatie van de nieren en de glomeruli om besmetting te voorkomen. Bovendien is het belangrijk om de oplossingen te filteren en aan te vullen met antibiotica om elke bron van verontreinigingen te elimineren. Mycoplasma-infecties kunnen inderdaad cytopathologie veroorzaken die bijgevolg interfereert met elke parameter gemeten in celkweek25.
De isolatie van glomeruli is afhankelijk van de intra-cardiale perfusie van kralen. Zeker, langzame perfusie met 20 ml 1x HBSS-bevattende kralen is essentieel om een hoog aantal glomeruli te oogsten. De kralen worden opgesloten in de glomeruli, wat hun zuivering vergemakkelijkt met behulp van een magnetische concentrator. De kralen kunnen worden bereid en bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 15 dagen voordat ze worden gebruikt om de experimentele procedure te vergemakkelijken.
Bovendien is het verteren van glomeruli met continu schudden cruciaal voor het scheiden van een groot aantal glomeruli van de nier. Aan de andere kant is de isolatie van murine GECs een uitdaging vanwege hun kleine omvang en de aanwezigheid van andere glomerulaire cellen. Daarom zijn de stapsgewijze isolatie van glomeruli, de groei van alle glomerulaire cellen in cultuur en het daaropvolgende gebruik van CD31-gecoate kralen om endotheelcellen te zuiveren van vitaal belang, met name voor het verkrijgen van grotere aantallen levensvatbare en voorwaardelijk proliferatieve GEC's. Niettemin is het valideren van de zuiverheid van cellen met immunostaining en flowcytometrie nodig.
Daarnaast beschrijft het protocol de karakterisering van het GEC-fenotype en de mitochondriale fusie/splijtingstest in vitro. De mitoDendra2-GEC's zijn een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van de cellulaire reacties van GEC-mitochondriën op verschillende stimuli in vitro zonder de noodzaak van transfectie of kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen aan te geven.
Acknowledgments
De auteurs bedanken professor Cijiang He en Dr. Fu Jia voor hun inzichten in muizen endotheelcelisolatie en bedanken professor Mone Zaidi voor het verstrekken van dePhAM-weggesneden muizen en waardevolle discussies. De auteurs willen ook de Microscopie CORE aan de Icahn School of Medicine op de berg Sinaï en het personeel bedanken voor de begeleiding die we hebben ontvangen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van National Institutes of Health grant R01DK097253 en Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 aan I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
