Summary
Der Artikel beschreibt die Methode zur Isolierung bedingt immortalisierter glomerulärer Endothelzellen aus den Nieren transgener Mäuse, die das thermolabile Affenvirus 40 exprimieren, und photoaktivierbaren Mitochondrien, PhAMexcised. Wir beschreiben das Verfahren zur Glomeruli-Isolierung aus ganzen Nieren mittels Perlen, Verdauungsschritten, Aussaat und Kultivierung von GECs-CD31-positiv.
Abstract
Eine Dysfunktion der glomerulären Endothelzelle (GEC) kann den Abbau der glomerulären Filtrationsbarriere initiieren und dazu beitragen. Erhöhter mitochondrialer oxidativer Stress wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, der zu einer GEC-Dysfunktion in der Pathogenese einiger glomerulärer Erkrankungen führt. In der Vergangenheit war die Isolierung von GECs aus In-vivo-Modellen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Isolierung reiner Kulturen aus Glomeruli eine notorische Herausforderung. GECs haben komplexe Wachstumsanforderungen in vitro und eine sehr begrenzte Lebensdauer. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung bedingt immortalisierter GECs mit fluoreszierenden Mitochondrien, die die Verfolgung von mitochondrialen Spaltungs- und Fusionsereignissen ermöglichen. GECs wurden aus den Nieren einer doppelten transgenen Maus isoliert, die das thermolabile SV40 TAg (aus der Immortomaus) exprimierte, was die Proliferation bedingt förderte und die Zelldifferenzierung unterdrückte, und einem photokonvertierbaren fluoreszierenden Protein (Dendra2) in allen Mitochondrien (aus der photoaktivierbaren Mitochondrien [PhAMexcised] Maus). Die erzeugte stabile Zelllinie ermöglicht eine Zelldifferenzierung nach Inaktivierung des immortalisierenden SV40 TAg-Gens und Photoaktivierung einer Untergruppe von Mitochondrien, was zu einem Wechsel der Fluoreszenz von Grün zu Rot führt. Die Verwendung von mitoDendra2-GECs ermöglicht die Live-Bildgebung der Verteilung, Fusion und Spaltung fluoreszierender Mitochondrien, ohne die Zellen zu färben.
Introduction
Der Glomerulus ist entscheidend für die Blutfiltration, indem er den Durchgang großer Moleküle durch die glomeruläre Filtrationsbarriere 1,2 einschränkt. Der Glomerulus enthält vier Zelltypen: parietale Epithelzellen, Podozyten (viszerale Epithelzellen), glomeruläre Endothelzellen (GEC) und mesangiale Zellen3. Das glomeruläre Endothel zeichnet sich durch eine einzigartige Gefäßstruktur aus, entsprechend dem Vorhandensein von Fenestrae, das für große Filtrationsvolumina erforderlich ist4. Die apikale Oberfläche des glomerulären Endothels ist mit einer negativ geladenen Glykokalyxschicht und einer Schicht bedeckt, die als endotheliale Oberflächenschicht bezeichnet wird und einen Raum zwischen dem Endothel und dem Blut schafft. Diese Struktur bietet eine hohe Ladungsselektivität, die den Durchgang von negativ geladenen Molekülen wie Albumin einschränkt und die Leukozyten- und Thrombozytenadhäsion verhindert5.
GECs reagieren sehr empfindlich auf metabolische Veränderungen, wie die Hyperglykämie im Zusammenhang mit dem diabetischen Milieu. Tatsächlich führt Diabetes zu einer erhöhten Zirkulation schädlicher Substanzen, zur Sättigung der Glukosestoffwechselwege und zu einem gestörten zellulären Redoxgleichgewicht 3,6. Darüber hinaus induziert die Zunahme der reaktiven Sauerstoffspezies eine mitochondriale Dysfunktion, die die Endothelfunktion beeinträchtigt7.
Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls ist es, immortalisierte glomeruläre Endothelzellen mit fluoreszierenden mitochondrialen Merkmalen zu isolieren. Tatsächlich hat die Zellkultur von primären GECs einen begrenzten proliferativen Zyklus und eine frühe Seneszenz8. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein von fluoreszierenden Mitochondrien, Spalt- und Fusionsereignisse als Reaktion auf Hyperglykämie oder eine andere Behandlung zu untersuchen. Als alternative Methode verwendeten andere Labore h-TERT, um Zellen in vitro9 zu verewigen.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von bedingt immortalisierten mitoDendra2 glomerulären Endothelzellen aus 4-6 Wochen alten Tieren (Abbildung 1). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Verwendung transgener Mäuse (H-2K b-tsA58), die das Simian Virus 40 Large Tumor Antigen (SV40 TAg) Gen10,11 zur Erzeugung thermolabiler bedingt immortalisierter Zellen beherbergen. Das TSA58 TAg-Genprodukt ist bei der permissiven Temperatur von 33 °C unter der Kontrolle des induzierbaren 5'-flankierenden Promotors des Maus-H-2K-b-Gens funktionsfähig, der bei Exposition gegenüber Interferon gamma (IFNγ) über das Basalniveau erhöht ist, wodurch der bedingte Proliferationsphänotyp12 erhalten bleibt. H-2Kb wird bei der nicht-permissiven Temperatur von 37 °C in Abwesenheit von IFNγ schnell abgebaut, wodurch die immortalisierende Funktion des tsA58Tag in Zellen entfernt wird und die Zellen einen differenzierteren Phänotyp13,14,15 entwickeln können. Die optionale Kreuzung von H-2Kb-tsA58 transgenen Mäusen mit PhAM-Mäusen, die ein mitochondrienspezifisches (Untereinheit VIII der Cytochrom-c-Oxidase) Dendra2-grün exprimieren, ermöglicht den Live-Nachweis fluoreszierender Mitochondrien16. Die grüne Dendra2-Fluoreszenz schaltet nach Bestrahlung mit einem 405-nm-Laser16 auf rote Fluoreszenz um. Wenn Mitochondrien nach dem Photoswitching verschmelzen, bilden sie längliche Formen, die durch den Austausch von grünem und gelbem Material gelb erscheinen oder rot erscheinen, wenn sie einer Spaltung unterzogenwerden 7,17. Die mitoDendra2-GECs sind ein großartiges Werkzeug, um die zellulären Reaktionen von GEC-Mitochondrien auf verschiedene Reize zu untersuchen.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Tierverfahren wurden von der IACUC an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai genehmigt. Wir verwendeten drei männliche Mäuse (H-2Kb-tsA58 transgene Mäuse mit photoaktivierbaren Mitochondrien [PhAM]), die im Jackson-Labor gekauft wurden, und behielten eine normale Chow-Diät bei.
1. Arbeitsbedingungen und Vorbereitungen
- Reinigen Sie den Arbeitsbereich in der Laminar-Flow-Haube mit 70% Ethanol und UV-C-Licht.
- Bereiten Sie die Waschpuffer der Perle vor. Machen Sie Puffer-1 unter Verwendung von 0,1 M Natriumphosphat bei pH 7,4-8,0, Puffer-2 unter Verwendung von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ohne Calcium und Magnesium, ergänzt mit 0,1% Rinderserumantigen (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 und Puffer-3 unter Verwendung von 0,2 M Tris mit 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Magnetpulverkonzentrator
- Herstellung von Magnetperlen
- Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig 200 μl magnetische Beads (4 x 108 Beads) mit 200 μL Puffer-1.
HINWEIS: Bereiten Sie 200 μL magnetische Perlen pro Maus 1 Tag vor der Gewebeentnahme vor. Die Perlen werden verwendet, um die Glomeruli zu ernten. - Legen Sie das Röhrchen für 1 min in einen Magnetpartikelkonzentrator und saugen Sie dann den Überstand vorsichtig ab. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Magneten und suspendieren Sie die gewaschenen Perlen in 200 μL Puffer-1.
- Legen Sie das Röhrchen mit den Magnetkügelchen für 1 min in den Magnetpartikelkonzentrator und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
- Inaktivieren Sie die freien Tosylgruppen, indem Sie die magnetischen Beads jeweils 2x, 5 min waschen, 200 μL Puffer-2 verwenden, indem Sie das Röhrchen in den Magnetpartikelkonzentrator legen und den Puffer verwerfen.
- Die magnetischen Beads werden in 200 μL Puffer-3 für 24 h bei 4 °C oder für 4 h bei 37 °C inkubiert, um die verbleibenden freien Tosylgruppen zu inaktivieren. Legen Sie das Rohr für 1 Minute in den magnetischen Konzentrator, saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn.
- Die Magnetkügelchen 1x mit 200 μL Puffer-2 für 5 min bei 4 °C waschen. Setzen Sie das Röhrchen für 1 min wieder in den Magnetkonzentrator ein und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. Entfernen Sie das Röhrchen aus dem magnetischen Konzentrator und suspendieren Sie die magnetischen Beads in 200 μL Puffer-2, um 4 x 108 Perlen/ml zu erhalten.
HINWEIS: In diesem Stadium ist es möglich, die Perlen bis zu 15 Tage bei 4 ° C zu belassen.
- Mischen Sie in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig 200 μl magnetische Beads (4 x 108 Beads) mit 200 μL Puffer-1.
3. Isolierung von glomerulären Zellen der Mausniere
- Bereiten Sie das Perfusionsmaterial vor: 30 ml Spritze, 25 G Schmetterlingsnadel. Bereiten Sie das Isoliermaterial vor: sterile 10 cm Schale, Skalpell, Magnetpulverkonzentrator, 40 μm Zellsieb, 100 μm Zellsieb.
- Bereiten Sie 100 ml 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zu, ergänzt mit 1% Antibiotika und stellen Sie den pH-Wert auf 7,35 ein. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter und halten Sie sie unter der Haube, um eine Kontamination zu vermeiden.
- Mischen Sie 200 μL magnetische Beads aus Schritt 2.1.6 mit 20 mL 1x HBSS.
HINWEIS: Für jede Maus werden 200 μL Perlen benötigt, die in 20 ml HBSS 1x verdünnt sind. - Bereiten Sie ein 1 ml Aliquot Kollagenase Typ II (125 CDU/mg) bei 1 mg/ml in 1x HBSS-Lösung, pH 7,35 vor. Die RPMI mit 10% FCS-Medium im Wasserbad bei 37 °C vorwärmen. Das Endothelzellkulturmedium bei 37 °C vorwärmen (siehe Materialtabelle ).
HINWEIS: Der RPMI wird verwendet, um die Kollagenase zu neutralisieren. - Zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte mit 2 ml 10 μg/ml Kollagen IV (1 ml/Well) für 45 min bei Raumtemperatur vorbeschichten. Waschen Sie die Platte 3x mit 1x PBS, um die Essigsäure zu entfernen, die zur Verdünnung des Kollagens verwendet wird. Verwenden Sie die beschichteten Platten sofort oder lagern Sie sie bei 2-8 °C für bis zu 4 Wochen.
HINWEIS: Das Versiegeln der Platte(n) mit einer transparenten Folie wird bevorzugt, um ein Austrocknen zu verhindern. Die Kollagenbeschichtung erleichtert die Befestigung von Zellen an der Platte. - Reinigen und sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente in Abbildung 2 mit 70% Ethanol und autoklavieren Sie sie anschließend für 30 Minuten. Reinigen Sie den chirurgischen Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.
- Betäuben Sie die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin / Xylazin (10 mg / ml Ketamin und 1 mg / ml Xylazin). Um zu bestätigen, dass das Tier vollständig betäubt ist, überprüfen Sie den Zehenklemmreflex.
- Befestigen Sie die Pfoten der Maus mit 19 G-Nadeln, um sie auf einer Sezierplattform zu halten. Reinigen Sie die Brust und den Bauch mit 70% Ethanol und öffnen Sie den Bauch entlang der Brust mit der Schere a (Abbildung 2).
- Führen Sie eine Schmetterlingsnadel in den linken Ventrikel ein (Abbildung 3A) und injizieren Sie etwa 100 μl der Perlenlösung (aus Schritt 1.2), um die Durchblutung zu erweitern.
- Brechen Sie die Vena cava inferior unterhalb der Nieren vorsichtig mit einer 19 G Nadel auf (Abbildung 3A). Setzen Sie die in Schritt 3.9 eingeleitete Perfusion fort.
HINWEIS: Alternativ kann eine Minipumpe mit einer Drehzahl verwendet werden: 18,0+, Zeit: 5 min. Eine gute Durchblutung ist wichtig, um eine große Anzahl von Glomeruli-haltigen Magnetperlen zu ernten. Dies ist ein Nicht-Überleben / terminales Verfahren. - Entfernen Sie vorsichtig das Fettgewebe mit einer Pinzette und schneiden Sie beide Nieren mit einer dünnen chirurgischen Schere c (Abbildung 2) heraus und legen Sie sie in eine Platte mit 1 ml 1x HBSS auf Eis. Zerkleinern Sie die Niere mit der Schere b (Abbildung 2) und dann mit einem sterilen Skalpell auf 1 mm kleine Stücke, wie in Abbildung 3B gezeigt.
- Als nächstes inkubieren Sie die gehackte Niere mit 1 ml Kollagenase Typ II aus Schritt 3.4 für 35 min bei 37 °C mit leichtem Kippen mit einem horizontalen Shaker. Das Gewebe sollte nach diesem Schritt vollständig verdaut werden, wie in Abbildung 3C dargestellt.
- Fügen Sie 4 ml RPMI mit 10% FBS (ab Schritt 3.4) hinzu, um die Kollagenase zu neutralisieren. Filtern Sie das verdaute Gewebe durch ein steriles 100-μm-Zellsieb in ein 50-ml-Röhrchen. Verwenden Sie den Boden eines sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchens, um das verdaute Gewebe gegen das Sieb zu rühren, damit die Glomeruli durchgehen können.
- Spülen Sie das Zellsieb mit 15 mL 1x HBSS aus und zentrifugieren Sie dann den Durchfluss bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Zu diesem Zeitpunkt enthält das Pellet drei Schichten; Die Perlen mit Glomeruli sind in der mittleren Schicht der Röhre sichtbar, die obere Schicht besteht aus kleineren Strukturen wie Tubuli und die untere Schicht besteht aus Trümmern (Abbildung 3D).
- Den Überstand und die oberste weiße Schicht vorsichtig absaugen. Das verbleibende Pellet enthält die Perlen mit den Glomeruli und Ablagerungen (Abbildung 3D). Resuspendieren Sie das Pellet mit 1,5 mL 1x HBSS und geben Sie es in ein 2 ml Röhrchen.
- Setzen Sie das Röhrchen in den magnetischen Konzentrator ein (Abbildung 3E), saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie dann die Perlen 2x mit 1 ml 1x HBSS. In diesem Stadium 20 μL der Zellsuspension auf einen Objektträger geben, um das Vorhandensein von Glomeruli unter dem Mikroskop zu überprüfen (Abbildung 3F; ein Glomerulus [schwarzer Pfeil] und einige Perlen [gelbe Pfeile] in der Suspension).
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, resuspendieren Sie das Pellet in einem Endothelzellwachstumsmedium (Table of Materials) und geben Sie es in ein sauberes 2-ml-Röhrchen. Geben Sie 2 μL IFNγ (100 U/ml) in das Röhrchen und legen Sie die Zellen auf eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die Zellen bei 33 °C.
- Nach 3 Tagen Kultur wechseln Sie das Medium vorsichtig, indem Sie 1 ml des Mediums pipettieren und durch 1 ml frisches Medium ersetzen. In diesem Stadium sind die Zellen heterogen mit einer Mischung von glomerulären Zellen (Abbildung 4G).
HINWEIS: In der auswachsenden Kultur wird es eine Mischung aus glomerulären Zellen und einigen magnetischen Perlen geben (Abbildung 4G). Beachten Sie, dass alle Zellen grüne, fluoreszierende Mitochondrien zeigen sollten. - Nach 7 Tagen Kultur saugen Sie das Medium vollständig ab und ersetzen Sie es durch ein frisches 2 ml Endothelzellwachstumsmedium, das mit IFNγ (100 U / ml) ergänzt wird. In diesem Stadium beginnen sich die Zellen zu vermehren, sind aber immer noch heterogen (Abbildung 4A).
- Nach 10 Tagen Kultur, wenn die Zellen ~80% Konfluenz erreicht haben, passieren Sie die Zellen mit Trypsin wie in Schritt 5.1 beschrieben und übertragen sie dann in einen T25-Kolben, der mit Kollagen IV beschichtet ist.
- Nach 1 Woche (insgesamt ~21 Tage Kultur) passieren Sie die Zellen in einen T75-Kolben, der mit Kollagen IV beschichtet ist.
4. Herstellung von Perlen zur Isolierung von Endothelzellen
- Beginnen Sie mit der Beschichtung der Schaf-Anti-Ratten-Perlen mit einem Ratten-Anti-Maus-CD31-Antikörper 3,18,19. Verwenden Sie 10 μL Perlen für jeden T75-Kolben.
- Waschen Sie 10 μL Perlen 3x mit 200 μL 1x PBS, ergänzt mit 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin. Legen Sie das Rohr in den Konzentratormagneten, um den Waschpuffer jedes Mal zu pipettieren.
- Resuspendieren Sie die Beads in 200 μL PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin. Fügen Sie 4,8 μl Ratten-Anti-Maus-CD31-Antikörper 7,18,19 hinzu, legen Sie das Röhrchen auf einen horizontalen Shaker und mischen Sie vorsichtig für 1 h bei Raumtemperatur, und halten Sie das Röhrchen dann über Nacht bei 4 °C.
5. Isolierung der glomerulären Endothelzellen mit CD31-beschichteten Beads
- 3 ml 0,25% Trypsin in einen T75-Kolben geben und die Zellen bei 37 °C für 5 min inkubieren. Neutralisieren Sie das Trypsin mit 3 ml endothelialem Wachstumsmedium, übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Röhrchen und zentrifugieren Sie dann bei 200 x g für 5 min.
- Saugen Sie den Überstand ab und waschen Sie die Zellen in 1 ml PBS, das 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin enthält. Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min.
- Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μL beschichteten Perlen, die in Schritt 4 hergestellt wurden, und fügen Sie 800 μL PBS hinzu, das 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin enthält. Die Zellen 45 min unter kontinuierlichem Schütteln bei 37 °C, 5% CO2 inkubieren.
- Legen Sie das Röhrchen in den magnetischen Konzentrator und waschen Sie die Zellen 4x mit 1x PBS mit 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% Penicillin / Streptomycin. Resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml endothelialem Wachstumsmedium, ergänzt mit 100 U/mL IFNγ.
- Platte 1,5 ml Zellen / Vertiefung in Kollagen IV-beschichteten Vertiefungen auf einer 6-Well-Platte. Kultur der Zellen unter freizügigen Bedingungen bei 33 °C.
HINWEIS: Die isolierten Zellen exprimieren das große T-Antigen tsA58 des Simian Virus 40 (SV40), was die Aktivierung der kontinuierlichen Proliferation bei 33 °C ermöglicht (permissive Bedingung). - Nach 4 Tagen in Kultur 750 μL des Mediums entfernen und durch das gleiche Volumen frisches Medium ersetzen, das mit 100 U / ml IFNγ ergänzt wurde.
- Nach 10 bis 14 Tagen Kultur überprüfen Sie mit einem Epifluoreszenzmikroskop mit einem 488-nm-Filter auf wachsende CD31-positive GECs-Kolonien (Abbildung 4C), die fluoreszierende Mitochondrien exprimieren.
- Nach 21 Tagen Kultur können die Zellen eine Konfluenz von 80%-90% erreicht haben; Sie werden in einen T25-Kolben umgefüllt. Nach Erreichen der Konfluenz können die Zellen mit RPMI-Wachstumsmedium und 10% FCS aufrechterhalten werden.
HINWEIS: Bevor die Zellen den Zusammenfluss erreichen, können sie heterogen aussehen (Abbildung 4B). Sobald sie jedoch zusammenfließen, erhalten sie eine Kopfsteinpflastermorphologie. - In diesem Stadium könnten die Zellen kryokonserviert werden. Bei Erreichen von 80% Konfluenz 3 ml 0,25% Trypsin in die Zellen geben und sie bei 37 °C für 5 min inkubieren. Neutralisieren Sie das Trypsin mit einem gleichen Volumen Wachstumsmedium, das mit 10% FBS ergänzt wird.
- Zentrifugieren bei 200 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 3 ml Gefriermedium (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquot die Zellen in Kryoröhren und Lagerung bei flüssiger Stickstoffdampftemperatur.
6. Anbau der mitoDendra2-GECs
- Die Zellen aus dem Kryoaliquot aus Schritt 5.10 in einem Wasserbad bei 37 °C auftauen und in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 mL vorgewärmtem endothelialem Wachstumsmedium überführen.
- Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Das Medium wird entfernt und das Pellet in den mit Kollagen IV-beschichteten T25 cm 2-Zellkulturkolben mit vorgewärmtem Endothelzellwachstumsmedium, ergänzt mit 100 U/ml IFNγ, überführt und bei 33 °C inkubiert.
- Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 70% -80% erreichen, normalerweise nach 5 Tagen, werden sie in einen T75 cm2 Zellkulturkolben überführt.
- Um die Zellen nach dem endothelialen Phänotyp zu differenzieren, werden die Zellen bei 37 °C in Wachstumsmedien ohne IFNγ in nicht-permissive Bedingungen überführt.
7. Passaging von mitoDendra2-GECs
- Entfernen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit PBS und fügen Sie 3 ml warme 0,25%ige Trypsin-EDTA-Lösung (T75 cm2-Kolben ) hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 5 min.
- Wenn die Zellen abgelöst sind, fügen Sie 5 ml Wachstumsmedium hinzu und pipetten Sie auf und ab. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 200 x g für 5 min bei Raumtemperatur und übertragen Sie die Zellen in einen neuen Kollagen-IV-beschichteten Kolben oder eine neue Platte.
HINWEIS: Passaging sollte einmal pro Woche im Verhältnis 1:4 durchgeführt werden.
8. Charakterisierung von mitoDendra2-GECs
- Führen Sie eine Immunfluoreszenzfärbung für CD31 an differenzierten Zellen 7,18,19,20 durch (Abbildung 4D). Verwenden Sie auch andere Marker wie vWF und Isolectin-B420.
- Um die mitochondriale Spezifität von Dendra2 zu bestätigen, markieren Sie Zellen mit mitochondrial-spezifischen Markern, indem Sie die Zellen in Wachstumsmedium inkubieren, das 100 nM mitochondrialen Tracker für 30 min bei 37 °C, 5%CO2 enthält.
- Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit vorgewärmtem Medium ohne Phenolrot, um Live-Aufnahmen durchzuführen.
HINWEIS: Alternativ können die Zellen mit Formaldehyd-Fixiermitteln (4%) für 30 Minuten fixiert werden, gefolgt von mehrmaligem Waschen in PBS. Fest installierte Zellen können bei 4 °C in 1x PBS bis zur Verwendung gelagert werden. Eine Bestätigung mit Durchflusszytometrie ist ebenfalls möglich: Markierungszellen mit Anti-CD31, Anti-PECAM, Anti-CD45. GECs sollten für Podozytenmarker (Synaptopodin, Nphs1, Podxl), Mesangialzellmarker (PDGFRβ, Angiotensinogen) und tubuläre Zellmarker (Aquaporin, Aminopeptidase-N) negativ gefärbt werden. Diese Marker dienen als Negativkontrollen. Aufgrund der mitochondrial-spezifischen Dendra2-Expression dieser Zellen ist die Verwendung des FITC-Kanals zu vermeiden.
9. Lebendzellbildgebung von Mitochondrienstrukturveränderungen als Reaktion auf oxidativen Stress oder hohe Glukose
- Platte 1 x 105 GECs auf einer 35 mm Glasbodenschale, beschichtet mit Kollagen IV unter Verwendung von Endothelzellwachstumsmedium (Table of Materials). Nach 24 h wechseln Sie zu Medium ohne Phenolrot. Zellen haben grüne, fluoreszierende Mitochondrien.
- Stellen Sie die Klimakammer vor Beginn des Experiments auf 37 °C, 5 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 1 h ein.
- Verwenden Sie unter einem konfokalen Mikroskop ein 40x/1,2-W-Objektiv, um den Fokus einzustellen und den interessierenden Bereich auszuwählen. Inkubieren Sie die Zellen mit 2 ml 5 mM oder 25 mM Glukose für 60 min.
- Setzen Sie die Zellen einem 405-nm-Laser (4% Laserleistung) aus, um eine Subpopulation von Mitochondrien von grün in rot umzuwandeln (Abbildung 5A-B, D-E).
- Verwenden Sie den 561-nm-Laser, um Dendra2 im unkonvertierten Zustand anzuregen, um die rote Fluoreszenz sichtbar zu machen. Siehe das detaillierte Photo-Switching-Protokoll, wie zuvor beschrieben16. Die Fusionsereignisse erscheinen aufgrund der Fusion der grünen und roten Matrix nach einigen Minuten als gelbe Fluoreszenz (Abbildung 4C, F).
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Representative Results
In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Endothelzellen mit stabilen fluoreszierenden Mitochondrien (mitoDendra2-GECs) beschrieben (Abbildung 1). Die Verwendung von jungen 6-10 Wochen alten Mäusen ist unerlässlich, um eine beträchtliche Anzahl gesunder Zellen zu erhalten. Nach 3 Tagen Kultur beginnen die Zellen langsam aus den isolierten Glomeruli zu wachsen, wie in Abbildung 3G gezeigt. Nach 7 Tagen sind die Zellen heterogen und zeigen andere glomeruläre Zelltypen wie Podozyten, parietale Epithelzellen und mesangiale Zellen (Abbildung 4A). Nach Erreichen einer Konfluenz von 70% bis 80% wurden andere glomeruläre Zellen unter Verwendung einer positiven Auswahl von Endothelzellen mit magnetischen CD31-markierten Perlen entfernt (Abbildung 4B-C). Die mitoDendra2-GECs exprimierten CD31 (Abbildung 4D) und waren negativ für den Podozytenmarker, wie durch Synaptopodin-negative Färbung gezeigt (Abbildung 4E-F).
Die fluoreszierende mitochondriale Eigenschaft in den mitoDendra2-GECs ermöglicht es, die Morphologie der Mitochondrien unter verschiedenen Bedingungen in vitro zu untersuchen. Hier testeten wir die Wirkung von hoher Glukose (25mM) auf die Mitochondrienstruktur von mitoDendra2-GECs (Abbildung 5D-F). Im Vergleich zu den länglichen Mitochondrien, die in Zellen unter normaler Glukose sichtbar sind (5mM; Abbildung 5A-C), hohe Glukose-induzierte Fragmentierung oder Spaltung von Mitochondrien, beobachtet von prominenten kugelförmigen Mitochondrien (Abbildung 5E). Darüber hinaus verwendeten wir einen 405-nm-Laser, um eine ausgewählte Subpopulation von Mitochondrien in ein einzelnes lebendes MitoDendra2-GEC photokonvertieren (Abbildung 5A,D). In Abbildung 5B und Abbildung 5E wird die erfolgreiche Photoumschaltung der Mitochondrien von grün (488nm) auf rot (561 nm) im ausgewählten Bereich dargestellt. Wichtig ist, dass es ermöglichte, die Fusionsereignisse in mitoDendra2-GECs zu beobachten, die unter normaler Glukose gezüchtet wurden, wie durch die gelb verschmolzene grüne und rote Fluoreszenz als Folge der Mitochondrienmatrixfusion beobachtet werden kann (Abbildung 5C). Im Gegensatz dazu waren die Mitochondrien in der mit hoher Glukose behandelten MitoDendra2-GEC fragmentiert und hauptsächlich rot (Abbildung 5F), was darauf hindeutet, dass im getesteten Zeitrahmen die Spaltungs-/Fusionsereignisse aufgrund der durch die Behandlung mit hoher Glukose verursachten Schäden verzögert oder gehemmt wurden, und dies stimmt mit früheren Berichten überein18,19.
Abbildung 1: Repräsentative Beschreibung der murinen GEC-Isolierung. Das Diagramm stellt die signifikanten Schritte der GEC-Isolierung dar, beginnend mit der Perfusion von Mäuseherzen mit magnetischen Kügelchen zur Isolierung der Nierenglomeruli, der Verdauung von Kollagenase, der Kultur von glomerulären Zellen und schließlich der Reinigung von GEC mit CD31-beschichteten Perlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beschreibung der Nierendissektion. Repräsentatives Bild aller sterilen chirurgischen Instrumente, die für die Dissektion benötigt werden. Eine Schere (a) wird benötigt, um die Haut der Maus zu öffnen, und eine separate Schere (b, c) wird benötigt, um die Niere zu isolieren. Pinzetten (d) und (e) werden benötigt, um die Haut zu halten. Pinzette (f) wird benötigt, um die sezierte Niere zu sammeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Beschreibung der Glomeruli-Ernte . (A) Perfusion des linken Ventrikels mit der HBSS-Perlenlösung mit einer 20-ml-Spritze. Perforieren Sie die Vena cava inferior mit einer 19 G Nadel. (B) Entfernen Sie nach der Durchblutung das Fett aus der Niere und schneiden Sie es in 1 mm große Stücke. (C) Verdauen Sie das Gewebe mit Kollagenase Typ II. (D) Nach dem Aufschluss und der Zentrifugation bilden sich drei Schichten; Die Perlen mit den Glomeruli befinden sich in der mittleren Schicht, wie der schwarze Pfeil anzeigt. (E) Die isolierten Perlen, die die Glomeruli tragen, werden mit dem magnetischen Konzentrator getrennt. (F) Repräsentatives Bild frisch isolierter Glomeruli. (G) Wachsende Zellen aus isolierten Glomeruli nach 3 Tagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Mitochondrialer Assay in vitro. (A) Glomeruläre Zellen nach 3 Tagen Kultur. (B) GEC nach 7 Tagen. (D) Reinigung von GEC mit CD31-markierten Perlen. Mikroskopische Bildgebung der CD31-Färbung. (E) GECs sind negativ für Synaptopodin. (F) Podozyten, die mit Synaptopodin (488 nm, grüne Fluoreszenz) als Negativkontrolle gefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Mikroskopische Darstellung der fluoreszierenden mitochondrialen Fusion in vitro. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40-fachen Wasserobjektiv aufgenommen. (A-B) Der ausgewählte Bereich (roter Kreis) wurde mit einer 405-nm-Linie (4% Laserleistung) für 300 Bleichiterationen mit einer Geschwindigkeit von 6,3-12,61/Pixel beleuchtet, wie zuvor beschrieben16. (A-C) Zellen in Wachstumsmedien, die 5 mM Glukose enthalten; Grüne Fluoreszenz (488 nm) zeigt gesunde Mitochondrien. (B,E) Mitochondrien wurden photogeschaltet in Rot (567 nm). (C) Gelbe Fluoreszenz detektiert ein aktives Fusionsereignis von GEC, das mit 5mM Glukose behandelt wurde. (D) Die Zellen wurden 30 min lang mit hoher Glukose 25 mM behandelt. Grüne Fluoreszenz zeigt fragmentierte Mitochondrien und (E) einen Teil, der photogeschaltet in rot wurde. (F) Die Abbildung zeigt ein vermindertes Fusionsereignis, dargestellt durch reduzierte gelbe Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mitochondrien sind entscheidend für den Zellstoffwechsel, die Homöostase und Stressreaktionen, und ihre Dysfunktion ist mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich Nierenerkrankungen. Mitochondrien spielen eine Rolle bei der pathologischen Erzeugung übermäßiger reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Regulation des intrazellulären Kalziumspiegels, der Zelltodwege und der Dynamik des Zytoskeletts21,22,23.
Die Isolierung von murinen GECs ist aufgrund ihrer geringen Anzahl, Größe, Matrixfaktoren und gegenseitigen Abhängigkeit mit anderen glomerulären Zellen, die für ihr Überleben unerlässlich sind, eine Herausforderung. Der aktuelle Artikel stellt ein detailliertes Protokoll für die GEC-Isolierung von Mäusen vor. Konkret nutzten wir transgene Mäuse als Werkzeug, um bedingt immortalisierte Zelllinien mit hohem Proliferationspotenzial zu erhalten. Die transgenen Mäuse, die das große T-Antigen tsA58 des Simian Virus 40 (SV40) exprimieren, ermöglichen die Aktivierung einer kontinuierlichen Proliferation unter permissiven Bedingungen bei 33 °C und wurden hier mit den PHAMexzidierten Mäusen gekreuzt, die mitochondrial-spezifische Fluoreszenz exprimieren. Die doppelten transgenen Mäuse boten ein hervorragendes Werkzeug, um die Struktur der Mitochondrien zu untersuchen. Tatsächlich schnitten PHAM Mäuse mitochondrial-spezifisch (Untereinheit VIII der Cytochrom-c-Oxidase) Dendra2 grün auf, was die Live-Detektion fluoreszierender Mitochondrien und die Beobachtung von Spalt- und Fusionsereignissen durch grün-rotes Photoswitching ermöglicht16.
Das Protokoll besteht aus drei wesentlichen Schritten: der Extraktion von Glomeruli mit Perlen, der Proliferation von glomerulären Zellen und der anschließenden Reinigung von GEC mit CD31-Perlen, sobald die Zellen in Kultur sind. Die Verwendung von nur einer Verdauung mit Kollagenase reicht aus, um glomeruläre Zellen zu isolieren. Andere Protokolle nutzen eine zweite Verdauung mit DNAse und Proteinase24. Wir haben jedoch bessere Zellerträge mit nur einem Verdauungsschritt festgestellt. Die DNAs können aktiv bleiben und die Proliferation der Zellen verlangsamen. Darüber hinaus konnte GEC durch differentielle Siebung isoliert werden, wie zuvor beschrieben20, was bei der Verwendung von Mäusenieren nicht immer einfach ist.
Es ist wichtig, alle chirurgischen Instrumente zu autoklavieren, bevor mit der Isolierung der Nieren und der Glomeruli begonnen wird, um eine Kontamination zu vermeiden. Darüber hinaus ist es wichtig, die Lösungen zu filtern und mit Antibiotika zu ergänzen, um jegliche Quelle von Verunreinigungen zu beseitigen. Tatsächlich können Mykoplasmeninfektionen eine Zytopathologie verursachen, die folglich jeden in der Zellkultur gemessenen Parameter stört25.
Die Isolierung von Glomeruli beruht auf der intrakardialen Perfusion von Perlen. Sicherlich ist eine langsame Perfusion mit 20 ml 1x HBSS-haltigen Perlen unerlässlich, um eine hohe Anzahl von Glomeruli zu ernten. Die Perlen werden in den Glomeruli eingeschlossen, was ihre Reinigung mit einem magnetischen Konzentrator erleichtert. Die Perlen können vorbereitet und bis zu 15 Tage bei 4 °C gelagert werden, bevor sie verwendet werden, um den experimentellen Ablauf zu erleichtern.
Darüber hinaus ist die Verdauung von Glomeruli mit kontinuierlichem Schütteln entscheidend für die Dissoziation einer großen Anzahl von Glomeruli von der Niere. Auf der anderen Seite ist die Isolierung von murinen GECs aufgrund ihrer geringen Größe und des Vorhandenseins anderer glomerulärer Zellen eine Herausforderung. Daher sind die schrittweise Isolierung von Glomeruli, das Wachstum aller glomerulären Zellen in Kultur und die anschließende Verwendung von CD31-beschichteten Perlen zur Reinigung von Endothelzellen von entscheidender Bedeutung, insbesondere um eine signifikantere Anzahl lebensfähiger und bedingt proliferativer GECs zu erhalten. Dennoch ist es erforderlich, die Reinheit der Zellen mit Immunfärbung und Durchflusszytometrie zu validieren.
Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Charakterisierung des GEC-Phänotyps und des Mitochondrienfusions-/Spaltassays in vitro. Die mitoDendra2-GECs sind ein hervorragendes Werkzeug, um die zellulären Reaktionen von GEC-Mitochondrien auf verschiedene Reize in vitro zu untersuchen, ohne dass eine Transfektion oder Färbung erforderlich ist.
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Disclosures
Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken Professor Cijiang He und Dr. Fu Jia für ihre Einblicke in die Endothelzellisolierung von Mäusen und danken Professor Mone Zaidi für die Bereitstellung der von PhAMausgeschnittenen Mäuse und wertvolle Diskussionen. Die Autoren möchten auch dem Microscopy CORE an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai und den Mitarbeitern für die Beratung danken, die wir erhalten haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institutes of Health Grant R01DK097253 und des Department of Defense CDMRP Grant E01 W81XWH2010836 an I.S.D. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
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