Summary
L'articolo descrive il metodo per isolare cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate dai reni di topi transgenici che esprimono il virus termolabile delle scimmie 40 e mitocondri fotoattivabili, PhAMasportato. Descriviamo la procedura per l'isolamento dei glomeruli da reni interi usando perline, fasi di digestione, semina e coltura di GEC-CD31 positivi.
Abstract
La disfunzione delle cellule endoteliali glomerulari (GEC) può avviare e contribuire alla rottura della barriera di filtrazione glomerulare. L'aumento dello stress ossidativo mitocondriale è stato suggerito come meccanismo che provoca la disfunzione GEC nella patogenesi di alcune malattie glomerulari. Storicamente l'isolamento degli OG dai modelli in vivo è stato notoriamente impegnativo a causa delle difficoltà nell'isolare colture pure dai glomeruli. Gli OG hanno requisiti di crescita complessi in vitro e una durata di vita molto limitata. Qui, descriviamo la procedura per isolare e coltivare GEC condizionatamente immortalati con mitocondri fluorescenti, consentendo il monitoraggio degli eventi di fissione e fusione mitocondriale. I GEC sono stati isolati dai reni di un topo transgenico doppio che esprime il termolabile SV40 TAg (dall'Immortomouse), promuovendo condizionatamente la proliferazione e sopprimendo la differenziazione cellulare, e una proteina fluorescente fotoconvertibile (Dendra2) in tutti i mitocondri (dal topo mitocondriale fotoattivabile). La linea cellulare stabile generata consente la differenziazione cellulare dopo l'inattivazione del gene immortalizzante SV40 TAg e la foto-attivazione di un sottogruppo di mitocondri causando un passaggio della fluorescenza dal verde al rosso. L'uso di mitoDendra2-GEC consente l'imaging dal vivo degli eventi di distribuzione, fusione e fissione dei mitocondri fluorescenti senza colorare le cellule.
Introduction
Il glomerulo è fondamentale per la filtrazione del sangue limitando il passaggio di grandi molecole attraverso la barriera di filtrazione glomerulare 1,2. Il glomerulo contiene quattro tipi di cellule: cellule epiteliali parietali, podociti (cellule epiteliali viscerali), cellule endoteliali glomerulari (GEC) e cellule mesangiali3. L'endotelio glomerulare è caratterizzato da una struttura vascolare unica, come per la presenza di fenestrae richieste per grandi volumi di filtrazione4. La superficie apicale dell'endotelio glomerulare è ricoperta da uno strato di glicocalice caricato negativamente e da un rivestimento chiamato strato superficiale endoteliale che crea uno spazio tra l'endotelio e il sangue. Questa struttura fornisce un'elevata selettività della carica limitando il passaggio di molecole caricate negativamente come l'albumina e impedendo l'adesione di leucociti e piastrine5.
Gli OG sono molto sensibili ai cambiamenti metabolici, come l'iperglicemia associata all'ambiente diabetico. Infatti, il diabete porta ad un aumento della circolazione di sostanze nocive, alla saturazione delle vie del metabolismo del glucosio e a disturbi dell'equilibrio redox cellulare 3,6. Inoltre, l'aumento delle specie reattive dell'ossigeno induce disfunzione mitocondriale, che influisce sulla funzione endoteliale7.
L'obiettivo generale dell'attuale protocollo è quello di isolare cellule endoteliali glomerulari immortalizzate con caratteristiche mitocondriali fluorescenti. Infatti, la coltura cellulare di GEC primari ha un ciclo proliferativo limitato e una senescenza precoce8. Inoltre, la presenza di mitocondri fluorescenti aiuta a esaminare gli eventi di fissione e fusione in risposta all'iperglicemia o a qualsiasi altro trattamento. Come metodo alternativo, altri laboratori hanno utilizzato h-TERT per immortalare le cellule in vitro9.
Il metodo qui descritto consente l'isolamento di cellule endoteliali glomerulari mitoDendra2 condizionatamente immortalate da animali di 4-6 settimane (Figura 1). Questo protocollo dettagliato descrive l'uso di topi transgenici (H-2K b-tsA58) che ospitano il gene 10,11 del virus delle scimmie 40 Large Tumor Antigene (SV40 TAg) per generare cellule termolabili condizionatamente immortalate. Il prodotto del gene tsA58 TAg è funzionale alla temperatura permissiva di 33 °C sotto il controllo del promotore 5' fiancheggiante inducibile del gene H-2Kb del topo, che viene aumentato al di sopra dei livelli basali dopo esposizione all'interferone gamma (IFNγ), mantenendo quindi il fenotipo di proliferazione condizionale12. H-2Kb viene rapidamente degradato alla temperatura non permissiva di 37 °C in assenza di IFNγ, rimuovendo la funzione immortalizzante del tsA58Tag nelle cellule e permettendo alle cellule di sviluppare un fenotipo 13,14,15 più differenziato. L'incrocio opzionale di topi transgenici H-2Kb-tsA58 con topi PhAM, che esprimono un mitocondrio-specifico (subunità VIII della citocromo c ossidasi) Dendra2-green, consente la rilevazione in tempo reale di mitocondri fluorescenti16. La fluorescenza verde Dendra2 passa alla fluorescenza rossa dopo l'esposizione a un laser16 a 405 nm. Quando i mitocondri si fondono dopo il foto-switching, formano forme allungate che appaiono gialle dallo scambio di materiale verde e giallo o appaiono rosse quando subiscono la fissione 7,17. I mitoDendra2-GEC sono un ottimo strumento per studiare le risposte cellulari dei mitocondri GEC a diversi stimoli.
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Protocol
Tutte le procedure animali qui descritte sono state approvate dalla IACUC presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Abbiamo usato tre topi maschi (topi transgenici H-2Kb-tsA58 con mitocondri fotoattivabili [PhAM]) acquistati dal laboratorio Jackson e tenuti su una normale dieta chow.
1. Condizioni di lavoro e preparativi
- Pulire lo spazio di lavoro all'interno della cappa a flusso laminare utilizzando etanolo al 70% e luce UV-C.
- Preparare i tamponi di lavaggio del tallone. Fare tampone-1 usando 0,1 M fosfato di sodio a pH 7,4-8,0, tampone-2 usando 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) senza calcio e magnesio integrato con antigene sierico bovino 0,1% (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 e tampone-3 usando 0,2 M Tris con 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Concentratore di particelle magnetiche
- Preparazione di sfere magnetiche
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare delicatamente 200 μL di sfere magnetiche (4 x 108 perle) con 200 μL di tampone-1.
NOTA: Preparare 200 μL di sfere magnetiche per topo 1 giorno prima della raccolta dei tessuti. Le perle saranno utilizzate per raccogliere i glomeruli. - Posizionare il tubo in un concentratore di particelle magnetiche per 1 minuto, quindi aspirare con cura il surnatante. Rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le perle lavate in 200 μL di tampone-1.
- Posizionare il tubo contenente le sfere magnetiche nel concentratore di particelle magnetiche per 1 minuto e aspirare delicatamente il surnatante.
- Inattivare i gruppi tosilici liberi lavando le sfere magnetiche 2x, 5 min ciascuna, utilizzando 200 μL di tampone-2 posizionando il tubo nel concentratore di particelle magnetiche ed eliminando il tampone.
- Incubare le sfere magnetiche in 200 μL di tampone-3 per 24 h a 4 °C, o per 4 ore a 37 °C, per inattivare i restanti gruppi tosilici liberi. Posizionare il tubo nel concentratore magnetico per 1 minuto, aspirare delicatamente il surnatante e gettarlo.
- Lavare le sfere magnetiche 1x con 200 μL di tampone-2 per 5 minuti a 4 °C. Riposizionare il tubo nel concentratore magnetico per 1 minuto e aspirare delicatamente il surnatante. Rimuovere il tubo dal concentratore magnetico e risospendere le sfere magnetiche in 200 μL di tampone-2 per ottenere 4 x 108 perle/ml.
NOTA: In questa fase, è possibile lasciare le perle a 4 °C per un massimo di 15 giorni.
- In una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml, mescolare delicatamente 200 μL di sfere magnetiche (4 x 108 perle) con 200 μL di tampone-1.
3. Isolamento delle cellule glomerulari renali di topo
- Preparare il materiale di perfusione: siringa da 30 ml, ago a farfalla da 25 G. Preparare il materiale isolante: piatto sterile da 10 cm, bisturi, concentratore di particelle magnetiche, filtro cellulare da 40 μm, filtro cellulare da 100 μm.
- Preparare 100 ml di 1x soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) integrata con antibiotici all'1% e regolare il pH a 7,35. Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm e tenerla sotto il cofano per evitare contaminazioni.
- Mescolare 200 μL di sfere magnetiche dal punto 2.1.6 con 20 mL di 1x HBSS.
NOTA: Per ogni topo, saranno necessari 200 μL di perline diluite in 20 ml di HBSS 1x. - Preparare un'aliquota di 1 mL di collagenasi di tipo II (125 CDU/mg) a 1 mg/mL in 1x soluzione HBSS, pH 7,35. Preriscaldare l'RPMI con il 10% di mezzo FCS a bagnomaria a 37 °C. Preriscaldare il terreno di coltura cellulare endoteliale a 37 °C (vedere la tabella dei materiali per i dettagli).
NOTA: L'RPM verrà utilizzato per neutralizzare la collagenasi. - Pre-rivestire due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 2 ml di 10 μg/mL di collagene IV (1 mL/pozzetto) per 45 minuti a temperatura ambiente. Lavare la piastra 3x con 1x PBS per rimuovere l'acido acetico usato per diluire il collagene. Utilizzare immediatamente le piastre rivestite o conservarle a 2-8 °C per un massimo di 4 settimane.
NOTA: è preferibile sigillare le piastre con una pellicola trasparente per evitare l'essiccazione. Il rivestimento di collagene facilita l'attaccamento delle cellule alla piastra. - Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici nella Figura 2 utilizzando etanolo al 70% e successivamente sterilizzandoli in autoclave per 30 minuti. Pulire lo spazio di lavoro chirurgico con etanolo al 70%.
- Anestetizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di ketamina/xilazina (10 mg/mL di ketamina e 1 mg/mL di xilazina). Per confermare che l'animale è completamente anestetizzato, controllare il riflesso del pizzicamento della punta.
- Fissare le zampe del mouse con aghi da 19 G per tenerlo in posizione su una piattaforma di dissezione. Pulire il torace e l'addome con etanolo al 70% e aprire l'addome lungo il torace con le forbici a (Figura 2).
- Inserire un ago a farfalla nel ventricolo sinistro (Figura 3A) e iniettare circa 100 μL della soluzione di perline (dal punto 1.2) per espandere la circolazione sanguigna.
- Rompere con cautela la vena cava inferiore sotto i reni con un ago da 19 G (Figura 3A). Continuare la perfusione iniziata nel passaggio 3.9.
NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare una mini pompa a velocità: 18.0+, tempo: 5 min. Una buona perfusione è importante per raccogliere un gran numero di sfere magnetiche portatrici di glomeruli. Questa è una procedura di non sopravvivenza / terminale. - Rimuovere delicatamente il tessuto adiposo con una pinzetta e asportare entrambi i reni con sottili forbici chirurgiche c (Figura 2) e metterli in una piastra con 1 mL di 1x HBSS su ghiaccio. Tritare il rene con le forbici b (Figura 2) quindi con un bisturi sterile a piccoli pezzi di 1 mm come mostrato nella Figura 3B.
- Quindi, incubare il rene tritato con 1 ml di collagenasi di tipo II dal punto 3.4 per 35 minuti a 37 °C con una leggera inclinazione utilizzando uno shaker orizzontale. Il tessuto deve essere completamente digerito dopo questa fase, come mostrato nella Figura 3C.
- Aggiungere 4 ml di RPMI con FBS al 10% (dal punto 3.4) per neutralizzare la collagenasi. Filtrare il tessuto digerito attraverso un filtro cellulare sterile da 100 μm in un tubo da 50 ml. Utilizzare il fondo di una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 ml per mescolare il tessuto digerito contro il filtro per consentire ai glomeruli di passare.
- Risciacquare il filtro cellulare con 15 ml di 1x HBSS e quindi centrifugare il flusso a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. A questo punto, il pellet contiene tre strati; le perle con glomeruli sono visibili nello strato intermedio del tubo, lo strato superiore è costituito da strutture più piccole come i tubuli e lo strato inferiore è costituito da detriti (Figura 3D).
- Aspirare con cura il surnatante e lo strato bianco superiore. Il pellet rimanente contiene le perle che portano i glomeruli e i detriti (Figura 3D). Risospendere il pellet con 1,5 ml di 1x HBSS e trasferirlo in un tubo da 2 ml.
- Posizionare il tubo nel concentratore magnetico (Figura 3E), aspirare il surnatante e quindi lavare le perline 2x con 1 mL di 1x HBSS; in questa fase, mettere 20 μL della sospensione cellulare su un vetrino per verificare la presenza di glomeruli al microscopio (Figura 3F; un glomerulo [freccia nera] e alcune perline [frecce gialle] nella sospensione).
- Aspirare con cautela il surnatante, risospendere il pellet nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali (Tabella dei materiali) e trasferirlo in un tubo pulito da 2 ml. Aggiungere 2 μL di IFNγ (100 U/mL) al tubo e placcare le celle su un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare le cellule a 33 °C.
- Dopo 3 giorni di coltura, cambiare accuratamente il terreno di coltura pipettando 1 mL del terreno e sostituendolo con 1 mL di terreno fresco. In questa fase, le cellule sono eterogenee con una miscela di cellule glomerulari (Figura 4G).
NOTA: Nella coltura in crescita, ci sarà un mix di cellule glomerulari e alcune sfere magnetiche (Figura 4G). Si noti che tutte le cellule dovrebbero mostrare mitocondri verdi e fluorescenti. - Dopo 7 giorni di coltura, aspirare completamente il terreno e sostituirlo con un nuovo terreno di crescita delle cellule endoteliali da 2 ml integrato con IFNγ (100 U/mL). In questa fase, le cellule iniziano a proliferare ma sono ancora eterogenee (Figura 4A).
- Dopo 10 giorni di coltura, quando le cellule raggiungono ~ 80% di confluenza, far passare le cellule usando tripsina come descritto al punto 5.1 e quindi trasferirle in un pallone T25 rivestito di collagene IV.
- Dopo 1 settimana (totale ~ 21 giorni di coltura), passare le cellule in un matraccio T75 rivestito di collagene IV.
4. Preparazione di perle per l'isolamento delle cellule endoteliali
- Inizia rivestendo le perle anti-ratto di pecora con unanticorpo CD31 3,18,19 anti-topo di ratto. Utilizzare 10 μL di perline per ogni matraccio T75.
- Lavare 10 μL di perline 3x con 200 μL di 1x PBS integrato con 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillina / streptomicina. Posizionare il tubo nel magnete del concentratore per pipettare ogni volta il tampone di lavaggio.
- Risospendere le perle in 200 μL di PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillina/streptomicina. Aggiungere 4,8 μL dianticorpo CD31 7,18,19 antitopo di ratto, posizionare il tubo su un agitatore orizzontale e mescolare delicatamente per 1 ora a temperatura ambiente, quindi mantenere il tubo a 4 °C per tutta la notte.
5. Isolare le cellule endoteliali glomerulari con perline rivestite di CD31
- Aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,25% in un matraccio T75 e incubare le cellule a 37 °C per 5 minuti. Neutralizzare la tripsina con 3 ml di terreno di crescita endoteliale, trasferire le cellule in un tubo da 15 ml, quindi centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
- Aspirare il surnatante e lavare le cellule in 1 mL di PBS contenente 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillina/streptomicina. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet in 200 μL di perline rivestite preparate nella fase 4 e aggiungere 800 μL di PBS contenente 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillina/streptomicina. Incubare le cellule per 45 minuti agitando continuamente a 37 °C, 5% CO2.
- Posizionare il tubo nel concentratore magnetico e lavare le celle 4x con 1x PBS contenente 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillina/streptomicina. Risospendere le cellule in 3 ml di terreno di crescita endoteliale integrato con 100 U/mL IFNγ.
- Piastra 1,5 ml di cellule/pozzetto in pozzetti rivestiti di collagene IV su una piastra a 6 pozzetti. Coltivare le cellule in condizioni permissive a 33 °C.
NOTA: Le cellule isolate esprimono il virus delle scimmie 40 (SV40) grande antigene T tsA58, consentendo l'attivazione della proliferazione continua a 33 °C (condizione permissiva). - Dopo 4 giorni di coltura, rimuovere 750 μL del terreno e sostituirlo con lo stesso volume di terreno fresco integrato con 100 U/mL IFNγ.
- Dopo 10-14 giorni di coltura, verificare la presenza di colonie di GEC CD31 positivi in crescita (Figura 4C) che esprimono mitocondri fluorescenti utilizzando un microscopio a epifluorescenza con un filtro a 488 nm.
- Dopo 21 giorni di coltura, le cellule possono aver raggiunto l'80%-90% di confluenza; trasferirli in un matraccio T25. Dopo aver raggiunto la confluenza, le celle possono essere mantenute con mezzo di crescita RPMI e FCS al 10%.
NOTA: Prima di raggiungere la confluenza, le celle possono apparire eterogenee (Figura 4B). Tuttavia, una volta che sono confluenti, acquisiscono una morfologia di ciottoli. - In questa fase, le cellule potrebbero essere crioconservate. Al raggiungimento dell'80% di confluenza, aggiungere 3 ml di tripsina allo 0,25% alle cellule e incubarle a 37 °C per 5 minuti. Neutralizzare la tripsina con un uguale volume di terreno di crescita integrato con FBS al 10%.
- Centrifugare a 200 x g per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di terreno di congelamento (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Aliquotare le cellule in crio-tubi e conservarle a temperatura di vapore di azoto liquido.
6. Coltivare i mitoDendra2-GEC
- Scongelare le cellule dalla crioaliquota, a partire dal punto 5.10, a bagnomaria a 37 °C e trasferirle in un tubo da 15 mL con 10 mL di terreno di crescita endoteliale preriscaldato.
- Centrifugare la sospensione a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il terreno e trasferire il pellet nel matraccio di coltura cellulare T25 cm2 rivestito di collagene IV con terreno di crescita delle cellule endoteliali preriscaldato integrato con IFNγ 100 U/mL e incubare a 33 °C.
- Cambia il mezzo il giorno successivo. Quando le cellule raggiungono il 70%-80% di confluenza, di solito dopo 5 giorni, trasferirle in un matraccio di coltura cellulare T75 cm2 .
- Per differenziare le cellule in base al fenotipo endoteliale, trasferire le cellule in condizioni non permissive a 37 °C in terreni di crescita senza IFNγ.
7. Passaggio di mitoDendra2-GECs
- Rimuovere il mezzo, lavare le cellule con PBS e aggiungere 3 ml di soluzione calda di tripsina-EDTA allo 0,25% (matraccio T75 cm2 ), incubare a 37 °C per 5 minuti.
- Quando le cellule sono staccate, aggiungere 5 ml di terreno di crescita e pipettare su e giù. Centrifugare la sospensione a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e trasferire le cellule in un nuovo matraccio o piastra rivestita di collagene IV.
NOTA: Il passaging deve essere effettuato una volta alla settimana con un rapporto di 1:4.
8. Caratterizzazione di mitoDendra2-GECs
- Eseguire la colorazione con immunofluorescenza per CD31 su cellule differenziate 7,18,19,20 (Figura 4D). Utilizzare anche altri marcatori come vWF e Isolectina-B420.
- Per confermare la specificità mitocondriale di Dendra2, marcare le cellule con marcatori mitocondriali specifici incubando le cellule in terreno di crescita contenente 100 nM di tracker mitocondriale per 30 minuti a 37 °C, 5% CO2.
- Rimuovere il mezzo e lavare delicatamente le cellule con mezzo preriscaldato senza rosso fenolo per eseguire l'imaging dal vivo.
NOTA: In alternativa, le cellule possono essere fissate usando fissativi di formaldeide (4%) per 30 minuti seguiti da un lavaggio più volte in PBS. Le celle fisse possono essere conservate a 4 °C in 1x PBS fino all'uso. È anche possibile una conferma con citometria a flusso: cellule marcatrici con anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. I GEC dovrebbero risultare negativi per i marcatori podociti (sinaptopodina, Nphs1, Podxl), i marcatori delle cellule mesangiali (PDGFRβ, angiotensinogeno) e i marcatori cellulari tubulari (acquaporina, aminopeptidasi-N). Questi marcatori servono come controlli negativi. A causa dell'espressione mitocondriale specifica di Dendra2 di queste cellule, evitare di utilizzare il canale FITC.
9. Imaging cellulare vivo dei cambiamenti strutturali dei mitocondri in risposta allo stress ossidativo o ad alto glucosio
- Piastra 1 x 105 GEC su un piatto con fondo di vetro da 35 mm rivestito con collagene IV utilizzando il mezzo di crescita delle cellule endoteliali (Tabella dei materiali). Dopo 24 ore, passare al mezzo senza rosso fenolo. Le cellule hanno mitocondri verdi e fluorescenti.
- Impostare la camera ambientale a 37 °C, 5% di umidità e 5% di CO2 1 h prima dell'inizio dell'esperimento.
- Al microscopio confocale, utilizzare un obiettivo 40x/1,2 W per regolare la messa a fuoco e selezionare la regione di interesse. Incubare le cellule con 2 ml di 5 mM o 25 mM di glucosio per 60 minuti.
- Esporre le cellule a un laser a 405 nm (potenza laser 4%) per fotoconvertire una sottopopolazione di mitocondri da verde a rosso (Figura 5A-B, D-E).
- Usa il laser a 561 nm per eccitare Dendra2 nello stato non convertito per visualizzare la fluorescenza rossa. Vedere il protocollo dettagliato di commutazione delle foto come descritto in precedenza16. Gli eventi di fusione appaiono come fluorescenza gialla dopo diversi minuti a causa della fusione della matrice verde e della matrice rossa (Figura 4C, F).
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Representative Results
In questo articolo, viene descritto un protocollo dettagliato per l'isolamento di cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti stabili (mitoDendra2-GECs) (Figura 1). L'uso di giovani topi di 6-10 settimane è essenziale per ottenere un numero considerevole di cellule sane. Dopo 3 giorni di coltura, le cellule iniziano a crescere lentamente dai glomeruli isolati, come mostrato in Figura 3G. Dopo 7 giorni, le cellule sono eterogenee, mostrando altri tipi di cellule glomerulari, come podociti, cellule epiteliali parietali e cellule mesangiali (Figura 4A). Dopo aver raggiunto il 70-80% di confluenza, altre cellule glomerulari sono state rimosse utilizzando una selezione positiva di cellule endoteliali con sfere magnetiche marcate CD31 (Figura 4B-C). I mitoDendra2-GEC esprimevano CD31 (Figura 4D) ed erano negativi per il marcatore podocita come mostrato dalla colorazione negativa della sinaptopodina (Figura 4E-F).
La caratteristica mitocondriale fluorescente nei mitoDendra2-GEC consente di studiare la morfologia dei mitocondri in varie condizioni in vitro. Qui, abbiamo testato l'effetto dell'alto glucosio (25mM) sulla struttura dei mitocondri di mitoDendra2-GEC (Figura 5D-F). Rispetto ai mitocondri allungati visibili nelle cellule sotto glucosio normale (5mM; Figura 5A-C), alta frammentazione o fissione dei mitocondri indotta da glucosio come osservato da mitocondri prominenti a forma di sferoide (Figura 5E). Inoltre, abbiamo utilizzato un laser a 405 nm per fotoconvertire una sottopopolazione selezionata di mitocondri in un singolo mitoDendra2-GEC vivo (Figura 5A,D). Nella Figura 5B e nella Figura 5E, viene presentata la corretta commutazione fotografica dei mitocondri da verde (488 nm) a rosso (561 nm) nell'area selezionata. È importante sottolineare che ha permesso di assistere agli eventi di fusione in mitoDendra2-GEC cresciuti sotto glucosio normale, come si può osservare dalla fluorescenza gialla verde e rossa fusa come risultato della fusione della matrice dei mitocondri (Figura 5C). Al contrario, nel mitoDendra2-GEC trattato con alto contenuto di glucosio, i mitocondri erano frammentati ed erano principalmente rossi (Figura 5F), suggerendo che, nel lasso di tempo testato, gli eventi di fissione / fusione sono stati ritardati o inibiti a causa del danno causato dal trattamento ad alto contenuto di glucosio, e questo è coerente con i precedenti rapporti18,19.
Figura 1: Descrizione rappresentativa dell'isolamento GEC murino. Il diagramma rappresenta i passaggi significativi dell'isolamento del GEC, a partire dalla perfusione del cuore dei topi con perline magnetiche per isolare i glomeruli renali, la digestione della collagenasi, la coltura delle cellule glomerulari e, infine, la purificazione del GEC utilizzando perline rivestite di CD31. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Descrizione della dissezione renale. Immagine rappresentativa di tutti gli strumenti chirurgici sterili necessari per la dissezione. Le forbici (a) sono necessarie per aprire la pelle del topo e un paio di forbici separate (b, c) sono necessarie per isolare il rene. Le pinzette (d) ed (e) sono necessarie per trattenere la pelle. La pinzetta (f) è necessaria per raccogliere il rene sezionato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Descrizione della raccolta dei glomeruli . (A) Perfondere il ventricolo sinistro con la soluzione di perline HBSS usando una siringa da 20 ml. Forare la vena cava inferiore con un ago da 19 G. (B) Dopo la perfusione, rimuovere il grasso dal rene e tagliarlo in pezzi di 1 mm. (C) Digerire il tessuto con collagenasi di tipo II. (D) Dopo la digestione e la centrifugazione, si formano tre strati; Le perle che portano i glomeruli sono nello strato intermedio, come indicato dalla freccia nera. (E) Separare le sfere isolate recanti i glomeruli utilizzando il concentratore magnetico. (F) Immagine rappresentativa di glomeruli appena isolati. (G) Cellule in crescita da glomeruli isolati dopo 3 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Saggio mitocondriale in vitro. (A) Cellule glomerulari dopo 3 giorni di coltura. (B) GEC dopo 7 giorni. (D) Purificazione di GEC con perline marcate con CD31. Imaging microscopico della colorazione CD31. (E) Gli OG sono negativi per la sinaptopodina. (F) Podociti colorati con sinaptopodina (488 nm, fluorescenza verde) come controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Imaging microscopico della fusione mitocondriale fluorescente in vitro. Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale utilizzando un obiettivo d'acqua 40x. (A-B) L'area selezionata (cerchio rosso) è stata illuminata con una linea a 405 nm (4% di potenza laser) per 300 iterazioni di sbiancamento a una velocità di 6,3-12,61 / pixel, come descritto in precedenza16. (A-C) Cellule in substrati di crescita contenenti 5 mM di glucosio; La fluorescenza verde (488 nm) mostra mitocondri sani. (B,E) I mitocondri sono stati foto-commutati in rosso (567 nm). (C) La fluorescenza gialla rileva un evento di fusione attivo di GEC trattati con 5mM di glucosio. (D) Le cellule sono state trattate con alto glucosio 25 mM per 30 minuti. La fluorescenza verde mostra mitocondri frammentati e (E) una porzione che è stata foto-commutata in rosso. (F) La figura mostra una diminuzione dell'evento di fusione, come mostrato dalla ridotta fluorescenza gialla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
I mitocondri sono fondamentali per il metabolismo cellulare, l'omeostasi e le risposte allo stress e la loro disfunzione è legata a molte malattie, tra cui le malattie renali. I mitocondri hanno un ruolo nella generazione patologica di specie reattive eccessive dell'ossigeno (ROS), nella regolazione dei livelli intracellulari di calcio, nelle vie di morte cellulare e nella dinamica citoscheletrica21,22,23.
L'isolamento dei GEC murini è difficile a causa del loro piccolo numero, dimensione, fattori della matrice e natura interdipendente con altre cellule glomerulari che sono essenziali per la loro sopravvivenza. L'articolo corrente presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento GEC del mouse. In particolare, abbiamo utilizzato topi transgenici come strumento per ottenere linee cellulari condizionatamente immortalate con alto potenziale di proliferazione. I topi transgenici, che esprimono il grande antigene T tsA58 del virus delle scimmie 40 (SV40), consentono l'attivazione della proliferazione continua in condizioni permissive a 33 °C e sono stati qui incrociati con i topi asportati PHAM che esprimono fluorescenza mitocondriale specifica. I topi transgenici doppi hanno offerto uno strumento eccellente per studiare la struttura dei mitocondri. Infatti, i topi asportati da PHAM sono dendra2 verdi mitocondriali specifici (subunità VIII della citocromo c ossidasi), consentendo la rilevazione in tempo reale di mitocondri fluorescenti e l'osservazione di eventi di fissione e fusione attraverso il foto-commutazione verde-rosso16.
Il protocollo consiste in tre fasi significative: l'estrazione dei glomeruli utilizzando perline, la proliferazione delle cellule glomerulari e la successiva purificazione di GEC utilizzando le perle CD31 una volta che le cellule sono in coltura. L'uso di una sola digestione con collagenasi è sufficiente per isolare le cellule glomerulari. Altri protocolli fanno uso di una seconda digestione con DNAse e proteinasi24. Tuttavia, abbiamo notato migliori rese cellulari con una sola fase di digestione. La DNAsi può rimanere attiva e rallentare la proliferazione delle cellule. Inoltre, GEC potrebbe essere isolato usando setacciatura differenziale come precedentemente descritto20, che non è sempre facile quando si usano reni di topi.
È fondamentale autoclavare tutti gli strumenti chirurgici prima di iniziare l'isolamento dei reni e dei glomeruli per evitare la contaminazione. Inoltre, è importante filtrare e integrare le soluzioni con antibiotici per eliminare qualsiasi fonte di contaminanti. Infatti, le infezioni da micoplasma possono causare citopatologia che di conseguenza interferisce con ogni parametro misurato in coltura cellulare25.
L'isolamento dei glomeruli si basa sulla perfusione intracardiaca delle perle. Certamente, una perfusione lenta con 20 ml di 1x perle contenenti HBSS è essenziale per raccogliere un numero elevato di glomeruli. Le perle saranno intrappolate nei glomeruli, che facilita la loro purificazione utilizzando un concentratore magnetico. Le perle possono essere preparate e conservate a 4 °C per un massimo di 15 giorni prima di utilizzarle per facilitare la procedura sperimentale.
Inoltre, digerire i glomeruli con agitazione continua è fondamentale per dissociare un buon numero di glomeruli dal rene. D'altra parte, l'isolamento dei GEC murini è difficile a causa delle loro piccole dimensioni e della presenza di altre cellule glomerulari. Pertanto, l'isolamento graduale dei glomeruli, la crescita di tutte le cellule glomerulari in coltura e il successivo uso di perline rivestite di CD31 per purificare le cellule endoteliali sono vitali, in particolare per ottenere un numero più significativo di GEC vitali e condizionatamente proliferativi. Tuttavia, è necessario convalidare la purezza delle cellule con immunocolorazione e citometria a flusso.
Inoltre, il protocollo descrive la caratterizzazione del fenotipo GEC e il saggio di fusione/fissione dei mitocondri in vitro. I mitoDendra2-GEC sono un ottimo strumento per studiare le risposte cellulari dei mitocondri GEC a diversi stimoli in vitro senza necessità di trasfezione o colorazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti da dichiarare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il professor Cijiang He e il dottor Fu Jia per le loro intuizioni sull'isolamento delle cellule endoteliali dei topi e ringraziano il professor Zaidi per aver fornito i topiasportati PhAM e preziose discussioni. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Microscopy CORE presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai e lo staff per la guida che abbiamo ricevuto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health grant R01DK097253 e Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 a I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
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