Summary
El artículo describe el método para aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas condicionalmente de los riñones de ratones transgénicos que expresan el virus simio termolábil 40 y las mitocondrias fotoactivables, PhAMextirpado. Describimos el procedimiento para el aislamiento de glomérulos de riñones enteros utilizando perlas, pasos de digestión, siembra y cultivo de GECs-CD31 positivos.
Abstract
La disfunción de las células endoteliales glomerulares (GEC) puede iniciar y contribuir a la ruptura de la barrera de filtración glomerular. El aumento del estrés oxidativo mitocondrial se ha sugerido como un mecanismo que resulta en la disfunción del GEC en la patogénesis de algunas enfermedades glomerulares. Históricamente, el aislamiento de los GEC de los modelos in vivo ha sido notoriamente desafiante debido a las dificultades para aislar los cultivos puros de los glomérulos. Los GEC tienen requisitos de crecimiento complejos in vitro y una vida útil muy limitada. Aquí, describimos el procedimiento para aislar y cultivar GEC inmortalizados condicionalmente con mitocondrias fluorescentes, lo que permite el seguimiento de los eventos de fisión y fusión mitocondrial. Los GEC se aislaron de los riñones de un ratón transgénico doble que expresaba el TAg SV40 termolábil (del Immortomouse), promoviendo condicionalmente la proliferación y suprimiendo la diferenciación celular, y una proteína fluorescente fotoconvertible (Dendra2) en todas las mitocondrias (del ratón mitocondria fotoactivable [PhAMextirpado]). La línea celular estable generada permite la diferenciación celular después de la inactivación del gen inmortalizante SV40 TAg y la fotoactivación de un subconjunto de mitocondrias que causan un cambio en la fluorescencia de verde a rojo. El uso de mitoDendra2-GEC permite obtener imágenes en vivo de los eventos de distribución, fusión y fisión de las mitocondrias fluorescentes sin teñir las células.
Introduction
El glomérulo es crítico para la filtración de la sangre al restringir el paso de moléculas grandes a través de la barrera de filtración glomerular 1,2. El glomérulo contiene cuatro tipos de células: células epiteliales parietales, podocitos (células epiteliales viscerales), células endoteliales glomerulares (GEC) y células mesangiales3. El endotelio glomerular se caracteriza por una estructura vascular única, según la presencia de fenestra requerida para grandes volúmenes de filtración4. La superficie apical del endotelio glomerular está cubierta con una capa de glicocálix cargada negativamente y una capa llamada capa superficial endotelial que crea un espacio entre el endotelio y la sangre. Esta estructura proporciona una alta selectividad de carga que restringe el paso de moléculas cargadas negativamente como la albúmina y previene la adhesión de leucocitos y plaquetas5.
Los GEC son muy sensibles a los cambios metabólicos, como la hiperglucemia asociada con el medio diabético. De hecho, la diabetes conduce a un aumento de la circulación de sustancias nocivas, la saturación de las vías del metabolismo de la glucosa y el equilibrio redox celular alterado 3,6. Además, el aumento de especies reactivas de oxígeno induce disfunción mitocondrial, que afecta la función endotelial7.
El objetivo general del protocolo actual es aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas con características mitocondriales fluorescentes. De hecho, el cultivo celular de GEC primarios tiene un ciclo proliferativo limitado y senescencia temprana8. Además, la presencia de mitocondrias fluorescentes ayuda a examinar los eventos de fisión y fusión en respuesta a la hiperglucemia o cualquier otro tratamiento. Como método alternativo, otros laboratorios utilizaron h-TERT para inmortalizar células in vitro9.
El método descrito aquí permite el aislamiento de células endoteliales glomerulares mitoDendra2 inmortalizadas condicionalmente de animales de 4-6 semanas de edad (Figura 1). Este protocolo detallado describe el uso de ratones transgénicos (H-2K b-tsA58) que albergan el gen 10,11 del antígeno tumoral grande del virus simio 40 (SV40 TAg) para generar células termolábiles inmortalizadas condicionalmente. El producto del gen tsA58 TAg es funcional a la temperatura permisiva de 33 °C bajo el control del promotor flanqueante 5' inducible del gen H-2K b de ratón, que aumenta por encima de los niveles basales tras la exposición al interferón gamma (IFNγ), manteniendo así el fenotipo de proliferación condicional12. H-2Kb se degrada rápidamente a la temperatura no permisiva de 37 °C en ausencia de IFNγ, eliminando la función inmortalizante del tsA58Tag en las células y permitiendo que las células desarrollen un fenotipo más diferenciado13,14,15. El cruce opcional de ratones transgénicos H-2Kb-tsA58 con ratones PhAM, que expresan una mitocondria específica (subunidad VIII de la citocromo c oxidasa) Dendra2-verde, permite la detección en vivo de mitocondriasfluorescentes 16. La fluorescencia verde Dendra2 cambia a fluorescencia roja después de la exposición a un láser de 405 nm16. Cuando las mitocondrias se fusionan después del fotocambio, forman formas alargadas que aparecen amarillas por el intercambio de material verde y amarillo o aparecen rojas cuando se someten a fisión 7,17. Los mitoDendra2-GECs son una gran herramienta para estudiar las respuestas celulares de las mitocondrias GEC a diferentes estímulos.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales descritos aquí fueron aprobados por el IACUC en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Utilizamos tres ratones machos (ratones transgénicos H-2Kb-tsA58 con mitocondrias fotoactivables [PhAM]) comprados en el laboratorio de Jackson y mantenidos en una dieta normal de comida.
1. Condiciones de trabajo y preparativos
- Limpie el espacio de trabajo dentro de la campana de flujo laminar utilizando etanol al 70% y luz UV-C.
- Prepare los amortiguadores de lavado de la cuenta. Hacer tampón-1 usando fosfato de sodio 0.1 M a pH 7.4-8.0, tampón-2 usando 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio suplementado con 0.1% de antígeno sérico bovino (BSA), 3 mM EDTA, pH 7.4, y tampón-3 usando 0.2 M Tris con 0.1% BSA, pH 8.5.
2. Concentrador de partículas magnéticas
- Preparación de perlas magnéticas
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle suavemente 200 μL de perlas magnéticas (4 x 108 perlas) con 200 μL de tampón-1.
NOTA: Prepare 200 μL de perlas magnéticas por ratón 1 día antes de la recolección de tejidos. Las cuentas se utilizarán para cosechar los glomérulos. - Coloque el tubo en un concentrador de partículas magnéticas durante 1 minuto, luego aspire cuidadosamente el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender las perlas lavadas en 200 μL de tampón-1.
- Coloque el tubo que contiene las perlas magnéticas en el concentrador de partículas magnéticas durante 1 minuto y aspire suavemente el sobrenadante.
- Inactivar los grupos tosil libres lavando las perlas magnéticas 2x, 5 min cada una, utilizando 200 μL de tampón-2 colocando el tubo en el concentrador de partículas magnéticas y desechando el tampón.
- Incubar las perlas magnéticas en 200 μL de tampón-3 durante 24 h a 4 °C, o durante 4 h a 37 °C, para inactivar los grupos tosil libres restantes. Coloque el tubo en el concentrador magnético durante 1 minuto, aspire suavemente el sobrenadante y deséchelo.
- Lavar las perlas magnéticas 1x con 200 μL de tampón-2 durante 5 min a 4 °C. Vuelva a colocar el tubo en el concentrador magnético durante 1 minuto y aspire suavemente el sobrenadante. Retire el tubo del concentrador magnético y vuelva a suspender las perlas magnéticas en 200 μL de tampón-2 para obtener 4 x 108 perlas/ml.
NOTA: En esta etapa, es posible dejar las perlas a 4 °C durante un máximo de 15 días.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezcle suavemente 200 μL de perlas magnéticas (4 x 108 perlas) con 200 μL de tampón-1.
3. Aislamiento de células glomerulares renales de ratón
- Prepare el material de perfusión: jeringa de 30 ml, aguja de mariposa de 25 g. Prepare el material de aislamiento: plato estéril de 10 cm, bisturí, concentrador de partículas magnéticas, filtro de células de 40 μm, filtro de células de 100 μm.
- Prepare 100 ml de 1x solución salina balanceada de Hank (HBSS) suplementada con antibióticos al 1% y ajuste el pH a 7.35. Filtrar la solución con un filtro de 0,2 μm y mantenerla debajo de la campana para evitar la contaminación.
- Mezclar 200 μL de perlas magnéticas del paso 2.1.6 con 20 ml de 1x HBSS.
NOTA: Para cada ratón, se necesitarán 200 μL de perlas diluidas en 20 ml de HBSS 1x. - Preparar una alícuota de 1 ml de colagenasa tipo II (125 CDU/mg) a 1 mg/ml en 1x solución HBSS, pH 7,35. Precaliente el RPMI con un 10% de FCS medio en un baño maría a 37 °C. Precaliente el medio de cultivo de células endoteliales a 37 °C (ver Tabla de materiales para más detalles).
NOTA: El RPMI se utilizará para neutralizar la colagenasa. - Cubra previamente dos pocillos de una placa de 6 pocillos con 2 ml de colágeno IV de 10 μg/ml (1 ml/pocillo) durante 45 min a temperatura ambiente. Lave la placa 3x con 1x PBS para eliminar el ácido acético utilizado para diluir el colágeno. Utilice las placas recubiertas inmediatamente o guárdelas a 2-8 °C durante un máximo de 4 semanas.
NOTA: Es preferible sellar la(s) placa(s) con una película transparente para evitar que se seque. El recubrimiento de colágeno facilita la unión de las células a la placa. - Limpie y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos de la Figura 2 utilizando etanol al 70% y posteriormente esterilizándolos en autoclave durante 30 min. Limpie el espacio de trabajo quirúrgico con etanol al 70%.
- Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (10 mg/ml de ketamina y 1 mg/ml de xilazina). Para confirmar que el animal está completamente anestesiado, verifique el reflejo de pellizco del dedo del pie.
- Fije las patas del ratón con agujas 19 G para mantenerlo en su lugar en una plataforma de disección. Limpie el pecho y el abdomen con etanol al 70%, y abra el abdomen a lo largo del pecho con unas tijeras (Figura 2).
- Inserte una aguja de mariposa en el ventrículo izquierdo (Figura 3A) e inyecte aproximadamente 100 μL de la solución de perlas (a partir del paso 1.2) para expandir la circulación sanguínea.
- Rompa con cuidado la vena cava inferior debajo de los riñones con una aguja de 19 G (Figura 3A). Continúe la perfusión iniciada en el paso 3.9.
NOTA: Alternativamente, se puede usar una mini bomba a velocidad: 18.0+, tiempo: 5 min. Una buena perfusión es importante para cosechar un gran número de glomérulos con perlas magnéticas. Este es un procedimiento de no supervivencia / terminal. - Retire suavemente el tejido graso con pinzas y extirpe ambos riñones con tijeras quirúrgicas delgadas c (Figura 2) y colóquelos en una placa con 1 ml de 1x HBSS en hielo. Picar el riñón con tijeras b (Figura 2) y luego con un bisturí estéril a trozos pequeños de 1 mm como se muestra en la Figura 3B.
- A continuación, incubar el riñón picado con 1 ml de colagenasa tipo II desde el paso 3.4 durante 35 min a 37 °C con una inclinación suave utilizando un agitador horizontal. El tejido debe ser completamente digerido después de este paso, como se muestra en la Figura 3C.
- Agregue 4 ml de RPMI con 10% de FBS (del paso 3.4) para neutralizar la colagenasa. Filtrar el tejido digerido a través de un colador de células estéril de 100 μm en un tubo de 50 ml. Use la parte inferior de un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml para agitar el tejido digerido contra el colador para permitir que los glomérulos pasen.
- Enjuague el filtro celular con 15 ml de 1x HBSS y luego centrifugar el flujo a 200 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. En este punto, el pellet contiene tres capas; las cuentas con glomérulos son visibles en la capa media del tubo, la capa superior consiste en estructuras más pequeñas como túbulos, y la capa inferior son escombros (Figura 3D).
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante y la capa blanca superior. El pellet restante contiene las cuentas que llevan los glomérulos y los escombros (Figura 3D). Resuspender el pellet con 1,5 ml de 1x HBSS y transferir a un tubo de 2 ml.
- Coloque el tubo en el concentrador magnético (Figura 3E), aspire el sobrenadante y luego lave las perlas 2x con 1 ml de 1x HBSS; en esta etapa, coloque 20 μL de la suspensión celular en un portaobjetos para verificar la presencia de glomérulos bajo el microscopio (Figura 3F; un glomérulo [flecha negra] y algunas cuentas [flechas amarillas] en la suspensión).
- Aspire cuidadosamente el sobrenadante, resuspenda el pellet en medio de crecimiento celular endotelial (Tabla de materiales) y transfiéralo a un tubo limpio de 2 ml. Agregue 2 μL de IFNγ (100 U/mL) al tubo y coloque las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las células a 33 °C.
- Después de 3 días de cultivo, cambie cuidadosamente el medio pipeteando 1 ml del medio y reemplazándolo con 1 ml de medio fresco. En esta etapa, las células son heterogéneas con una mezcla de células glomerulares (Figura 4G).
NOTA: En el cultivo de crecimiento, habrá una mezcla de células glomerulares y algunas perlas magnéticas (Figura 4G). Tenga en cuenta que todas las células deben mostrar mitocondrias verdes y fluorescentes. - Después de 7 días de cultivo, aspirar completamente el medio y reemplazarlo con 2 ml frescos de medio de crecimiento de células endoteliales suplementado con IFNγ (100 U/ml). En esta etapa, las células comienzan a proliferar, pero siguen siendo heterogéneas (Figura 4A).
- Después de 10 días de cultivo, cuando las células alcancen ~80% de confluencia, pasar las células usando tripsina como se describe en el paso 5.1 y luego transferirlas a un matraz T25 recubierto con colágeno IV.
- Después de 1 semana (total ~21 días de cultivo), pasar las células a un matraz T75 recubierto con colágeno IV.
4. Preparación de perlas para el aislamiento de células endoteliales
- Comience por cubrir las perlas anti-rata de oveja con un anticuerpo CD31 anti-ratónrata 3,18,19. Utilizar 10 μL de perlas para cada matraz T75.
- Lave 10 μL de perlas 3x con 200 μL de 1x PBS suplementado con BSA al 0,1%, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Coloque el tubo en el imán del concentrador para pipetear el amortiguador de lavado cada vez.
- Resuspender las perlas en 200 μL de PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilina/estreptomicina. Añadir 4,8 μL de anticuerpo CD31 anti-ratón de rata 7,18,19, colocar el tubo en un agitador horizontal y mezclar suavemente durante 1 h a temperatura ambiente, y luego mantener el tubo a 4 °C durante la noche.
5. Aislar las células endoteliales glomerulares con perlas recubiertas de CD31
- Añadir 3 ml de tripsina al 0,25% a un matraz T75 e incubar las células a 37 °C durante 5 min. Neutralizar la tripsina con 3 ml de medio de crecimiento endotelial, transferir las células a un tubo de 15 ml y luego centrifugar a 200 x g durante 5 min.
- Aspirar el sobrenadante y lavar las células en 1 ml de PBS que contenga 1% de BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
- Resuspender el pellet en 200 μL de perlas recubiertas preparadas en el paso 4, y añadir 800 μL de PBS que contengan 1% de BSA, 2 mM EDTA, 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar las células durante 45 min con agitación continua a 37 °C, 5%CO2.
- Coloque el tubo en el concentrador magnético y lave las celdas 4x con 1x PBS que contenga 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicilina/estreptomicina. Resuspender las células en 3 mL de medio de crecimiento endotelial suplementado con 100 U/mL de IFNγ.
- Placa de 1,5 ml de células/pocillo en pocillos recubiertos de colágeno IV en una placa de 6 pocillos. Cultivar las células en condiciones permisivas a 33 °C.
NOTA: Las células aisladas expresan el virus simio 40 (SV40) del antígeno T grande tsA58, lo que permite la activación de la proliferación continua a 33 °C (condición permisiva). - Después de 4 días en cultivo, retirar 750 μL del medio y sustituirlo por el mismo volumen de medio fresco suplementado con 100 U/ml de IFNγ.
- Después de 10 días a 14 días de cultivo, verifique si hay colonias de GEC CD31 positivas en crecimiento (Figura 4C) que expresan mitocondrias fluorescentes usando un microscopio de epifluorescencia con un filtro de 488 nm.
- Después de 21 días de cultivo, las células pueden haber alcanzado el 80%-90% de confluencia; transferirlos a un matraz T25. Después de alcanzar la confluencia, las células se pueden mantener con medio de crecimiento RPMI y 10% de FCS.
NOTA: Antes de llegar a la confluencia, las células pueden parecer heterogéneas (Figura 4B). Sin embargo, una vez que son confluentes, adquieren una morfología de adoquines. - En esta etapa, las células podrían ser criopreservadas. Al alcanzar el 80% de confluencia, añadir 3 mL de tripsina al 0,25% a las células e incubarlas a 37 °C durante 5 min. Neutralizar la tripsina con un volumen igual de medio de crecimiento suplementado con 10% de FBS.
- Centrifugar a 200 x g durante 5 min. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en 3 mL de medio de congelación (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Alícuota las células en criotubos y almacénelas en temperatura de vapor de nitrógeno líquido.
6. Cultivo de los mitoDendra2-GECs
- Descongelar las células de la crioalitocuota, a partir de la etapa 5.10, en un baño maría a 37 °C y transferirlas a un tubo de 15 ml con 10 ml de medio de crecimiento endotelial precalentado.
- Centrifugar la suspensión a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Retirar el medio y transferir el pellet al matraz de cultivo celular T25 cm2 recubierto de colágeno IV con medio de crecimiento celular endotelial precalentado suplementado con 100 U/ml de IFNγ e incubar a 33 °C.
- Cambia el medio al día siguiente. Cuando las células alcancen una confluencia del 70%-80%, generalmente después de 5 días, transferirlas a un matraz de cultivo celular T75 cm2 .
- Para diferenciar las células al fenotipo endotelial, transfiera las células a condiciones no permisivas a 37 °C en medios de crecimiento sin IFNγ.
7. Transmisión de mitoDendra2-GECs
- Retirar el medio, lavar las células con PBS y añadir 3 ml de solución tibia de tripsina-EDTA al 0,25% (matraz T75 cm2 ), incubar a 37 °C durante 5 min.
- Cuando las células estén separadas, añadir 5 ml de medio de crecimiento y pipetear hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar la suspensión a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y transferir las células a un nuevo matraz o placa recubierta de colágeno IV.
NOTA: El paso debe hacerse una vez a la semana en una proporción de 1:4.
8. Caracterización de mitoDendra2-GECs
- Realizar tinción de inmunofluorescencia para CD31 en células diferenciadas 7,18,19,20 (Figura 4D). Utilice otros marcadores como vWF e isolectina-B4 también20.
- Para confirmar la especificidad mitocondrial de Dendra2, marcar las células con marcadores mitocondriales específicos incubando las células en un medio de crecimiento que contenga 100 nM de seguidor mitocondrial durante 30 min a 37 °C, 5% deCO2.
- Retire el medio y lave las células suavemente con medio precalentado sin rojo fenol para realizar imágenes en vivo.
NOTA: Alternativamente, las células pueden fijarse con fijadores de formaldehído (4%) durante 30 minutos, seguido de lavado varias veces en PBS. Las celdas fijas se pueden almacenar a 4 °C en 1x PBS hasta su uso. También es posible una confirmación con citometría de flujo: marcar las células con anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. Los GEC deben ser negativos para marcadores de podocitos (sinaptopodina, Nphs1, Podxl), marcadores de células mesangiales (PDGFRβ, angiotensinógeno) y marcadores celulares tubulares (acuaporina, aminopeptidasa-N). Estos marcadores sirven como controles negativos. Debido a la expresión de Dendra2 mitocondrial específica de estas células, evite usar el canal FIFC.
9. Imágenes de células vivas de cambios estructurales de las mitocondrias en respuesta al estrés oxidativo o glucosa alta
- Placa 1 x 105 GEC en un plato de fondo de vidrio de 35 mm recubierto con colágeno IV utilizando medio de crecimiento celular endotelial (Tabla de materiales). Después de 24 h, cambiar a medio sin rojo fenol. Las células tienen mitocondrias verdes y fluorescentes.
- Ajuste la cámara ambiental a 37 °C, 5% de humedad y 5% deCO2 1 h antes del inicio del experimento.
- Bajo un microscopio confocal, use un objetivo de 40x/1.2 W para ajustar el enfoque y seleccionar la región de interés. Incubar las células con 2 ml de 5 mM o 25 mM de glucosa durante 60 min.
- Exponer las células a un láser de 405 nm (4% de potencia láser) para fotoconvertir una subpoblación de mitocondrias de verde a rojo (Figura 5A-B, D-E).
- Utilice el láser de 561 nm para excitar Dendra2 en el estado no convertido para visualizar la fluorescencia roja. Consulte el protocolo detallado de conmutación de fotos como se describió anteriormente16. Los eventos de fusión aparecen como fluorescencia amarilla después de varios minutos debido a la fusión de matriz verde y matriz roja (Figura 4C, F).
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Representative Results
En este artículo, se describe un protocolo detallado para el aislamiento de células endoteliales glomerulares inmortalizadas condicionalmente con mitocondrias fluorescentes estables (mitoDendra2-GEC) (Figura 1). El uso de ratones jóvenes de 6-10 semanas de edad es esencial para obtener un número sustancial de células sanas. Después de 3 días de cultivo, las células comienzan a crecer lentamente a partir de los glomérulos aislados, como se muestra en la Figura 3G. Después de 7 días, las células son heterogéneas, mostrando otros tipos de células glomerulares, como podocitos, células epiteliales parietales y células mesangiales (Figura 4A). Después de alcanzar una confluencia del 70% al 80%, se eliminaron otras células glomerulares utilizando una selección positiva de células endoteliales con perlas magnéticas marcadas con CD31 (Figura 4B-C). Los mitoDendra2-GEC expresaron CD31 (Figura 4D) y fueron negativos para el marcador de podocitos como se muestra por la tinción negativa de sinaptopodina (Figura 4E-F).
La característica mitocondrial fluorescente en los mitoDendra2-GEC permite estudiar la morfología de las mitocondrias en diversas condiciones in vitro. Aquí, probamos el efecto de la glucosa alta (25mM) en la estructura mitocondrial de los mitoDendra2-GEC (Figura 5D-F). En comparación con las mitocondrias alargadas visibles en las células bajo glucosa normal (5mM; Figura 5A-C), alta fragmentación o fisión inducida por glucosa de las mitocondrias observada por mitocondrias prominentes en forma de esferoide (Figura 5E). Además, utilizamos un láser de 405 nm para fotoconvertir una subpoblación seleccionada de mitocondrias en una sola mitoDendra2-GEC viva (Figura 5A, D). En la Figura 5B y la Figura 5E, se presenta el fotocambio exitoso de las mitocondrias de verde (488 nm) a rojo (561 nm) en el área seleccionada. Es importante destacar que permitió presenciar los eventos de fusión en mitoDendra2-GEC cultivados bajo glucosa normal, como se puede observar por la fluorescencia verde y roja amarilla fusionada como resultado de la fusión de la matriz mitocondrial (Figura 5C). En contraste, en el mitoDendra2-GEC tratado con glucosa alta, las mitocondrias estaban fragmentadas y eran principalmente rojas (Figura 5F), lo que sugiere que, en el período de tiempo probado, los eventos de fisión/fusión se retrasaron o inhibieron debido al daño causado por el tratamiento con glucosa alta, y esto es consistente con los relatos previos18,19.
Figura 1: Descripción representativa del aislamiento murino de GEC. El diagrama representa los pasos significativos del aislamiento de GEC, comenzando por la perfusión del corazón de ratones con perlas magnéticas para aislar los glomérulos renales, la digestión de la colagenasa, el cultivo de células glomerulares y, finalmente, la purificación de GEC utilizando perlas recubiertas de CD31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción de la disección renal. Imagen representativa de todos los instrumentos quirúrgicos estériles necesarios para la disección. Se necesitan tijeras (a) para abrir la piel del ratón, y se necesita un par separado de tijeras (b, c) para aislar el riñón. Se necesitan pinzas (d) y (e) para sujetar la piel. Se necesita una pinza (f) para recoger el riñón disecado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Descripción de la recolección de glomérulos . (A) Perfundir el ventrículo izquierdo con la solución de perlas HBSS usando una jeringa de 20 ml. Perforar la vena cava inferior con una aguja de 19 G. (B) Después de la perfusión, retire la grasa del riñón y córtela en trozos de 1 mm. (C) Digerir el tejido con colagenasa tipo II. (D) Después de la digestión y centrifugación, se forman tres capas; Las cuentas que llevan los glomérulos están en la capa media, como lo indica la flecha negra. (E) Separar las perlas aisladas que llevan los glomérulos utilizando el concentrador magnético. (F) Imagen representativa de glomérulos recién aislados. (G) Crecimiento de células a partir de glomérulos aislados después de 3 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Ensayo mitocondrial in vitro. (A) Células glomerulares después de 3 días de cultivo. (B) GEC después de 7 días. (D) Purificación de GEC con perlas marcadas con CD31. Imágenes microscópicas de tinción CD31. (E) Los GEC son negativos para la sinaptopodina. (F) Podocitos teñidos con sinaptopodina (488 nm, fluorescencia verde) como control negativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen microscópica de fusión mitocondrial fluorescente in vitro. Las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal utilizando un objetivo de agua de 40x. (A-B) El área seleccionada (círculo rojo) se iluminó con una línea de 405 nm (4% de potencia láser) para 300 iteraciones de blanqueo a una velocidad de 6.3-12.61 / píxel, como se describió anteriormente16. (A-C) Células en medios de crecimiento que contienen 5 mM de glucosa; La fluorescencia verde (488 nm) muestra mitocondrias sanas. (B,E) Las mitocondrias fueron foto-cambiadas a rojo (567 nm). (C) La fluorescencia amarilla detecta un evento de fusión activa de GEC tratado con glucosa 5mM. (D) Las células fueron tratadas con glucosa alta 25 mM durante 30 min. La fluorescencia verde muestra mitocondrias fragmentadas y (E) una porción que fue foto-cambiada a rojo. (F) La figura muestra un evento de fusión disminuido como lo muestra la fluorescencia amarilla reducida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las mitocondrias son críticas para el metabolismo celular, la homeostasis y las respuestas al estrés, y su disfunción está relacionada con muchas enfermedades, incluida la enfermedad renal. Las mitocondrias tienen un papel en la generación patológica de especies reactivas excesivas de oxígeno (ROS), la regulación de los niveles de calcio intracelular, las vías de muerte celular y la dinámica citoesquelética21,22,23.
El aislamiento de los GEC murinos es un desafío debido a su pequeño número, tamaño, factores de matriz y naturaleza interdependiente con otras células glomerulares que son esenciales para su supervivencia. El presente artículo presenta un protocolo detallado para el aislamiento GEC del ratón. En concreto, utilizamos ratones transgénicos como herramienta para obtener líneas celulares inmortalizadas condicionalmente con alto potencial de proliferación. Los ratones transgénicos, que expresan el antígeno T grande tsA58 del virus simio 40 (SV40), permiten la activación de la proliferación continua en condiciones permisivas a 33 °C y se cruzaron aquí con los ratones extirpados PHAM que expresan fluorescencia mitocondrial específica. Los ratones transgénicos dobles ofrecieron una excelente herramienta para estudiar la estructura de las mitocondrias. De hecho, los ratones extirpados con PHAM tienen Dendra2 verde mitocondrial específica (subunidad VIII de la citocromo c oxidasa), lo que permite la detección en vivo de mitocondrias fluorescentes y la observación de eventos de fisión y fusión a través de fotoconmutación verde-roja16.
El protocolo consta de tres pasos significativos: la extracción de glomérulos mediante perlas, la proliferación de células glomerulares y la posterior purificación de GEC mediante perlas CD31 una vez que las células están en cultivo. El uso de una sola digestión con colagenasa es suficiente para aislar las células glomerulares. Otros protocolos hacen uso de una segunda digestión con DNAsa y proteinasa24. Sin embargo, hemos notado mejores rendimientos celulares con un solo paso de digestión. La DNAsa puede permanecer activa y ralentizar la proliferación de las células. Además, el GEC podría aislarse mediante tamizado diferencial como se describió anteriormente20, lo que no siempre es fácil cuando se utilizan riñones de ratones.
Es crucial autoclave todas las herramientas quirúrgicas antes de iniciar el aislamiento de los riñones y los glomérulos para evitar la contaminación. Además, es importante filtrar y complementar las soluciones con antibióticos para eliminar cualquier fuente de contaminantes. De hecho, las infecciones por micoplasma pueden causar citopatología que, consecuentemente, interfiere con cada parámetro medido en cultivo celular25.
El aislamiento de los glomérulos se basa en la perfusión intracardíaca de las perlas. Ciertamente, la perfusión lenta con 20 ml de 1x perlas que contienen HBSS es esencial para cosechar un gran número de glomérulos. Las perlas quedarán atrapadas en los glomérulos, lo que facilita su purificación mediante un concentrador magnético. Las perlas pueden prepararse y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 15 días antes de utilizarlas para facilitar el procedimiento experimental.
Además, digerir los glomérulos con agitación continua es crucial para disociar un buen número de glomérulos del riñón. Por otro lado, el aislamiento de los GEC murinos es un desafío debido a su pequeño tamaño y la presencia de otras células glomerulares. Por lo tanto, el aislamiento gradual de los glomérulos, el crecimiento de todas las células glomerulares en cultivo y el posterior uso de perlas recubiertas de CD31 para purificar las células endoteliales son vitales, específicamente para obtener un número más significativo de GEC viables y condicionalmente proliferativos. Sin embargo, es necesario validar la pureza de las células con inmunotinción y citometría de flujo.
Además, el protocolo describe la caracterización del fenotipo GEC y el ensayo de fusión/fisión de mitocondrias in vitro. Los mitoDendra2-GECs son una excelente herramienta para estudiar las respuestas celulares de las mitocondrias GEC a diferentes estímulos in vitro sin necesidad de transfección o tinción.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros en competencia que declarar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Cijiang He y al Dr. Fu Jia por sus ideas sobre el aislamiento de células endoteliales de ratones y agradecen al profesor Mone Zaidi por proporcionar los ratonesextirpados PhAM y valiosas discusiones. Los autores también desean agradecer el CORE de Microscopía en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai y al personal por la orientación que recibimos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud subvención R01DK097253 y la subvención CDMRP del Departamento de Defensa E01 W81XWH2010836 a I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
