Summary
Artikeln beskriver metoden för att isolera villkorligt förevigade glomerulära endotelceller från njurarna hos transgena möss som uttrycker det termolabila simianviruset 40 och fotoaktiverbara mitokondrier, PhAMutskurna. Vi beskriver proceduren för glomeruliisolering från hela njurar med hjälp av pärlor, matsmältningssteg, sådd och odling av GEC-CD31-positiva.
Abstract
Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunktion kan initiera och bidra till glomerulär filtreringsbarriärnedbrytning. Ökad mitokondriell oxidativ stress har föreslagits som en mekanism som resulterar i GEC-dysfunktion i patogenesen av vissa glomerulära sjukdomar. Historiskt sett har isoleringen av GEC från in vivo-modeller varit notoriskt utmanande på grund av svårigheter att isolera rena kulturer från glomeruli. GEC har komplexa tillväxtkrav in vitro och en mycket begränsad livslängd. Här beskriver vi proceduren för att isolera och odla villkorligt förevigade GEC med fluorescerande mitokondrier, vilket möjliggör spårning av mitokondriell fission och fusionshändelser. GEC isolerades från njurarna hos en dubbel transgen mus som uttrycker den termolabila SV40 TAg (från Immortomouse), vilket villkorligt främjar proliferation och undertrycker celldifferentiering och ett fotokonvertibelt fluorescerande protein (Dendra2) i alla mitokondrier (från den fotoaktiverbara mitokondrierna [PhAMutskuren] musen). Den stabila cellinjen som genereras möjliggör celldifferentiering efter inaktivering av den odödliga SV40 TAg-genen och fotoaktivering av en delmängd av mitokondrier som orsakar en övergång i fluorescens från grönt till rött. Användningen av mitoDendra2-GEC möjliggör levande avbildning av fluorescerande mitokondriers distribution, fusion och fissionshändelser utan att färga cellerna.
Introduction
Glomerulus är avgörande för blodfiltrering genom att begränsa passagen av stora molekyler genom den glomerulära filtreringsbarriären 1,2. Glomerulus innehåller fyra celltyper: parietala epitelceller, podocyter (viscerala epitelceller), glomerulära endotelceller (GEC) och mesangiala celler3. Det glomerulära endotelet kännetecknas av en unik vaskulär struktur, enligt närvaron av fenestrae som krävs för stora filtreringsvolymer4. Den apikala ytan av det glomerulära endotelet är täckt med ett negativt laddat glykokalyxskikt och en beläggning som kallas endotelytskiktet som skapar ett utrymme mellan endotelet och blodet. Denna struktur ger hög laddningsselektivitet som begränsar passagen av negativt laddade molekyler såsom albumin och förhindrar leukocyt- och trombocytadhesion5.
GEC är mycket känsliga för metaboliska förändringar, såsom hyperglykemi i samband med diabetesmiljön. Faktum är att diabetes leder till ökad cirkulation av skadliga ämnen, mättnad av glukosmetabolismvägar och störd cellulär redoxbalans 3,6. Dessutom inducerar ökningen av reaktiva syrearter mitokondriell dysfunktion, vilket påverkar endotelfunktionen7.
Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att isolera odödliga glomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondriella egenskaper. Faktum är att cellkulturen hos primära GEC har en begränsad proliferativ cykel och tidig åldrande8. Dessutom hjälper närvaron av fluorescerande mitokondrier att undersöka fissions- och fusionshändelser som svar på hyperglykemi eller någon annan behandling. Som en alternativ metod använde andra laboratorier h-TERT för att föreviga celler in vitro9.
Metoden som beskrivs här möjliggör isolering av villkorligt odödliggjorda mitoDendra2 glomerulära endotelceller från 4-6 veckor gamla djur (Figur 1). Detta detaljerade protokoll beskriver användningen av transgena möss (H-2K b-tsA58) som hyser simianvirus 40 stort tumörantigen (SV40 TAg) gen10,11 för att generera termolabila villkorligt odödliga celler. TSA58 TAg-genprodukten är funktionell vid den tillåtna temperaturen 33 °C under kontroll av den inducerbara 5'-flankerande promotorn för musens H-2Kb-gen, som ökas över basalnivåerna vid exponering för interferon gamma (IFNγ), vilket upprätthåller den villkorliga proliferationsfenotypen12. H-2Kb bryts snabbt ned vid den icke-tillåtna temperaturen 37 °C i frånvaro av IFNγ, vilket avlägsnar den förevigande funktionen hos tsA58Tag i celler och låter cellerna utveckla en mer differentierad fenotyp13,14,15. Valfri korsning av H-2Kb-tsA58 transgena möss med PhAM-möss, som uttrycker en mitokondrierspecifik (subenhet VIII av cytokrom c-oxidas) Dendra2-grön, möjliggör levande detektion av fluorescerande mitokondrier16. Dendra2 grön fluorescens växlar till röd fluorescens efter exponering för en 405 nm laser16. När mitokondrier smälter samman efter fotobyte bildar de långsträckta former som verkar gula från utbytet av grönt och gult material eller verkar röda när de genomgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC är ett utmärkt verktyg för att studera de cellulära svaren från GEC mitokondrier på olika stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs här godkändes av IACUC vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai. Vi använde tre hanmöss (H-2Kb-tsA58 transgena möss med fotoaktiverbara mitokondrier [PhAM]) köpta från Jackson lab och höll på en normal chow-diet.
1. Arbetsförhållanden och förberedelser
- Rengör arbetsutrymmet inuti den laminära flödeshuven med 70% etanol och UV-C-ljus.
- Förbered pärlans tvättbuffertar. Gör buffert-1 med 0,1 M natriumfosfat vid pH 7,4-8,0, buffert-2 med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium kompletterat med 0,1% bovint serumantigen (BSA), 3 mM EDTA, pH 7,4 och buffert-3 med 0,2 M Tris med 0,1% BSA, pH 8,5.
2. Magnetisk partikelkoncentrator
- Framställning av magnetiska pärlor
- Blanda försiktigt 200 μl magnetiska pärlor (4 x 108 pärlor) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med 200 μl buffert-1.
OBS: Förbered 200 μL magnetiska pärlor per mus 1 dag före vävnadsskörd. Pärlorna kommer att användas för att skörda glomeruli. - Placera röret i en magnetisk partikelkoncentrator i 1 min och aspirera sedan försiktigt supernatanten. Ta bort röret från magneten och återsuspendera de tvättade pärlorna i 200 μl buffert-1.
- Placera röret som innehåller magnetpärlorna i magnetpartikelkoncentratorn i 1 min och sug försiktigt supernatanten.
- Inaktivera de fria tosylgrupperna genom att tvätta magnetpärlorna 2x, 5 min vardera, med 200 μL buffert-2 genom att placera röret i magnetpartikelkoncentratorn och kassera bufferten.
- Inkubera magnetpärlorna i 200 μl buffert-3 i 24 timmar vid 4 °C eller i 4 timmar vid 37 °C för att inaktivera de återstående fria tosylgrupperna. Placera röret i magnetkoncentratorn i 1 min, aspirera försiktigt supernatanten och kassera den.
- Tvätta magnetpärlorna 1x med 200 μl buffert-2 i 5 min vid 4 °C. Placera tillbaka röret i magnetkoncentratorn i 1 min och aspirera försiktigt supernatanten. Ta bort röret från magnetkoncentratorn och återsuspendera magnetpärlorna i 200 μl buffert-2 för att få 4 x 108 pärlor / ml.
OBS: I detta skede är det möjligt att lämna pärlorna vid 4 ° C i upp till 15 dagar.
- Blanda försiktigt 200 μl magnetiska pärlor (4 x 108 pärlor) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör med 200 μl buffert-1.
3. Isolering av glomerulära celler i musnjurarna
- Förbered perfusionsmaterialet: 30 ml spruta, 25 G fjärilsnål. Förbered isoleringsmaterialet: steril 10 cm skål, skalpell, magnetisk partikelkoncentrator, 40 μm cellsil, 100 μm cellsil.
- Förbered 100 ml 1x Hanks balanserade saltlösning (HBSS) kompletterad med 1% antibiotika och justera pH till 7,35. Filtrera lösningen med ett 0,2 μm filter och håll den under huven för att undvika kontaminering.
- Blanda 200 μL magnetiska pärlor från steg 2.1.6 med 20 ml 1x HBSS.
OBS: För varje mus behövs 200 μL pärlor utspädda i 20 ml HBSS 1x. - Bered en alikvot på 1 ml kollagenas typ II (125 CDU/mg) vid 1 mg/ml i 1x HBSS-lösning, pH 7,35. Förvärm RPMI med 10% FCS-medium i ett vattenbad vid 37 °C. Förvärm endotelcellodlingsmediet vid 37 °C (se materialförteckningen för närmare uppgifter).
RPMI kommer att användas för att neutralisera kollagenaset. - Förbelägg två brunnar av en 6-brunnsplatta med 2 ml 10 μg/ml kollagen IV (1 ml/brunn) i 45 min vid rumstemperatur. Tvätta plattan 3x med 1x PBS för att ta bort ättiksyran som används för att späda kollagenet. Använd de belagda plattorna omedelbart eller förvara dem vid 2–8 °C i upp till 4 veckor.
OBS: Tätning av plattan /plattorna med en transparent film är att föredra för att förhindra uttorkning. Kollagenbeläggningen underlättar fastsättningen av celler på plattan. - Rengör och sterilisera alla kirurgiska instrument i figur 2 genom att använda 70% etanol och därefter autoklavera dem i 30 minuter. Rengör operationsarbetsplatsen med 70% etanol.
- Bedöva mössen med en intraperitoneal injektion av ketamin/xylazin (10 mg/ml ketamin och 1 mg/ml xylazin). För att bekräfta att djuret är helt bedövat, kontrollera om tåns klämreflex är uppe.
- Fäst musens tassar med 19 G nålar för att hålla den på plats på en dissektionsplattform. Rengör bröstet och buken med 70% etanol och öppna buken längs bröstet med sax a (Figur 2).
- För in en fjärilsnål i vänster kammare (figur 3A) och injicera cirka 100 μl av pärllösningen (från steg 1.2) för att expandera blodcirkulationen.
- Bryt försiktigt den underlägsna vena cava under njurarna med en 19 G nål (figur 3A). Fortsätt perfusionen som initierades i steg 3.9.
OBS: Alternativt kan en minipump användas med hastighet: 18.0+, tid: 5 min. God perfusion är viktigt för att skörda ett stort antal glomeruli med magnetiska pärlor. Detta är ett icke-överlevnads- / terminalförfarande. - Ta försiktigt bort fettvävnaden med pincett och skär ut båda njurarna med tunn kirurgisk sax c (figur 2) och lägg dem i en tallrik med 1 ml 1x HBSS på is. Hacka njuren med sax b (figur 2) och sedan med en steril skalpell till 1 mm små bitar som visas i figur 3B.
- Inkubera sedan den malet njuren med 1 ml kollagenas typ II från steg 3.4 i 35 minuter vid 37 °C med försiktig lutning med en horisontell shaker. Vävnaden ska smälta fullständigt efter detta steg, som visas i figur 3C.
- Tillsätt 4 ml RPMI med 10% FBS (från steg 3.4) för att neutralisera kollagenaset. Filtrera den smälta vävnaden genom en steril 100 μm cellsil i ett 50 ml rör. Använd botten av ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugrör för att röra den smälta vävnaden mot silen så att glomeruli kan gå igenom.
- Skölj cellsilen med 15 ml 1x HBSS och centrifugera sedan genomströmningen vid 200 x g i 5 min vid rumstemperatur. Vid denna tidpunkt innehåller pelleten tre lager; pärlorna med glomeruli är synliga i rörets mittskikt, det övre lagret består av mindre strukturer som tubuler och bottenskiktet är skräp (figur 3D).
- Aspirera försiktigt supernatanten och det övre vita lagret. Den återstående pelleten innehåller pärlorna som bär glomeruli och skräp (figur 3D). Återsuspendera pelleten med 1,5 ml 1x HBSS och överför till ett 2 ml rör.
- Placera röret i magnetkoncentratorn (figur 3E), aspirera supernatanten och tvätta sedan pärlorna 2x med 1 ml 1x HBSS; Sätt i detta skede 20 μl av cellsuspensionen på ett objektglas för att verifiera närvaron av glomeruli under mikroskopet (figur 3F; en glomerulus [svart pil] och några pärlor [gula pilar] i suspensionen).
- Aspirera försiktigt supernatanten, återsuspendera pelleten i endotelcelltillväxtmedium (materialtabell) och överför den till ett rent 2 ml rör. Tillsätt 2 μL IFNγ (100 U/ml) till röret och plåta cellerna på en brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera cellerna vid 33 °C.
- Efter 3 dagars kultur, byt försiktigt mediet genom att pipettera ut 1 ml av mediet och ersätta det med 1 ml färskt medium. I detta skede är cellerna heterogena med en blandning av glomerulära celler (Figur 4G).
OBS: I den växande kulturen kommer det att finnas en blandning av glomerulära celler och några magnetiska pärlor (figur 4G). Observera att alla celler ska visa gröna, fluorescerande mitokondrier. - Efter 7 dagars odling, aspirera mediet helt och ersätt det med ett nytt 2 ml endotelcellstillväxtmedium kompletterat med IFNγ (100 U / ml). I detta skede börjar cellerna sprida sig men är fortfarande heterogena (figur 4A).
- Efter 10 dagars odling när cellerna når ~ 80% sammanflöde, passera cellerna med trypsin enligt beskrivningen i steg 5.1 och överför dem sedan till en T25-kolv belagd med kollagen IV.
- Efter 1 vecka (totalt ~ 21 dagars odling), passera cellerna till en T75-kolv belagd med kollagen IV.
4. Beredning av pärlor för endotelcellisolering
- Börja med att belägga fårens antiråttpärlor med en råttantimus-CD31-antikropp 3,18,19. Använd 10 μl pärlor för varje T75-kolv.
- Tvätta 10 μL pärlor 3x med 200 μL 1x PBS kompletterat med 0,1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Placera röret i koncentratormagneten för att pipettera tvättbufferten varje gång.
- Återsuspendera pärlorna i 200 μl PBS, 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Tillsätt 4,8 μlråttantikropp CD31 7,18,19, placera röret på en horisontell skakapparat och blanda försiktigt i 1 timme vid rumstemperatur och håll sedan röret vid 4 °C över natten.
5. Isolera de glomerulära endotelcellerna med CD31-belagda pärlor
- Tillsätt 3 ml 0,25 % trypsin till en T75-kolv och inkubera cellerna vid 37 °C i 5 minuter. Neutralisera trypsin med 3 ml endoteltillväxtmedium, överför cellerna till ett 15 ml rör och centrifugera sedan vid 200 x g i 5 min.
- Aspirera supernatanten och tvätta cellerna i 1 ml PBS innehållande 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin/streptomycin. Centrifugera vid 200 x g i 5 min.
- Återsuspendera pelleten i 200 μl belagda pärlor som beretts i steg 4 och tillsätt 800 μl PBS innehållande 1 % BSA, 2 mM EDTA, 1 % penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna i 45 min med kontinuerlig skakning vid 37 °C, 5%CO2.
- Placera röret i magnetkoncentratorn och tvätta cellerna 4x med 1x PBS innehållande 1% BSA, 2 mM EDTA, 1% penicillin / streptomycin. Återsuspendera cellerna i 3 ml endoteltillväxtmedium kompletterat med 100 U / ml IFNγ.
- Platta 1,5 ml celler/brunn i kollagen IV-belagda brunnar på en 6-brunnsplatta. Odla cellerna under tillåtna förhållanden vid 33 °C.
OBS: De isolerade cellerna uttrycker simianvirus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, vilket möjliggör aktivering av kontinuerlig proliferation vid 33 °C (tillåtet tillstånd). - Efter 4 dagar i odling, ta bort 750 μL av mediet och ersätt det med samma volym färskt medium kompletterat med 100 U / ml IFNγ.
- Efter 10 dagar till 14 dagars odling, kontrollera om det finns växande CD31-positiva GEC-kolonier (figur 4C) som uttrycker fluorescerande mitokondrier med hjälp av ett epifluorescensmikroskop med ett 488 nm-filter.
- Efter 21 dagars odling kan cellerna ha nått 80%-90% sammanflöde; Överför dem till en T25-kolv. Efter att ha nått sammanflöde kan celler bibehållas med RPMI-tillväxtmedium och 10% FCS.
OBS: Innan de når sammanflödet kan cellerna se heterogena ut (figur 4B). Men när de väl är sammanflytande förvärvar de en kullerstensmorfologi. - I detta skede kan cellerna kryopreserveras. När du når 80% sammanflöde, tillsätt 3 ml 0,25% trypsin till cellerna och inkubera dem vid 37 ° C i 5 minuter. Neutralisera trypsin med en lika stor volym tillväxtmedium kompletterat med 10% FBS.
- Centrifugera vid 200 x g i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 3 ml frysmedium (RPMI, 20% FBS, 10% DMSO). Alikvotera cellerna i kryorör och förvara dem i flytande kväveångtemperatur.
6. Odla mitoDendra2-GECs
- Tina cellerna från kryoalikvoten, från steg 5.10, i ett vattenbad vid 37 °C och överför dem till ett 15 ml rör med 10 ml förvärmt endoteltillväxtmedium.
- Centrifugera suspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Avlägsna mediet och överför pelleten till kollagen IV-belagd T25 cm 2-cellodlingskolv med förvärmt endotelcellstillväxtmedium kompletterat med 100 U/ml IFNγ och inkubera vid 33 °C.
- Byt medium nästa dag. När cellerna når 70% -80% sammanflöde, vanligtvis efter 5 dagar, överför dem till en T75 cm 2-cellodlingskolv.
- För att differentiera cellerna till endotelfenotyp, överför cellerna till icke-tillåtna förhållanden vid 37 ° C i tillväxtmedier utan IFNγ.
7. Passering av mitoDendra2-GEC
- Ta bort mediet, tvätta cellerna med PBS och tillsätt 3 ml varm 0,25% trypsin-EDTA-lösning (T75 cm2 kolv), inkubera vid 37 °C i 5 min.
- När cellerna lossnar, tillsätt 5 ml tillväxtmedium och pipettera upp och ner. Centrifugera suspensionen vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och överför cellerna till en ny kollagen IV-belagd kolv eller platta.
OBS: Passaging bör göras en gång i veckan i förhållandet 1:4.
8. Karakterisering av mitoDendra2-GEC
- Utför immunofluorescensfärgning för CD31 på differentierade celler 7,18,19,20 (figur 4D). Använd andra markörer som vWF och Isolectin-B4 också20.
- För att bekräfta mitokondriell specificitet av Dendra2, märk celler med mitokondriella markörer genom att inkubera cellerna i tillväxtmedium innehållande 100 nM mitokondriell tracker i 30 min vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ta bort mediet och tvätta cellerna försiktigt med förvärmt medium utan fenolrött för att utföra levande avbildning.
OBS: Alternativt kan celler fixeras med formaldehydfixeringsmedel (4%) i 30 minuter följt av tvättning flera gånger i PBS. Fasta celler kan förvaras vid 4 °C i 1x PBS tills de används. En bekräftelse med flödescytometri är också möjlig: märk celler med anti-CD31, anti-PECAM, anti-CD45. GEC bör fläcka negativt för podocytmarkörer (synaptopodin, Nphs1, Podxl), mesangiala cellmarkörer (PDGFRβ, angiotensinogen) och tubulära cellmarkörer (Aquaporin, Aminopeptidase-N). Dessa markörer fungerar som negativa kontroller. På grund av det mitokondriella specifika Dendra2-uttrycket av dessa celler, undvik att använda FITC-kanalen.
9. Levande cellavbildning av mitokondrier strukturella förändringar som svar på oxidativ stress eller hög glukos
- Platta 1 x 105 GEC på en 35 mm glasbottenskål belagd med kollagen IV med endotelcelltillväxtmedium (materialtabell). Efter 24 h, byt till medium utan fenolrött. Celler har gröna, fluorescerande mitokondrier.
- Ställ in miljökammaren på 37 °C, 5 % luftfuktighet och 5 %CO2 1 timme innan experimentet inleds.
- Under ett konfokalmikroskop använder du ett mål på 40x/1,2 W för att justera fokus och välja intresseområde. Inkubera cellerna med 2 ml 5 mM eller 25 mM glukos i 60 min.
- Utsätt cellerna för en 405 nm laser (4% lasereffekt) för att fotokonvertera en delpopulation av mitokondrier från grönt till rött (figur 5A-B, D-E).
- Använd 561 nm-lasern för att excitera Dendra2 i okonverterat tillstånd för att visualisera den röda fluorescensen. Se det detaljerade fotoväxlingsprotokollet som tidigare beskrivits16. Fusionshändelserna visas som gul fluorescens efter flera minuter på grund av grön matris och röd matrisfusion (figur 4C, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna artikel beskrivs ett detaljerat protokoll för isolering av villkorligt odödliga glomerulära endotelceller med stabila fluorescerande mitokondrier (mitoDendra2-GEC) (Figur 1). Användningen av unga 6-10 veckor gamla möss är avgörande för att få ett stort antal friska celler. Efter 3 dagars odling börjar cellerna växa långsamt från de isolerade glomeruli, som visas i figur 3G. Efter 7 dagar är cellerna heterogena och visar andra glomerulära celltyper, såsom podocyter, parietala epitelceller och mesangiella celler (Figur 4A). Efter att ha nått 70% till 80% sammanflöde avlägsnades andra glomerulära celler med hjälp av ett positivt urval av endotelceller med magnetiska CD31-märkta pärlor (figur 4B-C). MitoDendra2-GEC uttryckte CD31 (figur 4D) och var negativa för podocytmarkör enligt synaptopodinnegativ färgning (figur 4E-F).
Den fluorescerande mitokondriella funktionen i mitoDendra2-GEC gör det möjligt att studera mitokondriernas morfologi under olika förhållanden in vitro. Här testade vi effekten av hög glukos (25mM) på mitokondristrukturen hos mitoDendra2-GEC (Figur 5D-F). Jämfört med de långsträckta mitokondrierna synliga i celler under normal glukos (5mM; Figur 5A-C), hög glukosinducerad fragmentering eller fission av mitokondrier som observerats av framträdande sfäroidformade mitokondrier (figur 5E). Dessutom använde vi en 405 nm laser för att fotokonvertera en utvald delpopulation av mitokondrier i en enda levande mitoDendra2-GEC (figur 5A, D). I figur 5B och figur 5E presenteras framgångsrik fotoväxling av mitokondrier från grönt (488nm) till rött (561 nm) i det valda området. Viktigt är att det gjorde det möjligt att bevittna fusionshändelserna i mitoDendra2-GEC som odlas under normal glukos, vilket kan observeras av den gula sammanslagna gröna och röda fluorescensen som ett resultat av mitokondrimatrisfusion (figur 5C). I den högglukosbehandlade mitoDendra2-GEC däremot var mitokondrierna fragmenterade och huvudsakligen röda (figur 5F), vilket tyder på att fission/fusionshändelserna under den testade tidsramen försenades eller hämmades på grund av de skador som orsakades av behandlingen med hög glukos, och detta överensstämmer med tidigare rapporter18,19.
Figur 1: Representativ beskrivning av murin GEC-isolering. Diagrammet representerar de signifikanta stegen i GEC-isolering, från att perfusera mösshjärta med magnetiska pärlor för att isolera njurglomeruli, matsmältningen av kollagenas, kulturen av glomerulära celler och slutligen rening av GEC med CD31-belagda pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Beskrivning av njurdissektion. Representativ bild av alla sterila kirurgiska instrument som behövs för dissektionen. Sax (a) behövs för att öppna musens hud, och en separat sax (b,c) behövs för att isolera njuren. Pincett (d) och (e) behövs för att hålla huden. Pincett (f) behövs för att samla den dissekerade njuren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Beskrivning av glomeruliskörden . (A) Persfuse vänster kammare med HBSS-pärlor lösning med en 20 ml spruta. Perforera den underlägsna vena cava med en 19 G nål. (B) Efter perfusion, ta bort fettet från njuren och skär det i 1 mm bitar. C) Smälta vävnaden med kollagenas typ II. (D) Efter matsmältning och centrifugering bildas tre lager; Pärlorna som bär glomeruli ligger i mellanskiktet, vilket indikeras av den svarta pilen. (E) Separera de isolerade pärlorna med glomeruli med hjälp av magnetkoncentratorn. (F) Representativ bild av nyligen isolerade glomeruli. (G) Växande celler från isolerade glomeruli efter 3 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Mitokondriell analys in vitro. (A) Glomerulära celler efter 3 dagars odling. (B) GEC efter 7 dagar. (D) Rening av GEC med CD31-märkta pärlor. Mikroskopisk avbildning av CD31-färgning. (E) GEC är negativa för synaptopodin. (F) Podocyter färgade med synaptopodin (488 nm, grön fluorescens) som en negativ kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Mikroskopisk avbildning av fluorescerande mitokondriell fusion in vitro. Bilder förvärvades med ett konfokalmikroskop med ett 40x vattenmål. (A–B) Valt område (röd cirkel) belystes med en 405 nm-linje (4% lasereffekt) för 300 bleknings iterationer med en hastighet av 6,3-12,61 / pixel, som tidigare beskrivits16. (AC) Celler i tillväxtmedier innehållande 5 mM glukos; Grön fluorescens (488 nm) visar friska mitokondrier. (B,E) Mitokondrier fotobyttes till rött (567 nm). (C) Gul fluorescens detekterar en aktiv fusionshändelse av GEC behandlad med 5mM glukos. (D) Cellerna behandlades med hög glukos 25 mM i 30 min. Grön fluorescens visar fragmenterade mitokondrier och (E) en del som fotobyttes till rött. (F) Figuren visar en minskad fusionshändelse som visas av reducerad gul fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mitokondrier är avgörande för cellulär metabolism, homeostas och stressreaktioner, och deras dysfunktion är kopplad till många sjukdomar, inklusive njursjukdom. Mitokondrier har en roll i den patologiska genereringen av överdriven reaktiva syrearter (ROS), regleringen av intracellulära kalciumnivåer, celldödsvägar och cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen av murina GEC är utmanande på grund av deras lilla antal, storlek, matrisfaktorer och ömsesidigt beroende natur med andra glomerulära celler som är väsentliga för deras överlevnad. Den aktuella artikeln presenterar ett detaljerat protokoll för GEC-isolering för mus. Specifikt använde vi transgena möss som ett verktyg för att erhålla villkorligt förevigade cellinjer med hög spridningspotential. De transgena mössen, som uttrycker simianvirus 40 (SV40) stort T-antigen tsA58, möjliggör aktivering av kontinuerlig proliferation under tillåtna förhållanden vid 33 °C och korsades här med de PHAM-utskurna mössen som uttrycker mitokondriell specifik fluorescens. De dubbla transgena mössen erbjöd ett utmärkt verktyg för att studera mitokondriernas struktur. Faktum är att PHAM-utskurna möss bär mitokondriellt specifikt (subenhet VIII av cytokrom c-oxidas) Dendra2-grönt, vilket möjliggör levande detektion av fluorescerande mitokondrier och observation av fissions- och fusionshändelser genom grönröd fotoväxling16.
Protokollet består av tre signifikanta steg: extraktion av glomeruli med hjälp av pärlor, proliferation av glomerulära celler och efterföljande rening av GEC med CD31-pärlor när cellerna är i odling. Användningen av endast en matsmältning med kollagenas är tillräcklig för att isolera glomerulära celler. Andra protokoll använder en andra matsmältning med DNAse och proteinas24. Vi har dock märkt bättre cellutbyten med bara ett matsmältningssteg. DNAse kan förbli aktiv och bromsa spridningen av cellerna. Dessutom kan GEC isoleras med hjälp av differentiell siktning som tidigare beskrivits20, vilket inte alltid är lätt när man använder mössnjurar.
Det är viktigt att autoklavera alla kirurgiska verktyg innan isoleringen av njurarna och glomeruli påbörjas för att undvika kontaminering. Dessutom är det viktigt att filtrera och komplettera lösningarna med antibiotika för att eliminera alla föroreningskällor. Faktum är att mykoplasmainfektioner kan orsaka cytopatologi som följaktligen stör varje parameter som mäts i cellodling25.
Isoleringen av glomeruli är beroende av intra-hjärtperfusion av pärlor. Visst är långsam perfusion med 20 ml 1x HBSS-innehållande pärlor avgörande för att skörda ett stort antal glomeruli. Pärlorna kommer att fångas i glomeruli, vilket underlättar deras rening med hjälp av en magnetisk koncentrator. Pärlorna kan beredas och förvaras vid 4 °C i upp till 15 dagar innan de används för att underlätta experimentproceduren.
Dessutom är smältning av glomeruli med kontinuerlig skakning avgörande för att skilja ett stort antal glomeruli från njurarna. Å andra sidan är isoleringen av murina GEC utmanande på grund av deras lilla storlek och närvaron av andra glomerulära celler. Därför är den stegvisa isoleringen av glomeruli, tillväxten av alla glomerulära celler i odling och den efterföljande användningen av CD31-belagda pärlor för att rena endotelceller avgörande, speciellt för att erhålla ett mer betydande antal livskraftiga och villkorligt proliferativa GEC. Ändå behövs validering av renheten hos celler med immunfärgning och flödescytometri.
Dessutom beskriver protokollet karakteriseringen av GEC-fenotypen och mitokondriernas fusions-/fissionsanalys in vitro. MitoDendra2-GEC är ett utmärkt verktyg för att studera cellulära svar från GEC-mitokondrier på olika stimuli in vitro utan behov av transfektion eller färgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Upphovsmännen har inga konkurrerande ekonomiska intressen att deklarera.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Cijiang He och Dr. Fu Jia för deras insikter i möss endotelcellisolering och tackar professor Mone Zaidi för att ha tillhandahållit dePhAM-utskurna mössen och värdefulla diskussioner. Författarna vill också erkänna mikroskopi CORE vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai och personal för den vägledning vi fick. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health-bidrag R01DK097253 och Department of Defense CDMRP-bidrag E01 W81XWH2010836 till I.S.D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics--Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
