Summary
In questo protocollo viene descritto un modello di trapianto di fegato ortotopico suino dopo conservazione statica a freddo di organi donatori per 20 ore senza l'uso di un bypass veno-venoso durante l'attecchimento. L'approccio utilizza una tecnica chirurgica semplificata con minimizzazione della fase anepatica e sofisticata gestione del volume e del vasopressore.
Abstract
Il trapianto di fegato è considerato il gold standard per il trattamento di una varietà di malattie epatiche fatali. Tuttavia, i problemi irrisolti del fallimento cronico del trapianto, la carenza di donatori di organi in corso e l'aumento dell'uso di innesti marginali richiedono il miglioramento dei concetti attuali, come l'implementazione della perfusione tra organi e macchine. Al fine di valutare nuovi metodi di ricondizionamento e modulazione dell'innesto, sono necessari modelli traslazionali. Per quanto riguarda le somiglianze anatomiche e fisiologiche con l'uomo e i recenti progressi nel campo dello xenotrapianto, i suini sono diventati le principali specie animali di grandi dimensioni utilizzate nei modelli di trapianto. Dopo l'introduzione iniziale di un modello di trapianto di fegato ortotopico suino da parte di Garnier et al. nel 1965, diverse modifiche sono state pubblicate negli ultimi 60 anni.
A causa di tratti anatomici specifici specifici, un bypass veno-venoso durante la fase anepatica è considerato una necessità per ridurre la congestione intestinale e l'ischemia con conseguente instabilità emodinamica e mortalità perioperatoria. Tuttavia, l'implementazione di un bypass aumenta la complessità tecnica e logistica della procedura. Inoltre, in precedenza sono state riportate complicanze associate come embolia aerea, emorragia e la necessità di una splenectomia simultanea.
In questo protocollo, descriviamo un modello di trapianto di fegato ortotopico suino senza l'uso di un bypass veno-venoso. L'attecchimento di fegati donati dopo una conservazione statica a freddo di 20 ore - simulando condizioni donatrici a criteri estesi - dimostra che questo approccio semplificato può essere eseguito senza alterazioni emodinamiche significative o mortalità intraoperatoria e con un regolare assorbimento della funzionalità epatica (come definito dalla produzione di bile e dal metabolismo del CYP1A2 specifico del fegato). Il successo di questo approccio è assicurato da una tecnica chirurgica ottimizzata e da una sofisticata gestione anestesiologica del volume e del vasopressore.
Questo modello dovrebbe essere di particolare interesse per i gruppi di lavoro incentrati sul decorso postoperatorio immediato, sul danno da ischemia-riperfusione, sui meccanismi immunologici associati e sul ricondizionamento degli organi donatori con criteri estesi.
Introduction
Il trapianto di fegato rimane l'unica possibilità di sopravvivenza in una varietà di malattie diverse che portano a insufficienza epatica acuta o cronica. Dalla sua prima applicazione di successo nell'umanità nel 1963 da parte di Thomas E. Starzl, il concetto di trapianto di fegato si è evoluto in un'opzione di trattamento affidabile applicata in tutto il mondo, principalmente come risultato dei progressi nella comprensione del sistema immunitario, dello sviluppo della moderna immunosoppressione e dell'ottimizzazione delle cure perioperatorie e delle tecniche chirurgiche 1,2 . Tuttavia, l'invecchiamento della popolazione e una maggiore domanda di organi hanno portato a carenze di donatori, con un maggiore uso di innesti marginali da donatori con criteri estesi e l'emergere di nuove sfide negli ultimi decenni. Si ritiene che l'introduzione e l'implementazione diffusa della perfusione organo-macchina apra una serie di possibilità per quanto riguarda il ricondizionamento e la modulazione del trapianto e contribuisca a mitigare le carenze di organi e a ridurre la mortalità in lista d'attesa 3,4,5,6.
Per valutare questi concetti e i loro effetti in vivo, sono necessari modelli di trapianto traslazionale7. Nel 1983, Kamada et al. hanno introdotto un efficiente modello di trapianto di fegato ortotopico nei ratti che da allora è stato ampiamente modificato e applicato da gruppi di lavoro in tutto il mondo 8,9,10,11. Il modello di trapianto di fegato ortotopico nei topi è tecnicamente più impegnativo, ma anche più prezioso in termini di trasferibilità immunologica, ed è stato riportato per la prima volta nel 1991 da Qian et al.12. Nonostante i vantaggi in termini di disponibilità, benessere degli animali e costi, i modelli di roditori sono limitati nella loro applicabilità in ambito clinico7. Quindi, sono necessari modelli animali di grandi dimensioni.
Negli ultimi anni, i maiali sono diventati le principali specie animali utilizzate per la ricerca traslazionale a causa delle loro somiglianze anatomiche e fisiologiche con gli esseri umani. Inoltre, gli attuali progressi nel campo degli xenotrapianti potrebbero aumentare ulteriormente l'importanza dei suini come oggetto di ricerca13,14.
Garnier et al. hanno descritto un modello di trapianto di fegato nei suini già nel 196515. Diversi autori, tra cui Calne et al. nel 1967 e Chalstrey et al. nel 1971, successivamente riportarono modifiche, portando infine a un concetto sicuro e fattibile di trapianto sperimentale di fegato suino nei decenni successivi 16,17,18,19,20,21.
Più recentemente, diversi gruppi di lavoro hanno fornito dati relativi alle attuali problematiche del trapianto di fegato utilizzando una tecnica di trapianto di fegato ortotopico suino, che include quasi invariabilmente un bypass venovenoso attivo o passivo, cioè porto-caval,19,22. La ragione di ciò è un'intolleranza specie-specifica al bloccaggio della vena cava inferiore e della vena porta durante la fase anepatica a causa di un intestino relativamente più grande e di un minor numero di shunt porto-cavali o cavo-cavali (ad esempio, mancanza di una vena azygos), con conseguente aumento della morbilità perioperatoria e della mortalità23. Le tecniche di trapianto di vena cava inferiore applicate in riceventi umani come alternativa non sono fattibili in quanto la vena cava suina inferiore è racchiusa da tessuto epatico23.
Tuttavia, l'utilizzo di un bypass veno-venoso aumenta ulteriormente la complessità tecnica e logistica in una procedura chirurgica già impegnativa, impedendo quindi ai gruppi di lavoro di tentare del tutto l'implementazione del modello. Oltre agli effetti fisiologici e immunologici diretti di un bypass, alcuni autori hanno sottolineato la significativa morbilità come la perdita di sangue o l'embolia aerea durante il posizionamento dello shunt e la necessità di una splenectomia simultanea, che potenzialmente influisce sui risultati a breve e lungo termine dopo l'attecchimento24,25.
Il seguente protocollo descrive una semplice tecnica di trapianto di fegato ortotopico suino dopo conservazione statica a freddo di organi donatori per 20 ore, che rappresenta criteri estesi condizioni del donatore senza l'uso di un bypass veno-venoso durante l'attecchimento, incluso l'approvvigionamento di fegato del donatore, la preparazione del back-table, l'epatectomia ricevente e la gestione anestesiologica pre e intraoperatoria.
Questo modello dovrebbe essere di particolare interesse per i gruppi di lavoro chirurgici incentrati sul decorso postoperatorio immediato, sul danno da ischemia-riperfusione, sul ricondizionamento degli organi donatori a criteri estesi e sui meccanismi immunologici associati.
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Protocol
Questo studio è stato condotto presso il Laboratorio di Scienze Animali della Scuola di Medicina di Hannover dopo l'approvazione da parte dell'Autorità regionale della Bassa Sassonia per la protezione dei consumatori e la sicurezza alimentare (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146)
1. Approvvigionamento di fegato da donatore
NOTA: Le donatrici di fegato erano suini domestici femmina (Sus scrofa domesticus), di età compresa tra 4-5 mesi e con un peso corporeo medio di circa 50 kg, che erano già stati in quarantena presso la struttura di ricerca animale per un minimo di 10 giorni prima dell'intervento.
- Eseguire la premedicazione mediante iniezione intramuscolare di atropina (0,04-0,08 mg/kg di peso corporeo), zolazepam (5 mg/kg di peso corporeo) e tiletamina (5 mg/kg di peso corporeo). Dopo aver stabilito un accesso endovenoso (ad esempio, vena dell'orecchio) indurre l'anestesia con un'iniezione di propofol (1,5 - 2,5 mg / kg di peso corporeo).
- Eseguire l'intubazione con un tubo endotracheale da 8,0-8,5 mm, a seconda delle dimensioni e dell'anatomia dell'animale. Stabilire il monitoraggio dell'elettrocardiografia, la misurazione dei gas respiratori e della saturazione di ossigeno periferico e la misurazione non invasiva della pressione sanguigna.
- Mantenere l'anestesia nei suini durante l'approvvigionamento di fegato del donatore tramite inalazione di isoflurano (0,8-1,5 vol%) e applicazione endovenosa di fentanil (0,003-0,007 mg/kg di peso corporeo). Eseguire la ventilazione a volume controllato durante tutta la procedura.
- Dopo il posizionamento del maiale donatore in posizione supina e la fissazione degli arti alla base del tavolo operatorio con elastici, strofinare la pelle con agente antisettico, ad esempio povidone-iodio o alcool isopropilico, e coprire l'animale con teli sterili.
- Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia mediante perdita della risposta di ritiro al pizzico del piede. Eseguire una laparotomia della linea mediana a partire dal processo xifoideo utilizzando cauterizzazione monopolare. Posizionare un divaricatore addominale e mobilitare l'intestino alla destra del donatore.
- Eseguire una splenectomia mediante dissezione del legamento splenocolico, del legamento gastrosplenico e del legamento frenicosplenico. Morseggiare la vena splenica e l'arteria splenica vicino all'ilo splenico con un morsetto Overholt e posizionare le legature (sutura in polifilamento 3-0) dopo aver reciso i vasi. Recidere ulteriori vasi (più piccoli) con una pinza bipolare o con la legatura.
NOTA: Una splenectomia durante il prelievo di fegato da donatore non è obbligatoria, ma riduce l'efflusso di sangue durante e dopo la perfusione. - Mobilitare l'intestino sul lato sinistro del donatore e recidere il legamento falciforme e i legamenti triangolari usando forbici e cauterizzazione bipolare.
- Dopo una sufficiente dissezione del fegato, incidere la porzione sinistra del diaframma su una distanza di 5-10 cm usando le forbici per localizzare il segmento toracico dell'aorta discendente. Circondare e posizionare una legatura (sutura di polifilamento 3-0) senza stringere.
- Incidere la porzione destra del diaframma su una distanza di 5-10 cm usando le forbici e identificare la vena cava sopraepatica inferiore.
- Riposizionare l'intestino in alto a sinistra del donatore ed entrare nello spazio retroperitoneale mediante incisione trasversale del peritoneo su una distanza di 5-10 cm usando le forbici.
- Localizzare l'aorta addominale e la vena cava inferiore appena sopra la biforcazione iliaca e separare entrambi i vasi su una lunghezza di circa 6 cm. Posizionare due legature polifilamenti 3-0 attorno all'aorta addominale: una craniale della biforcazione iliaca e una cranica di circa 3 cm, senza stringere. Posizionare un'altra legatura attorno alla vena cava intraepatica inferiore senza stringere.
- Iniettare eparina per via endovenosa (25.000 I.E.). Scegliere una cannula appropriata e disaerare la linea di gocciolamento con soluzione di conservazione raffreddata.
- Stringere la prima legatura caudale situata intorno all'aorta addominale. Dopo aver occluso l'aorta addominale cranicamente della seconda legatura (manualmente o posizionando un morsetto vascolare atraumatico), effettuare un'incisione trasversale tra entrambe le legature usando le forbici.
- Inserire la cannula nell'incisione e fissarla con la legatura rimanente. Recidere la vena cava inferiore sopraepatica lontano cranialmente (vicino all'atrio destro) usando le forbici.
- Dopo una perdita di sangue di circa 1.500-2.000 ml, bloccare il segmento toracico dell'aorta discendente legando la legatura e iniziare la perfusione anterograda.
NOTA: Per l'eventuale necessità di sangue (trasfusioni) durante l'attecchimento o per la perfusione normotermica della macchina, il sangue intero (circa 1.500 ml) può essere raccolto utilizzando un contenitore contenente anticoagulante a base di citrato. - Stringere la legatura posta intorno alla vena cava infraepatica inferiore, incidere il vaso cranicamente della legatura e inserire un aspiratore chirurgico. Iniettare una dose letale di pentobarbital sodico (5.000 mg). Posizionare ghiaccio sterile frantumato nella cavità toracica e addominale senza compromettere il tessuto epatico.
- Dopo perfusione con 3.500 mL di soluzione di conservazione per un corso di circa 10-15 minuti, recidere la vena cava sopraepatica incisa inferiore. Recidere la vena cava infraepatica inferiore a livello della vena renale sinistra.
- Recidere il dotto biliare cranico del tessuto pancreatico tra due legature (polifilamento 3-0) per evitare la fuoriuscita di bile. Recidere la vena porta cranica del pancreas.
- Individuare l'arteria celiaca dopo la preparazione smussata e seguire dorsalmente l'aorta addominale. Eliminare il rispettivo segmento aortico per creare un cerotto per un successivo attecchimento.
- Eliminare il diaframma attorno alla vena cava sopraepatica inferiore e recidere le aderenze rimanenti usando le forbici. Estrarre il fegato.
- Eseguire una colecistectomia o stringere una legatura attorno al dotto cistico e lavare il dotto biliare comune con almeno 20 ml di soluzione di conservazione. Posizionare la cannula di perfusione nella vena porta e lavare l'innesto con ulteriori 500 ml di soluzione di conservazione. Posizionare l'innesto in una ciotola sterile posta sul ghiaccio.
NOTA: A seconda dell'obiettivo scientifico, l'organo può essere immediatamente preparato per l'attecchimento o tenuto sul ghiaccio per un periodo di tempo indefinito (20 ore in questo protocollo) prima di iniziare la preparazione e l'attecchimento della tavola posteriore.
2. Preparazione back-table del fegato
- Rimuovere il tessuto linfatico a partire dal segmento aortico e quindi identificare e occludere i rami laterali arteriosi e i vasi linfatici con clip, legature (polifilamento 4-0) o suture (monofilamento 5-0; Figura 1A). Allo stesso modo, rimuovere il tessuto linfatico attorno alla vena porta e occludere i rami laterali con punti di sutura (monofilamento 5-0).
- Identificare la vena cava sopraepatica inferiore e posizionare le suture attorno a entrambe le vene diaframmatiche (5-0 monofilamento) dopo aver rimosso il tessuto diaframmatico circostante. Lavare tutti i recipienti con soluzione salina fredda o di conservazione per identificare eventuali perdite residue. Eseguire l'accorciamento dei vasi e la preparazione del cerotto aortico solo dopo l'attecchimento per tenere conto delle circostanze anatomiche individuali.
3. Epatectomia ricevente, attecchimento del fegato del donatore e gestione perioperatoria
NOTA: Come riceventi di fegato, sono stati utilizzati suini domestici femmina (Sus scrofa domesticus) di età compresa tra 4-5 mesi e con un peso corporeo medio di circa 50 kg. Analogamente ai donatori di fegato, i riceventi erano stati in quarantena presso la struttura di ricerca animale per un minimo di 10 giorni prima del trapianto.
- Anestesia e gestione perioperatoria
- Eseguire la premedicazione mediante iniezione intramuscolare di atropina (0,04-0,08 mg/kg di peso corporeo), zolazepam (5 mg/kg di peso corporeo) e tiletamina (5 mg/kg di peso corporeo). Dopo aver stabilito un accesso endovenoso (ad es. vena dell'orecchio), indurre l'anestesia con un'iniezione di propofol (1,5-2,5 mg/kg di peso corporeo).
- Eseguire l'intubazione con un tubo endotracheale da 8,0-8,5 mm, a seconda delle dimensioni e dell'anatomia dell'animale. Stabilire il monitoraggio dell'elettrocardiografia, la misurazione dei gas respiratori e della saturazione di ossigeno periferico e la misurazione non invasiva della pressione sanguigna. Nel caso di un modello cronico, applicare un unguento oculare per evitare secchezza dopo l'intervento chirurgico.
- Posizionare l'animale ricevente su una base riscaldante in posizione supina e fissare gli arti sulla base del tavolo operatorio con elastici.
- Per un monitoraggio prolungato, sotto guida ecografica, posizionare un catetere venoso centrale a tre lumen e un catetere venoso di grandi dimensioni (7 Fr.) nella vena giugulare interna e un catetere venoso di grandi dimensioni (7 Fr.) per la terapia volumetrica. Inoltre, inserire un catetere arterioso nell'arteria carotidea / cervicale interna sotto controllo ecografico per la misurazione invasiva della pressione sanguigna (Figura 1B).
- Mantenere l'anestesia durante il prelievo d'organo tramite inalazione di isoflurano (0,8-1,5 vol%) e applicazione endovenosa di fentanil (0,003-0,007 mg/kg di peso corporeo). Eseguire la ventilazione a volume controllato durante tutta la procedura. Applicare 2.000 mg di sultamicillina per l'antibiosi perioperatoria e 250 mg di metilprednisolone per via endovenosa.
- Somministrare un vasopressore come la noradrenalina per via endovenosa per raggiungere una pressione arteriosa media target di 60 mmHg. Inoltre, applicare soluzioni cristalloidi come la soluzione di lattato di Ringer o soluzioni colloidali come gelatine fluide, se necessario.
- Applicare gluconato di calcio (10%) e bicarbonato di sodio (8,4%), glucosio (40%) o cloruro di potassio (7,45%) per via endovenosa rispetto alle analisi dei gas del sangue ottenute ogni 30 minuti.
- Epatectomia ricevente
- Strofinare la pelle con agente antisettico, ad esempio iodio povidone o alcool isopropilico, e coprire l'animale con teli sterili.
- Confermare un'adeguata profondità dell'anestesia mediante perdita della risposta di ritiro al pizzico del piede. Eseguire una laparotomia della linea mediana a partire dal processo xifoideo utilizzando cauterizzazione monopolare. Posizionare un divaricatore addominale e mobilizzare l'intestino a sinistra del donatore. Coprire l'intestino con un panno inumidito.
- Posizionare un catetere urinario sovrapubico per l'ottimizzazione della gestione del volume intraoperatorio.
- Recidere il legamento falciforme e i legamenti triangolari usando forbici e cauterizzazione bipolare. Dopo una sufficiente dissezione del fegato, circondare sia la vena cava sopraepatica che infraepatica inferiore vicino al parenchima epatico.
- Sezionare e recidere il dotto biliare comune sotto la giunzione del dotto cistico tra due legature (polifilamento 3-0).
- Incidere lo strato peritoneale superficiale che copre il legamento epatoduodenale e identificare le arterie epatiche poco prima di entrare nel parenchima epatico. Sezionare usando il cauterizzazione bipolare o il posizionamento di clip, legature o punti di sutura.
- Sezionare l'aorta addominale mediante incisione nella linea mediana (strato avascolare) dei muscoli diaframmatici destro e sinistro. Preparare l'aorta per l'anastomosi aortica rimuovendo il tessuto circostante.
NOTA: questo passaggio è necessario solo se viene eseguita un'anastomosi aortica. Altrimenti, sezionare ulteriormente l'arteria epatica / la regione ilare per prepararsi a un'anastomosi end-to-end convenzionale tra le arterie epatiche donatrice e ricevente. - Eseguire l'epatectomia ricevente posizionando un morsetto vascolare atraumatico sulla vena porta, seguito da morsetti vascolari atraumatici sulla vena cava sopraepatica inferiore (compreso il diaframma circostante mentre si ritrae caudalmente il fegato) e la vena cava infraepatica inferiore.
- Recidere tutti e tre i vasi vicino al parenchima epatico. Rimuovere il fegato ricevente dalla cavità addominale.
NOTA: Il serraggio dei vasi segna l'inizio della fase anepatica. Durante la fase anepatica, i suini sono emodinamicamente instabili e richiedono quantità rilevanti di vasopressori/catecolamine. L'anestesista deve essere pronto ad applicare noradrenalina ed epinefrina. Mantenere la fase fino alla riperfusione del fegato il più breve possibile. Comunicare bene con l'anestesista.
- Attecchimento del fegato del donatore
- Posizionare il fegato del donatore nella cavità addominale. Accorciare la vena cava sovraepatica donatrice e/o ricevente inferiore ad una lunghezza adeguata evitando attorcigliamenti o troppe tensioni sull'anastomosi.
- Posizionare una singola sutura come filo di sostegno (5-0 monofilamento), adattando l'angolo destro della vena cava sovraepatica donatrice e ricevente inferiore. Iniziare il lato dorsale dell'anastomosi dall'angolo sinistro della/e nave/e con una sutura in esecuzione (monofilamento 5-0, a doppio braccio).
- Quando si raggiunge l'angolo destro, rimuovere il filo di supporto, fissare la sutura corrente con un morsetto e continuare con il lato ventrale dell'anastomosi, di nuovo iniziando dall'angolo sinistro della nave o delle navi. Stringere la sutura con più nodi senza restringere il diametro del vaso per evitare stenosi.
- Accorciare la vena porta del donatore e/o del ricevente ad una lunghezza adeguata evitando attorcigliamenti o troppa tensione sull'anastomosi.
- Eseguire un'anastomosi vascolare della vena porta del donatore e del ricevente analoga ai passaggi 3.3.2-3.3.3 utilizzando una sutura monofilamento, a doppia braccia 6-0.
- Eseguire la riperfusione porto-venosa rimuovendo il morsetto vascolare, occludendo la vena porta ricevente e occludere la vena cava infraepatica del donatore inferiore con un morsetto vascolare dopo aver drenato circa 200-400 ml di sangue. Rimuovere lentamente il morsetto vascolare che occlude la vena cava sopraepatica ricevente inferiore e cercare il sanguinamento attivo.
NOTA: La rimozione di entrambi i morsetti segna la fine della fase anepatica. La quantità di catecolamine necessaria dovrebbe diminuire significativamente poco dopo. - Accorciare la vena cava infraepatica inferiore del donatore e/o del ricevente. Eseguire un'anastomosi vascolare della vena cava infraepatica donatrice e ricevente inferiore analoga ai passaggi 3.3.2-3.3.3 utilizzando una sutura monofilamento 5-0, a doppia bracciata. Rimuovere i morsetti occludendo la vena cava infraepatica donatrice e ricevente inferiore.
- Preparare un cerotto aortale ellittico (cerotto Carrel) con un diametro di circa 1-1,5, cm a seconda delle circostanze anatomiche, usando le forbici. Bloccare l'aorta addominale con un morsetto vascolare di Cooley atraumatico e fare un'incisione usando un bisturi. Ingrandire l'incisione usando le forbici per adattarsi al cerotto.
- Iniziare l'anastomosi aortica con una sutura corrente (6-0 monofilamento, a doppio braccio) all'angolo cranico dell'incisione / cerotto. Quando si raggiunge l'angolo caudale, fissare la sutura in esecuzione con un morsetto e completare nuovamente l'anastomosi iniziando dall'angolo cranico. Stringere la sutura con più nodi e rimuovere lentamente il morsetto vascolare.
NOTA: Il bloccaggio dell'aorta addominale influenzerà significativamente la pressione sanguigna del maiale. Comunicare bene con l'anestesista. - Posizionare una garza emostatica attorno all'anastomosi arteriosa. Posizionare un catetere nel dotto biliare comune e fissarlo con una singola legatura. Assicurarsi di non occludere il diametro del catetere.
- Chiudere temporaneamente l'addome adattando la fascia muscolare e la pelle con una sutura corrente e coprire l'addome con pellicola trasparente e / o teli per evitare perdite termiche.
NOTA: Se gli obiettivi scientifici richiedono un modello cronico, eseguire un'anastomosi end-to-end tra il dotto biliare donatore e ricevente, chiudere l'addome con suture separate per il peritoneo e la fascia muscolare e chiudere la pelle con suture singole. - Alla fine del follow-up, iniettare una dose letale di 5.000 mg di pentobarbital sodico per l'eutanasia intraoperatoria.
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Representative Results
La tecnica presentata in questo protocollo ha fornito risultati affidabili e riproducibili in termini di stabilità emodinamica e sopravvivenza animale durante tutta la procedura, nonché funzione di innesto nel decorso postoperatorio.
Più recentemente, abbiamo applicato il modello per lo studio del danno da ischemia-riperfusione e degli interventi terapeutici che mitigano gli effetti dannosi nell'immediato decorso postoperatorio. Dopo il prelievo e 20 ore di conservazione statica a freddo, sono stati impiantati innesti di fegato (con un peso medio di 983,38 g) nel modo descritto. Gli esperimenti sono stati terminati 6 ore dopo la riperfusione venosa portale e il campionamento di sangue e bile, nonché di fegato e tessuto del dotto biliare a intervalli definiti. Tutti i riceventi sono sopravvissuti all'attecchimento e al successivo follow-up di 6 ore in anestesia generale fino all'eutanasia.
Poiché il focus di questo protocollo risiede nella fattibilità di un modello di trapianto di fegato ortotopico suino senza l'uso di un bypass veno-venoso, i risultati qui presentati sono limitati ai parametri vitali intraoperatori e all'applicazione di vasopressori (Figura 2), nonché alle prestazioni dell'innesto, definite dai parametri di laboratorio convenzionali, cioè concentrazioni sieriche di lattato, aspartato transaminasi (AST), alanina transaminasi (ALT) e glutammato deidrogenasi (GLDH), produzione di bile (Tabella 1) e test della capacità di funzionalità massima epatica (LiMAx) come descritto in precedenza in un modello di resezione epatica suina (Figura 3)26. Il test LiMAx si basa sul metabolismo in tempo reale della 13C-metacetina iniettata per via endovenosa dal sistema CYP1A2 specifico per il fegato. Prima e dopo l'iniezione, il rapporto di 13CO 212CO2 nell'aria espirata è determinato per quantificare la funzione epatica individuale27.
Come previsto, i riceventi hanno richiesto un aumento delle concentrazioni di noradrenalina immediatamente prima e durante la fase anepatica al fine di stabilizzare la pressione arteriosa media (MAD) a ≥60 mmHg. Basse concentrazioni di adrenalina sono state utilizzate simultaneamente per aumentare ulteriormente la gittata cardiaca in questo periodo di tempo vulnerabile. Dopo la riperfusione venosa portale, la necessità di vasopressori è diminuita rapidamente e ancora di più durante il bloccaggio temporaneo dell'aorta addominale per il completamento dell'anastomosi aortica. Dopo l'attecchimento, la MAD e le dosi richieste di vasopressori sono rimaste stabili.
Il tempo medio di intervento, definito come il tempo dall'incisione cutanea al completamento di tutte le anastomosi e riperfusioni vascolari, è stato di 103,50 minuti, inclusa una fase aneepatica media di 27,13 minuti. Da notare che solo due riceventi hanno subito una fase anepatica di oltre 30 minuti. Tutti i riceventi hanno mostrato una diminuzione delle concentrazioni sieriche di lattato 4 ore dopo la riperfusione portale-venosa e i valori di LiMAx ottenuti 6 ore dopo la riperfusione portale-venosa erano paragonabili ai valori misurati nei donatori di fegato prima del prelievo di organi in tutti tranne uno ricevente (fase anepatica di 34 minuti).
Figura 1: Preparazione dell'innesto e del ricevente. (A) La figura raffigura la preparazione del back-table dell'asse celiaco e del segmento aortico. (B) Questa figura mostra il ricevente in posizione supina con monitoraggio esteso, tra cui un catetere venoso centrale (blu) nella vena giugulare interna sinistra e un catetere arterioso (rosso) nell'arteria carotide/cervicale interna destra. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Pressione arteriosa media e concentrazioni di vasopressori richiesti durante l'attecchimento. La figura rappresenta la pressione arteriosa media (MAD in mmHg) misurata e le concentrazioni di noradrenalina ed epinefrina (in μg/kg/h) durante periodi di tempo definiti durante la procedura in tutti gli otto destinatari. I valori sono presentati come media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Valori del test della capacità di funzionalità massima epatica (LiMAx) ottenuti dai donatori prima del prelievo epatico e dai riceventi 6 ore dopo l'attecchimento. La figura mostra i dati del box plot (errore medio e standard della media) dal test della capacità di funzionalità massima epatica (LiMAx) dai donatori prima del prelievo di fegato e dai riceventi 6 ore dopo l'attecchimento (n = 8). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Rsperimento | Peso dell'innesto | Peso del destinatario | GRWR | Tempo di funzionamento | Fase anepatica | Lattato (mmol/L) | Picco AST | Picco ALT | Picco GLDH | Volume della bile | ||
| No. | g) | (kg) | (%) | (min) | (min) | 2 ore | 4 ore | 6 ore | (U/L) | (U/L) | (U/L) | (ml) |
| 1 | 1082 | 48.8 | 2.22 | 115 | 25 | 5.8 | 4.7 | 3.7 | 677 | 122 | 39 | 48 |
| 2 | 946 | 51.4 | 1.84 | 125 | 34 | 6.6 | 5.9 | 5.2 | 1207 | 109 | 268 | 15 |
| 3 | 957 | 57.6 | 1.66 | 110 | 30 | 8.3 | 5.8 | 8.1 | 742 | 125 | 143 | 73 |
| 4 | 825 | 49.2 | 1.68 | 87 | 22 | 7.6 | 6.7 | 6.5 | 675 | 99 | 113 | 35 |
| 5 | 1045 | 53.4 | 1.96 | 101 | 25 | 7.9 | 6.8 | 5.6 | 919 | 86 | 129 | 25 |
| 6 | 924 | 45.2 | 2.04 | 105 | 32 | 6.7 | 4.6 | 3.7 | 414 | 90 | 114 | 75 |
| 7 | 785 | 48.2 | 1.63 | 95 | 24 | 6.8 | 4.8 | 4.1 | 557 | 70 | 110 | 1.5 |
| 8 | 1303 | 54.6 | 2.39 | 90 | 25 | 12.7 | 12.2 | 9.8 | 1011 | 87 | 94 | 10 |
| SIGNIFICARE | 983.38 | 51.05 | 1.93 | 103.50 | 27.13 | 7.80 | 6.44 | 5.84 | 775.25 | 98.50 | 126.25 | 35.31 |
| SEM | 57.59 | 1.41 | 0.10 | 4.57 | 1.52 | 0.76 | 0.88 | 0.78 | 90.79 | 6.73 | 23.00 | 9.87 |
Tabella 1: Innesto perioperatorio e variabili riceventi. La tabella riassume il peso dell'innesto e del ricevente, nonché il rapporto peso innesto-ricevente (GRWR) e la durata dell'operazione (incisione cutanea fino al completamento di tutte le anastomosi e riperfusioni vascolari) e della fase anepatica. Le variabili che indicano la funzione del trapianto, come i parametri di laboratorio convenzionali, cioè le concentrazioni sieriche di lattato, aspartato transaminasi (AST), alanina transaminasi (ALT) e glutammato deidrogenasi (GLDH), e la produzione di bile sono fornite per ciascuno degli otto trapianti eseguiti.
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Discussion
I recenti sviluppi tecnici come l'introduzione della perfusione meccanica hanno il potenziale per rivoluzionare il campo del trapianto di fegato. Al fine di tradurre i concetti di ricondizionamento o modifica dell'innesto in contesti clinici, sono inevitabili modelli di trapianto riproducibili in animali di grandi dimensioni.
Dopo l'introduzione iniziale del trapianto di fegato ortotopico suino, diversi autori hanno lavorato al miglioramento di queste tecniche negli ultimi cinquant'anni. Le differenze all'interno degli approcci chirurgici riportati sono spesso minori e riguardano le anastomosi vascolari e biliari, l'anestesia e la gestione perioperatoria. Tuttavia, contrariamente alla situazione attuale del trapianto clinico di fegato in cui l'uso del bypass venovenoso è ancora comune ma facoltativo 28, un bypass porto-cavale attivo o passivo durante la fase anepatica nei suini è considerato una necessità per ridurre la congestione intestinale e, quindi, la successiva ischemia intestinale con instabilità emodinamica e mortalità perioperatoria, come descritto in un lavoro ben elaborato di Esmaeilzadeh et al.25.
Oltre ai costi aggiuntivi implicati e alle sfide tecniche di un bypass veno-venoso, ad esempio cateteri, un dispositivo a pompa, la necessità di ulteriori anticoagulanti e potenziali complicanze come embolia aerea o emorragia, e a seconda dell'approccio scelto, la necessità di una splenectomia simultanea ha spinto i gruppi a descrivere tecniche modificate senza bypass veno-venosi25,29, 30.
Torres et al.31 hanno osservato una grave instabilità emodinamica in animali sottoposti ad attecchimento senza l'uso di un bypass veno-venoso rispetto ai riceventi con uno shunt passivo porto-cavale e, quindi, hanno eseguito un bloccaggio temporaneo dell'aorta sopraceliaca in questi animali, che è stato anche descritto da altri in modelli di auto-/allo-trapianto di fegato suino 23,31,32 . Tuttavia, l'induzione di ischemia calda mediante cross-clamping dell'aorta ricevente comporta il rischio di un rilevante rilascio di molecole pro-infiammatorie e di danno tissutale dopo la riperfusione e dovrebbe pertanto essere evitata a tutti i costi al fine di produrre risultati scientifici affidabili, specialmente quando si valuta il danno da ischemia-riperfusione. Inoltre, questo approccio non assomiglia alla pratica clinica nell'uomo, che, quindi, limita la traduzione dei risultati ottenuti in questi modelli.
Per evitare tali misure di sostegno dannose, riteniamo che due punti siano cruciali. (1) La fase anepatica deve essere mantenuta al minimo assoluto, cioè al di sotto dei 30 minuti, come è già stato dimostrato nelle prime fasi del trapianto di fegato suino da Battersby et al.33. Riteniamo che l'esecuzione di suture (a doppio braccio) e un massimo di un filo di supporto siano sufficienti per creare un'anastomosi semplice e sicura sia per la vena cava sopraepatica inferiore che per la vena porta. Ovviamente, la riperfusione portale-venosa dovrebbe iniziare prima di anastomosi la vena cava infraepatica inferiore. (2) La gestione anestesiologica deve essere eseguita da un anestesista esperto, idealmente familiare con la chirurgia epatica o il trapianto in pazienti umani34. La sofisticata gestione del volume e la terapia con vasopressori, cioè noradrenalina ed epinefrina, in combinazione con una tecnica chirurgica semplificata sono la base per l'implementazione di successo di questo modello.
È interessante notare che solo un piccolo numero di gruppi chirurgici ha fornito dati sul successo del trapianto di fegato ortotopico suino senza bypass veno-venoso e concomitante bloccaggio aortico sopraceliaco. Per quanto ne sappiamo, Oike et al., Heuer et al. e, più recentemente, Fondevila et al. sono stati gli unici gruppi a riportare i loro risultati (promettenti), con tassi di sopravvivenza rispettivamente dell'87%, 80% e 100%, 35,36,37. Il tempo anepatico mediano nella nostra coorte è stato di 25 minuti ed era, quindi, identico ai dati presentati da Heuer et al.36. Durante la fase anepatica, Oike et al.35 hanno riportato una riduzione del 50% -60% della pressione arteriosa, simile alle osservazioni fatte in questa coorte, portando ad un aumento delle dosi di vasopressori per evitare una diminuzione del MAD al di sotto di 60 mmHg. Heuer et al.36 non hanno menzionato l'uso della terapia con catecolamine nella loro pubblicazione, ma non specificamente menzionato la trasfusione di sangue intero per migliorare la stabilità emodinamica. Quest'ultimo non era richiesto in questo modello. Fondevila et al., che hanno riportato un tempo anepatico medio inferiore a 20 minuti, si sono basati esclusivamente sulla somministrazione di soluzioni cristalloidi e non hanno applicato sostanze vasoattive durante l'attecchimento37.
Da notare che, a differenza delle recenti pubblicazioni che applicano l'anastomosi end-to-end dal donatore all'arteria epatica ricevente19,22, questo modello include un'anastomosi end-to-side con un cerotto Carrel dell'aorta donatrice che viene anastomosi all'aorta sopraceliaca del ricevente. Soprattutto per i contesti sperimentali, con l'uso di organi che soddisfano criteri donatori estesi, ad esempio, tempo ischemico freddo prolungato, potrebbe essere favorevole escludere qualsiasi problema con la perfusione arteriosa dell'innesto. L'applicazione di un cerotto Carrel aiuterà ad evitare la stenosi dell'anastomosi arteriosa che potrebbe diventare funzionalmente rilevante in caso di vasospasmi periferici concomitanti frequentemente osservati dopo la riperfusione. Tuttavia, questo approccio richiederà più tempo rispetto all'anastomosi end-to-end convenzionale a causa dell'accesso più elaborato dell'aorta.
Poiché i nostri esperimenti rappresentativi si sono concentrati sulla fase postoperatoria immediata e sul danno da ischemia-riperfusione, i riceventi sono stati tenuti sotto anestesia e sono stati eutanizzati 6 ore dopo la riperfusione. Sebbene vantaggioso per quanto riguarda il benessere degli animali, ciò costituisce una limitazione significativa alla convalida della nostra tecnica per quanto riguarda l'innesto e la sopravvivenza del ricevente. Crediamo, tuttavia, che sulla base dei parametri vitali, dell'emodinamica, della clearance del lattato, della produzione di bile e in particolare del metabolismo del CYP1A2 specifico del fegato in tempo reale (test LiMAx) osservato durante il follow-up, l'applicazione a lungo termine del nostro modello dovrebbe essere fattibile, soprattutto perché gli innesti utilizzati nell'ambito degli esperimenti sono stati sottoposti a celle frigorifere statiche per 20 ore prima dell'attecchimento, in contrasto con l'applicazione riuscita di modelli di trapianto comparabili da parte di altri35, 36,37. Inoltre, i rapporti precedenti menzionati hanno dimostrato che la mortalità perioperatoria è stata osservata esclusivamente durante e fino a 6 ore dopo l'intervento chirurgico, ad eccezione di un ricevente che è morto per embolia polmonare il primo giorno postoperatorio nello studio di Oike et al.35.
In questo lavoro, dimostriamo che un approccio semplificato al trapianto di fegato ortotopico suino senza l'uso di un bypass veno-venoso durante l'attecchimento può essere eseguito in modo sicuro ed è più conveniente, senza significative alterazioni emodinamiche o mortalità intraoperatoria anche dopo una prolungata conservazione statica a freddo dell'organo donatore. Tale modello dovrebbe essere di particolare interesse per i gruppi di lavoro (chirurgici) incentrati sul decorso postoperatorio immediato, sul danno da ischemia-riperfusione, sul ricondizionamento di organi donatori con criteri estesi e sui meccanismi immunologici associati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Britta Trautewig, Corinna Löbbert, Astrid Dinkel e Ingrid Meder per la loro diligenza e impegno. Inoltre, gli autori ringraziano Tom Figiel per aver prodotto il materiale fotografico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abdominal retractor | No Company Name available | No Catalog Number available | |
| Aortic clamp, straight | Firma Martin | No Catalog Number available | |
| Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL | Radiometer Medical ApS | 956-622 | |
| Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL) | B.Braun | 648037 | |
| Backhaus clamp | Bernshausen | BF432 | |
| Bipolar forceps, 23 cm | SUTTER | 780222 SG | |
| Bowl 5 L, 6 L, 9 L | Chiru-Instrumente | 35-114327 | |
| Braunol Braunoderm | B.Braun | 3881059 | |
| Bulldog clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Button canula | Krauth + Timmermann GmbH | 1464LL1B | |
| Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%)) | B.Braun | 2353745 | |
| Cell Saver (Autotransfusion Reservoir) | Fresenius Kabi AG | 9108471 | |
| Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm | Arrow | AD-24703 | |
| Clamp | INOX | B-17845 / BH110 / B-481 | |
| Clamp | Aesculap | AN909R | |
| Clamp, 260 mm | Fehling Instruments GMbH &Co.KG | ZAU-2 | |
| Clip Forceps, medium | Ethicon | LC207 | |
| Clip forceps, small | Ethicon | LC107 | |
| CPDA-1 solution | Fresenius Kabi AG | 41SD09AA00 | |
| Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution) | Dr.Franz Köhler Chemie GmbH | 2125921 | |
| Dissecting scissors | LAWTON 05-0641 | No Catalog Number available | |
| Dissecting scissors, 180 mm | Metzenbaum | BC606R | |
| Endotracheal tube 8.0 mm | Covetrus | 800764 | |
| Epinephrine (Adrenalin 1:1000) | InfectoPharm | 9508734 | |
| Falcon Tubes 50ml | Greiner | 227 261 L | |
| Femoralis clamp | Ulrich | No Catalog Number available | |
| Fentanyl 0.1mg | PanPharma | 00483 | |
| Forceps, anatomical | Martin | 12-100-20 | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD052R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD032R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD240R | |
| Forceps, surgical | Bernshausen | BD 671 | |
| Forceps, surgical | INOX | B-1357 | |
| G40 solution | Serag Wiessner | 10755AAF | |
| Gelafundin ISO solution 40 mg/mL | B. Braun | 210257641 | |
| Guidewire with marker | Arrow | 14F21E0236 | |
| Haemostatic gauze ("Tabotamp" 5 x 7.5 cm) | Ethicon | 474273 | |
| Heparin sodium 25,000IE | Ratiopharm | W08208A | |
| Hico-Aquatherm 60 | Hospitalwerk | No Catalog Number available | |
| Infusion Set Intrafix | B.Braun | 4062981 L | |
| Intrafix SafeSet 180 cm | B.Braun | 4063000 | |
| Introcan Safety, 18 G | B.Braun | 4251679-01 | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-bore venous catheter, 7Fr. | Edwards Lifesciences | I301F7 | |
| Ligaclip, medium | Ethicon | LT200 | |
| Ligaclip, small | Ethicon | LT100 | |
| Material scissors | Martin | 11-285-23 | |
| Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg) | Sanofi | 7823704 | |
| Monopolar ERBE ICC 300 | Fa. Erbe | No Catalog Number available | |
| NaCl solution (0.9%) | Baxter | 1533 | |
| Needle holder | Aesculap | BM36 | |
| Needle holder | Aesculap | BM035R | |
| Needle holder | Aesculap | BM 67 | |
| Neutral electrode | Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen | 21191 - 060 | |
| Norepinephrine (Sinora) | Sintetica GmbH | 04150124745717 | |
| Omniflush Sterile Filed 10 mL | B.Braun | 3133335 | |
| Original Perfusorline 300 cm | B.Braun | 21E26E8SM3 | |
| Overhold clamp | INOX | BH 959 | |
| Overhold clamp | Ulrich | CL 2911 | |
| Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL) | WDT, Garbsen | 21217 | |
| Perfusers | B.Braun | 49-020-031 | |
| Perfusor Syringe 50 mL | B.Braun | 8728810F | |
| Petri dishes 92 x 17 mm | Nunc | 150350 | |
| Poole Suction Instrument Argyle flexibel | Covidien, Mansfield USA | 20C150FHX | |
| Potassium chloride (7.45%) | B.Braun | 4030539078276 | |
| Pressure measurement set | Codan pvb Medical GmbH | 957179 | |
| Propofol (1%) | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| S-Monovette 2.6 mL K3E | Sarstedt | 04.1901 | |
| S-Monovette 2.9 mL 9NC | Sarstedt | 04.1902 | |
| S-Monovette 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 11602 | |
| Sartinski clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Scalpel No.11 | Feather Safety Razor Co.LTD | 02.001.40.011 | |
| Scissors | INOX | BC 746 | |
| Seldinger Arterial catheter | Arrow | SAC-00520 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | B.Braun | 212768082 | |
| Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC") | B.Braun | 4899719 | |
| Sterofundin ISO solution | B.Braun | No Catalog Number available | |
| Suction | Dahlhausen | 07.068.25.301 | |
| Suction Aesculap Securat 80 | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Suction catheter | ConvaTec | 5365049 | |
| Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam) | Pfizer | DL253102 | |
| Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm | ConvaTec | UK 1F02772 | |
| Suprasorb ("Toptex lite RK") | Lohmann & Rauscher | 31654 | |
| Suture Vicryl 3-0 | Ethicon | VCP 1218 H | |
| Suture Vicryl 4-0 | Ethicon | V392H | |
| Suture, Prolene 4-0 | Ethicon | 7588 H | |
| Suture, Prolene 5-0, double armed | Ethicon | 8890 H | |
| Suture, Prolene 5-0, single armed | Ethicon | 8720 H | |
| Suture, Prolene 6-0, double armed | Ethicon | 7230 H | |
| Suture, Prolene 6-0, single armed | Ethicon | EH 7406 H | |
| Suture, Prolene: blau 3-0 | Ethicon | EH 7499H | |
| Suture, Safil 2/0 | Aesculap | C 1038446 | |
| Suture, Terylene 0 | Serag Wiessner | 353784 | |
| Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | B.Braun | 4606027V | |
| TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm | Fresenius Kabi AG | 2877101 | |
| Ultrasound Butterfly IQ+ | Butterfly Network Inc. | 850-20014 | |
| Ventilator "Oxylog Dräger Fl" | Dräger Medical AG | No Catalog Number available | |
| Yankauer Suction | Medline | RA19GMD | |
| Zoletil 100 mg/mL (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin) | Virbac | 794-861794861 |
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