Summary
Neste protocolo, descreve-se um modelo de transplante hepático ortotópico suíno após armazenamento a frio estático de órgãos doadores por 20 h sem o uso de bypass venovenoso durante o enxerto. A abordagem utiliza uma técnica cirúrgica simplificada com minimização da fase anhepática e manejo sofisticado do volume e vasopressor.
Abstract
O transplante de fígado é considerado o padrão-ouro para o tratamento de uma variedade de doenças hepáticas fatais. No entanto, questões não resolvidas de insuficiência crônica do enxerto, escassez contínua de doadores de órgãos e o aumento do uso de enxertos marginais exigem a melhoria dos conceitos atuais, como a implementação da perfusão de máquinas de órgãos. Para avaliar novos métodos de recondicionamento e modulação do enxerto, são necessários modelos translacionais. No que diz respeito às semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos e aos recentes progressos no campo do xenotransplante, os porcos tornaram-se a principal espécie animal de grande porte usada em modelos de transplante. Após a introdução inicial de um modelo de transplante de fígado ortotópico suíno por Garnier et al. em 1965, várias modificações foram publicadas nos últimos 60 anos.
Devido a características anatômicas específicas de especificações, um bypass venovenoso durante a fase anhepática é considerado uma necessidade para reduzir a congestão intestinal e a isquemia, resultando em instabilidade hemodinâmica e mortalidade perioperatória. No entanto, a implementação de um desvio aumenta a complexidade técnica e logística do procedimento. Além disso, complicações associadas, como embolia aérea, hemorragia e necessidade de esplenectomia simultânea, foram relatadas anteriormente.
Neste protocolo, descrevemos um modelo de transplante hepático ortotópico suíno sem o uso de bypass venovenoso. O enxerto de fígados de doadores após armazenamento a frio estático de 20 h - simulando condições de doador com critérios estendidos - demonstra que essa abordagem simplificada pode ser realizada sem alterações hemodinâmicas significativas ou mortalidade intraoperatória e com captação regular da função hepática (conforme definido pela produção biliar e metabolismo hepático específico do CYP1A2). O sucesso dessa abordagem é assegurado por uma técnica cirúrgica otimizada e um sofisticado volume anestesiológico e manejo vasopressor.
Esse modelo deve ser de especial interesse para grupos de trabalho com foco no curso pós-operatório imediato, lesão de isquemia-reperfusão, mecanismos imunológicos associados e recondicionamento de órgãos doadores de critérios estendidos.
Introduction
O transplante de fígado continua a ser a única chance de sobrevivência em uma variedade de doenças diferentes que levam à insuficiência hepática aguda ou crônica. Desde sua primeira aplicação bem-sucedida na humanidade, em 1963, por Thomas E. Starzl, o conceito de transplante hepático evoluiu para uma opção de tratamento confiável aplicada em todo o mundo, principalmente como resultado dos avanços na compreensão do sistema imunológico, do desenvolvimento da imunossupressão moderna e da otimização dos cuidados perioperatórios e das técnicas cirúrgicas 1,2 . No entanto, o envelhecimento populacional e a maior demanda por órgãos resultaram na escassez de doadores, com o aumento do uso de enxertos marginais de doadores de critérios estendidos e o surgimento de novos desafios nas últimas décadas. Acredita-se que a introdução e a implementação generalizada da perfusão de máquinas de órgãos abram um leque de possibilidades no que diz respeito ao recondicionamento e modulação do enxerto e ajudem a mitigar a escassez de órgãos e reduzir a mortalidade na lista de espera 3,4,5,6.
Para avaliar esses conceitos e seus efeitos in vivo, são necessários modelos de transplante translacional7. Em 1983, Kamada et al. introduziram um modelo eficiente de transplante ortotópico de fígado em ratos que desde então tem sido extensivamente modificado e aplicado por grupos de trabalho em todo o mundo 8,9,10,11. O modelo de transplante hepático ortotópico em camundongos é tecnicamente mais exigente, mas também mais valioso em termos de transferibilidade imunológica, e foi relatado pela primeira vez em 1991 por Qian et al.12. Apesar das vantagens em relação à disponibilidade, bem-estar animal e custos, os modelos de roedores são limitados em sua aplicabilidade em ambientes clínicos7. Por isso, são necessários modelos animais de grande porte.
Nos últimos anos, os porcos tornaram-se a principal espécie animal usada para pesquisa translacional devido às suas semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos. Além disso, o progresso atual no campo do xenotransplante pode aumentar ainda mais a importância dos suínos como objetos de pesquisa13,14.
Garnier et al. descreveram um modelo de transplante hepático em suínos já em 196515. Vários autores, incluindo Calne et al., em 1967, e Chalstrey et al., em 1971, posteriormente relataram modificações, levando a um conceito seguro e viável de transplante experimental de fígado suíno nas décadas seguintes 16,17,18,19,20,21.
Mais recentemente, diferentes grupos de trabalho têm fornecido dados sobre questões atuais no transplante hepático utilizando uma técnica de transplante hepático ortotópico suíno, quase invariavelmente incluindo um veno-venoso ativo ou passivo, ou seja, porto-caval, bypass19,22. A razão para isso é uma intolerância específica da espécie ao pinçamento da veia cava inferior e da veia porta durante a fase anhepática devido a um intestino comparativamente maior e menos shunts porto-caval ou cavo-caval (por exemplo, falta de uma veia ázigos), resultando em aumento da morbidade e mortalidade perioperatória23. As técnicas de transplante poupador de veia cava inferior aplicadas em receptores humanos como alternativa não são viáveis, pois a veia cava inferior suína é envolta por tecido hepático23.
No entanto, o uso de um bypass venovenoso aumenta ainda mais a complexidade técnica e logística em um procedimento cirúrgico já exigente, possivelmente impedindo que os grupos de trabalho tentem a implementação do modelo completamente. Além dos efeitos fisiológicos e imunológicos diretos de um bypass, alguns autores têm apontado a morbidade significativa, como perda de sangue ou embolia aérea durante a colocação do shunt e a necessidade de uma esplenectomia simultânea, potencialmente afetando os resultados de curto e longo prazo após o enxerto24,25.
O protocolo a seguir descreve uma técnica simples de transplante hepático ortotópico suíno após armazenamento a frio estático de órgãos de doadores por 20 h, representando condições de doador de critérios estendidos sem o uso de bypass venovenoso durante o enxerto, incluindo captação de fígado do doador, preparo da mesa de fundo, hepatectomia do receptor e manejo anestesiológico pré e intraoperatório.
Esse modelo deve ser de especial interesse para grupos de trabalho cirúrgicos com foco no curso pós-operatório imediato, lesão de isquemia-reperfusão, recondicionamento de órgãos doadores de critérios estendidos e mecanismos imunológicos associados.
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Protocol
Este estudo foi realizado no Laboratório de Zootecnia da Faculdade de Medicina de Hannover após aprovação pela autoridade regional da Baixa Saxónia para a proteção dos consumidores e a segurança alimentar (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146)
1. Colheita de fígado do doador
NOTA: Os doadores de fígado eram fêmeas de porcos domésticos (Sus scrofa domesticus), com idade entre 4 e 5 meses de idade e com peso corporal médio de aproximadamente 50 kg, que já estavam em quarentena no centro de pesquisa animal por um mínimo de 10 dias antes da cirurgia.
- Realizar pré-medicação por injeção intramuscular de atropina (0,04-0,08 mg/kg de peso corporal), zolazepam (5 mg/kg de peso corporal) e tiletamina (5 mg/kg de peso corporal). Depois de estabelecer um acesso intravenoso (por exemplo, veia da orelha) induza a anestesia com uma injeção de propofol (1,5 - 2,5 mg/kg de peso corporal).
- Realizar a intubação com um tubo endotraqueal de 8,0-8,5 mm, dependendo do tamanho e anatomia do animal. Estabelecer monitoramento de eletrocardiografia, medição de gases respiratórios e saturação periférica de oxigênio e medição não invasiva da pressão arterial.
- Manter a anestesia em suínos durante a captação hepática do doador através da inalação de isoflurano (0,8-1,5 vol%) e aplicação intravenosa de fentanil (0,003-0,007 mg/kg de peso corporal). Realize ventilação controlada por volume durante todo o procedimento.
- Após a colocação do porco doador em decúbito dorsal e fixação dos membros na base da mesa de operação com faixas elásticas, esfregue a pele com agente antisséptico, por exemplo, iodopovidona ou álcool isopropílico, e cubra o animal com cortinas estéreis.
- Confirme uma profundidade adequada da anestesia pela perda da resposta de abstinência à beliscação do dedo do pé. Realizar uma laparotomia de linha média começando no processo xifoide usando cauterização monopolar. Coloque um afastador abdominal e mobilize o intestino à direita do doador.
- Realize uma esplenectomia por dissecção do ligamento esplenocólico, do ligamento gastroesplênico e do ligamento frenicospênico. Aperte a veia esplênica e a artéria esplênica perto do hilo esplênico com um grampo Overholt e coloque ligaduras (sutura de polifilamento 3-0) após cortar os vasos. Sever vasos adicionais (menores) por pinça bipolar ou por ligadura.
NOTA: Uma esplenectomia durante a captação hepática do doador não é obrigatória, mas reduz o efluxo de sangue durante e após a perfusão. - Mobilize o intestino para o lado esquerdo do doador e corte o ligamento falciforme e os ligamentos triangulares usando tesoura e cauterização bipolar.
- Após dissecção suficiente do fígado, incise a porção esquerda do diafragma a uma distância de 5-10 cm usando tesoura para localizar o segmento torácico da aorta descendente. Envolva e coloque uma ligadura (sutura de polifilamento 3-0) sem apertar.
- Incidir a porção direita do diafragma a uma distância de 5-10 cm usando tesoura e identificar a veia cava supra-hepática inferior.
- Realoque o intestino para o canto superior esquerdo do doador e entre no espaço retroperitoneal por incisão transversal do peritônio a uma distância de 5-10 cm usando uma tesoura.
- Localize a aorta abdominal e a veia cava inferior logo acima da bifurcação ilíaca e separe ambos os vasos em um comprimento de aproximadamente 6 cm. Coloque duas ligaduras de polifilamento 3-0 ao redor da aorta abdominal: uma craniana da bifurcação ilíaca e outra de aproximadamente 3 cm cranialmente, sem apertar. Coloque outra ligadura ao redor da veia cava intra-hepática inferior sem apertar.
- Injetar heparina por via intravenosa (25.000 I.E.). Escolha uma cânula apropriada e desareje a linha de gotejamento com solução de preservação resfriada.
- Aperte a primeira ligadura localizada caudalmente ao redor da aorta abdominal. Depois de ocluir a aorta abdominal cranialmente da segunda ligadura (manualmente ou colocando uma braçadeira vascular atraumática), faça uma incisão transversal entre ambas as ligaduras usando uma tesoura.
- Insira a cânula na incisão e prenda-a com a ligadura restante. Severar a veia cava inferior supra-hepática muito cranialmente (perto do átrio direito) usando tesoura.
- Após perda de sangue de aproximadamente 1.500-2.000 mL, pinça cruzada do segmento torácico da aorta descendente amarrando a ligadura e inicie a perfusão anterógrada.
NOTA: Para a possível necessidade de sangue (transfusões) durante o enxerto ou para a perfusão normotérmica da máquina, o sangue total (aproximadamente 1.500 mL) pode ser coletado usando um recipiente contendo anticoagulante à base de citrato. - Aperte a ligadura colocada ao redor da veia cava infra-hepática inferior, incise o vaso cranialmente da ligadura e insira um aspirador cirúrgico. Injete uma dose letal de pentobarbital sódico (5.000 mg). Coloque gelo estéril esmagado na cavidade torácica e abdominal sem comprometer o tecido hepático.
- Após perfusão com 3.500 mL de solução de preservação ao longo de um curso de aproximadamente 10-15 min, corte a veia cava supra-hepática incisada inferior. Severar a veia cava infra-hepática inferior ao nível da veia renal esquerda.
- Separar o ducto biliar craniano do tecido pancreático entre duas ligaduras (polifilamento 3-0) para evitar o derramamento biliar. Cortar a veia porta craniana do pâncreas.
- Localize a artéria celíaca após uma preparação contundente e siga dorsalmente até a aorta abdominal. Excisar o respectivo segmento aórtico para criar um remendo para enxerto posterior.
- Excise o diafragma ao redor da veia cava supra-hepática inferior e corte as aderências remanescentes usando tesoura. Extraia o fígado.
- Realize uma colecistectomia ou aperte uma ligadura ao redor do ducto cístico e lave o ducto biliar comum com pelo menos 20 mL de solução de preservação. Coloque a cânula de perfusão na veia porta e lave o enxerto com mais 500 mL de solução de preservação. Coloque o enxerto em uma tigela estéril colocada no gelo.
NOTA: Dependendo do objetivo científico, o órgão pode ser imediatamente preparado para enxerto ou mantido no gelo por um período indefinido de tempo (20 h neste protocolo) antes de iniciar a preparação e o enxerto da mesa de fundo.
2. Preparação da mesa traseira do fígado
- Remover o tecido linfático começando no segmento aórtico e, assim, identificar e ocluir os ramos do lado arterial e vasos linfáticos com clipes, ligaduras (polifilamento 4-0) ou suturas (monofilamento 5-0; Figura 1A). Da mesma forma, remova o tecido linfático ao redor da veia porta e oclua os ramos laterais com suturas (monofilamento 5-0).
- Identifique a veia cava supra-hepática inferior e coloque suturas ao redor de ambas as veias diafragmáticas (monofilamento 5-0) após a remoção do tecido diafragmático circundante. Lave todos os recipientes com solução salina fria ou solução de preservação para identificar quaisquer vazamentos restantes. Realizar o encurtamento dos vasos e a preparação do remendo aórtico somente após o enxerto para levar em conta as circunstâncias anatômicas individuais.
3. Hepatectomia receptora, enxerto hepático do doador e manejo perioperatório
NOTA: Como receptoras de fígado, foram utilizadas fêmeas de porcos domésticos (Sus scrofa domesticus) com idade entre 4 e 5 meses e com peso corporal médio de aproximadamente 50 kg. Analogamente aos doadores de fígado, os receptores estavam em quarentena no centro de pesquisa animal por um mínimo de 10 dias antes do transplante.
- Anestesia e manejo perioperatório
- Realizar pré-medicação por injeção intramuscular de atropina (0,04-0,08 mg/kg de peso corporal), zolazepam (5 mg/kg de peso corporal) e tiletamina (5 mg/kg de peso corporal). Depois de estabelecer um acesso intravenoso (por exemplo, veia da orelha), induza a anestesia com uma injeção de propofol (1,5-2,5 mg/kg de peso corporal).
- Realizar a intubação com um tubo endotraqueal de 8,0-8,5 mm, dependendo do tamanho e anatomia do animal. Estabelecer monitoramento de eletrocardiografia, medição de gases respiratórios e saturação periférica de oxigênio e medição não invasiva da pressão arterial. No caso de um modelo crônico, aplique pomada ocular para evitar o ressecamento após a intervenção cirúrgica.
- Colocar o animal receptor numa base de aquecimento em decúbito dorsal e fixar os membros na base da mesa de operação com elásticos.
- Para monitoramento prolongado, sob orientação ultrassonográfica, coloque um cateter venoso central de três lúmens e um cateter venoso de grande diâmetro (7 Fr.) na veia jugular interna e um cateter venoso de grande diâmetro (7 Fr.) para terapia de volume. Além disso, inserir um cateter arterial na artéria carótida/cervical interna sob controle ultrassonográfico para aferição invasiva da pressão arterial (Figura 1B).
- Manter a anestesia durante a recuperação do órgão através da inalação de isoflurano (0,8-1,5 vol%) e aplicação intravenosa de fentanil (0,003-0,007 mg/kg de peso corporal). Realize ventilação controlada por volume durante todo o procedimento. Aplicar 2.000 mg de sultamicilina para antibiose perioperatória e 250 mg de metilprednisolona por via intravenosa.
- Administrar um vasopressor como a norepinefrina por via intravenosa para atingir uma pressão arterial média alvo de 60 mmHg. Além disso, aplique soluções cristaloides, como a solução de lactato de Ringer ou soluções coloides, como gelatinas fluidas, se necessário.
- Aplicar gluconato de cálcio (10%) e bicarbonato de sódio (8,4%), glicose (40%) ou cloreto de potássio (7,45%) por via intravenosa em relação às análises de gases sanguíneos obtidas a cada 30 min.
- Hepatectomia receptora
- Esfregue a pele com agente antisséptico, por exemplo, iodopovidona ou álcool isopropílico, e cubra o animal com cortinas estéreis.
- Confirme uma profundidade adequada da anestesia pela perda da resposta de abstinência à beliscação do dedo do pé. Realizar uma laparotomia de linha média começando no processo xifoide usando cauterização monopolar. Coloque um afastador abdominal e mobilize o intestino à esquerda do doador. Cubra o intestino com um pano umedecido.
- Coloque um cateter urinário suprapúbico para a otimização do manejo do volume intraoperatório.
- Corte o ligamento falciforme e os ligamentos triangulares usando tesoura e cauterização bipolar. Após dissecção suficiente do fígado, circunde as veias cavas supra-hepática e infra-hepática inferior perto do parênquima hepático.
- Dissecar e cortar o ducto biliar comum abaixo da junção do ducto cístico entre duas ligaduras (polifilamento 3-0).
- Incidir a camada peritoneal superficial que cobre o ligamento hepatoduodenal e identificar as artérias hepáticas pouco antes de entrar no parênquima hepático. Dissecar usando cauterização bipolar ou a colocação de clipes, ligaduras ou suturas.
- Dissecar a aorta abdominal por incisão na linha média (camada avascular) dos músculos diafragmáticos direito e esquerdo. Prepare a aorta para a anastomose aórtica pela remoção do tecido circundante.
NOTA: Esta etapa só é necessária se uma anastomose aórtica for realizada. Caso contrário, disseque ainda mais a artéria hepática/a região hilar para se preparar para uma anastomose convencional de ponta a ponta entre as artérias hepáticas doadora e receptora. - Realizar hepatectomia receptora colocando um grampo vascular atrauracático na veia porta, seguido de pinças vasculares atraumáticas na veia cava supra-hepática inferior (incluindo o diafragma circundante enquanto retrai caudalmente o fígado) e na veia cava infra-hepática inferior.
- Sever todos os três vasos perto do parênquima hepático. Remova o fígado receptor da cavidade abdominal.
NOTA: O aperto dos vasos marca o início da fase anhepática. Durante a fase anhepática, os porcos são hemodinamicamente instáveis e necessitam de quantidades relevantes de vasopressores/catecolaminas. O anestesiologista deve estar preparado para aplicar norepinefrina e epinefrina. Mantenha a fase até a reperfusão do fígado o mais curto possível. Comunique-se bem com o anestesiologista.
- Enxerto hepático do doador
- Coloque o fígado do doador na cavidade abdominal. Encurtar a veia cava supra-hepática do doador e/ou receptor inferior a um comprimento adequado, evitando torções ou muita tensão na anastomose.
- Coloque uma única sutura como fio de suporte (monofilamento 5-0), adaptando o canto direito da veia cava supra-hepática do doador e do receptor inferior. Comece o lado dorsal da anastomose a partir do canto esquerdo do(s) vaso(s) com uma sutura em execução (monofilamento 5-0, de braço duplo).
- Ao chegar ao canto direito, remova o fio de suporte, prenda a sutura de corrida com uma braçadeira e continue com o lado ventral da anastomose, novamente começando pelo canto esquerdo do(s) vaso(s). Aperte a sutura com múltiplos nós sem contrair o diâmetro do vaso para evitar estenose.
- Encurte a veia porta do doador e/ou receptor para um comprimento adequado, evitando torções ou muita tensão na anastomose.
- Realizar uma anastomose vascular da veia porta doadora e receptora análoga aos passos 3.3.2-3.3.3 usando uma sutura de monofilamento 6-0, de braço duplo.
- Realizar a reperfusão portovenosa removendo a braçadeira vascular, ocluindo a veia porta receptora, e ocluir a veia cava infra-hepática inferior do doador com pinça vascular após drenar aproximadamente 200-400 mL de sangue. Remova lentamente a pinça vascular que oclui a veia cava supra-hepática inferior receptora e procure sangramento ativo.
NOTA: A remoção de ambos os grampos marca o fim da fase anhepática. A quantidade de catecolaminas necessárias deve diminuir significativamente logo em seguida. - Encurtar a veia cava infra-hepática inferior do doador e/ou receptor. Realizar uma anastomose vascular das veias cavas infra-hepáticas doadoras e receptoras inferiores análogas aos passos 3.3.2-3.3.3 usando uma sutura de monofilamento 5-0 de braço duplo. Remova os grampos que ocluem as veias cavas infra-hepáticas inferiores do doador e do receptor.
- Prepare um adesivo aórtico elíptico (adesivo de Carrel) com um diâmetro de aproximadamente 1-1,5, cm, dependendo das circunstâncias anatômicas, usando uma tesoura. Campe a aorta abdominal com um grampo vascular de Cooley atraumática e faça uma incisão usando um bisturi. Aumente a incisão usando uma tesoura para encaixar o adesivo.
- Inicie a anastomose aórtica com uma sutura corrente (monofilamento 6-0, braço duplo) no canto craniano da incisão/mancha. Ao chegar ao canto caudal, prenda a sutura de corrida com uma braçadeira e complete a anastomose novamente começando no canto craniano. Aperte a sutura com vários nós e remova lentamente a braçadeira vascular.
NOTA: O pinçamento da aorta abdominal afetará significativamente a pressão arterial do porco. Comunique-se bem com o anestesiologista. - Coloque uma gaze hemostática ao redor da anastomose arterial. Coloque um cateter no ducto biliar comum e prenda-o com uma única ligadura. Certifique-se de não ocluir o diâmetro do cateter.
- Feche o abdômen temporariamente, adaptando a fáscia muscular e a pele com uma sutura corrente e cubra o abdômen com filme aderente e / ou cortinas para evitar a perda térmica.
NOTA: Se os objetivos científicos exigirem um modelo crônico, realizar uma anastomose de ponta a ponta entre o ducto biliar doador e receptor, fechar o abdômen com suturas de corrida separadas para o peritônio e a fáscia muscular e fechar a pele com suturas únicas. - No final do acompanhamento, injete uma dose letal de 5.000 mg de pentobarbital sódico para eutanásia intraoperatória.
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Representative Results
A técnica apresentada neste protocolo proporcionou resultados confiáveis e reprodutíveis em termos de estabilidade hemodinâmica e sobrevida animal ao longo do procedimento, bem como função do enxerto no pós-operatório.
Mais recentemente, aplicamos o modelo para o estudo da lesão de isquemia-reperfusão e intervenções terapêuticas mitigando efeitos prejudiciais no pós-operatório imediato. Após a recuperação e 20 h de armazenamento a frio estático, enxertos hepáticos (com peso médio de 983,38 g) foram implantados da maneira descrita. Os experimentos foram encerrados 6 h após reperfusão portal-venosa e amostragem de sangue e bile, bem como tecido hepático e ducto biliar em intervalos definidos. Todos os receptores sobreviveram ao enxerto e ao subsequente seguimento de 6 h sob anestesia geral até a eutanásia.
Como o foco deste protocolo reside na viabilidade de um modelo de transplante hepático ortotópico suíno sem o uso de um bypass venovenoso, os resultados aqui apresentados limitam-se aos parâmetros vitais intraoperatórios e à aplicação de vasopressores (Figura 2), bem como ao desempenho do enxerto, definido por parâmetros laboratoriais convencionais, ou seja, concentrações séricas de lactato, aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT) e glutamato desidrogenase (GLDH), produção biliar (Tabela 1) e o teste de capacidade de função máxima hepática (LiMAx), conforme descrito anteriormente em um modelo de ressecção hepática suína (Figura 3)26. O teste de LiMAx baseia-se no metabolismo em tempo real da metacetina 13C-metacetina injetada por via intravenosa pelo sistema CYP1A2 específico do fígado. Antes e após a injeção, a proporção de 13CO212CO2 no ar exalado é determinada para quantificar a função hepática individual27.
Como esperado, os receptores necessitaram de concentrações aumentadas de norepinefrina imediatamente antes e durante toda a fase anhepática, a fim de estabilizar a pressão arterial média (DAM) em ≥60 mmHg. Baixas concentrações de epinefrina foram usadas simultaneamente para aumentar adicionalmente o débito cardíaco neste período de tempo vulnerável. Após a reperfusão portal-venosa, a necessidade de vasopressores diminuiu rapidamente e ainda mais durante o pinçamento temporário da aorta abdominal para a conclusão da anastomose aórtica. Após o enxerto, a DMA e as doses necessárias de vasopressores permaneceram estáveis.
O tempo médio de operação, definido como o tempo desde a incisão cutânea até a conclusão de toda a anastomose vascular e reperfusão, foi de 103,50 min, incluindo uma fase anhepática média de 27,13 min. Vale ressaltar que apenas dois receptores foram submetidos a uma fase anhepática de mais de 30 min. Todos os receptores apresentaram concentrações séricas de lactato em declínio 4 h após a reperfusão venosa portal, e os valores de LiMAx obtidos 6 h após a reperfusão venosa portal foram comparáveis aos valores medidos nos doadores hepáticos antes da captação do órgão em todos, exceto um receptor (fase anhepática de 34 min).
Figura 1: Preparação do enxerto e do receptor. (A) A figura representa a preparação da mesa traseira do eixo celíaco e do segmento aórtico. (B) Esta figura mostra o receptor em decúbito dorsal com monitorização prolongada, incluindo cateter venoso central (azul) na veia jugular interna esquerda e cateter arterial (vermelho) na artéria carótida/cervical interna direita. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pressão arterial média e concentrações de vasopressores necessárias durante o enxerto. A figura representa a pressão arterial média (MAD em mmHg) medida e as concentrações de norepinefrina e epinefrina (em μg/kg/h) durante períodos de tempo definidos ao longo do procedimento em todos os oito receptores. Os valores são apresentados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Valores do teste de capacidade máxima de função hepática (LiMAx) obtidos dos doadores antes da captação hepática e dos receptores 6 h após o enxerto. A figura representa os dados do box plot (média e erro padrão da média) do teste da capacidade máxima de função hepática (LiMAx) dos doadores antes da captação hepática e dos receptores 6 h após o enxerto (n = 8). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Experimentar | Peso do enxerto | Peso do destinatário | GRWR | Tempo de operação | Fase anhepática | Lactato (mmol/L) | Pico AST | ALT de pico | Pico GLDH | Volume biliar | ||
| Não. | g) | (kg) | (%) | (mín) | (mín) | 2 h | 4 horas | 6 h | (U/L) | (U/L) | (U/L) | (mL) |
| 1 | 1082 | 48.8 | 2.22 | 115 | 25 | 5.8 | 4.7 | 3.7 | 677 | 122 | 39 | 48 |
| 2 | 946 | 51.4 | 1.84 | 125 | 34 | 6.6 | 5.9 | 5.2 | 1207 | 109 | 268 | 15 |
| 3 | 957 | 57.6 | 1.66 | 110 | 30 | 8.3 | 5.8 | 8.1 | 742 | 125 | 143 | 73 |
| 4 | 825 | 49.2 | 1.68 | 87 | 22 | 7.6 | 6.7 | 6.5 | 675 | 99 | 113 | 35 |
| 5 | 1045 | 53.4 | 1.96 | 101 | 25 | 7.9 | 6.8 | 5.6 | 919 | 86 | 129 | 25 |
| 6 | 924 | 45.2 | 2.04 | 105 | 32 | 6.7 | 4.6 | 3.7 | 414 | 90 | 114 | 75 |
| 7 | 785 | 48.2 | 1.63 | 95 | 24 | 6.8 | 4.8 | 4.1 | 557 | 70 | 110 | 1.5 |
| 8 | 1303 | 54.6 | 2.39 | 90 | 25 | 12.7 | 12.2 | 9.8 | 1011 | 87 | 94 | 10 |
| SIGNIFICAR | 983.38 | 51.05 | 1.93 | 103.50 | 27.13 | 7.80 | 6.44 | 5.84 | 775.25 | 98.50 | 126.25 | 35.31 |
| SEM | 57.59 | 1.41 | 0.10 | 4.57 | 1.52 | 0.76 | 0.88 | 0.78 | 90.79 | 6.73 | 23.00 | 9.87 |
Tabela 1: Variáveis do enxerto e do receptor perioperatórios. A tabela resume o peso do enxerto e do receptor, bem como a relação peso-receptor do enxerto para receptor (GRWR) e a duração da operação (incisão cutânea até a conclusão de todas as anastomoses vasculares e reperfusão) e da fase anhepática. Variáveis que indicam a função do enxerto, como parâmetros laboratoriais convencionais, ou seja, concentrações séricas de lactato, aspartato transaminase (AST), alanina transaminase (ALT) e glutamato desidrogenase (GLDH), e produção biliar são fornecidas para cada um dos oito transplantes realizados.
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Discussion
Desenvolvimentos técnicos recentes, como a introdução da perfusão mecânica, têm o potencial de revolucionar o campo do transplante de fígado. A fim de traduzir os conceitos de recondicionamento ou modificação do enxerto em ambientes clínicos, modelos de transplante reprodutíveis em animais de grande porte são inevitáveis.
Após a introdução inicial do transplante hepático ortotópico suíno, vários autores têm trabalhado no aprimoramento dessas técnicas nas últimas cinco décadas. As diferenças dentro das abordagens cirúrgicas relatadas são frequentemente menores e dizem respeito a anastomoses vasculares e biliares, anestesia e manejo perioperatório. No entanto, em contraste com a situação atual no transplante hepático clínico, em que o uso de bypass venovenoso ainda é comum, mas opcional 28, um bypass porto-caval ativo ou passivo durante a fase anhepática em suínos é considerado uma necessidade para reduzir a congestão intestinal e, assim, a isquemia intestinal subsequente com instabilidade hemodinâmica e mortalidade perioperatória, conforme descrito em um trabalho bem elaborado de Esmaeilzadeh et al.25.
Além dos custos adicionais implicados e dos desafios técnicos de um bypass venovenoso, por exemplo, cateteres, um dispositivo de bomba, a necessidade de anticoagulação adicional e possíveis complicações, como embolia aérea ou hemorragia, e dependendo da abordagem escolhida, a necessidade de uma esplenectomia simultânea levou os grupos a descrever técnicas modificadas sem bypass venovenoso25,29, 30.
Torres et al.31 observaram grave instabilidade hemodinâmica em animais submetidos a enxerto sem o uso de bypass venovenoso em comparação com receptores com shunt porto-caval passivo e, assim, realizaram pinçamento temporário da aorta supracelíaca nesses animais, o que também foi descrito por outros em modelos de auto-/alotransplante hepático suíno 23,31,32 . No entanto, a indução de isquemia quente por pinçamento cruzado da aorta receptora acarreta o risco de liberação relevante de moléculas pró-inflamatórias e danos teciduais na reperfusão e, portanto, deve ser evitada a todo custo, a fim de produzir resultados científicos confiáveis, especialmente quando se avalia a lesão de isquemia-reperfusão. Além disso, essa abordagem não se assemelha à prática clínica em humanos, o que, portanto, limita a tradução dos resultados obtidos nesses modelos.
Para evitar tais medidas de apoio prejudiciais, consideramos que dois pontos são cruciais. (1) A fase anhepática deve ser mantida no mínimo absoluto, ou seja, abaixo de 30 min, como já foi demonstrado nas fases iniciais do transplante hepático suíno por Battersby et al.33. Acreditamos que suturas de corrida (de braço duplo) e no máximo um fio de suporte são suficientes para criar uma anastomose simples e segura tanto para a veia cava supra-hepática inferior quanto para a veia porta. Obviamente, a reperfusão portal-venosa deve começar antes da anastomose da veia cava infra-hepática inferior. (2) O manejo anestésico deve ser realizado por um anestesiologista experiente, idealmente familiarizado com cirurgia hepática ou transplante em pacientes humanos34. O manejo sofisticado do volume e a terapia com vasopressores, ou seja, norepinefrina e epinefrina, em combinação com uma técnica cirúrgica simplificada, são a base para a implementação bem-sucedida desse modelo.
Curiosamente, apenas um pequeno número de grupos cirúrgicos forneceu dados sobre o transplante hepático ortotópico suíno bem-sucedido sem bypass venovenoso e pinçamento aórtico supracelíaco concomitante. Até onde sabemos, Oike et al., Heuer et al. e, mais recentemente, Fondevila et al. foram os únicos grupos a relatar seus resultados (promissores), com taxas de sobrevida de 87%, 80% e 100%, respectivamente35,36,37. A mediana do tempo anhepático em nossa coorte foi de 25 min e, portanto, idêntica aos dados apresentados por Heuer et al.36. Durante a fase anhepática, Oike et al.35 relataram uma redução de 50%-60% na pressão arterial, semelhante às observações feitas nesta coorte, levando ao aumento das doses de vasopressores para evitar uma diminuição da DMA abaixo de 60 mmHg. Heuer et al.36 não mencionaram o uso da terapia com catecolaminas em sua publicação, mas não mencionaram especificamente a transfusão de sangue total para melhorar a estabilidade hemodinâmica. Este último não era exigido neste modelo. Fondevila et al., que relataram um tempo anhepático médio inferior a 20 min, contaram apenas com a administração de soluções cristaloides e não aplicaram substâncias vasoativas durante o enxerto37.
Digno de nota, ao contrário de publicações recentes que aplicam anastomose de ponta a ponta do doador para a artéria hepática receptora19,22, esse modelo inclui uma anastomose de ponta a ponta com um remendo de Carrel da aorta doadora sendo anastomosado à aorta supracelíaca do receptor. Especialmente para ambientes experimentais, com o uso de órgãos que preencham critérios estendidos de doadores, por exemplo, tempo isquêmico frio prolongado, pode ser favorável descartar quaisquer problemas com a perfusão arterial do enxerto. A aplicação de um adesivo de Carrel ajudará a evitar a estenose da anastomose arterial que pode se tornar funcionalmente relevante no caso de vasoespasmos periféricos concomitantes frequentemente observados após a reperfusão. No entanto, essa abordagem será mais demorada do que a anastomose convencional de ponta a ponta devido ao acesso mais elaborado da aorta.
Como nossos experimentos representativos se concentraram na fase pós-operatória imediata e na lesão de isquemia-reperfusão, os receptores foram mantidos sob anestesia e eutanasiados 6 h após a reperfusão. Embora benéfica no que diz respeito ao bem-estar animal, esta constitui uma limitação significativa para a validação de nossa técnica quanto à sobrevivência do enxerto e do receptor. Acreditamos, no entanto, que, com base nos parâmetros vitais, hemodinâmica, depuração do lactato, produção biliar e, especialmente, no metabolismo do CYP1A2 específico do fígado em tempo real (teste LiMAx) observado ao longo do seguimento, a aplicação a longo prazo do nosso modelo deve ser viável, especialmente porque os enxertos utilizados nos experimentos foram submetidos a armazenamento a frio estático por 20 h de enxerto prévio, em contraste com a aplicação bem-sucedida de modelos de transplante comparáveis por outros35, 36,37. Além disso, os relatos prévios mencionados demonstraram que a mortalidade perioperatória foi observada exclusivamente durante e até 6 h após a cirurgia, com exceção de um receptor que morreu de embolia pulmonar no primeiro dia de pós-operatório no estudo de Oike et al.35.
Neste trabalho, demonstramos que uma abordagem simplificada do transplante hepático ortotópico suíno sem o uso de bypass venovenoso durante o enxerto pode ser realizada com segurança e é mais custo-efetiva, sem alterações hemodinâmicas significativas ou mortalidade intraoperatória mesmo após armazenamento a frio estático prolongado do órgão doador. Tal modelo deve ser de especial interesse para grupos de trabalho (cirúrgicos) com foco no curso pós-operatório imediato, lesão de isquemia-reperfusão, recondicionamento de órgãos doadores de critérios estendidos e mecanismos imunológicos associados.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Britta Trautewig, Corinna Löbbert, Astrid Dinkel e Ingrid Meder por sua diligência e comprometimento. Além disso, os autores agradecem a Tom Figiel por produzir o material da imagem.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abdominal retractor | No Company Name available | No Catalog Number available | |
| Aortic clamp, straight | Firma Martin | No Catalog Number available | |
| Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL | Radiometer Medical ApS | 956-622 | |
| Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL) | B.Braun | 648037 | |
| Backhaus clamp | Bernshausen | BF432 | |
| Bipolar forceps, 23 cm | SUTTER | 780222 SG | |
| Bowl 5 L, 6 L, 9 L | Chiru-Instrumente | 35-114327 | |
| Braunol Braunoderm | B.Braun | 3881059 | |
| Bulldog clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Button canula | Krauth + Timmermann GmbH | 1464LL1B | |
| Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%)) | B.Braun | 2353745 | |
| Cell Saver (Autotransfusion Reservoir) | Fresenius Kabi AG | 9108471 | |
| Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm | Arrow | AD-24703 | |
| Clamp | INOX | B-17845 / BH110 / B-481 | |
| Clamp | Aesculap | AN909R | |
| Clamp, 260 mm | Fehling Instruments GMbH &Co.KG | ZAU-2 | |
| Clip Forceps, medium | Ethicon | LC207 | |
| Clip forceps, small | Ethicon | LC107 | |
| CPDA-1 solution | Fresenius Kabi AG | 41SD09AA00 | |
| Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution) | Dr.Franz Köhler Chemie GmbH | 2125921 | |
| Dissecting scissors | LAWTON 05-0641 | No Catalog Number available | |
| Dissecting scissors, 180 mm | Metzenbaum | BC606R | |
| Endotracheal tube 8.0 mm | Covetrus | 800764 | |
| Epinephrine (Adrenalin 1:1000) | InfectoPharm | 9508734 | |
| Falcon Tubes 50ml | Greiner | 227 261 L | |
| Femoralis clamp | Ulrich | No Catalog Number available | |
| Fentanyl 0.1mg | PanPharma | 00483 | |
| Forceps, anatomical | Martin | 12-100-20 | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD052R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD032R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD240R | |
| Forceps, surgical | Bernshausen | BD 671 | |
| Forceps, surgical | INOX | B-1357 | |
| G40 solution | Serag Wiessner | 10755AAF | |
| Gelafundin ISO solution 40 mg/mL | B. Braun | 210257641 | |
| Guidewire with marker | Arrow | 14F21E0236 | |
| Haemostatic gauze ("Tabotamp" 5 x 7.5 cm) | Ethicon | 474273 | |
| Heparin sodium 25,000IE | Ratiopharm | W08208A | |
| Hico-Aquatherm 60 | Hospitalwerk | No Catalog Number available | |
| Infusion Set Intrafix | B.Braun | 4062981 L | |
| Intrafix SafeSet 180 cm | B.Braun | 4063000 | |
| Introcan Safety, 18 G | B.Braun | 4251679-01 | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-bore venous catheter, 7Fr. | Edwards Lifesciences | I301F7 | |
| Ligaclip, medium | Ethicon | LT200 | |
| Ligaclip, small | Ethicon | LT100 | |
| Material scissors | Martin | 11-285-23 | |
| Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg) | Sanofi | 7823704 | |
| Monopolar ERBE ICC 300 | Fa. Erbe | No Catalog Number available | |
| NaCl solution (0.9%) | Baxter | 1533 | |
| Needle holder | Aesculap | BM36 | |
| Needle holder | Aesculap | BM035R | |
| Needle holder | Aesculap | BM 67 | |
| Neutral electrode | Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen | 21191 - 060 | |
| Norepinephrine (Sinora) | Sintetica GmbH | 04150124745717 | |
| Omniflush Sterile Filed 10 mL | B.Braun | 3133335 | |
| Original Perfusorline 300 cm | B.Braun | 21E26E8SM3 | |
| Overhold clamp | INOX | BH 959 | |
| Overhold clamp | Ulrich | CL 2911 | |
| Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL) | WDT, Garbsen | 21217 | |
| Perfusers | B.Braun | 49-020-031 | |
| Perfusor Syringe 50 mL | B.Braun | 8728810F | |
| Petri dishes 92 x 17 mm | Nunc | 150350 | |
| Poole Suction Instrument Argyle flexibel | Covidien, Mansfield USA | 20C150FHX | |
| Potassium chloride (7.45%) | B.Braun | 4030539078276 | |
| Pressure measurement set | Codan pvb Medical GmbH | 957179 | |
| Propofol (1%) | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| S-Monovette 2.6 mL K3E | Sarstedt | 04.1901 | |
| S-Monovette 2.9 mL 9NC | Sarstedt | 04.1902 | |
| S-Monovette 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 11602 | |
| Sartinski clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Scalpel No.11 | Feather Safety Razor Co.LTD | 02.001.40.011 | |
| Scissors | INOX | BC 746 | |
| Seldinger Arterial catheter | Arrow | SAC-00520 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | B.Braun | 212768082 | |
| Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC") | B.Braun | 4899719 | |
| Sterofundin ISO solution | B.Braun | No Catalog Number available | |
| Suction | Dahlhausen | 07.068.25.301 | |
| Suction Aesculap Securat 80 | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Suction catheter | ConvaTec | 5365049 | |
| Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam) | Pfizer | DL253102 | |
| Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm | ConvaTec | UK 1F02772 | |
| Suprasorb ("Toptex lite RK") | Lohmann & Rauscher | 31654 | |
| Suture Vicryl 3-0 | Ethicon | VCP 1218 H | |
| Suture Vicryl 4-0 | Ethicon | V392H | |
| Suture, Prolene 4-0 | Ethicon | 7588 H | |
| Suture, Prolene 5-0, double armed | Ethicon | 8890 H | |
| Suture, Prolene 5-0, single armed | Ethicon | 8720 H | |
| Suture, Prolene 6-0, double armed | Ethicon | 7230 H | |
| Suture, Prolene 6-0, single armed | Ethicon | EH 7406 H | |
| Suture, Prolene: blau 3-0 | Ethicon | EH 7499H | |
| Suture, Safil 2/0 | Aesculap | C 1038446 | |
| Suture, Terylene 0 | Serag Wiessner | 353784 | |
| Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | B.Braun | 4606027V | |
| TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm | Fresenius Kabi AG | 2877101 | |
| Ultrasound Butterfly IQ+ | Butterfly Network Inc. | 850-20014 | |
| Ventilator "Oxylog Dräger Fl" | Dräger Medical AG | No Catalog Number available | |
| Yankauer Suction | Medline | RA19GMD | |
| Zoletil 100 mg/mL (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin) | Virbac | 794-861794861 |
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