Summary
В данном протоколе описана модель ортотопической трансплантации печени свиней после статического холодного хранения донорских органов в течение 20 ч без применения вено-венозного шунтирования при приживлении. Подход использует упрощенную хирургическую технику с минимизацией печеночной фазы и сложным объемным и вазопрессорным управлением.
Abstract
Трансплантация печени считается золотым стандартом для лечения различных смертельных заболеваний печени. Однако нерешенные проблемы хронической недостаточности трансплантата, продолжающейся нехватки доноров органов и более широкого использования маргинальных трансплантатов требуют улучшения современных концепций, таких как внедрение машинной перфузии органов. Для оценки новых методов восстановления и модуляции трансплантата требуются трансляционные модели. Что касается анатомического и физиологического сходства с человеком и недавнего прогресса в области ксенотрансплантации, свиньи стали основными крупными видами животных, используемыми в моделях трансплантации. После первоначального введения ортотопической модели трансплантации печени свиней Garnier et al. в 1965 году, за последние 60 лет было опубликовано несколько модификаций.
Из-за специфических анатомических признаков вено-венозное шунтирование во время печеночной фазы рассматривается как необходимость уменьшения кишечной застойки и ишемии, приводящих к гемодинамической нестабильности и периоперационной смертности. Однако внедрение обхода увеличивает техническую и логистическую сложность процедуры. Кроме того, ранее сообщалось о сопутствующих осложнениях, таких как воздушная эмболия, кровоизлияние и необходимость одновременной спленэктомии.
В этом протоколе описана модель ортотопической трансплантации печени свиней без применения вено-венозного шунтирования. Приживление донорской печени после статического холодного хранения в течение 20 ч - моделирование расширенных критериев донорских условий - демонстрирует, что этот упрощенный подход может быть выполнен без значительных гемодинамических изменений или интраоперационной смертности и с регулярным поглощением функции печени (как определено производством желчи и специфическим для печени метаболизмом CYP1A2). Успех этого подхода обеспечивается оптимизированной хирургической техникой и сложным анестезиологическим объемом и управлением вазопрессорами.
Эта модель должна представлять особый интерес для рабочих групп, специализирующихся на немедленном послеоперационном течении, ишемии-реперфузионном повреждении, связанных иммунологических механизмах и восстановлении расширенных критериев донорских органов.
Introduction
Трансплантация печени остается единственным шансом на выживание при различных заболеваниях, приводящих к острой или хронической печеночной недостаточности. С момента своего первого успешного применения в человечестве в 1963 году Томасом Э. Старзлом концепция трансплантации печени превратилась в надежный вариант лечения, применяемый во всем мире, главным образом в результате достижений в понимании иммунной системы, развития современной иммуносупрессии и оптимизации периоперационного ухода и хирургических методов 1,2 . Однако старение населения и более высокий спрос на органы привели к нехватке доноров, с более широким использованием маргинальных трансплантатов от доноров с расширенными критериями и появлением новых проблем в последние десятилетия. Считается, что внедрение и широкое внедрение машинной перфузии органов открывает широкий спектр возможностей в отношении восстановления и модуляции трансплантата и помогает смягчить нехватку органов и снизить смертность в листе ожидания 3,4,5,6.
Для того чтобы оценить эти понятия и их эффекты in vivo, необходимы трансляционные модели трансплантации7. В 1983 году Kamada et al. представили эффективную ортотопическую модель трансплантации печени у крыс, которая с тех пор была широко модифицирована и применена рабочими группами по всему миру 8,9,10,11. Ортотопическая модель трансплантации печени у мышей технически более требовательна, но также более ценна с точки зрения иммунологической переносимости, и впервые была зарегистрирована в 1991 году Qian et al.12. Несмотря на преимущества в отношении доступности, благополучия животных и затрат, модели грызунов ограничены в их применимости в клинических условиях7. Следовательно, требуются модели крупных животных.
В последние годы свиньи стали основным видом животных, используемым для трансляционных исследований из-за их анатомического и физиологического сходства с людьми. Кроме того, текущий прогресс в области ксенотрансплантации может еще больше повысить важность свиней как объектов исследования13,14.
Garnier et al. описали модель трансплантации печени у свиней еще в 1965году 15. Несколько авторов, в том числе Calne et al. в 1967 году и Chalstrey et al. в 1971 году, впоследствии сообщили об изменениях, что в конечном итоге привело к безопасной и осуществимой концепции экспериментальной трансплантации печени свиней в течение десятилетий, которые последовали за 16,17,18,19,20,21.
Совсем недавно различные рабочие группы представили данные о текущих проблемах трансплантации печени с использованием метода ортотопической трансплантации печени свиней, почти всегда включающего активную или пассивную вено-венозную, т.е. порто-каваль, шунтирование19,22. Причиной этого является видоспецифическая непереносимость пережатия нижней полой вены и воротной вены во время печеночной фазы из-за сравнительно большей кишки и меньшего количества порто-кавальных или каво-кавальных шунтов (например, отсутствие азигосной вены), что приводит к увеличению периоперационной заболеваемости и смертности23. Методы трансплантации полой вены, применяемые у людей-реципиентов в качестве альтернативы, неосуществимы, поскольку нижняя полая вена свиньи заключена в печеночную ткань23.
Тем не менее, использование вено-венозного шунтирования еще больше увеличивает техническую и логистическую сложность в и без того сложной хирургической процедуре, что, возможно, мешает рабочим группам пытаться реализовать модель в целом. Помимо прямых физиологических и иммунологических эффектов шунтирования, некоторые авторы указали на значительную заболеваемость, такую как кровопотеря или воздушная эмболия во время установки шунта, и необходимость одновременной спленэктомии, потенциально влияющей на краткосрочные и долгосрочные результаты после приживления24,25.
Следующий протокол описывает простую технику ортотопической трансплантации печени свиней после статического холодного хранения донорских органов в течение 20 ч, представляющую расширенные критерии донорских состояний без использования вено-венозного шунтирования во время приживления, включая закупку донорской печени, подготовку закулисного стола, гепатэктомию реципиента и анестезиологическое пред- и интраоперационное лечение.
Эта модель должна представлять особый интерес для хирургических рабочих групп, ориентированных на непосредственное послеоперационное течение, ишемию-реперфузионное повреждение, восстановление расширенных критериев донорских органов и связанные с ними иммунологические механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было проведено в Лаборатории наук о животных Ганноверской медицинской школы после одобрения региональным органом Нижней Саксонии по защите прав потребителей и безопасности пищевых продуктов (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146)
1. Закупка донорской печени
ПРИМЕЧАНИЕ: Донорами печени были самки домашних свиней (Sus scrofa domesticus) в возрасте 4-5 месяцев со средней массой тела около 50 кг, которые уже находились на карантине в исследовательском центре на животных в течение как минимум 10 дней до операции.
- Проводят премедикацию путем внутримышечного введения атропина (0,04-0,08 мг/кг массы тела), золазепама (5 мг/кг массы тела) и тилетамина (5 мг/кг массы тела). После установления внутривенного доступа (например, ушной вены) индуцируют анестезию инъекцией пропофола (1,5 - 2,5 мг/кг массы тела).
- Выполняют интубацию эндотрахеальной трубкой 8,0-8,5 мм в зависимости от размера и анатомии животного. Установить мониторинг электрокардиографии, измерение дыхательных газов и насыщения периферическим кислородом, а также неинвазивное измерение артериального давления.
- Поддерживать анестезию у свиней во время забора донорской печени путем ингаляции изофлурана (0,8-1,5 об.) и внутривенного введения фентанила (0,003-0,007 мг/кг массы тела). Выполняйте объемную вентиляцию на протяжении всей процедуры.
- После помещения свиньи-донора в лежачее положение и фиксации конечностей у основания операционного стола эластичными лентами скрабируют кожу антисептическим средством, например, повидон-йодом или изопропиловым спиртом, и накрывают животное стерильными шторами.
- Подтвердить адекватную глубину анестезии потерей реакции отмены на защемление пальцев ног. Выполняют лапаротомию средней линии, начиная с мечевидного отростка с помощью монополярного прижигания. Поместите абдоминальный ретрактор и мобилизуйте кишечник справа от донора.
- Выполняют спленэктомию путем рассечения спленокольной связки, гастроспленической связки и френикоспленической связки. Зажмите селезеночную вену и селезеночную артерию вблизи селезеночного хилума с помощью зажима Overholt и поместите лигатуры (3-0 полифиламентного шва) после разрыва сосудов. Разрывайте дополнительные (меньшие) сосуды либо биполярными щипцами, либо лигированием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Спленэктомия во время забора донорской печени не является обязательной, но уменьшает отток крови во время и после перфузии. - Мобилизуйте кишечник в левую сторону донора и разорвите фальциформную связку и треугольные связки с помощью ножниц и биполярного прижигания.
- После достаточного рассечения печени разрезают левую часть диафрагмы на расстоянии 5-10 см с помощью ножниц для определения местонахождения грудного сегмента нисходящей аорты. Обведите и поместите лигатуру (полифиламентный шов 3-0) без затягивания.
- Разрезайте правый участок диафрагмы на расстоянии 5-10 см с помощью ножниц и определите верховатую полую вену ниже.
- Переместить кишечник в левый верхний угол донора и войти в забрюшинное пространство путем поперечного разреза брюшины на расстоянии 5-10 см ножницами.
- Расположите брюшную аорту и нижнюю полую вену чуть выше подвздошной бифуркации и разделите оба сосуда длиной примерно 6 см. Поместите две 3-0 полифиламентные лигатуры вокруг брюшной аорты: одну черепную подвздошную бифуркацию и одну примерно 3 см краниально, без подтяжки. Поместите еще одну лигатуру вокруг внутрипеченочной полой вены ниже без затягивания.
- Внутривенно вводят гепарин (25 000 т.е.). Выберите подходящую канюлю и очистите капельную линию с охлажденным консервационным раствором.
- Подтяните каудально расположенную первую лигатуру вокруг брюшной аорты. После закупорки брюшной аорты краниально второй лигатуры (либо вручную, либо путем размещения атравматического сосудистого зажима), сделайте поперечный разрез между обеими лигатурами с помощью ножниц.
- Вставьте канюлю в разрез и закрепите ее оставшейся лигатурой. Разрежьте супрахепатическую нижнюю полую вену гораздо краниально (близко к правому предсердию) ножницами.
- После кровопотери примерно 1 500-2 000 мл перекрестно зажимают грудной сегмент нисходящей аорты путем связывания лигатуры и начинают антеградную перфузию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для возможной необходимости в крови (переливаниях) во время приживления или для нормотермической перфузии в машине цельная кровь (приблизительно 1 500 мл) может быть собрана с использованием контейнера, содержащего антикоагулянт на основе цитрата. - Затяните лигатуру, размещенную вокруг нижней части полой вены, разрезайте сосуд краниально лигатуры и вставьте хирургический аспиратор. Ввести смертельную дозу пентобарбитала натрия (5000 мг). Поместите измельченный стерильный лед в грудную и брюшную полость без ущерба для ткани печени.
- После перфузии 3 500 мл консервационного раствора в течение примерно 10-15 мин разорвать разрезанную верховатую полую вену. Разорвать инфрахепатическую полую вену ниже на уровне левой почечной вены.
- Разрежьте желчный проток краниальной ткани поджелудочной железы между двумя лигатурами (3-0 полифиламента), чтобы избежать разлива желчи. Разорвать воротную вену черепной поджелудочной железы.
- Найдите целиакию артерии после тупого препарата и следуйте дорсально к брюшной аорте. Иссечение соответствующего сегмента аорты, чтобы создать пластырь для последующего приживления.
- Иссечь диафрагму вокруг верховатой полой вены и разорвать оставшиеся спайки ножницами. Экстракт печени.
- Выполнить холецистэктомию или подтянуть лигатуру вокруг кистозного протока и промыть общий желчный проток не менее чем 20 мл консервирующего раствора. Поместите перфузионную канюлю в воротную вену и промойте трансплантат еще 500 мл консервационного раствора. Поместите трансплантат в стерильную миску, помещенную на лед.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от научной цели, орган может быть немедленно подготовлен к приживлению или храниться на льду в течение неопределенного периода времени (20 ч в этом протоколе) перед началом приготовления и приживления.
2. Закулисная подготовка печени
- Удалить лимфатическую ткань, начинающуюся в сегменте аорты, и тем самым выявить и закупорить артериальные боковые ветви и лимфатические сосуды либо клипсами, лигатурами (4-0 полифиламента), либо швами (5-0 мононити); Рисунок 1А). Аналогично удалите лимфатическую ткань вокруг воротной вены и закупорите боковые ветви швами (5-0 мононити).
- Определите верхнюю часть полой вены и наложите швы вокруг обеих диафрагмальных вен (5-0 мононити) после удаления окружающей диафрагмальной ткани. Промыть все сосуды холодным физиологическим раствором или консервационным раствором, чтобы выявить любые оставшиеся утечки. Выполняют укорочение сосудов и подготовку пластыря аорты только при приживлении с учетом индивидуальных анатомических обстоятельств.
3. Реципиентная гепатэктомия, донорское приживление печени и периоперационное лечение
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве реципиентов печени использовались самки домашних свиней (Sus scrofa domesticus) в возрасте 4-5 месяцев со средней массой тела около 50 кг. Аналогично донорам печени, реципиенты находились в карантине в исследовательском центре на животных в течение как минимум 10 дней до трансплантации.
- Анестезия и периоперационное лечение
- Проводят премедикацию путем внутримышечного введения атропина (0,04-0,08 мг/кг массы тела), золазепама (5 мг/кг массы тела) и тилетамина (5 мг/кг массы тела). После установления внутривенного доступа (например, ушной вены) индуцируют анестезию инъекцией пропофола (1,5-2,5 мг/кг массы тела).
- Выполняют интубацию эндотрахеальной трубкой 8,0-8,5 мм в зависимости от размера и анатомии животного. Установить мониторинг электрокардиографии, измерение дыхательных газов и насыщения периферическим кислородом, а также неинвазивное измерение артериального давления. В случае хронической модели применяют глазную мазь, чтобы избежать сухости после хирургического вмешательства.
- Поместите животное-реципиента на нагревательное основание в лежачем положении и зафиксируйте конечности на основании операционного стола резинками.
- Для расширенного мониторинга под ультразвуковым контролем поместите трехпросветный центральный венозный катетер и венозный катетер с большим отверстием (7 фр.) во внутреннюю яремную вену и венозный катетер с большим отверстием (7 фр.) для объемной терапии. Кроме того, вставьте артериальный катетер во внутреннюю сонную/шейную артерию под ультразвуковым контролем для инвазивного измерения артериального давления (рисунок 1B).
- Поддерживать анестезию во время извлечения органов путем ингаляции изофлурана (0,8-1,5 об.%) и внутривенного применения фентанила (0,003-0,007 мг/кг массы тела). Выполняйте объемную вентиляцию на протяжении всей процедуры. Применяют 2000 мг сультамициллина для периоперационного антибиоза и 250 мг метилпреднизолона внутривенно.
- Вводите вазопрессор, такой как норадреналин, внутривенно для достижения целевого среднего артериального давления 60 мм рт.ст. Кроме того, при необходимости применяют кристаллоидные растворы, такие как раствор лактата Рингера или коллоидные растворы, такие как жидкие желатины.
- Применяют глюконат кальция (10%) и бикарбонат натрия (8,4%), глюкозу (40%) или хлорид калия (7,45%) внутривенно в отношении анализов газов крови, полученных каждые 30 мин.
- Реципиентная гепатэктомия
- Очистите кожу антисептическим средством, например, повидон-йодом или изопропиловым спиртом, и накройте животное стерильными шторами.
- Подтвердить адекватную глубину анестезии потерей реакции отмены на защемление пальцев ног. Выполняют лапаротомию средней линии, начиная с мечевидного отростка с помощью монополярного прижигания. Поместите абдоминальный ретрактор и мобилизуйте кишечник слева от донора. Накройте кишечник смоченной тканью.
- Поместите надлобковый мочевой катетер для оптимизации интраоперационного управления объемом.
- Разорвите фальциформную связку и треугольные связки с помощью ножниц и биполярного прижигания. После достаточного рассечения печени опоясывают как супрахепатическую, так и инфрахепатическую вену, нижнюю близкую к паренхиме печени.
- Рассекните и разрежьте общий желчный проток ниже соединения кистозного протока между двумя лигатурами (3-0 полифиламента).
- Разрезать поверхностный перитонеальный слой, покрывающий гепатодуоденальную связку, и идентифицировать печеночные артерии незадолго до поступления в паренхиму печени. Рассечение с помощью биполярного прижигания или размещения клипс, лигатур или швов.
- Рассечение брюшной аорты путем разреза в средней линии (аваскулярном слое) правой и левой диафрагмальных мышц. Подготовьте аорту к анастомозу аорты путем удаления окружающих тканей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг требуется только в том случае, если выполняется анастомоз аорты. В противном случае дополнительно рассекайте печеночную артерию / хиларную область, чтобы подготовиться к обычному сквозному анастомозу между донорской и реципиентной печеночными артериями. - Выполняют реципиентную гепатэктомию путем размещения атравматического сосудистого зажима на воротной вене с последующим атравматическими сосудистыми зажимами на верхней половой вене нижней (включая окружающую диафрагму при каудальном втягивании печени) и нижней полой вене.
- Разорвите все три сосуда близко к паренхиме печени. Удалить печень реципиента из брюшной полости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Зажим сосудов знаменует собой начало печеночной фазы. Во время печеночной фазы свиньи гемодинамически нестабильны и нуждаются в соответствующем количестве вазопрессоров / катехоламинов. Анестезиолог должен быть готов к применению норадреналина и адреналина. Держите фазу до реперфузии печени как можно короче. Хорошо общайтесь с анестезиологом.
- Донорское приживление печени
- Поместите донорскую печень в брюшную полость. Укоротите донорскую и/или реципиентную надрецепочную полую вену ниже адекватной длины, избегая при этом излома или слишком большого напряжения на анастомозе.
- Наложите один шов в виде поддерживающей нити (5-0 мононити), адаптируя правый угол донора и реципиента надрецептивной вены нижней. Начинают спинную сторону анастомоза с левого угла сосуда(ов) бегущим швом (5-0 монофиламентных, двухруких).
- Достигнув правого угла, снимите опорную нить, закрепите бегущий шов зажимом, и продолжайте вентральной стороной анастомоза, снова начиная с левого угла сосуда (сосудов). Затяните шов несколькими узлами, не сужая диаметр сосуда, чтобы избежать стеноза.
- Укоротите донорскую и/или реципиентную воротную вену до достаточной длины, избегая изгиба или слишком большого напряжения на анастомозе.
- Выполните сосудистый анастомоз воротной вены донора и реципиента аналогично шагам 3.3.2-3.3.3 с использованием монофиламентного двурукого шва 6-0.
- Выполняют порто-венозную реперфузию путем удаления сосудистого зажима, закупоривая воротную вену реципиента, и закупоривают донорскую инфрахепатическую полую вену нижней частью сосудистого зажима после дренажа примерно 200-400 мл крови. Медленно удаляют сосудистый зажим, закупоривающий надреагетическую полую вену реципиента и ищут активное кровотечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Снятие обоих зажимов знаменует собой конец печеночной фазы. Количество необходимых катехоламинов должно значительно уменьшиться вскоре после этого. - Укоротите донорскую и/или реципиентную инфрахепатическую полую вену ниже. Выполняют сосудистый анастомоз донора и реципиента инфрахепатической вены нижней по аналогии с этапами 3.3.2-3.3.3 с использованием монофиламентного, двурукого шва 5-0. Снимите зажимы, закупоривающие донора и реципиента инфрахепатическую нижнюю вену.
- Подготовьте эллиптический аортальный пластырь (Carrel patch) диаметром примерно 1-1,5 см в зависимости от анатомических обстоятельств, используя ножницы. Зажмите брюшную аорту атравматичным сосудистым зажимом Кули и сделайте разрез с помощью скальпеля. Увеличьте разрез с помощью ножниц, чтобы он соответствовал пластырю.
- Начинают анастомоз аорты с бегущего шва (6-0 монофиламентных, двуруких) в черепном углу разреза/пластыря. Достигнув каудального угла, закрепите бегущий шов зажимом и снова завершите анастомоз, начиная с черепного угла. Затяните шов несколькими узлами и медленно снимите сосудистый зажим.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пережатие брюшной аорты значительно повлияет на кровяное давление свиньи. Хорошо общайтесь с анестезиологом. - Поместите гемостатическую марлю вокруг артериального анастомоза. Поместите катетер в общий желчный проток и закрепите его одной лигатурой. Убедитесь, что диаметр катетера не закупоривается.
- Временно закройте брюшко, адаптировав мышечную фасцию и кожу бегущим швом и покройте брюшко пищевой пленкой и / или шторами, чтобы избежать потери тепла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если научные цели требуют хронической модели, выполните сквозной анастомоз между донором и желчным протоком реципиента, закройте брюшную полость отдельными бегущими швами для брюшины и мышечной фасции и закройте кожу одиночными швами. - В конце наблюдения вводят смертельную дозу 5000 мг пентобарбитала натрия для интраоперационной эвтаназии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Методика, представленная в этом протоколе, обеспечила надежные и воспроизводимые результаты с точки зрения гемодинамической стабильности и выживаемости животных на протяжении всей процедуры, а также функции трансплантата в послеоперационном течении.
Совсем недавно мы применили модель для изучения ишемии-реперфузионного повреждения и терапевтических вмешательств, смягчающих пагубные последствия в непосредственном послеоперационном течении. После извлечения и 20 ч статического холодного хранения трансплантаты печени (со средним весом 983,38 г) имплантировали описанным способом. Эксперименты были прекращены через 6 ч после портально-венозной реперфузии и забора крови и желчи, а также ткани печени и желчных протоков через определенные промежутки времени. Все реципиенты пережили приживление и последующее 6-часовое наблюдение под общим наркозом до эвтаназии.
Поскольку основное внимание в этом протоколе уделяется осуществимости ортотопической модели трансплантации печени свиней без использования вено-венозного шунтирования, представленные здесь результаты ограничены интраоперационными жизненно важными параметрами и применением вазопрессоров (рисунок 2), а также производительностью трансплантата, определяемой обычными лабораторными параметрами, т. е. сывороточными концентрациями лактата, аспартаттрансаминазы (АСТ), аланинтрансаминазы (АЛТ) и глутаматдегидрогеназы (GLDH), производство желчи (Таблица 1) и тест на максимальную функциональную способность печени (LiMAx), как описано ранее в модели резекции печени свиней (Рисунок 3)26. Тест LiMAx основан на метаболизме в реальном времени внутривенно вводимого 13С-метацетина специфической для печени системой CYP1A2. До и после инъекции соотношение 13CO212CO2 в выдыхаемом воздухе определяется для количественной оценки индивидуальной функции печени27.
Как и ожидалось, реципиентам требовалось повышение концентрации норадреналина непосредственно перед и в течение всей печеночной фазы, чтобы стабилизировать среднее артериальное давление (MAD) на уровне ≥60 мм рт.ст. Низкие концентрации адреналина одновременно использовались для дополнительного увеличения сердечного выброса в этот уязвимый период времени. При портально-венозной реперфузии потребность в вазопрессорах быстро снижается и тем более при временном пережатии брюшной аорты для завершения аортального анастомоза. После приживления MAD и необходимые дозы вазопрессоров оставались стабильными.
Среднее время операции, определяемое как время от разреза кожи до завершения всех сосудистых анастомозов и реперфузий, составило 103,50 мин, включая среднюю анапеченочную фазу 27,13 мин. Следует отметить, что только два реципиента прошли анапеченочную фазу более 30 минут. У всех реципиентов наблюдалось снижение концентрации лактата в сыворотке крови через 4 ч после портально-венозной реперфузии, а значения LiMAx, полученные через 6 ч после портально-венозной реперфузии, были сопоставимы со значениями, измеренными у доноров печени до забора органов у всех, кроме одного реципиента (печеночная фаза 34 мин).
Рисунок 1: Подготовка трансплантата и реципиента. (A) На рисунке изображена подготовка заднего стола оси целиакии и сегмента аорты. (B) На этом рисунке показан реципиент в положении лежа на спине с расширенным мониторингом, включая центральный венозный катетер (синий) в левой внутренней яремной вене и артериальный катетер (красный) в правой внутренней сонной/шейной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Среднее артериальное давление и концентрации вазопрессоров, необходимые при приживлении. На рисунке показано измеренное среднее артериальное давление (MAD в мм рт.ст.) и концентрации норадреналина и адреналина (в мкг/кг/ч) в течение определенных периодов времени на протяжении всей процедуры у всех восьми реципиентов. Значения представлены как среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Значения теста максимальной функциональной способности печени (LiMAx), полученные от доноров до закупок печени и от реципиентов через 6 ч после приживления. На рисунке показаны данные прямоугольного графика (средняя и стандартная погрешность среднего значения) из теста максимальной функциональной способности печени (LiMAx) от доноров до закупок печени и от реципиентов через 6 ч после приживления (n = 8). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Эксперимент | Вес трансплантата | Вес получателя | GRWR | Время работы | Анапеченочная фаза | Лактат (ммоль/л) | Пиковый АСТ | Пик ALT | Пик GLDH | Объем желчи | ||
| Лол | (г) | (кг) | (%) | (мин) | (мин) | 2 ч | 4 ч | 6 ч | (Е/Л) | (Е/Л) | (Е/Л) | (мл) |
| 1 | 1082 | 48.8 | 2.22 | 115 | 25 | 5.8 | 4.7 | 3.7 | 677 | 122 | 39 | 48 |
| 2 | 946 | 51.4 | 1.84 | 125 | 34 | 6.6 | 5.9 | 5.2 | 1207 | 109 | 268 | 15 |
| 3 | 957 | 57.6 | 1.66 | 110 | 30 | 8.3 | 5.8 | 8.1 | 742 | 125 | 143 | 73 |
| 4 | 825 | 49.2 | 1.68 | 87 | 22 | 7.6 | 6.7 | 6.5 | 675 | 99 | 113 | 35 |
| 5 | 1045 | 53.4 | 1.96 | 101 | 25 | 7.9 | 6.8 | 5.6 | 919 | 86 | 129 | 25 |
| 6 | 924 | 45.2 | 2.04 | 105 | 32 | 6.7 | 4.6 | 3.7 | 414 | 90 | 114 | 75 |
| 7 | 785 | 48.2 | 1.63 | 95 | 24 | 6.8 | 4.8 | 4.1 | 557 | 70 | 110 | 1.5 |
| 8 | 1303 | 54.6 | 2.39 | 90 | 25 | 12.7 | 12.2 | 9.8 | 1011 | 87 | 94 | 10 |
| ЗНАЧИТЬ | 983.38 | 51.05 | 1.93 | 103.50 | 27.13 | 7.80 | 6.44 | 5.84 | 775.25 | 98.50 | 126.25 | 35.31 |
| СЕМ | 57.59 | 1.41 | 0.10 | 4.57 | 1.52 | 0.76 | 0.88 | 0.78 | 90.79 | 6.73 | 23.00 | 9.87 |
Таблица 1: Периоперационный трансплантат и переменные реципиента. В таблице суммируется вес трансплантата и реципиента, а также отношение веса трансплантата к реципиенту (GRWR) и продолжительность операции (разрез кожи до завершения всех сосудистых анастомозов и реперфузий) и печеночной фазы. Переменные, указывающие на функцию трансплантата, такие как обычные лабораторные параметры, то есть сывороточные концентрации лактата, аспартаттрансаминазы (АСТ), аланинтрансаминазы (АЛТ) и глутаматдегидрогеназы (GLDH), а также производство желчи, приведены для каждой из восьми выполненных трансплантаций.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Последние технические разработки, такие как внедрение машинной перфузии, могут революционизировать область трансплантации печени. Чтобы перевести концепции восстановления или модификации трансплантата в клинические условия, воспроизводимые модели трансплантации у крупных животных неизбежны.
После первоначального введения ортотопической трансплантации печени свиней несколько авторов работали над улучшением этих методов в течение последних пяти десятилетий. Различия в сообщаемых хирургических подходах часто незначительны и касаются сосудистых и билиарных анастомозов, анестезии и периоперационного ведения. Тем не менее, в отличие от нынешней ситуации в клинической трансплантации печени, в которой использование вено-венозного шунтирования по-прежнему распространено, но необязательно 28, активное или пассивное порто-кавальное шунтирование во время печеночной фазы у свиней рассматривается как необходимость уменьшения кишечной застойки и, таким образом, последующей кишечной ишемии с гемодинамической нестабильностью и периоперационной смертностью, как описано в хорошо проработанной работе Эсмаилзаде и др.25.
Помимо связанных с этим дополнительных затрат и технических проблем вено-венозного шунтирования, например, катетеров, насосного устройства, необходимости дополнительной антикоагуляции и потенциальных осложнений, таких как воздушная эмболия или кровоизлияние, и в зависимости от выбранного подхода, необходимость одновременной спленэктомии побудила группы описать модифицированные методы без вено-венозного шунтирования25,29, 30 см.
Torres et al.31 наблюдали тяжелую гемодинамическую нестабильность у животных, подвергающихся приживлению без применения вено-венозного шунтирования по сравнению с реципиентами с пассивным порто-кавальным шунтом и, таким образом, выполняли временное зажатие супрацелиальной аорты у этих животных, что также было описано другими в моделях ауто-/аллотрансплантации печени свиней 23,31,32 . Однако индукция теплой ишемии путем перекрестного зажима аорты реципиента несет риск соответствующего высвобождения провоспалительных молекул и повреждения тканей при реперфузии и, следовательно, должна быть предотвращена любой ценой для получения надежных научных результатов, особенно при оценке повреждения ишемией-реперфузией. Кроме того, такой подход не напоминает клиническую практику на людях, что, следовательно, ограничивает трансляцию результатов, полученных в этих моделях.
Мы считаем, что для того, чтобы избежать таких пагубных мер поддержки, решающее значение имеют два момента. (1) Анапеченочная фаза должна быть сведена к абсолютному минимуму, т.е. ниже 30 мин, как это уже было показано на ранних этапах трансплантации печени свиней Баттерсби и др.33. Мы считаем, что бегущих швов (двуруких) и максимум одной поддерживающей нити достаточно для создания простого и безопасного анастомоза как для надцепной полой вены, так и для воротной вены. Очевидно, что портально-венозная реперфузия должна начинаться до анастомозирования нижней полой вены. (2) Анестезиологическое лечение должно проводиться опытным анестезиологом, в идеале знакомым с хирургией печени или трансплантацией у пациентов34. Сложное управление объемами и терапия вазопрессорами, т.е. норадреналином и адреналином, в сочетании с упрощенной хирургической техникой являются основой для успешной реализации этой модели.
Интересно, что лишь небольшое количество хирургических групп предоставили данные об успешной ортотопической трансплантации печени свиней без вено-венозного шунтирования и сопутствующего супрацелиального пережатия аорты. Насколько нам известно, Oike et al., Heuer et al. и, совсем недавно, Fondevila et al. были единственными группами, сообщившими о своих (многообещающих) результатах, с показателями выживаемости 87%, 80% и 100% соответственно 35,36,37. Среднее время печени в нашей когорте составляло 25 мин и, таким образом, было идентично данным, представленным Heuer et al.36. Во время печеночной фазы Oike et al.35 сообщили о снижении артериального артериального давления на 50-60%, аналогичном наблюдениям, сделанным в этой когорте, что привело к увеличению доз вазопрессоров, чтобы избежать снижения MAD ниже 60 мм рт.ст. Heuer et al.36 не упомянули об использовании катехоламиновой терапии в своей публикации, но конкретно не упомянули переливание цельной крови для улучшения гемодинамической стабильности. Последнее не требовалось в данной модели. Fondevila et al., которые сообщили о среднем времени печени менее 20 мин, полагались исключительно на введение кристаллоидных растворов и не применяли вазоактивные вещества во время приживления37.
Следует отметить, что в отличие от недавних публикаций, применяющих сквозной анастомоз от донора к реципиентной печеночной артерии19,22, эта модель включает сквозной анастомоз с пластырем Карреля донорской аорты, анастомозируемой к супрацелиальной аорте реципиента. Особенно для экспериментальных условий, с использованием органов, отвечающих расширенным критериям донора, например, длительное холодное ишемическое время, может быть выгодно исключить любые проблемы с артериальной перфузией трансплантата. Применение пластыря Карреля поможет избежать стеноза артериального анастомоза, который может стать функционально значимым в случае сопутствующих периферических спазмов сосудов, часто наблюдаемых после реперфузии. Тем не менее, этот подход будет более трудоемким, чем обычный сквозной анастомоз из-за более проработанного доступа к аорте.
Поскольку наши репрезентативные эксперименты были сосредоточены на непосредственной послеоперационной фазе и травме ишемии-реперфузии, реципиентов держали под наркозом и усыпляли через 6 часов после реперфузии. Хотя это полезно в отношении благополучия животных, это представляет собой значительное ограничение для проверки нашей техники в отношении трансплантата и выживаемости реципиента. Мы считаем, однако, что на основе жизненно важных параметров, гемодинамики, клиренса лактата, производства желчи и особенно специфического для печени метаболизма CYP1A2 в реальном времени (тест LiMAx), наблюдаемого на протяжении всего наблюдения, долгосрочное применение нашей модели должно быть осуществимым, особенно потому, что трансплантаты, используемые в экспериментах, подвергались статическому холодному хранению в течение 20 ч до приживления, в отличие от успешного применения сопоставимых моделей трансплантации другими35, 36,37. Кроме того, упомянутые предыдущие отчеты показали, что периоперационная смертность наблюдалась исключительно во время и до 6 ч после операции, за исключением одного реципиента, умирающего от легочной эмболии в первый послеоперационный день в исследовании Oike et al.35.
В данной работе показано, что упрощенный подход к ортотопической трансплантации печени свиней без использования вено-венозного шунтирования при приживлении может быть выполнен безопасно и является более экономичным, без значительных гемодинамических изменений или интраоперационной смертности даже после длительного статического холодного хранения донорского органа. Такая модель должна представлять особый интерес для (хирургических) рабочих групп, ориентированных на непосредственное послеоперационное течение, ишемию-реперфузионное повреждение, восстановление расширенных критериев донорских органов и связанные с ними иммунологические механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Бритту Траутевиг, Коринну Лёбберт, Астрид Динкель и Ингрид Медер за их усердие и приверженность. Кроме того, авторы благодарят Тома Фигиэля за создание картинного материала.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abdominal retractor | No Company Name available | No Catalog Number available | |
| Aortic clamp, straight | Firma Martin | No Catalog Number available | |
| Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL | Radiometer Medical ApS | 956-622 | |
| Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL) | B.Braun | 648037 | |
| Backhaus clamp | Bernshausen | BF432 | |
| Bipolar forceps, 23 cm | SUTTER | 780222 SG | |
| Bowl 5 L, 6 L, 9 L | Chiru-Instrumente | 35-114327 | |
| Braunol Braunoderm | B.Braun | 3881059 | |
| Bulldog clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Button canula | Krauth + Timmermann GmbH | 1464LL1B | |
| Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%)) | B.Braun | 2353745 | |
| Cell Saver (Autotransfusion Reservoir) | Fresenius Kabi AG | 9108471 | |
| Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm | Arrow | AD-24703 | |
| Clamp | INOX | B-17845 / BH110 / B-481 | |
| Clamp | Aesculap | AN909R | |
| Clamp, 260 mm | Fehling Instruments GMbH &Co.KG | ZAU-2 | |
| Clip Forceps, medium | Ethicon | LC207 | |
| Clip forceps, small | Ethicon | LC107 | |
| CPDA-1 solution | Fresenius Kabi AG | 41SD09AA00 | |
| Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution) | Dr.Franz Köhler Chemie GmbH | 2125921 | |
| Dissecting scissors | LAWTON 05-0641 | No Catalog Number available | |
| Dissecting scissors, 180 mm | Metzenbaum | BC606R | |
| Endotracheal tube 8.0 mm | Covetrus | 800764 | |
| Epinephrine (Adrenalin 1:1000) | InfectoPharm | 9508734 | |
| Falcon Tubes 50ml | Greiner | 227 261 L | |
| Femoralis clamp | Ulrich | No Catalog Number available | |
| Fentanyl 0.1mg | PanPharma | 00483 | |
| Forceps, anatomical | Martin | 12-100-20 | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD052R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD032R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD240R | |
| Forceps, surgical | Bernshausen | BD 671 | |
| Forceps, surgical | INOX | B-1357 | |
| G40 solution | Serag Wiessner | 10755AAF | |
| Gelafundin ISO solution 40 mg/mL | B. Braun | 210257641 | |
| Guidewire with marker | Arrow | 14F21E0236 | |
| Haemostatic gauze ("Tabotamp" 5 x 7.5 cm) | Ethicon | 474273 | |
| Heparin sodium 25,000IE | Ratiopharm | W08208A | |
| Hico-Aquatherm 60 | Hospitalwerk | No Catalog Number available | |
| Infusion Set Intrafix | B.Braun | 4062981 L | |
| Intrafix SafeSet 180 cm | B.Braun | 4063000 | |
| Introcan Safety, 18 G | B.Braun | 4251679-01 | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-bore venous catheter, 7Fr. | Edwards Lifesciences | I301F7 | |
| Ligaclip, medium | Ethicon | LT200 | |
| Ligaclip, small | Ethicon | LT100 | |
| Material scissors | Martin | 11-285-23 | |
| Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg) | Sanofi | 7823704 | |
| Monopolar ERBE ICC 300 | Fa. Erbe | No Catalog Number available | |
| NaCl solution (0.9%) | Baxter | 1533 | |
| Needle holder | Aesculap | BM36 | |
| Needle holder | Aesculap | BM035R | |
| Needle holder | Aesculap | BM 67 | |
| Neutral electrode | Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen | 21191 - 060 | |
| Norepinephrine (Sinora) | Sintetica GmbH | 04150124745717 | |
| Omniflush Sterile Filed 10 mL | B.Braun | 3133335 | |
| Original Perfusorline 300 cm | B.Braun | 21E26E8SM3 | |
| Overhold clamp | INOX | BH 959 | |
| Overhold clamp | Ulrich | CL 2911 | |
| Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL) | WDT, Garbsen | 21217 | |
| Perfusers | B.Braun | 49-020-031 | |
| Perfusor Syringe 50 mL | B.Braun | 8728810F | |
| Petri dishes 92 x 17 mm | Nunc | 150350 | |
| Poole Suction Instrument Argyle flexibel | Covidien, Mansfield USA | 20C150FHX | |
| Potassium chloride (7.45%) | B.Braun | 4030539078276 | |
| Pressure measurement set | Codan pvb Medical GmbH | 957179 | |
| Propofol (1%) | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| S-Monovette 2.6 mL K3E | Sarstedt | 04.1901 | |
| S-Monovette 2.9 mL 9NC | Sarstedt | 04.1902 | |
| S-Monovette 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 11602 | |
| Sartinski clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Scalpel No.11 | Feather Safety Razor Co.LTD | 02.001.40.011 | |
| Scissors | INOX | BC 746 | |
| Seldinger Arterial catheter | Arrow | SAC-00520 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | B.Braun | 212768082 | |
| Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC") | B.Braun | 4899719 | |
| Sterofundin ISO solution | B.Braun | No Catalog Number available | |
| Suction | Dahlhausen | 07.068.25.301 | |
| Suction Aesculap Securat 80 | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Suction catheter | ConvaTec | 5365049 | |
| Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam) | Pfizer | DL253102 | |
| Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm | ConvaTec | UK 1F02772 | |
| Suprasorb ("Toptex lite RK") | Lohmann & Rauscher | 31654 | |
| Suture Vicryl 3-0 | Ethicon | VCP 1218 H | |
| Suture Vicryl 4-0 | Ethicon | V392H | |
| Suture, Prolene 4-0 | Ethicon | 7588 H | |
| Suture, Prolene 5-0, double armed | Ethicon | 8890 H | |
| Suture, Prolene 5-0, single armed | Ethicon | 8720 H | |
| Suture, Prolene 6-0, double armed | Ethicon | 7230 H | |
| Suture, Prolene 6-0, single armed | Ethicon | EH 7406 H | |
| Suture, Prolene: blau 3-0 | Ethicon | EH 7499H | |
| Suture, Safil 2/0 | Aesculap | C 1038446 | |
| Suture, Terylene 0 | Serag Wiessner | 353784 | |
| Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | B.Braun | 4606027V | |
| TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm | Fresenius Kabi AG | 2877101 | |
| Ultrasound Butterfly IQ+ | Butterfly Network Inc. | 850-20014 | |
| Ventilator "Oxylog Dräger Fl" | Dräger Medical AG | No Catalog Number available | |
| Yankauer Suction | Medline | RA19GMD | |
| Zoletil 100 mg/mL (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin) | Virbac | 794-861794861 |
References
- Zarrinpar, A., Busuttil, R. W. Liver transplantation: Past, present and future. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 10 (7), 434-440 (2013).
- Song, A. T., et al. Liver transplantation: Fifty years of experience. World Journal of Gastroenterology. 20 (18), 5363-5374 (2014).
- Jakubauskas, M., et al. Machine perfusion in liver transplantation: A systematic review and meta-analysis. Visceral Medicine. , (2021).
- Serifis, N., et al. Machine perfusion of the liver: A review of clinical trials. Frontiers in Surgery. 8, 625394 (2021).
- Ceresa, C. D. L., Nasralla, D., Pollok, J. -M., Friend, P. J. Machine perfusion of the liver: Applications in transplantation and beyond. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 19 (3), 199-209 (2022).
- Schlegel, A., Muller, X., Dutkowski, P. Machine perfusion strategies in liver transplantation. Hepatobiliary Surgery and Nutrition. 8 (5), 490-501 (2019).
- Wenzel, N., Blasczyk, R., Figueiredo, C. Animal models in allogenic solid organ transplantation. Transplantology. 2 (4), 412-424 (2021).
- Kamada, N., Calne, R. Y. A surgical experience with five hundred thirty liver transplants in the rat. Surgery. 93 (1), 64-69 (1983).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
- Yang, L., et al. A rat model of orthotopic liver transplantation using a novel magnetic anastomosis technique for suprahepatic vena cava reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (133), e56933 (2018).
- Chen, X. -C., et al. Reduced complications after arterial reconnection in a rat model of orthotopic liver transplantation. Journal of Visualized Experiments. (165), e60628 (2020).
- Qian, S. G., Fung, J. J., Demetris, A. V., Ildstad, S. T., Starzl, T. E. Orthotopic liver transplantation in the mouse. Transplantation. 52 (3), 562-564 (1991).
- Li, X., Wang, Y., Yang, H., Dai, Y. Liver and hepatocyte transplantation: What can pigs contribute. Frontiers in Immunology. 12, 802692 (2022).
- Reardon, S. First pig-to-human heart transplant: what can scientists learn. Nature. 601 (7893), 305-306 (2022).
- Garnier, H., et al. Liver transplantation in the pig: Surgical approach. Comptes Rendus Hebdomadaires des Seances de l'Academie des Sciences. Serie d: Sciences Naturelles. 260 (21), 5621-5623 (1965).
- Calne, R. Y., et al. Observations of orthotopic liver transplantation in the pig. British Medical Journal. 2 (5550), 478-480 (1967).
- Chalstrey, L. J., et al. Technique of orthotopic liver transplantation in the pig. The British Journal of Surgery. 58 (8), 585-588 (1971).
- Filipponi, F., Falcini, F., Benassai, C., Martini, E. Orthotopic liver transplant in pigs: Several variations of the surgical technic. Il Giornale di Chirurgia. 10 (7-8), 374-378 (1989).
- Spetzler, V. N., et al. Technique of porcine liver procurement and orthotopic transplantation using an active porto-caval shunt. Journal of Visualized Experiments. (99), e52055 (2015).
- Oldhafer, K. J., Hauss, J., Gubernatis, G., Pichlmayr, R., Spiegel, H. U. Liver transplantation in pigs: A model for studying reperfusion injury. Journal of Investigative Surgery. 6 (5), 439-450 (1993).
- Oldhafer, K. J., et al. Analysis of liver hemodynamics in severe ischemia and reperfusion injury after liver transplantation. Zentralblatt fur Chirurgie. 119 (5), 317-321 (1994).
- Vogel, T., et al. Successful transplantation of porcine liver grafts following 48-hour normothermic preservation. PLoS One. 12 (11), 0188494 (2017).
- Leal, A. J., et al. A simplified experimental model of large-for-size liver transplantation in pigs. Clinics. 68 (8), 1152-1156 (2013).
- Schiefer, J., et al. Regulation of histamine and diamine oxidase in patients undergoing orthotopic liver transplantation. Scientific Reports. 10 (1), 822 (2020).
- Esmaeilzadeh, M., et al. Technical guidelines for porcine liver allo-transplantation: A review of literature. Annals of Transplantation. 17 (2), 101-110 (2012).
- Oldhafer, F., et al. Supportive hepatocyte transplantation after partial hepatectomy enhances liver regeneration in a preclinical pig model. European Surgical Research. 62 (4), 238-247 (2021).
- Stockmann, M., et al. The LiMAx test: A new liver function test for predicting postoperative outcome in liver surgery. HPB. 12 (2), 139-146 (2010).
- Lapisatepun, W., Lapisatepun, W., Agopian, V., Xia, V. W. Venovenous bypass during liver transplantation: A new look at an old technique. Transplantation Proceedings. 52 (3), 905-909 (2020).
- Falcini, F., et al. Veno-venous bypass in experimental liver transplantation: portal-jugular versus caval-portal-jugular. Il Giornale di Chirurgia. 11 (4), 206-210 (1990).
- Copca, N., et al. Experimental liver transplantation on pigs -- Technical considerations. Chirurgia. 108 (4), 542-546 (2013).
- Torres, O. J., et al. Hemodynamic alterations during orthotopic liver experimental transplantation in pigs. Acta Cirurgica Brasileria. 23 (2), 135-139 (2008).
- Canedo, B. F., et al. Liver autotransplantation in pigs without venovenous bypass: A simplified model using a supraceliac aorta cross-clamping maneuver. Annals of Transplantation. 20, 320-326 (2015).
- Battersby, C., Hickman, R., Saunders, S. J., Terblanche, J. Liver function in the pig. 1. The effects of 30 minutes' normothermic ischaemia. The British Journal of Surgery. 61 (1), 27-32 (1974).
- Kaiser, G. M., Heuer, M. M., Frühauf, N. R., Kühne, C. A., Broelsch, C. E. General handling and anesthesia for experimental surgery in pigs. Journal of Surgical Research. 130 (1), 73-79 (2006).
- Oike, F., et al. Simplified technique of orthotopic liver transplantation in pigs. Transplantation. 71 (2), 328-331 (2001).
- Heuer, M., et al. Liver transplantation in swine without venovenous bypass. European Surgical Research. 45 (1), 20-25 (2010).
- Fondevila, C., et al. Step-by-step guide for a simplified model of porcine orthotopic liver transplant. The Journal of Surgical Research. 167 (1), 39-45 (2011).
