Summary
En este protocolo, se describe un modelo de trasplante hepático ortotópico porcino después del almacenamiento estático en frío de órganos de donantes durante 20 h sin el uso de un bypass venovenoso durante el injerto. El enfoque utiliza una técnica quirúrgica simplificada con minimización de la fase anhepática y un sofisticado manejo del volumen y vasopresores.
Abstract
El trasplante de hígado se considera el estándar de oro para el tratamiento de una variedad de enfermedades hepáticas fatales. Sin embargo, los problemas no resueltos de la falla crónica del injerto, la escasez continua de donantes de órganos y el mayor uso de injertos marginales requieren la mejora de los conceptos actuales, como la implementación de la perfusión de la máquina de órganos. Para evaluar nuevos métodos de reacondicionamiento y modulación del injerto, se requieren modelos traslacionales. Con respecto a las similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos y los avances recientes en el campo del xenotrasplante, los cerdos se han convertido en la principal especie animal grande utilizada en los modelos de trasplante. Después de la introducción inicial de un modelo de trasplante hepático ortotópico porcino por Garnier et al. en 1965, se han publicado varias modificaciones en los últimos 60 años.
Debido a los rasgos anatómicos específicos específicos, un bypass venovenoso durante la fase anhepática se considera una necesidad para reducir la congestión intestinal y la isquemia que resulta en inestabilidad hemodinámica y mortalidad perioperatoria. Sin embargo, la implementación de un bypass aumenta la complejidad técnica y logística del procedimiento. Además, las complicaciones asociadas, como embolia aérea, hemorragia y la necesidad de una esplenectomía simultánea, se han informado anteriormente.
En este protocolo, describimos un modelo de trasplante hepático ortotópico porcino sin el uso de un bypass venovenoso. El injerto de hígados de donantes después de un almacenamiento en frío estático de 20 h, simulando condiciones de donantes de criterios extendidos, demuestra que este enfoque simplificado se puede realizar sin alteraciones hemodinámicas significativas o mortalidad intraoperatoria y con una captación regular de la función hepática (definida por la producción de bilis y el metabolismo CYP1A2 específico del hígado). El éxito de este enfoque está garantizado por una técnica quirúrgica optimizada y un sofisticado volumen anestésico y manejo vasopresor.
Este modelo debe ser de especial interés para grupos de trabajo centrados en el curso postoperatorio inmediato, la lesión por isquemia-reperfusión, los mecanismos inmunológicos asociados y el reacondicionamiento de órganos donantes de criterios extendidos.
Introduction
El trasplante de hígado sigue siendo la única posibilidad de supervivencia en una variedad de enfermedades diferentes que conducen a insuficiencia hepática aguda o crónica. Desde su primera aplicación exitosa en la humanidad en 1963 por Thomas E. Starzl, el concepto de trasplante hepático se ha convertido en una opción de tratamiento confiable aplicada en todo el mundo, principalmente como resultado de los avances en la comprensión del sistema inmunológico, el desarrollo de la inmunosupresión moderna y la optimización de la atención perioperatoria y las técnicas quirúrgicas 1,2 . Sin embargo, el envejecimiento de la población y una mayor demanda de órganos han dado lugar a una escasez de donantes, con un mayor uso de injertos marginales de donantes de criterios ampliados y la aparición de nuevos desafíos en las últimas décadas. Se cree que la introducción y la implementación generalizada de la perfusión de la máquina de órganos abre una serie de posibilidades con respecto al reacondicionamiento y la modulación del injerto y ayuda a mitigar la escasez de órganos y reducir la mortalidad en lista de espera 3,4,5,6.
Para evaluar estos conceptos y sus efectos in vivo, son necesarios modelos de trasplante traslacional7. En 1983, Kamada et al. introdujeron un modelo ortotópico eficiente de trasplante hepático en ratas que desde entonces ha sido ampliamente modificado y aplicado por grupos de trabajo de todo el mundo 8,9,10,11. El modelo ortotópico de trasplante hepático en ratones es técnicamente más exigente, pero también más valioso en términos de transferibilidad inmunológica, y fue reportado por primera vez en 1991 por Qian et al.12. A pesar de las ventajas en cuanto a disponibilidad, bienestar animal y costos, los modelos de roedores son limitados en su aplicabilidad en entornos clínicos7. Por lo tanto, se requieren modelos animales grandes.
En los últimos años, los cerdos se han convertido en la principal especie animal utilizada para la investigación traslacional debido a sus similitudes anatómicas y fisiológicas con los humanos. Además, los avances actuales en el campo de los xenotrasplantes podrían aumentar aún más la importancia de los cerdos como objetos de investigación13,14.
Garnier et al. describieron un modelo de trasplante hepático en cerdos ya en 196515. Varios autores, incluidos Calne et al. en 1967 y Chalstrey et al. en 1971, informaron posteriormente modificaciones, lo que finalmente condujo a un concepto seguro y factible de trasplante experimental de hígado porcino en las décadas siguientes 16,17,18,19,20,21.
Más recientemente, diferentes grupos de trabajo han proporcionado datos con respecto a los problemas actuales en el trasplante hepático utilizando una técnica de trasplante hepático ortotópico porcino, que casi invariablemente incluye un veno-venoso activo o pasivo, es decir, porto-caval, bypass19,22. La razón de esto es una intolerancia específica de la especie al pinzamiento de la vena cava inferior y la vena porta durante la fase anhepática debido a un intestino comparativamente más grande y menos derivaciones porto-cavas o cavo-cavas (por ejemplo, falta de una vena ácigos), lo que resulta en un aumento de la morbilidad y mortalidad perioperatoria23. Las técnicas de trasplante con preservación inferior de vena cava aplicadas en receptores humanos como alternativa no son factibles ya que la vena cava inferior porcina está encerrada por tejido hepático23.
Sin embargo, el uso de un bypass venovenoso aumenta aún más la complejidad técnica y logística en un procedimiento quirúrgico ya exigente, por lo tanto, posiblemente impida que los grupos de trabajo intenten implementar el modelo por completo. Además de los efectos fisiológicos e inmunológicos directos de un bypass, algunos autores han señalado la morbilidad significativa como la pérdida de sangre o embolia aérea durante la colocación de la derivación y la necesidad de una esplenectomía simultánea, lo que puede afectar los resultados a corto y largo plazo después del injerto24,25.
El siguiente protocolo describe una técnica simple de trasplante hepático ortotópico porcino después del almacenamiento estático en frío de órganos del donante durante 20 h, que representa condiciones de donantes de criterios extendidos sin el uso de un bypass venovenoso durante el injerto, incluida la obtención de hígado del donante, la preparación de la mesa posterior, la hepatectomía del receptor y el manejo anestésico pre e intraoperatorio.
Este modelo debe ser de especial interés para grupos de trabajo quirúrgicos centrados en el curso postoperatorio inmediato, la lesión por isquemia-reperfusión, el reacondicionamiento de órganos donantes de criterios extendidos y los mecanismos inmunológicos asociados.
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Protocol
Este estudio se realizó en el Laboratorio de Ciencia Animal de la Facultad de Medicina de Hannover después de la aprobación de la autoridad regional de Baja Sajonia para la protección del consumidor y la seguridad alimentaria (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146)
1. Obtención de hígado de donante
NOTA: Las donantes de hígado eran hembras domésticas (Sus scrofa domesticus), de 4-5 meses de edad y con un peso corporal promedio de aproximadamente 50 kg, que ya habían estado en cuarentena en el centro de investigación animal durante un mínimo de 10 días antes de la cirugía.
- Realizar la premedicación mediante inyección intramuscular de atropina (0,04-0,08 mg/kg de peso corporal), zolazepam (5 mg/kg de peso corporal) y tiletamina (5 mg/kg de peso corporal). Después de establecer un acceso intravenoso (p. ej., vena del oído) inducir la anestesia con una inyección de propofol (1,5 - 2,5 mg/kg de peso corporal).
- Realizar la intubación con un tubo endotraqueal de 8,0-8,5 mm, dependiendo del tamaño y la anatomía del animal. Establecer monitorización de electrocardiografía, medición de gases respiratorios y saturación periférica de oxígeno, y medición no invasiva de la presión arterial.
- Mantener la anestesia en cerdos durante la obtención de hígado del donante mediante inhalación de isoflurano (0,8-1,5 vol%) y aplicación intravenosa de fentanilo (0,003-0,007 mg/kg de peso corporal). Realice ventilación controlada por volumen durante todo el procedimiento.
- Después de la colocación del cerdo donante en posición supina y la fijación de las extremidades en la base de la mesa de operaciones con bandas elásticas, frote la piel con agente antiséptico, por ejemplo, povidona yodada o alcohol isopropílico, y cubra al animal con cortinas estériles.
- Confirmar una profundidad adecuada de anestesia por pérdida de la respuesta de abstinencia al pellizco del dedo del pie. Realizar una laparotomía de línea media comenzando en el proceso xifoide mediante el uso de cauterización monopolar. Coloque un retractor abdominal y movilice el intestino a la derecha del donante.
- Realizar una esplenectomía por disección del ligamento esplenocólico, el ligamento gastroesplénico y el ligamento frenicosplénico. Sujete la vena esplénica y la arteria esplénica cerca del hilio esplénico con una pinza Overholt y coloque ligaduras (sutura de polifilamento 3-0) después de cortar los vasos. Cortar vasos adicionales (más pequeños) ya sea por pinzas bipolares o por ligadura.
NOTA: Una esplenectomía durante la obtención de hígado del donante no es obligatoria, pero reduce el flujo de sangre durante y después de la perfusión. - Movilizar el intestino hacia el lado izquierdo del donante y cortar el ligamento falciforme y los ligamentos triangulares usando tijeras y cauterio bipolar.
- Después de una disección suficiente del hígado, incise la porción izquierda del diafragma a una distancia de 5-10 cm con tijeras para localizar el segmento torácico de la aorta descendente. Rodear y colocar una ligadura (sutura de polifilamento 3-0) sin apretar.
- Incidir la porción derecha del diafragma a una distancia de 5-10 cm con unas tijeras e identificar la vena cava suprahepática inferior.
- Reubicar el intestino en la parte superior izquierda del donante y entrar en el espacio retroperitoneal mediante incisión transversal del peritoneo a una distancia de 5-10 cm con unas tijeras.
- Localice la aorta abdominal y la vena cava inferior justo por encima de la bifurcación ilíaca y separe ambos vasos en una longitud de aproximadamente 6 cm. Coloque dos ligaduras de polifilamento 3-0 alrededor de la aorta abdominal: una craneal de la bifurcación ilíaca y otra de aproximadamente 3 cm cranealmente, sin apretar. Coloque otra ligadura alrededor de la vena cava intrahepática inferior sin apretar.
- Inyectar heparina por vía intravenosa (25.000 I.E.). Elija una cánula adecuada y desairee la línea de goteo con una solución de conservación enfriada.
- Apriete la primera ligadura situada caudalmente alrededor de la aorta abdominal. Después de ocluir la aorta abdominal cranealmente de la segunda ligadura (ya sea manualmente o colocando una pinza vascular atraumática), haga una incisión transversal entre ambas ligaduras con tijeras.
- Inserte la cánula en la incisión y asegúrela con la ligadura restante. Cortar la vena cava inferior suprahepática cranealmente (cerca de la aurícula derecha) con unas tijeras.
- Después de una pérdida de sangre de aproximadamente 1.500-2.000 ml, pinza cruzada el segmento torácico de la aorta descendente atando la ligadura y comience la perfusión anterógrada.
NOTA: Para la posible necesidad de sangre (transfusiones) durante el injerto o para la perfusión normotérmica con máquina, la sangre total (aproximadamente 1.500 ml) se puede recolectar utilizando un recipiente que contenga anticoagulante a base de citrato. - Apriete la ligadura colocada alrededor de la vena cava infrahepática inferior, incite el vaso cranealmente de la ligadura e inserte un aspirador quirúrgico. Inyecte una dosis letal de pentobarbital sódico (5,000 mg). Coloque hielo estéril triturado en la cavidad torácica y abdominal sin comprometer el tejido hepático.
- Después de la perfusión con 3.500 ml de solución de preservación en un curso de aproximadamente 10-15 min, cortar la vena cava suprahepática incisa inferior. Cortar la vena cava infrahepática inferior a nivel de la vena renal izquierda.
- Cortar el conducto biliar craneal del tejido pancreático entre dos ligaduras (polifilamento 3-0) para evitar el derrame de bilis. Cortar la vena porta craneal del páncreas.
- Localice la arteria celíaca después de la preparación roma y siga dorsalmente hasta la aorta abdominal. Extirpar el segmento aórtico respectivo para crear un parche para su posterior injerto.
- Extirpar el diafragma alrededor de la vena cava suprahepática inferior y cortar las adherencias restantes con unas tijeras. Extraer el hígado.
- Realice una colecistectomía o apriete una ligadura alrededor del conducto cístico y enjuague el conducto biliar común con al menos 20 ml de solución de preservación. Coloque la cánula de perfusión en la vena porta y enjuague el injerto con otros 500 ml de solución de preservación. Coloque el injerto en un recipiente estéril colocado sobre hielo.
NOTA: Dependiendo del objetivo científico, el órgano puede prepararse inmediatamente para el injerto o mantenerse en hielo durante un período de tiempo indefinido (20 h en este protocolo) antes de comenzar la preparación y el injerto de la mesa posterior.
2. Preparación de la mesa posterior del hígado
- Eliminar el tejido linfático comenzando en el segmento aórtico y, por lo tanto, identificar y ocluir las ramas laterales arteriales y los vasos linfáticos con clips, ligaduras (polifilamento 4-0) o suturas (monofilamento 5-0; Figura 1A). Asimismo, retirar el tejido linfático alrededor de la vena porta y ocluir las ramas laterales con suturas (monofilamento 5-0).
- Identificar la vena cava suprahepática inferior y colocar suturas alrededor de ambas venas diafragmáticas (monofilamento 5-0) después de eliminar el tejido diafragmático circundante. Enjuague todos los recipientes con solución salina fría o solución de conservación para identificar cualquier fuga restante. Realice el acortamiento de los vasos y la preparación del parche aórtico solo después del injerto para tener en cuenta las circunstancias anatómicas individuales.
3. Hepatectomía del receptor, injerto hepático del donante y manejo perioperatorio
NOTA: Como receptoras de hígado, se utilizaron hembras domésticas (Sus scrofa domesticus) de 4-5 meses de edad y con un peso corporal promedio de aproximadamente 50 kg. De manera análoga a los donantes de hígado, los receptores habían estado en cuarentena en el centro de investigación animal durante un mínimo de 10 días antes del trasplante.
- Anestesia y manejo perioperatorio
- Realizar la premedicación mediante inyección intramuscular de atropina (0,04-0,08 mg/kg de peso corporal), zolazepam (5 mg/kg de peso corporal) y tiletamina (5 mg/kg de peso corporal). Después de establecer un acceso intravenoso (por ejemplo, vena del oído), inducir la anestesia con una inyección de propofol (1.5-2.5 mg / kg de peso corporal).
- Realizar la intubación con un tubo endotraqueal de 8,0-8,5 mm, dependiendo del tamaño y la anatomía del animal. Establecer monitorización de electrocardiografía, medición de gases respiratorios y saturación periférica de oxígeno, y medición no invasiva de la presión arterial. En el caso de un modelo crónico, aplique ungüento ocular para evitar la sequedad después de la intervención quirúrgica.
- Coloque al animal receptor sobre una base de calentamiento en posición supina y fije las extremidades en la base de la mesa de operaciones con bandas elásticas.
- Para un monitoreo prolongado, bajo guía de ultrasonido, coloque un catéter venoso central de tres lúmenes y un catéter venoso de gran calibre (7 Fr.) en la vena yugular interna y un catéter venoso de gran calibre (7 Fr.) para la terapia de volumen. Además, inserte un catéter arterial en la arteria carótida/cervical interna bajo control de ultrasonido para la medición invasiva de la presión arterial (Figura 1B).
- Mantener la anestesia durante la recuperación de órganos mediante inhalación de isoflurano (0,8-1,5 vol%) y aplicación intravenosa de fentanilo (0,003-0,007 mg/kg de peso corporal). Realice ventilación controlada por volumen durante todo el procedimiento. Aplicar 2.000 mg de sultamicilina para la antibiosis perioperatoria y 250 mg de metilprednisolona por vía intravenosa.
- Administrar un vasopresor como la norepinefrina por vía intravenosa para lograr una presión arterial media objetivo de 60 mmHg. Además, aplique soluciones cristaloides como la solución de lactato de Ringer o soluciones coloidales como gelatinas fluidas si es necesario.
- Aplicar gluconato de calcio (10%) y bicarbonato de sodio (8,4%), glucosa (40%) o cloruro de potasio (7,45%) por vía intravenosa con respecto a los análisis de gases en sangre obtenidos cada 30 min.
- Hepatectomía receptora
- Frote la piel con un agente antiséptico, por ejemplo, povidona yodada o alcohol isopropílico, y cubra al animal con cortinas estériles.
- Confirmar una profundidad adecuada de anestesia por pérdida de la respuesta de abstinencia al pellizco del dedo del pie. Realizar una laparotomía de línea media comenzando en el proceso xifoide mediante el uso de cauterización monopolar. Coloque un retractor abdominal y movilice el intestino a la izquierda del donante. Cubra el intestino con un paño humedecido.
- Colocar un catéter urinario suprapúbico para la optimización del manejo del volumen intraoperatorio.
- Cortar el ligamento falciforme y los ligamentos triangulares usando tijeras y cauterio bipolar. Después de una disección suficiente del hígado, rodear las venas cavas suprahepáticas e infrahepáticas inferiores cerca del parénquima hepático.
- Diseccionar y cortar el conducto biliar común por debajo de la unión del conducto cístico entre dos ligaduras (polifilamento 3-0).
- Incidir la capa peritoneal superficial que cubre el ligamento hepatoduodenal e identificar las arterias hepáticas poco antes de entrar en el parénquima hepático. Diseccionar usando cauterio bipolar o la colocación de clips, ligaduras o suturas.
- Diseccionar la aorta abdominal mediante una incisión en la línea media (capa avascular) de los músculos diafragmáticos derecho e izquierdo. Preparar la aorta para la anastomosis aórtica mediante la extirpación del tejido circundante.
NOTA: Este paso sólo es necesario si se realiza una anastomosis aórtica. De lo contrario, diseccionar aún más la arteria hepática / la región hiliar para prepararse para una anastomosis convencional de extremo a extremo entre las arterias hepáticas donante y receptora. - Realizar la hepatectomía receptora colocando una pinza vascular atraumática en la vena porta, seguida de pinzas vasculares atraumáticas en la vena cava suprahepática inferior (incluido el diafragma circundante mientras se retrae caudalmente el hígado) y la vena cava infrahepática inferior.
- Cortar los tres vasos cerca del parénquima hepático. Extraer el hígado receptor de la cavidad abdominal.
NOTA: El pinzamiento de los vasos marca el inicio de la fase anhepática. Durante la fase anhepática, los cerdos son hemodinámicamente inestables y requieren cantidades relevantes de vasopresores/catecolaminas. El anestesiólogo debe estar preparado para aplicar norepinefrina y epinefrina. Mantenga la fase hasta la reperfusión del hígado lo más corta posible. Comunicarse bien con el anestesiólogo.
- Injerto de hígado de donante
- Coloque el hígado del donante en la cavidad abdominal. Acortar la vena cava suprahepática donante y/o receptora inferior a una longitud adecuada evitando torceduras o demasiada tensión sobre la anastomosis.
- Colocar una sola sutura como hilo de soporte (monofilamento 5-0), adaptando la esquina derecha de la vena cava suprahepática donante y receptora inferior. Comience el lado dorsal de la anastomosis desde la esquina izquierda de los vasos con una sutura corriente (monofilamento 5-0, doble brazo).
- Al llegar a la esquina derecha, retire el hilo de soporte, asegure la sutura de carrera con una pinza y continúe con el lado ventral de la anastomosis, comenzando nuevamente desde la esquina izquierda del vaso (s). Apriete la sutura con múltiples nudos sin constreñir el diámetro del vaso para evitar la estenosis.
- Acorte la vena porta donante y/o receptora a una longitud adecuada evitando torceduras o demasiada tensión en la anastomosis.
- Realizar una anastomosis vascular de la vena porta donante y receptora análoga a los pasos 3.3.2-3.3.3 utilizando una sutura de doble brazo de monofilamento 6-0.
- Realizar la reperfusión portovenosa mediante la eliminación de la pinza vascular, ocluyendo la vena porta receptora, y ocluir la vena cava infrahepática inferior del donante con una pinza vascular después de drenar aproximadamente 200-400 mL de sangre. Retirar lentamente la pinza vascular que ocluye la vena cava suprahepática receptora inferior y buscar sangrado activo.
NOTA: La extracción de ambas pinzas marca el final de la fase anhepática. La cantidad de catecolaminas requeridas debe disminuir significativamente poco después. - Acortar la vena cava infrahepática donante y/o receptora inferior. Realizar una anastomosis vascular de la vena cava infrahepática donante y receptora inferior análoga a los pasos 3.3.2-3.3.3 utilizando una sutura de doble brazo de monofilamento 5-0. Retirar las pinzas que ocluyen la vena cava infrahepática inferior del donante y del receptor.
- Preparar un parche aortal elíptico (parche de Carrel) con un diámetro de aproximadamente 1-1,5, cm dependiendo de las circunstancias anatómicas, utilizando tijeras. Sujete la aorta abdominal con una pinza vascular Cooley atraumática y haga una incisión usando un bisturí. Amplíe la incisión con tijeras para ajustar el parche.
- Comience la anastomosis aórtica con una sutura para correr (monofilamento 6-0, doble brazo) en la esquina craneal de la incisión / parche. Al llegar a la esquina caudal, asegure la sutura de carrera con una pinza y complete la anastomosis nuevamente comenzando en la esquina craneal. Apriete la sutura con múltiples nudos y retire lentamente la pinza vascular.
NOTA: El pinzamiento de la aorta abdominal afectará significativamente la presión arterial del cerdo. Comunicarse bien con el anestesiólogo. - Coloque una gasa hemostática alrededor de la anastomosis arterial. Coloque un catéter en el conducto biliar común y asegúrelo con una sola ligadura. Asegúrese de no ocluir el diámetro del catéter.
- Cerrar el abdomen temporalmente adaptando la fascia muscular y la piel con una sutura para correr y cubrir el abdomen con film adhesivo y/o cortinas para evitar la pérdida térmica.
NOTA: Si los objetivos científicos requieren un modelo crónico, realizar una anastomosis de extremo a extremo entre el conducto biliar donante y receptor, cerrar el abdomen con suturas separadas para el peritoneo y la fascia muscular, y cerrar la piel con suturas individuales. - Al final del seguimiento, inyecte una dosis letal de 5.000 mg de pentobarbital sódico para la eutanasia intraoperatoria.
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Representative Results
La técnica presentada en este protocolo ha proporcionado resultados fiables y reproducibles en términos de estabilidad hemodinámica y supervivencia animal durante todo el procedimiento, así como la función del injerto en el curso postoperatorio.
Más recientemente, aplicamos el modelo para el estudio de la lesión por isquemia-reperfusión y las intervenciones terapéuticas que mitigan los efectos perjudiciales en el curso postoperatorio inmediato. Tras la recuperación y 20 h de almacenamiento en frío estático, se implantaron injertos hepáticos (con un peso medio de 983,38 g) de la manera descrita. Los experimentos terminaron 6 h después de la reperfusión venosa portal y el muestreo de sangre y bilis, así como de tejido hepático y del conducto biliar a intervalos definidos. Todos los receptores sobrevivieron al injerto y al seguimiento posterior de 6 h bajo anestesia general hasta la eutanasia.
Dado que el enfoque de este protocolo radica en la viabilidad de un modelo de trasplante hepático ortotópico porcino sin el uso de un bypass venovenoso, los resultados presentados aquí se limitan a los parámetros vitales intraoperatorios y la aplicación de vasopresores (Figura 2), así como al rendimiento del injerto, definido por parámetros de laboratorio convencionales, es decir, concentraciones séricas de lactato, aspartato transaminasa (AST), alanina transaminasa (ALT) y glutamato deshidrogenasa (GLDH), producción de bilis (Tabla 1) y prueba de capacidad funcional máxima hepática (LiMAx) como se describió previamente en un modelo de resección hepática porcina (Figura 3)26. La prueba LiMAx se basa en el metabolismo en tiempo real de la 13C-metacetina inyectada por vía intravenosa por el sistema CYP1A2 específico del hígado. Antes y después de la inyección, se determina la relación de 13CO 212CO2 en el aire exhalado para cuantificar la función hepática individual27.
Como era de esperar, los receptores requirieron mayores concentraciones de norepinefrina inmediatamente antes y durante toda la fase anhepática para estabilizar la presión arterial media (MAD) en ≥60 mmHg. Las bajas concentraciones de epinefrina se utilizaron simultáneamente para aumentar adicionalmente el gasto cardíaco en este período de tiempo vulnerable. Tras la reperfusión portal-venosa, la necesidad de vasopresores disminuyó rápidamente y aún más durante el pinzamiento temporal de la aorta abdominal para completar la anastomosis aórtica. Después del injerto, la MAD y las dosis requeridas de vasopresores permanecieron estables.
El tiempo medio de operación, definido como el tiempo desde la incisión cutánea hasta la finalización de todas las anastomosis vasculares y la reperfusión, fue de 103,50 min, incluida una fase anhepática media de 27,13 min. Cabe destacar que solo dos receptores se sometieron a una fase anhepática de más de 30 minutos. Todos los receptores mostraron una disminución de las concentraciones séricas de lactato 4 h después de la reperfusión venosa portal, y los valores de LiMAx obtenidos 6 h después de la reperfusión venosa portal fueron comparables a los valores medidos en los donantes de hígado antes de la obtención de órganos en todos menos un receptor (fase anhepática de 34 min).
Figura 1: Preparación del injerto y del receptor. (A) La figura representa la preparación de la mesa posterior del eje celíaco y el segmento aórtico. (B) Esta figura muestra al receptor en posición supina con monitorización prolongada, incluyendo un catéter venoso central (azul) en la vena yugular interna izquierda y un catéter arterial (rojo) en la arteria carótida/cervical interna derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Presión arterial media y concentraciones de vasopresores requeridas durante el injerto. La figura muestra la presión arterial media (MAD en mmHg) medida y las concentraciones de norepinefrina y epinefrina (en μg/kg/h) durante períodos de tiempo definidos a lo largo del procedimiento en los ocho receptores. Los valores se presentan como media ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Valores de la prueba de capacidad funcional máxima hepática (LiMAx) obtenida de los donantes antes de la obtención hepática y de los receptores 6 h después del injerto. La figura muestra los datos del diagrama de caja (media y error estándar de la media) de la prueba de capacidad de función máxima hepática (LiMAx) de los donantes antes de la obtención hepática y de los receptores 6 h después del injerto (n = 8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Experimento | Peso del injerto | Peso del receptor | GRWR | Tiempo de operación | Fase anhepática | Lactato (mmol/L) | Pico AST | ALT máximo | Pico GLDH | Volumen biliar | ||
| No. | g) | (kg) | (%) | (min) | (min) | 2 h | 4 h | 6 h | (U/L) | (U/L) | (U/L) | (ml) |
| 1 | 1082 | 48.8 | 2.22 | 115 | 25 | 5.8 | 4.7 | 3.7 | 677 | 122 | 39 | 48 |
| 2 | 946 | 51.4 | 1.84 | 125 | 34 | 6.6 | 5.9 | 5.2 | 1207 | 109 | 268 | 15 |
| 3 | 957 | 57.6 | 1.66 | 110 | 30 | 8.3 | 5.8 | 8.1 | 742 | 125 | 143 | 73 |
| 4 | 825 | 49.2 | 1.68 | 87 | 22 | 7.6 | 6.7 | 6.5 | 675 | 99 | 113 | 35 |
| 5 | 1045 | 53.4 | 1.96 | 101 | 25 | 7.9 | 6.8 | 5.6 | 919 | 86 | 129 | 25 |
| 6 | 924 | 45.2 | 2.04 | 105 | 32 | 6.7 | 4.6 | 3.7 | 414 | 90 | 114 | 75 |
| 7 | 785 | 48.2 | 1.63 | 95 | 24 | 6.8 | 4.8 | 4.1 | 557 | 70 | 110 | 1.5 |
| 8 | 1303 | 54.6 | 2.39 | 90 | 25 | 12.7 | 12.2 | 9.8 | 1011 | 87 | 94 | 10 |
| SIGNIFICAR | 983.38 | 51.05 | 1.93 | 103.50 | 27.13 | 7.80 | 6.44 | 5.84 | 775.25 | 98.50 | 126.25 | 35.31 |
| SEM | 57.59 | 1.41 | 0.10 | 4.57 | 1.52 | 0.76 | 0.88 | 0.78 | 90.79 | 6.73 | 23.00 | 9.87 |
Tabla 1: Variables perioperatorias de injerto y receptor. La tabla resume el peso del injerto y del receptor, así como la relación injerto-peso receptor (GRWR) y la duración de la operación (incisión de la piel hasta la finalización de toda la anastomosis vascular y reperfusión) y de la fase anhepática. Las variables que indican la función del injerto, como los parámetros de laboratorio convencionales, es decir, las concentraciones séricas de lactato, aspartato transaminasa (AST), alanina transaminasa (ALT) y glutamato deshidrogenasa (GLDH), y la producción de bilis se proporcionan para cada uno de los ocho trasplantes realizados.
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Discussion
Los desarrollos técnicos recientes, como la introducción de la perfusión por máquina, tienen el potencial de revolucionar el campo del trasplante hepático. Para traducir los conceptos de reacondicionamiento o modificación del injerto a entornos clínicos, los modelos de trasplante reproducibles en animales grandes son inevitables.
Después de la introducción inicial del trasplante hepático ortotópico porcino, varios autores han trabajado en la mejora de estas técnicas en las últimas cinco décadas. Las diferencias dentro de los enfoques quirúrgicos informados a menudo son menores y se refieren a anastomosis vasculares y biliares, anestesia y manejo perioperatorio. No obstante, en contraste con la situación actual en el trasplante hepático clínico en el que el uso del bypass venovenoso sigue siendo común pero opcional 28, un bypass portocaval activo o pasivo durante la fase anhepática en cerdos se considera una necesidad para reducir la congestión intestinal y, por lo tanto, la isquemia intestinal posterior con inestabilidad hemodinámica y mortalidad perioperatoria, como se describe en un trabajo bien elaborado de Esmaeilzadeh et al.25.
Además de los costos adicionales implicados y los desafíos técnicos de un bypass venovenoso, por ejemplo, catéteres, un dispositivo de bomba, la necesidad de anticoagulación adicional y posibles complicaciones como embolia aérea o hemorragia, y dependiendo del enfoque elegido, la necesidad de una esplenectomía simultánea ha llevado a los grupos a describir técnicas modificadas sin bypass venovenoso25,29, 30.
Torres et al.31 observaron una severa inestabilidad hemodinámica en animales sometidos a injerto sin el uso de bypass venovenoso en comparación con receptores con derivación portocava pasiva y, por lo tanto, realizaron pinzamiento temporal de la aorta supracelíaca en estos animales, que también fue descrito por otros en modelos de auto/alotrasplante hepático porcino 23,31,32 . Sin embargo, la inducción de isquemia caliente mediante pinzamiento cruzado de la aorta receptora conlleva el riesgo de liberación relevante de moléculas proinflamatorias y daño tisular tras la reperfusión y, por lo tanto, debe evitarse a toda costa para producir resultados científicos confiables, especialmente cuando se evalúa la lesión por isquemia-reperfusión. Además, este enfoque no se parece a la práctica clínica en humanos, lo que, por lo tanto, limita la traducción de los resultados obtenidos en estos modelos.
Para evitar medidas de apoyo tan perjudiciales, creemos que dos puntos son cruciales. (1) La fase anhepática debe mantenerse en un mínimo absoluto, es decir, por debajo de 30 min, como ya se ha demostrado en las primeras fases del trasplante de hígado porcino por Battersby et al.33. Creemos que las suturas de correr (de doble brazo) y un máximo de un hilo de soporte son suficientes para crear una anastomosis simple y segura tanto para la vena cava suprahepática inferior como para la vena porta. Obviamente, la reperfusión portal-venosa debe comenzar antes de anastomosar la vena cava infrahepática inferior. (2) El manejo anestésico debe ser realizado por un anestesiólogo experimentado, idealmente familiarizado con la cirugía hepática o el trasplante en pacientes humanos34. El manejo sofisticado del volumen y la terapia con vasopresores, es decir, norepinefrina y epinefrina, en combinación con una técnica quirúrgica simplificada son la base para la implementación exitosa de este modelo.
Curiosamente, solo un pequeño número de grupos quirúrgicos han proporcionado datos sobre el trasplante hepático ortotópico porcino exitoso sin derivación venovenosa y pinzamiento aórtico supracelíaco concomitante. Hasta donde sabemos, Oike et al., Heuer et al., y, más recientemente, Fondevila et al. fueron los únicos grupos que informaron sus resultados (prometedores), con tasas de supervivencia del 87%, 80% y 100%, respectivamente35,36,37. La mediana del tiempo anestapático en nuestra cohorte fue de 25 min y, por lo tanto, fue idéntica a los datos presentados por Heuer et al.36. Durante la fase anhepática, Oike et al.35 relataron una reducción del 50%-60% de la presión arterial, similar a las observaciones realizadas en esta cohorte, lo que llevó a un aumento de las dosis de vasopresores para evitar una disminución de la MAD por debajo de 60 mmHg. Heuer et al.36 no mencionaron el uso de la terapia con catecolaminas en su publicación, pero mencionaron no específicamente la transfusión de sangre total para mejorar la estabilidad hemodinámica. Este último no era necesario en este modelo. Fondevila et al., que relataron un tiempo arenal medio inferior a 20 min, se basaron únicamente en la administración de soluciones cristaloides y no aplicaron sustancias vasoactivas durante el injerto37.
Cabe destacar que, a diferencia de las publicaciones recientes que aplican la anastomosis de extremo a extremo de la arteria hepática del donante a la receptora19,22, este modelo incluye una anastomosis de extremo a lado con un parche de Carrel de la aorta del donante que se anastomosa a la aorta supracelíaca del receptor. Especialmente para entornos experimentales, con el uso de órganos que cumplen con los criterios extendidos del donante, por ejemplo, tiempo isquémico frío prolongado, podría ser favorable descartar cualquier problema con la perfusión arterial del injerto. La aplicación de un parche de Carrel ayudará a evitar la estenosis de la anastomosis arterial que podría llegar a ser funcionalmente relevante en el caso de vasoespasmos periféricos concomitantes observados con frecuencia después de la reperfusión. Sin embargo, este enfoque llevará más tiempo que la anastomosis convencional de extremo a extremo debido al acceso más elaborado de la aorta.
Como nuestros experimentos representativos se centraron en la fase postoperatoria inmediata y la lesión por isquemia-reperfusión, los receptores se mantuvieron bajo anestesia y fueron sacrificados 6 h después de la reperfusión. Aunque beneficioso con respecto al bienestar animal, esto constituye una limitación significativa para la validación de nuestra técnica con respecto a la supervivencia del injerto y del receptor. Creemos, sin embargo, que sobre la base de los parámetros vitales, hemodinámica, aclaramiento de lactato, producción de bilis y, especialmente, el metabolismo CYP1A2 específico del hígado en tiempo real (prueba LiMAx) observado durante el seguimiento, la aplicación a largo plazo de nuestro modelo debería ser factible, especialmente porque los injertos utilizados en los experimentos se sometieron a almacenamiento en frío estático durante 20 h antes del injerto, en contraste con la aplicación exitosa de modelos de trasplante comparables por otros35, 36,37. Además, los relatos previos mencionados demostraron que la mortalidad perioperatoria se observó exclusivamente durante y hasta 6 h después de la cirugía, excepto un receptor que murió de embolia pulmonar en el primer día postoperatorio en el estudio de Oike et al.35.
En este trabajo, demostramos que un enfoque simplificado para el trasplante hepático ortotópico porcino sin el uso de un bypass venovenoso durante el injerto se puede realizar de manera segura y es más rentable, sin alteraciones hemodinámicas significativas o mortalidad intraoperatoria incluso después del almacenamiento prolongado en frío estático del órgano donante. Tal modelo debe ser de especial interés para grupos de trabajo (quirúrgicos) que se centran en el curso postoperatorio inmediato, la lesión por isquemia-reperfusión, el reacondicionamiento de órganos donantes de criterios extendidos y los mecanismos inmunológicos asociados.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Britta Trautewig, Corinna Löbbert, Astrid Dinkel e Ingrid Meder por su diligencia y compromiso. Además, los autores agradecen a Tom Figiel por producir el material fotográfico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Abdominal retractor | No Company Name available | No Catalog Number available | |
| Aortic clamp, straight | Firma Martin | No Catalog Number available | |
| Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL | Radiometer Medical ApS | 956-622 | |
| Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL) | B.Braun | 648037 | |
| Backhaus clamp | Bernshausen | BF432 | |
| Bipolar forceps, 23 cm | SUTTER | 780222 SG | |
| Bowl 5 L, 6 L, 9 L | Chiru-Instrumente | 35-114327 | |
| Braunol Braunoderm | B.Braun | 3881059 | |
| Bulldog clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Button canula | Krauth + Timmermann GmbH | 1464LL1B | |
| Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%)) | B.Braun | 2353745 | |
| Cell Saver (Autotransfusion Reservoir) | Fresenius Kabi AG | 9108471 | |
| Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm | Arrow | AD-24703 | |
| Clamp | INOX | B-17845 / BH110 / B-481 | |
| Clamp | Aesculap | AN909R | |
| Clamp, 260 mm | Fehling Instruments GMbH &Co.KG | ZAU-2 | |
| Clip Forceps, medium | Ethicon | LC207 | |
| Clip forceps, small | Ethicon | LC107 | |
| CPDA-1 solution | Fresenius Kabi AG | 41SD09AA00 | |
| Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution) | Dr.Franz Köhler Chemie GmbH | 2125921 | |
| Dissecting scissors | LAWTON 05-0641 | No Catalog Number available | |
| Dissecting scissors, 180 mm | Metzenbaum | BC606R | |
| Endotracheal tube 8.0 mm | Covetrus | 800764 | |
| Epinephrine (Adrenalin 1:1000) | InfectoPharm | 9508734 | |
| Falcon Tubes 50ml | Greiner | 227 261 L | |
| Femoralis clamp | Ulrich | No Catalog Number available | |
| Fentanyl 0.1mg | PanPharma | 00483 | |
| Forceps, anatomical | Martin | 12-100-20 | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD052R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD032R | |
| Forceps, anatomical, 250 mm | Aesculap | BD240R | |
| Forceps, surgical | Bernshausen | BD 671 | |
| Forceps, surgical | INOX | B-1357 | |
| G40 solution | Serag Wiessner | 10755AAF | |
| Gelafundin ISO solution 40 mg/mL | B. Braun | 210257641 | |
| Guidewire with marker | Arrow | 14F21E0236 | |
| Haemostatic gauze ("Tabotamp" 5 x 7.5 cm) | Ethicon | 474273 | |
| Heparin sodium 25,000IE | Ratiopharm | W08208A | |
| Hico-Aquatherm 60 | Hospitalwerk | No Catalog Number available | |
| Infusion Set Intrafix | B.Braun | 4062981 L | |
| Intrafix SafeSet 180 cm | B.Braun | 4063000 | |
| Introcan Safety, 18 G | B.Braun | 4251679-01 | |
| Isofluran CP | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| Large-bore venous catheter, 7Fr. | Edwards Lifesciences | I301F7 | |
| Ligaclip, medium | Ethicon | LT200 | |
| Ligaclip, small | Ethicon | LT100 | |
| Material scissors | Martin | 11-285-23 | |
| Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg) | Sanofi | 7823704 | |
| Monopolar ERBE ICC 300 | Fa. Erbe | No Catalog Number available | |
| NaCl solution (0.9%) | Baxter | 1533 | |
| Needle holder | Aesculap | BM36 | |
| Needle holder | Aesculap | BM035R | |
| Needle holder | Aesculap | BM 67 | |
| Neutral electrode | Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen | 21191 - 060 | |
| Norepinephrine (Sinora) | Sintetica GmbH | 04150124745717 | |
| Omniflush Sterile Filed 10 mL | B.Braun | 3133335 | |
| Original Perfusorline 300 cm | B.Braun | 21E26E8SM3 | |
| Overhold clamp | INOX | BH 959 | |
| Overhold clamp | Ulrich | CL 2911 | |
| Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL) | WDT, Garbsen | 21217 | |
| Perfusers | B.Braun | 49-020-031 | |
| Perfusor Syringe 50 mL | B.Braun | 8728810F | |
| Petri dishes 92 x 17 mm | Nunc | 150350 | |
| Poole Suction Instrument Argyle flexibel | Covidien, Mansfield USA | 20C150FHX | |
| Potassium chloride (7.45%) | B.Braun | 4030539078276 | |
| Pressure measurement set | Codan pvb Medical GmbH | 957179 | |
| Propofol (1%) | CP-Pharma | No Catalog Number available | |
| S-Monovette 2.6 mL K3E | Sarstedt | 04.1901 | |
| S-Monovette 2.9 mL 9NC | Sarstedt | 04.1902 | |
| S-Monovette 7.5 mL Z-Gel | Sarstedt | 11602 | |
| Sartinski clamp | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Scalpel No.11 | Feather Safety Razor Co.LTD | 02.001.40.011 | |
| Scissors | INOX | BC 746 | |
| Seldinger Arterial catheter | Arrow | SAC-00520 | |
| Sodium bicarbonate (8.4%) | B.Braun | 212768082 | |
| Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC") | B.Braun | 4899719 | |
| Sterofundin ISO solution | B.Braun | No Catalog Number available | |
| Suction | Dahlhausen | 07.068.25.301 | |
| Suction Aesculap Securat 80 | Aesculap | No Catalog Number available | |
| Suction catheter | ConvaTec | 5365049 | |
| Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam) | Pfizer | DL253102 | |
| Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm | ConvaTec | UK 1F02772 | |
| Suprasorb ("Toptex lite RK") | Lohmann & Rauscher | 31654 | |
| Suture Vicryl 3-0 | Ethicon | VCP 1218 H | |
| Suture Vicryl 4-0 | Ethicon | V392H | |
| Suture, Prolene 4-0 | Ethicon | 7588 H | |
| Suture, Prolene 5-0, double armed | Ethicon | 8890 H | |
| Suture, Prolene 5-0, single armed | Ethicon | 8720 H | |
| Suture, Prolene 6-0, double armed | Ethicon | 7230 H | |
| Suture, Prolene 6-0, single armed | Ethicon | EH 7406 H | |
| Suture, Prolene: blau 3-0 | Ethicon | EH 7499H | |
| Suture, Safil 2/0 | Aesculap | C 1038446 | |
| Suture, Terylene 0 | Serag Wiessner | 353784 | |
| Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL | B.Braun | 4606027V | |
| TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm | Fresenius Kabi AG | 2877101 | |
| Ultrasound Butterfly IQ+ | Butterfly Network Inc. | 850-20014 | |
| Ventilator "Oxylog Dräger Fl" | Dräger Medical AG | No Catalog Number available | |
| Yankauer Suction | Medline | RA19GMD | |
| Zoletil 100 mg/mL (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin) | Virbac | 794-861794861 |
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