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Biochemistry

इन विट्रो नकली गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल तरल पदार्थ के मल्टी सबफेज एक्सचेंज के माध्यम से एकल बूंद में इमल्शन का पाचन

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

मल्टी-सबफेज एक्सचेंज के साथ लागू एक पेंडेंट ड्रॉप सतह फिल्म संतुलन, जिसे ऑक्टोपस उपनाम दिया गया है, नकली गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल तरल पदार्थ के साथ मूल थोक समाधान के अनुक्रमिक उपचरण विनिमय द्वारा पाचन स्थितियों की नकल करने की अनुमति देता है। नकली इन विट्रो पाचन की निगरानी पाचन की निगरानी पाचन इंटरफेशियल परत के इंटरफेशियल तनाव को सीटू में रिकॉर्ड करके की जाती है।

Abstract

वर्तमान में इमल्शन का उपयोग विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों जैसे मोटापा, पोषक तत्व फोर्टिफिकेशन, खाद्य एलर्जी और पाचन रोगों से निपटने के लिए पोषक तत्वों और दवाओं को समाहित करने और वितरित करने के लिए किया जा रहा है। वांछित कार्यक्षमता प्रदान करने के लिए एक इमल्शन की क्षमता, अर्थात्, जठरांत्र संबंधी मार्ग के भीतर एक विशिष्ट साइट तक पहुंचना, लिपोलिसिस को रोकना / मंद करना, या पाचनशक्ति को सुविधाजनक बनाना, अंततः जठरांत्र संबंधी मार्ग में एंजाइमेटिक गिरावट के लिए इसकी संवेदनशीलता पर निर्भर करता है। तेल-इन-वाटर इमल्शन में, लिपिड बूंदें इंटरफेशियल परतों से घिरी होती हैं, जहां इमल्सीफायर इमल्शन को स्थिर करते हैं और एनकैप्सुलेटेड यौगिक की रक्षा करते हैं। इमल्शन की अनुरूप पाचनशक्ति प्राप्त करना उनकी प्रारंभिक संरचना पर निर्भर करता है, लेकिन उन इंटरफेशियल परतों के विकास की निगरानी की भी आवश्यकता होती है क्योंकि वे जठरांत्र संबंधी पाचन के विभिन्न चरणों के अधीन होते हैं। मल्टी-सबफेज एक्सचेंज के साथ लागू एक पेंडेंट ड्रॉप सतह फिल्म संतुलन एक अनुकूलित स्थिर पाचन मॉडल को लागू करके तेल में डूबी एकल जलीय बूंद में इमल्शन के इन विट्रो पाचन का अनुकरण करने की अनुमति देता है। जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से पारगमन कृत्रिम मीडिया के साथ मूल बूंद थोक समाधान के उपचरण विनिमय द्वारा नकल किया जाता है, जो जठरांत्र संबंधी मार्ग के प्रत्येक डिब्बे / चरण की शारीरिक स्थितियों की नकल करता है। इंटरफेशियल तनाव का गतिशील विकास पूरे सिम्युलेटेड गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पाचन में सीटू में दर्ज किया गया है। पचने वाले इंटरफेस के यांत्रिक गुण, जैसे कि इंटरफेशियल फैलाव लोच और चिपचिपाहट, प्रत्येक पाचन चरण (मौखिक, गैस्ट्रिक, छोटी आंत) के बाद मापा जाता है। प्रत्येक पाचन मीडिया की संरचना को पाचन स्थितियों की विशिष्टताओं के लिए ट्यून किया जा सकता है, जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पैथोलॉजी और शिशु पाचन मीडिया शामिल हैं। प्रोटियोलिसिस और लिपोलिसिस को प्रभावित करने वाले विशिष्ट इंटरफेशियल तंत्र की पहचान की जाती है, जो इमल्शन के इंटरफेशियल इंजीनियरिंग द्वारा पाचन को संशोधित करने के लिए उपकरण प्रदान करते हैं। प्राप्त परिणामों को कम एलर्जेनिसिटी, नियंत्रित ऊर्जा सेवन और कम पाचनशक्ति जैसी अनुरूप कार्यक्षमताओं के साथ नए खाद्य मैट्रिक्स डिजाइन करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है।

Introduction

यह समझना कि वसा कैसे पचता है, जिसमें इमल्शन पाचन शामिल है, तर्कसंगत रूप सेअनुरूप कार्यक्षमता वाले उत्पादों को डिजाइन करने के लिए महत्वपूर्ण है। वसा पाचन के लिए सब्सट्रेट एक इमल्शन है क्योंकि वसा को यांत्रिक क्रिया द्वारा खपत पर पायसीकृत किया जाता है और मुंह और पेट में बायोसर्फेक्टेंट्स के साथ मिलाया जाता है। इसके अलावा, मनुष्यों द्वारा खपत अधिकांश वसा पहले से ही इमल्सीफाइड (जैसे दूध उत्पाद) है, और शिशुओं या कुछ बुजुर्ग लोगों के मामले में, यह खपत का एकमात्र रूप है। इसलिए, विशिष्ट पाचन प्रोफाइल के साथ इमल्शन-आधारित उत्पादों का डिजाइन पोषण1 में बहुत महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, इमल्शन विभिन्न गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों जैसे मोटापा3, पोषक तत्व फोर्टिफिकेशन, खाद्य एलर्जी और पाचन रोगों से निपटने के लिए पोषक तत्वों, दवाओं, या लिपोफिलिक बायोएक्टिव्स2 को समाहित और वितरित कर सकते हैं। तेल-इन-पानी इमल्शन में, लिपिड बूंदें प्रोटीन, सर्फेक्टेंट, पॉलिमर, कण और मिश्रण जैसे इमल्सीफायर की इंटरफेशियल परतों सेघिरी होती हैं। पायसीकारकों की भूमिका दोहरी है: इमल्शन5 को स्थिर करें और एक विशिष्ट साइट पर एनकैप्सुलेटेड यौगिक की रक्षा / परिवहन करें। इमल्शन की अनुरूप पाचनशक्ति प्राप्त करना उनकी प्रारंभिक संरचना पर निर्भर करता है, लेकिन गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट के माध्यम से पारगमन के दौरान इस इंटरफ़ेस के निरंतर विकास की निगरानी की भी आवश्यकता होती है (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्र 1: कुछ मुख्य गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों से निपटने के लिए इमल्शन के इंटरफेशियल इंजीनियरिंग को लागू करना। कृपया इस आंकड़े के बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लिपिड पाचन अंततः एक इंटरफेशियल प्रक्रिया है क्योंकि इसके लिए तेल में निहित ट्राइग्लिसराइड्स को मुक्त फैटी एसिड और मोनोसिलग्लिसराइड्स 6 में पहुंचने और हाइड्रोलाइज करने के लिए इंटरफेशियल परत के माध्यम से इमल् सीफाइड लिपिड बूंदों के तेल-पानी इंटरफेस पर लाइपेस (गैस्ट्रिक या अग्नाशय) के सोखना की आवश्यकता होती है। यह चित्र 2 में स्कीमाइज़ किया गया है। गैस्ट्रिक लाइपेस तेल-पानी इंटरफ़ेस (चित्रा 2, गैस्ट्रिक पाचन) के लिए पेट में पेप्सिन और फॉस्फोलिपिड्स के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। फिर, अग्नाशयी लाइपेस / कोलिपेस छोटी आंत में ट्रिप्सिन / काइमोट्रिप्सिन, फॉस्फोलिपिड्स, पित्त लवण और पाचन उत्पादों के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। प्रोटीज इंटरफेशियल कवरेज को बदल सकते हैं, लाइपेस सोखना को रोक सकते हैं या अनुकूल बना सकते हैं, जबकि पित्त लवण अत्यधिक सतह सक्रिय होते हैं और लाइपेस सोखना को बढ़ावा देने के लिए शेष पायसीकारक में से अधिकांश को विस्थापित करते हैं (चित्रा 2, आंतों का पाचन)। आखिरकार, लिपोलिसिस की दर और सीमा प्रारंभिक / गैस्ट्रिक पचने वाले इमल्शन के इंटरफेशियल गुणों पर निर्भर करती है, जैसे कि मोटाई, इंटर / इंट्रामोलेक्यूलर कनेक्शन, और इलेक्ट्रोस्टैटिक और स्टेरिक इंटरैक्शन। तदनुसार, इंटरफेशियल परत के विकास की निगरानी करना क्योंकि यह पच जाता है, लाइपेस सोखना को प्रभावित करने वाले इंटरफेशियल तंत्र और घटनाओं की पहचान करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है और इसलिए, लिपिड पाचन।

Figure 2
चित्रा 2: गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल लिपिड पाचन में इंटरफेस की भूमिका को दर्शाते हुए योजनाबद्ध आरेख। पेप्सिन हाइड्रोलिसिस गैस्ट्रिक चरण में इंटरफेशियल संरचना को बदल देता है, जबकि गैस्ट्रिक लाइपेस ट्राइग्लिसराइड्स को हाइड्रोलाइज करता है। छोटी आंत में, ट्रिप्सिन / काइमोट्रिप्सिन इंटरफेशियल फिल्म को आगे बढ़ाता है, जबकि लिपोलिसिस बीएस / लाइपेस के सोखना, ट्राइग्लिसराइड्स के हाइड्रोलिसिस और बीएस मिसेल / कॉम्प्लेक्स में घुलनशीलता द्वारा लिपोलाइटिक उत्पादों के प्रदूषकों द्वारा आगे बढ़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्रेनेडा विश्वविद्यालय (यूजीआर) में पेंडेंट ड्रॉप उपकरण को एक पेटेंट तकनीक, समाक्षीय डबल केशिका के साथ लागू किया गया है, जो थोक समाधान 7 के उपचरण विनिमय को सक्षम बनाताहै। केशिका, जो पेंडेंट ड्रॉप रखती है, में दो समाक्षीय केशिकाओं की व्यवस्था होती है जो स्वतंत्र रूप से डबल माइक्रोइंजेक्टर के प्रत्येक चैनल से जुड़ी होती हैं। प्रत्येक माइक्रोइंजेक्टर स्वतंत्र रूप से काम कर सकता है, जिससे प्रवाह के माध्यम से गिराई गई सामग्री का आदान-प्रदानहो सकता है। तदनुसार, सबफेज एक्सचेंज में आंतरिक केशिका के साथ नए समाधान का एक साथ इंजेक्शन और एक ही प्रवाह दर का उपयोग करके बाहरी केशिका के साथ थोक समाधान का निष्कर्षण होता है। यह प्रक्रिया इंटरफेशियल क्षेत्र या बूंद की मात्रा की कोई गड़बड़ी के बिना थोक समाधान के प्रतिस्थापन की अनुमति देती है। इस प्रक्रिया को बाद में एक बहु-उपचरण विनिमय में अपग्रेड किया गया था, जो ड्रॉपलेट बल्क समाधान 8 के आठ अनुक्रमिक सबफेज एक्सचेंजों की अनुमति देताहै। यह लिपिडिक मीडिया में निलंबित एकल जलीय बूंद में पाचन प्रक्रिया के अनुकरण को सक्षम बनाता है, क्रमिक रूप से विभिन्न डिब्बों (मुंह, पेट, छोटी आंत) की नकल करने वाले कृत्रिम मीडिया के साथ थोक समाधान का आदान-प्रदान करके। पूरे सेटअप को चित्र 3 में दर्शाया गया है, जिसमें घटकों का विवरण भी शामिल है। माइक्रोइंजेक्टर में सिरिंज आठ वायस वाल्व से जुड़े होते हैं, प्रत्येक एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब से जुड़ता है जिसमें चित्र 2 में वर्णित घटकों के साथ कृत्रिम पाचन द्रव होता है।

Figure 3
चित्रा 3: सभी घटकों के साथ ऑक्टोपस का सामान्य दृश्य। सीसीडी कैमरा, माइक्रोस्कोप, माइक्रो-पोजिशनर, थर्मोस्टेबलाइज्ड सेल और डबल केशिका स्वतंत्र रूप से एक डबल माइक्रोइंजेक्टर से जुड़े होते हैं, जिसमें आठ वायस वाल्व से जुड़े दो सिरिंज होते हैं। प्रत्येक सिरिंज केशिका, नमूना और एक निर्वहन के साथ चार माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों से जुड़ता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4 ए दिखाता है कि कैसे प्रत्येक कृत्रिम पाचन तरल पदार्थ को डबल केशिका के माध्यम से सबफेज एक्सचेंज द्वारा पेंडेंट ड्रॉप में इंजेक्ट किया जाता है। चित्रा 2 में विस्तृत प्रत्येक पाचन यौगिक को एक साथ / क्रमिक रूप से लागू किया जा सकता है, जो जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से मार्ग का अनुकरण करता है। कृत्रिम पाचन तरल पदार्थों में विभिन्न एंजाइम और बायोसर्फेक्टेंट होते हैं, जो प्रारंभिक पायसीकारक के इंटरफेशियल तनाव को बदलते हैं, जैसा कि चित्रा 4 बी में स्कीमाटाइज्ड है। यूजीआर में विकसित सॉफ्टवेयर DINATEN ( सामग्री की तालिका देखें), वास्तविक समय में इंटरफेशियल तनाव के विकास को रिकॉर्ड करता है क्योंकि प्रारंभिक इंटरफेशियल परत विट्रो में पच जाती है। इसके अलावा, प्रत्येक पाचन चरण के बाद, इंटरफेशियल परत की फैलाव लोच की गणना स्थिर इंटरफेशियल परत पर मात्रा / इंटरफेशियल क्षेत्र के आवधिक दोलनों को लागू करके और इंटरफेशियल तनाव की प्रतिक्रिया को रिकॉर्ड करके की जाती है। आवृत्ति और दोलन के आयाम को भिन्न किया जा सकता है, और सॉफ्टवेयर के साथ छवि प्रसंस्करण CONTACTO डिलैटेशनल रियोलॉजिकल पैरामीटर 8 प्रदान करताहै।

Figure 4
चित्र 4: पाचन प्रोफाइल के उदाहरण। (A) प्रारंभिक पायसीकारक परत को पेंडेंट ड्रॉप में विभिन्न समाधानों के अनुक्रमिक उपचरण विनिमय द्वारा माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में रखे गए कृत्रिम पाचन मीडिया के अधीन किया जाता है। (बी) प्रारंभिक पायसीकारक के इंटरफेशियल तनाव (वाई-अक्ष) का सामान्य विकास समय (एक्स-अक्ष) के कार्य के रूप में होता है क्योंकि यह कृत्रिम मीडिया में विभिन्न एंजाइमों / बायोसर्फेक्टेंट्स द्वारा विट्रो में पच जाता है। सादे आंतों के तरल पदार्थ के साथ एक अंतिम उपचरण विनिमय मिश्रित मिसेल में घुलनशीलता द्वारा पचे हुए लिपिड के प्रदूषक को मापता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

यह अध्ययन पेंडेंट ड्रॉप उपकरण 9 के साथ इंटरफेशियल परतों के इन विट्रो पाचन को मापने के लिए डिज़ाइन किए गए सामान्य प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करताहै। प्रारंभिक इंटरफेशियल परत को क्रमिक रूप से जठरांत्र संबंधी मार्ग के माध्यम से मार्ग की नकल करने वाली स्थितियों के अधीन किया जाता है, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है। इन विभिन्न पाचन मीडिया को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों (चित्रा 4 ए) में निहित विभिन्न समाधानों के उपचरण विनिमय द्वारा पेंडेंट ड्रॉप में इंजेक्ट किया जाता है। इन मीडिया की संरचना को गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल स्थितियों के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है, जिनका मूल्यांकन किया जाएगा, अर्थात्, गैस्ट्रिक / आंतों के प्रोटियोलिसिस / लिपोलिसिस, संचयी प्रभाव और सिनेर्जीको मापने की अनुमति देता है। प्रत्येक डिब्बे में पाचन प्रक्रिया की नकल करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रयोगात्मक स्थितियां इन्फोजेस्ट द्वारा प्रकाशित अंतर्राष्ट्रीय सहमति प्रोटोकॉल का पालन करती हैं, जिसमें पीएच और इलेक्ट्रोलाइट्स और एंजाइमों की मात्रा का विवरणदिया गया है। पेंडेंट ड्रॉप पर आधारित प्रयोगात्मक उपकरण नकली पाचन प्रक्रिया के दौरान सीटू में इंटरफेशियल तनाव की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। इंटरफेशियल परत के फैलाव संबंधी रिओलॉजी की गणना प्रत्येक पाचन चरण के अंत में की जाती है। इस तरह, प्रत्येक पायसीकारक एक पाचन प्रोफ़ाइल प्रदान करता है जो पचे हुए इंटरफेस के गुणों को दर्शाता है, जैसा कि चित्र 4 बी में दर्शाया गया है। यह पाचन प्रक्रिया के विभिन्न चरणों के लिए इसकी संवेदनशीलता या प्रतिरोध के बारे में निष्कर्ष निकालने की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर, कृत्रिम पाचन मीडिया में एसिड / मूल पीएच, इलेक्ट्रोलाइट्स, प्रोटीज (गैस्ट्रिक और आंतों), लाइपेस (गैस्ट्रिक और आंतों), पित्त लवण और फॉस्फोलिपिड्स होते हैं, जो अपने संबंधित पाचन तरल पदार्थ (गैस्ट्रिक या आंतों) में घुल जाते हैं। चित्रा 4 बी एक पायसीकारक के इंटरफेशियल तनाव के विकास की एक सामान्य प्रोफ़ाइल दिखाता है, जो पहले प्रोटीज कार्रवाई के अधीन होता है, उसके बाद लाइपेस। सामान्य तौर पर, इंटरफेशियल परत का प्रोटियोलिसिस हाइड्रोलाइज्ड पेप्टाइड्स 9,12 के प्रदूषकों के कारण इंटरफेशियल तनाव में वृद्धि को बढ़ावा देता है, जबकि लिपोलिसिस के परिणामस्वरूप पित्त लवण और लाइपेस13 के सोखने के कारण इंटरफेशियल तनाव में बहुत तेज कमी आती है। आंतों के तरल पदार्थ के साथ एक अंतिम उपचरण विनिमय अशोषित / पचने वाली सामग्री के थोक समाधान को कम करता है और घुलनशील यौगिकों के प्रदूषकों को सोखने और मिश्रित मिसेल में पचे हुए लिपिड के घुलनशीलता को बढ़ावा देता है। यह दर्ज किए गए बढ़े हुए इंटरफेशियल तनाव (चित्रा 4 बी) द्वारा निर्धारित किया गया है।

सारांश में, एक बूंद में इन विट्रो पाचन को अनुकरण करने के लिए पेंडेंट ड्रॉप में लागू प्रयोगात्मक डिजाइन संचयी प्रभाव और तालमेल को मापने की अनुमति देता है क्योंकि पाचन प्रक्रिया को प्रारंभिक इंटरफेशियल परत10 पर क्रमिक रूप से लागू किया जाता है। प्रत्येक पाचन मीडिया की संरचना को पाचन स्थितियों की विशिष्टताओं के लिए आसानी से ट्यून किया जा सकता है, जिसमें गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पैथोलॉजी या शिशु पाचन मीडिया14 शामिल हैं। फिर, प्रोटियोलिसिस और लिपोलिसिस को प्रभावित करने वाले इंटरफेशियल तंत्र की पहचान का उपयोग इमल्शन के इंटरफेशियल इंजीनियरिंग द्वारा पाचन को संशोधित करने के लिए किया जा सकता है। प्राप्त परिणामों को कम एलर्जेनिसिटी, नियंत्रित ऊर्जा सेवन और कम पाचन क्षमता15,16,17,18,19 जैसी अनुरूप कार्यक्षमताओं के साथ नए खाद्य मैट्रिक्स को डिजाइन करने में लागू किया जा सकता है।

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Protocol

1. सतह विज्ञान प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी ग्लासवेयर के लिए सफाई अनुक्रम

  1. ग्लासवेयर को एक केंद्रित सफाई समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पानी (10%) में पतला स्क्रब करें।
  2. नल के पानी, प्रोपेनोल, आसुत जल और अल्ट्राप्योर पानी के अनुक्रम के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें। एक केबिन में सुखाएं और उपयोग होने तक एक बंद कैबिनेट में स्टोर करें।

2. नमूना तैयारी

  1. INFOGEST मानकीकृत प्रोटोकॉल11,20 के अनुसार कृत्रिम पाचन मीडिया तैयार करें (सामग्री की तालिका देखें)। विवरण के लिए, तालिका 1 देखें और सतह सक्रिय संदूषण और नमूनों के कमजोर पड़ने को रोकने के लिए इंटरफेशियल कार्य की आवश्यकताओं के लिए छोटे अनुकूलन शामिल करें (1: 10)10।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए पायसीकारक समाधान तैयार करें।
    1. (1 किग्रा· के केंद्रित घोल का 0.01 लीटर तैयार करें) एल-1) प्रारंभिक बफर (तालिका 1) में पायसीफायर या पायसीकारक का मिश्रण (सामग्री की तालिका देखें) और रात भर हल्के आंदोलन के तहत रखें।
    2. 0.1 किलो तक पतला करें · इंटरफ़ेस को संतृप्त करने के लिए एल -1 (या आवश्यकतानुसार); पहले प्रकाशित रिपोर्ट 21 के बाद एक निरंतर इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखने के 1 घंटे के बाद इंटरफेशियल तनाव में एक छद्म पठार तकपहुंचना।
    3. उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए हल्के आंदोलन के तहत रखें।
  3. तेल चरण को शुद्ध करें।
    1. वनस्पति तेल (सूरजमुखी, जैतून, ट्रिओलिन, आदि) का मिश्रण तैयार करें। और मैग्नीशियम मेटासिलिकेट रेजिन ( सामग्री की तालिका देखें) एक बड़े बीकर में 2: 1 डब्ल्यू / डब्ल्यू के अनुपात में। कम से कम 3 घंटे के लिए हल्के यांत्रिक आंदोलन के तहत रखें।
    2. वाणिज्यिक सेंट्रीफ्यूज में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 8,000 x g पर मिश्रण को सेंट्रीफ्यूज करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    3. एक सिरिंज फिल्टर (0.2 μm छिद्र आकार) के साथ वैक्यूम के तहत तेल मिश्रण को फ़िल्टर करें ( सामग्री की तालिका देखें)। उपयोग होने तक नाइट्रोजन के साथ सील और बुलबुले वाली साफ एम्बर बोतलों में स्टोर करें।

3. ऑक्टोपस का अंशांकन और सफाई

  1. एक केशिका (वाल्व 6/4) और बाहरी निकास (वाल्व 8-नीले रंग) के माध्यम से सिरिंज और सभी वाल्वों दोनों को साफ करने का अनुक्रम स्थापित करके अल्ट्राप्योर पानी के साथ सभी टयूबिंग को कुल्ला करें। बाएं संवाद (पूरक चित्रा 1 ए) में क्लीन बटन दबाकर इसे निष्पादित करें।
  2. पानी की बूंद बनाकर और 5 मिनट के लिए वास्तविक समय में मापकर कमरे के तापमान पर पानी के सतह तनाव7 की जांच करें (पूरक चित्र 1 बी, सी)।
    1. वायु-जल के लिए विभेदक घनत्व निर्धारित करें (0.9982 किग्रा· एल -1) बाएं संवाद में, पूरक चित्र 1 बी।
  3. 0.002 एल स्वच्छ वनस्पति तेल के साथ स्वच्छ क्यूवेट (ऑप्टिकल ग्लास) भरें और इसे थर्मोस्टेटिक सेल (चित्रा 3) में क्यूवेट धारक में रखें।
  4. थर्मोस्टेट सेट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर तापमान संतुलन की अनुमति दें।
  5. कमरे के तापमान7 पर पानी-तेल के इंटरफेशियल तनाव की जांच करें।
    1. वनस्पति तेल-पानी के लिए अंतर घनत्व निर्धारित करें (जैतून का तेल: 0.800 किलोग्राम · एल -1) (पूरक चित्रा 1 सी)।
    2. 0.5 μL-1 की दर से 40 μL इंजेक्ट करें और इंजेक्शन के अंत तक हर सेकंड वास्तविक समय में मापें। यह एक सरल गतिशील प्रक्रिया है (पूरक चित्रा 1 बी, डी)।
    3. डेटा शीट में ड्रॉपलेट वॉल्यूम के फ़ंक्शन के रूप में इंटरफेशियल तनाव को प्लॉट करें।
    4. जांचें कि ड्रॉपलेट वॉल्यूम रेंज ड्रॉपलेट वॉल्यूम से स्वतंत्र इंटरफेशियल तनाव के लिए एक मूल्य प्रदान करती है। ड्रॉपलेट वॉल्यूम के फ़ंक्शन के रूप में इंटरफेशियल क्षेत्र को प्लॉट करें।
    5. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए दो चरणों (पूरक चित्रा 1 बी और पूरक चित्रा 2 ए) वाली प्रक्रिया को प्रोग्राम करें।
      1. एक आंतरिक सिरिंज के साथ, निरंतर इंटरफेशियल तनाव की इस सीमा के भीतर निहित मात्रा को इंजेक्ट करें।
      2. चरण 3.5.4 में चयनित मान पर इंटरफेशियल क्षेत्र स्थिर रखें और 5 मिनट 7 के लिए इंटरफेशियल तनाव रिकॉर्डकरें।

4. प्रत्येक पाचन चरण के लिए DINATEN में एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया प्रोग्रामिंग

नोट: प्रक्रिया मापदंडों के लिए, पूरक चित्रा 1 बी देखें।

  1. प्रारंभिक नियंत्रण निष्पादित करें।
    1. ड्रॉप गठन के लिए, केशिका (वाल्व 6) (पूरक चित्रा 2 ए) में पायसीकारक समाधान के 10 μL (±5 μL) इंजेक्ट करें।
    2. 1 घंटे के लिए20 मिमी 2 (±10 मिमी2 ) के निरंतर इंटरफेशियल क्षेत्र21 पर सोखना रिकॉर्ड करें (पूरक चित्र 2 बी)।
    3. फैलाव रिओलॉजी8 (पूरक चित्रा 2 सी) रिकॉर्ड करें।
      1. दोलन के आयाम को 1.25 μL, अवधि 10 s पर सेट करें।
      2. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र (चरण 4.1.2) पर अधिशोषण को 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें।
      3. चरण 4.1.3 को विभिन्न अवधियों में दोहराएं: 5 एस, 20 एस, 50 एस और 100 एस।
  2. गैस्ट्रिक पाचन रिकॉर्ड करें।
    1. 10 सेकंड के लिए चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखना21 रिकॉर्ड करें।
    2. वाल्व 2 (एसएसजीएफ) और गैस्ट्रिक एंजाइम (तालिका 1) (पूरक चित्रा 2 डी) में तरल के साथ सबफेज एक्सचेंज7।
      1. वाल्व 2 से बाईं सिरिंज भरें। वाल्व 6-केशिका में 125 μL इंजेक्ट करें, जिसमें बाईं सिरिंज 5 μL-1 पर हो।
      2. केशिका से 125 μL निकालें, जिसमें दाईं सिरिंज के साथ 5 μL-1 पर है। वाल्व 8 से बाहर निकलने के लिए दाईं सिरिंज को अनलोड करें। पूर्ण विनिमय सुनिश्चित करने के लिए चरण 4.2.2.1-4.2.2.2 10 बार दोहराएं।
    3. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में अधिशोषण21 को चरण 4.1.2 में 1 घंटे के लिए रिकॉर्ड करें (पूरक चित्र 2 बी)।
    4. फैलाव रिओलॉजी8 (पूरक चित्रा 2 सी) रिकॉर्ड करें।
      1. दोलन के आयाम को 1.25 μL, अवधि 10 s पर सेट करें।
      2. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र के अधिशोषण को चरण 4.1.2 में 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें। अलग-अलग अवधियों में दोहराएं: 5 एस, 20 एस, 50 एस, 100 एस।
  3. आंतों के पाचन को रिकॉर्ड करें।
    1. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखना21 को चरण 4.1.2 में 10 सेकंड (पूरक चित्र 2 बी) में रिकॉर्ड करें।
    2. वाल्व 3 (एसएसआईएफ) और आंतों के एंजाइमों / पित्त लवण / फॉस्फोलिपिड्स में तरल के साथ सबफेज एक्सचेंज7 (तालिका 1) (पूरक चित्रा 2 डी)।
      1. वाल्व 2 से बाईं सिरिंज भरें। वाल्व 6-केशिका में 125 μL इंजेक्ट करें, जिसमें बाईं सिरिंज 5 μL-1 पर हो। केशिका से 125 μL निकालें, जिसमें दाईं सिरिंज के साथ 5 μL-1 पर है।
      2. वाल्व 8 से बाहर निकलने के लिए दाईं सिरिंज को अनलोड करें। पूर्ण विनिमय सुनिश्चित करने के लिए चरण 4.3.2.1-4.3.2.2 10 बार दोहराएं।
    3. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखना21 को चरण 4.1.2 में 1 घंटे के लिए रिकॉर्ड करें।
    4. फैलाव रिओलॉजी8 (पूरक चित्रा 2 सी) रिकॉर्ड करें।
      1. दोलन के आयाम को 1.25 μL, अवधि 10 s पर सेट करें।
      2. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में अधिशोषण को चरण 4.1.2 में 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें।
      3. अलग-अलग अवधियों में दोहराएं: 5 एस, 20 एस, 50 एस, 100 एस।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए प्रदूषकों को रिकॉर्ड करें।
    1. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखना21 को चरण 4.1.2 में 10 सेकंड (पूरक चित्र 2 बी) में रिकॉर्ड करें।
    2. वाल्व 5 (एसएसआईएफ) में तरल के साथ सबफेज एक्सचेंज7 (तालिका 1, पूरक चित्रा 2 डी)।
      1. वाल्व 5 से बाईं सिरिंज भरें। वाल्व 5-केशिका में 125 μL इंजेक्ट करें, जिसमें बाईं सिरिंज 5 μL-1 पर हो।
      2. केशिका से 125 μL निकालें, जिसमें दाईं सिरिंज के साथ 5 μL-1 पर है। वाल्व 8 से बाहर निकलने के लिए दाईं सिरिंज को अनलोड करें। पूर्ण विनिमय सुनिश्चित करने के लिए चरण 4.4.2.1-4.4.2.2 10 बार दोहराएं।
    3. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में अधिशोषण21 को चरण 4.1.2 में 1 घंटे के लिए रिकॉर्ड करें (पूरक चित्र 2 बी)।
    4. फैलाव रिओलॉजी8 (पूरक चित्रा 2 सी) रिकॉर्ड करें।
      1. 1.25 μL, अवधि 10 s के आयाम को बनाए रखें।
      2. चयनित इंटरफेशियल क्षेत्र में अधिशोषण को चरण 4.1.2 में 10 सेकंड के लिए रिकॉर्ड करें।
      3. चरण 4.4.4 को अलग-अलग अवधियों में दोहराएं: 5 एस, 20 एस, 50 एस, 100 एस।

5. प्रयोग स्थापित करना

  1. कृत्रिम पाचन मीडिया के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को भरें और उनमें से प्रत्येक को संबंधित ट्यूबिंग द्वारा संबंधित वाल्व से कनेक्ट करें।
  2. वाल्व 2, वाल्व 3, वाल्व 4, और वाल्व 5 से बाहरी निकास (वाल्व 8) (पूरक चित्रा 1 ए) तक सफाई करके वाल्व 2-5 में ट्यूबिंग भरें।
  3. वाल्व 1 से वाल्व 6-केशिका को 5 बार साफ करके वाल्व 1 में ट्यूबिंग भरें।
  4. केशिका को तेल चरण में रखें। वाल्व 1 (प्रारंभिक समाधान, तालिका 1) के साथ बाईं सिरिंज लोड करें।
  5. चरण 4.1-प्रारंभिक, चरण 4.2-गैस्ट्रिक, चरण 4.3-आंतों और चरण 4.4-प्रदूषकों को क्रमिक रूप से संसाधित करना शुरू करें, प्रत्येक प्रक्रिया के अंत में डेटा को सहेजें।

6. छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर CONTACTO 8 के साथ फैलाव रियोलॉजिकल मापदंडों की गणना

नोट: विवरण के लिए, देखें माल्डोनाडो-वाल्डेरामा एट अल.8.

  1. किसी दिए गए आवृत्ति और आयाम (पूरक चित्रा 3 ए) पर क्षेत्र दोलन के अनुरूप छवियों को लोड करें।
  2. रिओलॉजी (पूरक चित्रा 3 बी) दबाएं और फैलाव पैरामीटर (पूरक चित्रा 3 सी) प्राप्त करें।
  3. डेटा स्प्रेड शीट में परिणाम कॉपी-पेस्ट करें।

7. प्रयोगात्मक परिणामों की योजना बनाना

  1. पिछले चरण के समय के अंतिम डेटा को जोड़कर पाचन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में समय कॉलम की फिर से गणना करें।
  2. उपयोग की जाने वाली पाचन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए इंटरफेशियल तनाव बनाम योजक समय प्लॉट करें।
  3. पाचन चरण बनाम प्रत्येक चरण के अंत में प्राप्त अंतिम इंटरफेशियल तनाव / फैलाव लोच और चिपचिपाहट को प्लॉट करें: प्रारंभिक, गैस्ट्रिक पाचन, ग्रहणी पाचन, और प्रदूषक।

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Representative Results

यह खंड ऑक्टोपस के साथ मापा गया पाचन प्रोफाइल के विभिन्न उदाहरण दिखाता है। सिम्युलेटेड पाचन प्रोफ़ाइल मिलान की सामान्य उपस्थिति चित्रा 4 बी में दिखाई गई है। इंटरफेशियल तनाव आमतौर पर पाचन प्रोफ़ाइल में समय के खिलाफ दर्शाया जाता है। पाचन चरणों पर विचार किया जाता है जिन्हें विभिन्न रंगों में दर्शाया जाता है। पहला चरण प्रारंभिक परत बनाता है और प्रत्येक मामले के आधार पर पायसीकारक या प्रोटीन / सर्फेक्टेंट / बहुलक के सोखना चरण से मेल खाता है। फिर, विभिन्न पाचन तरल पदार्थों को नए मीडिया वाले थोक समाधान में सबफेज एक्सचेंज द्वारा इंजेक्ट किया जाता है। नया सबफेज प्रारंभिक पायसीकारक परत के इंटरफेशियल तनाव में और प्रत्येक पाचन चरण के अंत में मापा जाने वाले फैलाव रिओलॉजी में परिवर्तन पैदा करता है। पाचन प्रक्रिया में अधिकतम आठ पाचन चरण शामिल हो सकते हैं।

Figure 5
चित्रा 5: गैस्ट्रिक पाचन प्रोफाइल का उदाहरण। (ए) मानव सीरम एल्बुमिन का गैस्ट्रिक प्रोटियोलिसिस। पाचन मीडिया को टी = 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक खंड में विस्तृत समाधानों के साथ सबफेज एक्सचेंज द्वारा लागू किया जाता है। नीला: प्रोटीन के साथ प्रारंभिक बफर, लाल: पेप्सिन के साथ एसएसजीएफ। डेल कैस्टिलो-सैंटेला एट अल.12 की अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। (बी) साइट्रस पेक्टिन का गैस्ट्रिक लिपोलिसिस। पाचन मीडिया को टी = 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक खंड में विस्तृत समाधानों के साथ सबफेज एक्सचेंज द्वारा लागू किया जाता है। नीला: साइट्रस पेक्टिन के साथ प्रारंभिक बफर, पीला: गैस्ट्रिक लाइपेस के साथ एसएसजीएफ, ग्रे: एसएसजीएफ। इन्फैंट्स-गार्सिया एट अल.17 की अनुमति से पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5 इमल्सीफायर के गैस्ट्रिक पाचन के लिए प्राप्त कुछ प्रयोगात्मक परिणामों को दर्शाता है। चित्रा 5 ए में, मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए) 12 को पहले जैतून के तेल-पानी के इंटरफ़ेस पर अधिशोषित किया जाता है, जिससे इंटरफेशियल तनाव 1 घंटे के बाद पठार तक पहुंच जाता है। इस चरण के अंत में, रिओलॉजी को आवृत्ति (अवधि) के 0.1 हर्ट्ज (10 एस) पर मापा जाता है। दूसरे चरण में, पेप्सिन के साथ एसएसजीएफ को सबफेज एक्सचेंज द्वारा जोड़ा जाता है। इसमें एक सिरिंज के साथ एक वॉल्यूम पेश करना शामिल है, जबकि दूसरे सिरिंज के साथ उसी वॉल्यूम को निकालना शामिल है। इस तरह, बूंद का क्षेत्र नहीं बदलता है, तेल-पानी इंटरफ़ेस पर अपरिवर्तनीय रूप से अधिशोषित घटकों को बनाए रखता है। विनिमय 10-15 बार दोहराया जाता है। एसएसजीएफ और पेप्सिन के साथ सबफेज एक्सचेंज के दौरान, प्रोटीन के हाइड्रोलिसिस के कारण इंटरफेशियल तनाव बढ़ जाता है, जो प्रारंभिक प्रोटीन परत को पतला करता है (चित्रा 5 ए)। चित्रा 5 बी में, साइट्रस पेक्टिन (सीपी) 17 ट्राइग्लिसराइड तेल-पानी पर 40 मिनट के लिए सोखता है, इसके बाद 0.1 हर्ट्ज पर फैलाव रिओलॉजी होता है। दूसरे चरण में, गैस्ट्रिक लाइपेस के साथ एसएसजीएफ को ड्रॉप के थोक में इंजेक्ट किया जाता है; प्रोटियोलिसिस के विपरीत, लिपोलिसिस के परिणामस्वरूप लाइपेस का सोखना और फैटी एसिड का गठन होता है, जो इंटरफ़ेस पर रहता है, जिससे इंटरफेशियल तनाव कम हो जाता है। प्रदूषक चरण तीसरा चरण है, जो हाइड्रोफिलिक के उत्पादन या लिपोलिसिस के लिपोफिलिक उत्पादों के घुलनशीलता का आकलन करता है। चित्रा 5 बी से पता चलता है कि एसएसजीएफ के साथ सबफेज एक्सचेंज इंटरफेशियल तनाव की शून्य प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इसे लिपोफिलिक पाचन उत्पादों के उत्पादन के रूप में व्याख्या किया जा सकता है, जो अपरिवर्तनीय रूप से अधिशोषित होते हैं और घुलनशील नहीं होते हैं, इंटरफ़ेस पर लंगर डाले रहते हैं। गैस्ट्रिक चरण में पित्त लवण की अनुपस्थिति घुलनशीलता की कमी के लिए जिम्मेदार है। लिपोलिसिस की डिग्री को इंटरफेशियल तनाव के मूल्य से गुणात्मक रूप से विश्लेषण किया जा सकता है।

Figure 6
चित्र 6: आंतों के पाचन प्रोफाइल का उदाहरण। (A) 37 डिग्री सेल्सियस पर एसएसआईएफ में पित्त लवण (काले वर्ग), लाइपेस (ग्रे त्रिकोण), और लाइपेस + पित्त लवण (नारंगी रोम्बोइड्स) के सोखना-प्रदूषक प्रोफाइल। Macierzanka et al.13 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। (बी) पहले से अधिशोषित एफ 68 (गहरे हरे) और एफ 127 (हल्के हरे) पर पित्त लवण + लाइपेस का अधिशोषण, एसएसआईएफ में पित्त लवण (पीला) का अधिशोषण। प्रदूषक: पित्त लवण (नारंगी), एफ 68 (गहरे बैंगनी), और एफ 127 (हल्के बैंगनी) पर एसएसआईएफ के साथ उपचरण विनिमय। टोरसेलो-गोमेज़ एट अल.19 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6 इमल्सीफायर के आंतों के पाचन के लिए प्राप्त प्रयोगात्मक परिणामों को दर्शाता है। गैस्ट्रिक पाचन के विपरीत, छोटी आंत में पित्त लवण की उपस्थिति एसएसआईएफ के साथ सबफेज एक्सचेंज और थोक समाधान की कमी पर अलग-अलग प्रदूषक प्रोफाइल प्रदान करती है। चित्र 6ए शुद्ध पित्त लवण, शुद्ध लाइपेस और मिश्रित लाइपेस/पित्त लवण 8,9,10,13 के लिए प्राप्त प्रदूषक प्रोफाइल को दर्शाता है। पित्त लवण तेल-पानी इंटरफ़ेस पर विपरीत रूप से अवशोषित होते हैं, और इसलिए, वे एसएसआईएफ के साथ सबफेज एक्सचेंज पर पूरी तरह से विघटित हो जाते हैं, जैसा कि नंगे तेल-पानी इंटरफ़ेस 8,13 के मूल्य तक पहुंचने के लिए इंटरफेशियल तनाव में वृद्धि से संकेत मिलता है। इसके विपरीत, लाइपेस अपरिवर्तनीय रूप से सोखता है, जैसा कि एसएसआईएफ द्वारा सबफ़ेज़ एक्सचेंज के बाद इंटरफेशियल तनाव के निरंतर मूल्य द्वारा दिया गया है। मिश्रण लाइपेस और पित्त लवण एसएसआईएफ द्वारा एक मध्यवर्ती मूल्य तक सबफेज एक्सचेंज पर इंटरफेशियल तनाव में सीमित वृद्धि द्वारा निर्धारित एक मध्यवर्ती प्रदूषक प्रोफ़ाइल प्रदान करता है। शेष इंटरफेशियल परत में लाइपेस और मुक्त फैटी एसिड होते हैं। पित्त लवण संभवतः इंटरफ़ेस से विघटित हो जाते हैं और लिपोलिसिस में गठित कुछ मुक्त फैटी एसिड को घुलनशील करते हैं। चित्रा 6 बी प्लूरोनिक के दो रूपों के लिपोलिसिस पर इंटरफेशियल तनाव के विकास को दर्शाता है: एफ 127 और एफ 6819। चित्र 6 बी तेल-पानी इंटरफ़ेस पर लाइपेस और पित्त लवण के सोखने और एफ 68 और एफ 127 की पहले से गठित इंटरफेशियल फिल्मों पर मुक्त फैटी एसिड के उत्पादन के कारण इंटरफेशियल तनाव में भारी कमी दिखाता है। प्रदूषक चरण एसएसआईएफ के साथ सबफेज एक्सचेंज के कारण बढ़े हुए इंटरफेशियल तनाव को दर्शाता है, जो लिपोलाइटिक उत्पादों के घुलनशीलता को निर्धारित करता है।

Figure 7
चित्रा 7: पूर्ण गतिशील गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल पाचन प्रोफाइल का उदाहरण। (ए) एयर-वाटर इंटरफेस पर एएस -48 अधिशोषित फिल्म की इन विट्रो पाचन प्रोफ़ाइल। पाचन मीडिया को टी = 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक खंड में विस्तृत समाधानों के साथ सबफेज एक्सचेंज द्वारा लागू किया जाता है। नियंत्रण: एएस -48, पेप्सिन के साथ प्रारंभिक बफर: पेप्सिन के साथ एसएसजीएफ, ट्रिप्सिन: ट्रिप्सिन + काइमोट्रिप्सिन के साथ एसएसआईएफ, प्रदूषक: एसएसआईएफ। डेल कैस्टिलो-सैंटेला एट अल.18 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित। (बी) जैतून के तेल-पानी के इंटरफेस पर मानव और गोजातीय सीरम एल्बुमिन अधिशोषित फिल्मों की इन विट्रो पाचन प्रोफ़ाइल। पाचन मीडिया को टी = 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक खंड में विस्तृत समाधानों के साथ सबफेज एक्सचेंज द्वारा लागू किया जाता है। बीएसए, पेप्सिन के साथ प्रारंभिक बफर: पेप्सिन के साथ एसएसजीएफ, ट्रिप्सिन: ट्रिप्सिन + काइमोट्रिप्सिन के साथ एसएसआईएफ, लिपोलिसिस: लाइपेस और पित्त लवण के साथ एसएसआईएफ, प्रदूषक: एसएसआईएफ। प्लॉटकिए गए वक्र <5% विचलन के साथ प्रतिनिधि प्रयोग हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7 पूर्ण नकली पाचन प्रोफाइल के उदाहरण दिखाता है। चित्रा 7 ए वायु-जल इंटरफ़ेस 18 पर अधिशोषित खाद्य जैव-संरक्षक एएस -48 की पाचन प्रोफ़ाइल को दर्शाता है। पाचन प्रक्रिया को इस पेप्टाइड के प्रोटियोलिसिस पर ध्यान केंद्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि हवा-पानी इंटरफ़ेस पर होने के कारण तेल के लिपोलिसिस की आवश्यकता नहीं थी। इसलिए, चित्रा 7 ए में नकली पाचन में पांच चरण शामिल हैं: नियंत्रण / प्रारंभिक फिल्म, पेप्सिनोलिसिस, ट्रिप्सिनोलिसिस और प्रदूषक। प्रयोगात्मक परिणामों से पता चला है कि यह बैक्टीरियोसिन पेप्सिन और ट्रिप्सिन हाइड्रोलिसिस दोनों के लिए प्रतिरोधी है क्योंकि सतह तनाव अपरिवर्तित रहा। तदनुसार, एएस -48 को इन विट्रो पाचन के लिए प्रतिरोधी एक अच्छा खाद्य जैव-संरक्षक माना जाता था। चित्रा 7 बी तेल-पानी इंटरफ़ेस22 पर अधिशोषित मानव और गोजातीय सीरम एल्बुमिन की अधिशोषित परतों के इन विट्रो पाचन प्रोफाइल की तुलना करता है। इस सिमुलेशन को इन दो प्रोटीनों23 द्वारा स्थिर इमल्शन की पाचनशक्ति की नकल करने और कर्क्यूमिन4 के एनकैप्सुलेशन का मूल्यांकन करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। इसलिए, नकली पाचन को पांच चरणों में अनुकूलित किया गया था: नियंत्रण / प्रारंभिक, पेप्सिनोलिसिस, ट्रिप्सिनोलिसिस, लिपोलिसिस और प्रदूषक। प्रयोगात्मक परिणामों ने पेप्सिन पाचन के बाद इंटरफेशियल तनाव में वृद्धि दिखाई, जो पेप्सिनोलिसिस के लिए संवेदनशीलता में वृद्धि का संकेत देता है। इसके लिए सोखने पर गोजातीय संस्करण के बढ़ते प्रकटीकरण को जिम्मेदार ठहराया गया था, जो पेप्सिन-अतिसंवेदनशील साइटों को उजागर करता था। फिर, ट्रिप्सिनोलिसिस और लिपोलिसिस ने पूरी तरह से समान पाचन प्रोफाइल प्रदान किए (चित्रा 7 बी)।

Figure 8
चित्रा 8: जठरांत्र संबंधी पाचन के अंतिम मूल्यों का उदाहरण। (ए) इंटरफेशियल तनाव, (बी) फैलाव लोच, (सी) जैतून के तेल-पानी के इंटरफ़ेस पर β-लैक्टोग्लोबुलिन अधिशोषित फिल्म के इन विट्रो पाचन की फैलाव चिपचिपाहट। प्रत्येक चरण में पचे हुए इंटरफ़ेस को बराबर करने के बाद फैलाव मापदंडों को 1 हर्ट्ज, 0.1 हर्ट्ज और 0.01 हर्ट्ज पर मापा गया था। पाचन मीडिया को टी = 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगात्मक खंड में विस्तृत समाधानों के साथ सबफेज एक्सचेंज द्वारा लागू किया जाता है। नियंत्रण: प्रोटीन, पेप्सिन के साथ प्रारंभिक बफर: पेप्सिन के साथ एसएसजीएफ, ट्रिप्सिन: ट्रिप्सिन + काइमोट्रिप्सिन के साथ एसएसआईएफ, लिपोलिसिस: लाइपेस और पित्त लवण के साथ एसएसआईएफ, प्रदूषक: एसएसआईएफ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सामान्य तौर पर, विभिन्न पचे हुए इंटरफेशियल परतों की प्रकृति का मूल्यांकन और तुलना करने के लिए, पाचन प्रक्रिया में विचार किए गए प्रत्येक चरण के लिए अंतिम इंटरफेशियल तनाव और पचने वाले इंटरफेस के लिए प्राप्त फैलाव लोच / चिपचिपाहट को प्लॉट किया जाता है। चित्रा 8 इंटरफेशियल तनाव (चित्रा 8 ए), फैलाव लोच (चित्रा 8 बी), और फैलाव चिपचिपाहट (चित्रा 8 सी) को दर्शाता है, जिसे 1 हर्ट्ज, 0.1 हर्ट्ज और 0.01 हर्ट्ज की आवृत्तियों पर मापा जाता है। तेल-पानी इंटरफ़ेस16 पर अधिशोषित β-लैक्टोग्लोबुलिन के प्रत्येक पाचन चरण के बाद प्लॉट किए गए मूल्य प्राप्त किए गए थे। चित्रा 8 ए से पता चलता है कि प्रोटियोलिसिस (पेप्सिन और ट्रिप्सिन) इंटरफेशियल तनाव में छोटी वृद्धि पैदा करता है, जबकि लिपोलिसिस इस मूल्य को कम करता है, और प्रदूषक फिर से बढ़ जाता है। फैलाव लोच के बारे में, प्रोटीन तेल-पानी इंटरफ़ेस पर लोचदार और परस्पर जुड़ी फिल्में बनाता है। पित्त लवण की उपस्थिति कम लोच के साथ अत्यधिक गतिशील और द्रव इंटरफेशियल फिल्मों का उत्पादन करती है। अंत में, शेष लिपोलाइटिक उत्पाद प्रदूषकों के बाद एक एकजुट लोचदार फिल्म विकसित नहीं कर सकते हैं। दोलन आवृत्ति (चित्रा 8 बी) के साथ फैलाव लोच थोड़ी बढ़ जाती है। अंत में, चित्रा 8 सी में दिखाए गए इंटरफेशियल फिल्मों की फैलाव चिपचिपाहट केवल कम आवृत्ति पर पता लगाने योग्य है और इंटरफ़ेस पर मल्टीलेयर, समुच्चय या अन्य क्षयकारी संरचनाओं के अस्तित्व का पता लगाती है। पल्स-उपचारित β-लैक्टोग्लोबुलिन के लिए प्राप्त पाचन प्रोफ़ाइल के साथ β-लैक्टोग्लोबुलिन की पाचन प्रोफ़ाइल की तुलना करने से इस प्रकार के शारीरिक उपचार के अधीन प्रोटीन की पाचन क्षमता में सुधारहुआ।

प्रारंभिक बफर 0.00113 मोल एल -1 एनएएच2पीओ4, पीएच 7.0
सरलीकृत सिम्युलेटेड गैस्ट्रिक द्रव (एसएसजीएफ) [NaH2PO4] = 0.00113 mol L-1, [NaCl] = 0.15 mol L-1, pH 3.0
सरलीकृत सिम्युलेटेड आंतों का तरल पदार्थ (एसएसआईएफ) [NaH2PO4] = 0.00113 mol L-1, [NaCl] = 0.15 mol L-1, [CaCl2] = 0.003 mol L-1, pH 7.0
गैस्ट्रिक एंजाइम पेप्सिन (50 : 103 यू एल -1), गैस्ट्रिक लाइपेस (0.5 : 103 यू एल -1)
आंतों के एंजाइम ट्रिप्सिन (2.5 : 103 यू एल -1), काइमोट्रिप्सिन (0.625 × 103 यू एल -1), अग्नाशयी लाइपेस (50 : 103 यू एल -1), सह-लाइपेज (150 : 103 यू एल -1)
पित्त लवण मिश्रण पित्त लवण मिश्रण: सोडियम टौरोकोलेट और सोडियम डीऑक्सीकोलेट (50/50) या सोडियम टौरोकोलेट और सोडियम ग्लाइकोकोडॉक्सिकोलेट (50/50)

तालिका 1: कृत्रिम पाचन मीडिया की संरचना।

पूरक चित्रा 1: कंप्यूटर इंटरफ़ेस DINATEN के बुनियादी संचालन। (ए) कंप्यूटर इंटरफ़ेस DINATEN की सामान्य उपस्थिति; बाएं संवाद सभी वाल्वों से जुड़े दो सिरिंज दिखाता है और इंजेक्शन / निष्कर्षण और सफाई को नियंत्रित करता है। केंद्रीय संवाद में कमांड, ड्रॉप छवि और परिणामों के साथ तालिका होती है। (बी) वास्तविक समय गणना समय के कार्य के रूप में स्वचालित माप प्रदान करती है। (ग) विभेदक घनत्व को शामिल करने के लिए वाम कमान। (डी) एक सरल गतिशील प्रक्रिया इंजेक्शन / निष्कर्षण मात्रा, दर और कैप्चर समय को नियंत्रित करती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 2: प्रत्येक पाचन चरण (प्रक्रिया) को प्रोग्रामिंग के लिए इंटरफ़ेस। (ए) निश्चित मात्रा और निश्चित इंजेक्शन दर के बाएं सिरिंज के साथ ड्रॉप गठन। (बी) निरंतर इंटरफेशियल क्षेत्र में सोखना: नियंत्रण। (सी) एक निश्चित आयाम, अवधि और चक्रों की संख्या के साथ रिओलॉजी। (डी) सबफेज एक्सचेंज: एक ही दर पर दोनों सिरिंज के साथ इंजेक्ट और निकालें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा 3: छवि विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर के साथ फैलाव मापदंडों की गणना। (ए) एक निश्चित अवधि में दोलन के अनुरूप छवियों का विश्लेषण। (बी) चयनित छवियों की इंटरफेशियल परत के फैलाव मापदंडों की गणना। (सी) फैलाव विश्लेषण से परिणामों को दिखाने वाला संवाद। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह लेख पेंडेंट ड्रॉप उपकरण का उपयोग करके इंटरफेशियल परतों के इन विट्रो पाचन को मापने के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल को पाचन बफर की संरचना को ट्यून करके प्रयोग की विशिष्ट आवश्यकताओं में समायोजित किया जा सकता है, जो साहित्य के साथ तुलना की सुविधा के लिए INFOGEST11,20 सामंजस्यपूर्ण प्रोटोकॉल पर आधारित हैं। पाचन एंजाइम और बायोसर्फेक्टेंट्स को व्यक्तिगत रूप से, क्रमिक रूप से या एक साथ जोड़ा जा सकता है। इस बाद के विकल्प को सावधानी के साथ आयोजित करने की आवश्यकता है क्योंकि इंटरफेशियल परत की संतृप्ति केवल बहुत कम इंटरफेशियल तनाव प्रदान करके विभिन्न घटनाओं में बाधा डालेगी और बूंद को गिरने का कारण बन सकती है। प्रत्येक पाचन घटक के प्रभाव का विश्लेषण करने में सक्षम होने के लिए, विभिन्न पाचन एंजाइमों को क्रमिक रूप से और विभिन्न सांद्रता में जोड़ा जाता है। इस तरह, प्रत्येक घटक के प्रभावों का विश्लेषण और व्यवस्थित किया जा सकता है, और तालमेल का मूल्यांकन अनुक्रमिक जोड़ द्वारा किया जाता है। इसके अलावा, बूंदों को गिरने से रोकने के लिए, कुछ सांद्रता को पतला कियाजाता है। प्राप्त परिणामों को सीधे इमल् सीफाइड प्रणालियों में लागू नहीं किया जा सकता है क्योंकि शर्तों को सरलीकृत प्रणाली के लिए समायोजित किया जाता है। हालांकि, इंटरफेशियल तनाव का विकास इंटरफेशियल कवरेज के विकास को दर्शाता है क्योंकि इंटरफेशियल परत10 पच जाती है। इसी तरह, फैलाव रीलॉजी का विकास इंटरफ़ेस के यांत्रिक गुणों पर कुछ जानकारी प्रदान करता है क्योंकि पाचन आगे बढ़ता है। इन परिणामों में उपयोगी जानकारी होती है जिसे इमल्सीफाइड सिस्टम पर लागू करने के लिए अनुकूलित और सावधानीपूर्वक व्याख्या की जा सकती है।

पेंडेंट ड्रॉप उपकरण विशेष रूप से इंटरफेशियल परत पर होने वाली सीटू घटनाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है, जैसा कि चित्र 2 में दर्शाया गया है। सबसे पहले, एक प्रारंभिक इंटरफेशियल परत बनती है, जो एक एकल इमल्शन बूंद का प्रतिनिधित्व करती है। यह प्रारंभिक परत विभिन्न पाचन स्थितियों के अधीन है और जलीय चरण में विभिन्न घटकों की उपस्थिति के कारण क्रमिक रूप से इसकी संरचना को बदलती है। इसके अलावा, लाइपेस को तेल चरण तक पहुंचने और वसा को हाइड्रोलाइज करने के लिए इस इंटरफेशियल परत को दूर करना चाहिए। इन इंटरफेशियल घटनाओं का मूल्यांकन शुरू में बनाई गई एक ही इंटरफेशियल परत पर किया जाना चाहिए। इन विट्रो पाचन के लिए एक इमल्शन के अधीन होने से अलग-अलग समय पर नमूनाकरण और इमल्शन में परिवर्तन का मूल्यांकन होगा क्योंकि यह पच जाता है (बूंद आकार, जेटा क्षमता), लेकिन यह प्रत्येक इमल्शन बूंद के आसपास इंटरफेशियल परत के सीटू मूल्यांकन की अनुमति नहीं देगा। इसलिए, मल्टी-सबफेज एक्सचेंज के साथ लागू पेंडेंट ड्रॉप उपकरण में इमल्शन14 के इंटरफेशियल इंजीनियरिंग पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक पूरक तकनीक शामिल है।

इस पद्धति की पहली सीमा मिश्रित उत्पादों के साथ इंटरफेशियल परत की संतृप्ति से संबंधित है, जिसे बूंद के गिरने को रोकने के लिए पतला करने की आवश्यकता होती है। एक और प्रयोगात्मक मुद्दा बुलबुले के न्यूक्लियेशन से बचने के लिए सभी कृत्रिम मीडिया का विघटन है, जो केशिका से बूंद अलगाव का कारण भी बन सकता है। इमल् सीफाइड प्रणालियों की तुलना में बड़े तेल-जल अनुपात पर विचार करना भी महत् वपूर्ण है। अंत में, हालांकि फैलाव संबंधी रिओलॉजी में पाचन एंजाइमों द्वारा गठित और बाधित इंटरफेशियल परत के भीतर अंतर-और इंट्रामोलेक्यूलर संघों पर जानकारी होती है, लेकिन इमल्शन स्थिरता की व्याख्या करना और विस्तार करना मुश्किल है। कुल मिलाकर, एक बहु-उपचरण विनिमय उपकरण के साथ लागू पेंडेंट ड्रॉप इमल्शन12 के इन विट्रो पाचन अध्ययनों के पूरक के लिए उपकरण का एक उपयोगी टुकड़ा है, जो बूंद आकार वितरण के विकास और वैद्युतकणसंचलन22 के साथ प्रोटीन पाचन की जेटा क्षमता का पालन करता है। लिंग भिन्नता, शिशु पाचन, या पाचन मुद्दों के लिए पाचन तंत्र के संशोधनों में प्रयोगात्मक प्रक्रिया के भविष्य के अनुप्रयोग शामिल हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते थे।

Acknowledgments

इस शोध को आरटीआई 2018-101309-बी-सी 21 और पीआईडी 2020-631-116615आरए00 परियोजनाओं द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो एमसीआईएन / एईआई / 10.13039 / 501100011033 और "ईआरडीएफ ए यूरोप बनाने का तरीका" द्वारा वित्त पोषित था। यह काम (आंशिक रूप से) ग्रेनेडा विश्वविद्यालय (स्पेन) के बायोकोलाइड और द्रव भौतिकी समूह (रेफरी पीएआई-एफक्यूएम 115) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

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References

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जैव रसायन अंक 189
<em>इन विट्रो</em> नकली गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल तरल पदार्थ के मल्टी सबफेज एक्सचेंज के <em>माध्यम से</em> एकल बूंद में इमल्शन का पाचन
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Maldonado-Valderrama, J., del Castillo Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. Á. In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids. J. Vis. Exp. (189), e64158, doi:10.3791/64158 (2022).

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