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Biochemistry

In vitro Digestão de emulsões em uma única gotícula via troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados

Published: November 18, 2022 doi: 10.3791/64158
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Applied Physics, Faculty of Sciences, Campus de Fuentenueva, University of Granada, 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Pharmacy, Campus de Cartuja, University of Granada, 3Department of Software Engineering, School of Computer and Telecommunication Engineering, Campus de Aynadamar, University of Granada

Summary

Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfase, apelidada de OCTOPUS, permite imitar condições digestivas pela troca subfásica sequencial da solução a granel original com fluidos gastrointestinais simulados. A digestão in vitro simulada é monitorada registrando in situ a tensão interfacial da camada interfacial digerida.

Abstract

As emulsões estão sendo usadas atualmente para encapsular e fornecer nutrientes e medicamentos para combater diferentes condições gastrointestinais, como obesidade, fortificação de nutrientes, alergias alimentares e doenças digestivas. A capacidade de uma emulsão de fornecer a funcionalidade desejada, ou seja, atingir um local específico dentro do trato gastrointestinal, inibir / retardar a lipólise ou facilitar a digestibilidade, depende em última análise de sua suscetibilidade à degradação enzimática no trato gastrointestinal. Em emulsões de óleo em água, as gotículas lipídicas são cercadas por camadas interfaciais, onde os emulsificantes estabilizam a emulsão e protegem o composto encapsulado. Alcançar uma digestibilidade personalizada das emulsões depende de sua composição inicial, mas também requer o monitoramento da evolução dessas camadas interfaciais, pois elas são submetidas a diferentes fases da digestão gastrointestinal. Um balanço de filme de superfície de gota pendente implementado com uma troca multi-subfásica permite simular a digestão in vitro de emulsões em uma única gota aquosa imersa em óleo, aplicando um modelo de digestão estática personalizado. O trânsito através do trato gastrointestinal é imitado pela troca subfásica da solução original em massa de gotículas com meios artificiais, imitando as condições fisiológicas de cada compartimento/etapa do trato gastrointestinal. A evolução dinâmica da tensão interfacial é registrada in situ ao longo de toda a digestão gastrointestinal simulada. As propriedades mecânicas das interfaces digeridas, como elasticidade dilatacional interfacial e viscosidade, são medidas após cada fase de digestão (oral, gástrica, intestino delgado). A composição de cada meio digestivo pode ser ajustada para explicar as particularidades das condições digestivas, incluindo patologias gastrointestinais e meios digestivos infantis. Os mecanismos interfaciais específicos que afetam a proteólise e a lipólise são identificados, fornecendo ferramentas para modular a digestão pela engenharia interfacial de emulsões. Os resultados obtidos podem ser manipulados para projetar novas matrizes alimentares com funcionalidades personalizadas, como baixa alergenicidade, ingestão controlada de energia e diminuição da digestibilidade.

Introduction

Entender como a gordura é digerida, o que envolve a digestão em emulsão, é importante para projetar racionalmente produtos com funcionalidade personalizada1. O substrato para a digestão de gordura é uma emulsão, uma vez que a gordura é emulsionada após o consumo por ação mecânica e mistura com biossurfactantes na boca e no estômago. Além disso, a maior parte da gordura consumida pelos seres humanos já é emulsionada (como produtos lácteos) e, no caso de bebês ou alguns idosos, essa é a única forma de consumo. Assim, o design de produtos à base de emulsão com perfis de digestão específicos é muito importante na nutrição1. Além disso, as emulsões podem encapsular e fornecer nutrientes, medicamentos ou bioativos lipofílicos2 para lidar com diferentes condições gastrointestinais, como obesidade3, fortificação de nutrientes, alergias alimentares e doenças digestivas. Nas emulsões de óleo em água, as gotículas lipídicas são cercadas por camadas interfaciais de emulsificantes, como proteínas, surfactantes, polímeros, partículas e misturas4. O papel dos emulsificantes é duplo: estabilizar a emulsão5 e proteger/transportar o composto encapsulado para um local específico. A obtenção de uma digestibilidade personalizada das emulsões depende de sua composição inicial, mas também requer o monitoramento da evolução contínua dessa interface durante o trânsito pelo trato gastrointestinal (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Aplicando engenharia interfacial de emulsões para lidar com algumas das principais condições gastrointestinais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A digestão lipídica é, em última análise, um processo interfacial, pois requer a adsorção de lipases (gástricas ou pancreáticas) na interface óleo-água de gotículas lipídicas emulsionadas através da camada interfacial para alcançar e hidrolisar os triglicerídeos contidos no óleo em ácidos graxos livres e monoacilglicerídeos6. Isso está esquematizado na Figura 2. A lipase gástrica compete com a pepsina e os fosfolipídios no estômago pela interface óleo-água (Figura 2, digestão gástrica). Em seguida, a lipase/colipase pancreática compete com tripsina/quimotripsina, fosfolipídios, sais biliares e produtos digestivos no intestino delgado. As proteases podem alterar a cobertura interfacial, prevenindo ou favorecendo a adsorção da lipase, enquanto os sais biliares são altamente ativos superficiais e deslocam a maior parte do emulsificante restante para promover a adsorção da lipase (Figura 2, digestão intestinal). Eventualmente, a taxa e a extensão da lipólise dependem das propriedades interfaciais da emulsão digerida inicial/gástrica, como a espessura, as conexões inter/intramoleculares e as interações eletrostáticas e estéricas. Assim, o monitoramento da evolução da camada interfacial à medida que é digerida oferece uma plataforma experimental para identificar mecanismos e eventos interfaciais que afetam a adsorção da lipase e, portanto, a digestão lipídica.

Figure 2
Figura 2: Diagrama esquemático ilustrando o papel das interfaces na digestão lipídica gastrointestinal. A hidrólise da pepsina altera a composição interfacial na fase gástrica, enquanto a lipase gástrica hidrolisa os triglicerídeos. No intestino delgado, a tripsina/quimotripsina hidrolisa ainda mais o filme interfacial, enquanto a lipólise prossegue pela adsorção de BS/lipases, pela hidrólise de triglicerídeos e pela dessorção de produtos lipolíticos por solubilização nas micelas/complexo BS. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O equipamento de gota de pingente da Universidade de Granada (UGR) é implementado com uma tecnologia patenteada, o duplo capilar coaxial, que permite a troca subfásica da solução a granel7. O capilar, que contém a gota do pingente, consiste em um arranjo de dois capilares coaxiais que são conectados independentemente a cada canal de um microinjetor duplo. Cada microinjetor pode operar de forma independente, permitindo a troca do conteúdo caído pelo fluxo7. Assim, a troca subfásica consiste na injeção simultânea da nova solução com o capilar interno e na extração da solução a granel com o capilar externo usando a mesma taxa de fluxo. Este processo permite a substituição da solução a granel sem perturbação da área interfacial ou do volume da gota. Este procedimento foi posteriormente atualizado para uma troca multi-subfase, que permite até oito trocas subfásicas sequenciais da solução a granel de gotículas8. Isso permite a simulação do processo digestivo em uma única gota aquosa suspensa em meio lipídico, trocando sequencialmente a solução a granel por meios artificiais imitando os diferentes compartimentos (boca, estômago, intestino delgado). Toda a configuração é representada na Figura 3, incluindo os detalhes dos componentes. As seringas do microinjetor são conectadas às oito válvulas vias, cada uma conectando-se a um tubo de microcentrífuga contendo o fluido digestivo artificial com componentes descritos na Figura 2.

Figure 3
Figura 3: Visão geral do OCTOPUS com todos os componentes. A câmera CCD, o microscópio, o microposicionador, a célula termoestabilizada e o capilar duplo foram conectados independentemente a um microinjetor duplo com duas seringas conectadas a oito válvulas vias. Cada seringa se conecta com capilares, quatro tubos de microcentrífuga com amostra e uma descarga. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 4A mostra como cada um dos fluidos digestivos artificiais é injetado na gota pendente por troca de subfases através do duplo capilar. Cada composto digestivo detalhado na Figura 2 pode ser aplicado simultaneamente/sequencialmente, simulando a passagem pelo trato gastrointestinal. Os fluidos digestivos artificiais contêm diferentes enzimas e biossurfactantes, que alteram a tensão interfacial do emulsificante inicial, conforme esquematizado na Figura 4B. O software DINATEN (ver Tabela de Materiais), também desenvolvido na UGR, registra a evolução da tensão interfacial em tempo real à medida que a camada interfacial inicial é digerida in vitro. Além disso, após cada fase digestiva, a elasticidade dilatacional da camada interfacial é calculada impondo oscilações periódicas de volume/área interfacial na camada interfacial estabilizada e registrando a resposta da tensão interfacial. O período/frequência e a amplitude da oscilação podem ser variados, e o processamento da imagem com o software CONTACTO fornece os parâmetros reológicos dilatacionais8.

Figure 4
Figura 4: Exemplos de perfis de digestão . (A) A camada emulsificante inicial é submetida a meio digestivo artificial colocado na microcentrífuga por troca subfásica sequencial das diferentes soluções na gota pendente. (B) A evolução geral da tensão interfacial (eixo y) do emulsionante inicial em função do tempo (eixo x) à medida que é digerido in vitro pelas várias enzimas/biossurfactantes nos meios artificiais. Uma troca subfásica final com fluido intestinal simples mede a dessorção de lipídios digeridos por solubilização em micelas mistas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este estudo apresenta o protocolo geral desenhado para medir a digestão in vitro de camadas interfaciais com equipamento de gota pendente9. A camada interfacial inicial é submetida sequencialmente a condições que imitam a passagem pelo trato gastrointestinal, conforme ilustrado na Figura 2. Esses diferentes meios digestivos são injetados na gota pendente por troca subfásica das diferentes soluções contidas nos tubos de microcentrífuga (Figura 4A). A composição desses meios pode ser personalizada dependendo das condições gastrointestinais que serão avaliadas, a saber, proteólise/lipólise gástrica/intestinal, permitindo mensurar efeitos cumulativos e sinergias10. As condições experimentais utilizadas para mimetizar o processo de digestão em cada compartimento seguem o protocolo de consenso internacional publicado pelo INFOGEST detalhando o pH e as quantidades de eletrólitos e enzimas11. O dispositivo experimental baseado na gota pendente permite o registro da tensão interfacial in situ durante todo o processo de digestão simulado. A reologia dilatacional da camada interfacial é calculada no final de cada etapa digestiva. Dessa forma, cada emulsificante oferece um perfil de digestão que ilustra as propriedades das interfaces digeridas, conforme ilustrado na Figura 4B. Isso permite a extração de conclusões sobre sua suscetibilidade ou resistência às diferentes etapas do processo digestivo. Em geral, o meio digestivo artificial contém pH ácido/básico, eletrólitos, proteases (gástricas e intestinais), lipases (gástricas e intestinais), sais biliares e fosfolipídios, que são dissolvidos em seus respectivos fluidos digestivos (gástrico ou intestinal). A Figura 4B mostra um perfil genérico da evolução da tensão interfacial de um emulsificante, primeiro submetido à ação da protease, seguido pelas lipases. Em geral, a proteólise da camada interfacial promove um aumento da tensão interfacial devido à dessorção de peptídeos hidrolisados9,12, enquanto a lipólise resulta em uma redução muito acentuada da tensão interfacial devido à adsorção de sais biliares e lipases 13. Uma troca subfásica final com o fluido intestinal esgota a solução a granel de material não adsorvido/digerido e promove a dessorção de compostos solúveis e a solubilização de lipídios digeridos em micelas mistas. Isso é quantificado pelo aumento da tensão interfacial registrada (Figura 4B).

Em resumo, o delineamento experimental implementado na gota pendente para simular a digestão in vitro em uma única gota permite medir efeitos cumulativos e sinergias à medida que o processo de digestão é aplicado sequencialmente à camada interfacial inicial10. A composição de cada meio digestivo pode ser facilmente ajustada para dar conta das particularidades das condições digestivas, incluindo patologias gastrointestinais ou meios digestivos infantis14. Em seguida, a identificação dos mecanismos interfaciais que afetam a proteólise e a lipólise pode ser usada para modular a digestão pela engenharia interfacial de emulsões. Os resultados obtidos podem ser aplicados no desenho de novas matrizes alimentares com funcionalidades sob medida, como baixa alergenicidade, ingestão controlada de energia e digestibilidade diminuída 15,16,17,18,19.

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Protocol

1. Sequência de limpeza para todos os artigos de vidro utilizados na experimentação da ciência da superfície

  1. Esfregue os copos com uma solução de limpeza concentrada (ver Tabela de Materiais) diluída em água (10%).
  2. Enxágue bem com uma sequência de água da torneira, propanol, água destilada e água ultrapura. Seque em uma cabine e armazene em um armário fechado até o uso.

2. Preparação da amostra

  1. Preparar meios digestivos artificiais de acordo com os protocolos padronizados do INFOGEST11,20 (ver Tabela de Materiais). Para mais pormenores, ver Quadro 1 e incluir pequenas adaptações aos requisitos do trabalho interfacial para evitar a contaminação por superfície ativa e a diluição das amostras (1:10)10.
  2. Prepare a solução emulsificante seguindo as etapas abaixo.
    1. Preparar 0,01 L de uma solução concentrada de (1 kg· L−1) emulsionante ou uma mistura de emulsionantes (ver Tabela de Materiais) num tampão inicial (Tabela 1) e manter sob agitação ligeira durante a noite.
    2. Diluir até 0,1 kg· L−1 (ou conforme necessário) para saturar a interface; atingir um pseudoplatô na tensão interfacial após 1 h de adsorção em uma área interfacial constante seguindo o relato publicado anteriormente21.
    3. Mantenha sob agitação leve por 15 minutos antes do uso.
  3. Purificar a fase de óleo.
    1. Prepare uma mistura de óleo vegetal (girassol, azeitona, trioleína, etc.) e resinas de metassilicato de magnésio (ver Tabela de Materiais) numa proporção de 2:1 p/p num copo grande. Manter sob agitação mecânica suave por pelo menos 3 h.
    2. Centrifugar a mistura a 8.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente numa centrífuga comercial (ver Tabela de Materiais).
    3. Filtrar a mistura de óleo sob vácuo com um filtro de seringa (tamanho de poro de 0,2 μm) (ver Tabela de Materiais). Armazenar em frascos de âmbar limpos selados e borbulhados com nitrogênio até o uso.

3. Calibração e limpeza do OCTOPUS

  1. Enxaguar toda a tubulação com água ultrapura, definindo uma sequência de limpeza de ambas as seringas e todas as válvulas através de um capilar (válvulas 6/4) e para a saída externa (válvula de cor 8-azul). Execute isso pressionando o botão limpar na caixa de diálogo à esquerda (Figura 1A Suplementar).
  2. Verifique a tensão superficial7 da água à temperatura ambiente, formando uma gota de água e medindo em tempo real por 5 min (Figura suplementar 1B, C).
    1. Ajuste a densidade diferencial para ar-água (0,9982 kg· L−1) na caixa de diálogo esquerda, Figura suplementar 1B.
  3. Encha a cubeta limpa (vidro óptico) com 0,002 L de óleo vegetal limpo e coloque-a no suporte da cubeta na célula termostática (Figura 3).
  4. Ajuste o termostato e permita o equilíbrio da temperatura a 37 °C.
  5. Verifique a tensão interfacial da água-óleo à temperatura ambiente7.
    1. Defina a densidade diferencial para óleo-água vegetal (azeite: 0.800 kg· L−1) (Figura 1C Suplementar).
    2. Injete 40 μL a uma taxa de 0,5 μL·s−1 e meça em tempo real a cada segundo até o final da injeção. Este é um processo dinâmico simples (Figura 1B, D suplementar).
    3. Plote a tensão interfacial em função do volume de gotículas em uma folha de dados.
    4. Verifique se a faixa de volume da gota fornece um valor para a tensão interfacial independente do volume da gota. Plote a área interfacial em função do volume das gotículas.
    5. Programe um processo contendo duas etapas (Figura 1B Suplementar e Figura 2A Suplementar) seguindo as etapas abaixo.
      1. Com uma seringa interna, injete um volume contido dentro desta faixa de tensão interfacial constante.
      2. Manter a área interfacial constante no valor selecionado na etapa 3.5.4 e registrar a tensão interfacial por 5 min7.

4. Programando um processo experimental em DINATEN para cada etapa digestiva

NOTA: Para obter os parâmetros do processo, consulte a Figura 1B suplementar.

  1. Execute o controle inicial.
    1. Para a formação de gotas, injectar 10 μL (±5 μL) de solução emulsionante no capilar (válvula 6) (Figura complementar 2A).
    2. Registrar a adsorção em uma área interfacial constante 21 de 20 mm 2 (±10 mm2) por 1 h (Figura suplementar 2B).
    3. Registre a reologiadilatacional 8 (Figura suplementar 2C).
      1. Ajuste a amplitude de oscilação para 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registre a adsorção na área interfacial selecionada (etapa 4.1.2) por 10 s.
      3. Repita a etapa 4.1.3 em diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s e 100 s.
  2. Registre a digestão gástrica.
    1. Registre a adsorção21 na área interfacial selecionada por 10 s.
    2. Troca subfásica7 com líquido na valva 2 (sSGF) e enzimas gástricas (Tabela 1) (Figura suplementar 2D).
      1. Encha a seringa esquerda a partir da válvula 2. Injete 125 μL na válvula 6-capilar com a seringa esquerda a 5 μL·s−1.
      2. Extrair 125 μL do capilar com a seringa direita a 5 μL·s−1. Descarregue a seringa direita para sair da válvula 8. Repita as etapas 4.2.2.1-4.2.2.2 10 vezes para garantir a troca completa.
    3. Registar a adsorção21 na área interfacial seleccionada no passo 4.1.2 durante 1 h (Figura 2B suplementar).
    4. Registre a reologiadilatacional 8 (Figura suplementar 2C).
      1. Ajuste a amplitude de oscilação para 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registre a adsorção da área interfacial selecionada na etapa 4.1.2 por 10 s. Repita em diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  3. Registre a digestão intestinal.
    1. Registar a adsorção21 na área interfacial seleccionada no passo 4.1.2 durante 10 s (Figura 2B suplementar).
    2. Troca subfásica7 com líquido na valva 3 (sSIF) e enzimas intestinais/sais biliares/fosfolipídios (Tabela 1) (Figura suplementar 2D).
      1. Encha a seringa esquerda a partir da válvula 2. Injete 125 μL na válvula 6-capilar com a seringa esquerda a 5 μL·s−1. Extrair 125 μL do capilar com a seringa direita a 5 μL·s−1.
      2. Descarregue a seringa direita para sair da válvula 8. Repita as etapas 4.3.2.1-4.3.2.2 10 vezes para garantir a troca completa.
    3. Registar a adsorção21 na área interfacial seleccionada no passo 4.1.2 durante 1 h.
    4. Registre a reologiadilatacional 8 (Figura suplementar 2C).
      1. Ajuste a amplitude de oscilação para 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registre a adsorção na área interfacial selecionada na etapa 4.1.2 por 10 s.
      3. Repita em diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.
  4. Registre a dessorção seguindo as etapas abaixo.
    1. Registar a adsorção21 na área interfacial seleccionada no passo 4.1.2 durante 10 s (Figura 2B suplementar).
    2. Trocasubfásica 7 com líquido na válvula 5 (sSIF) (Tabela 1, Figura suplementar 2D).
      1. Encha a seringa esquerda a partir da válvula 5. Injete 125 μL na válvula 5-capilar com a seringa esquerda a 5 μL·s−1.
      2. Extrair 125 μL do capilar com a seringa direita a 5 μL·s−1. Descarregue a seringa direita para sair da válvula 8. Repita as etapas 4.4.2.1-4.4.2.2 10 vezes para garantir a troca completa.
    3. Registar a adsorção21 na área interfacial seleccionada no passo 4.1.2 durante 1 h (Figura 2B suplementar).
    4. Registre a reologiadilatacional 8 (Figura suplementar 2C).
      1. Manter a amplitude de 1,25 μL, período 10 s.
      2. Registre a adsorção na área interfacial selecionada na etapa 4.1.2 por 10 s.
      3. Repita a etapa 4.4.4 em diferentes períodos: 5 s, 20 s, 50 s, 100 s.

5. Configurando o experimento

  1. Encha os tubos de microcentrífuga com o meio de digestão artificial e conecte cada um deles à respectiva válvula pela tubulação correspondente.
  2. Encha a tubulação nas válvulas 2-5 limpando da válvula 2, válvula 3, válvula 4 e válvula 5 até a saída externa (válvula 8) (Figura suplementar 1A).
  3. Encha a tubulação na válvula 1 limpando da válvula 1 para a válvula 6-capilar 5 vezes.
  4. Coloque o capilar na fase oleosa. Carregar a seringa esquerda com válvula 1 (solução inicial, Tabela 1).
  5. Comece a processar sequencialmente a etapa 4.1-inicial, a etapa 4.2-gástrica, a etapa 4.3-intestinos e a etapa 4.4-dessorção, salvando os dados no final de cada processo.

6. Cálculo dos parâmetros reológicos dilatacionais com o software de processamento de imagem CONTACTO8

NOTA: Para mais detalhes, ver Maldonado-Valderrama et al.8.

  1. Carregar as imagens correspondentes à oscilação da área a uma dada frequência e amplitude (Figura suplementar 3A).
  2. Pressione Reologia (Figura Suplementar 3B) e obtenha os parâmetros dilatacionais (Figura Suplementar 3C).
  3. Copie e cole os resultados na folha de distribuição de dados.

7. Plotagem dos resultados experimentais

  1. Recalcule a coluna de tempo em cada uma das etapas do processo de digestão adicionando os últimos dados da hora da etapa anterior.
  2. Plote a tensão interfacial versus o tempo aditivo para cada uma das etapas do processo de digestão utilizado.
  3. Plotar a tensão interfacial/elasticidade dilatacional final e viscosidade obtidas no final de cada etapa versus a fase de digestão: inicial, digestão gástrica, digestão duodenal e dessorção.

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Representative Results

Esta seção mostra diferentes exemplos de perfis de digestão medidos com o OCTOPUS. A aparência geral das correspondências de perfil de digestão simuladas é mostrada na Figura 4B. A tensão interfacial é geralmente representada contra o tempo no perfil de digestão. As diferentes fases/etapas de digestão consideradas são representadas em diferentes cores. A primeira fase forma a camada inicial e corresponde à fase de adsorção do emulsionante ou proteína/surfactante/polímero, dependendo de cada caso. Em seguida, os diferentes fluidos digestivos são injetados por troca de subfases em uma solução a granel contendo o novo meio. A nova subfase produz alterações na tensão interfacial da camada emulsificante inicial e na reologia dilatacional medida ao final de cada etapa digestiva. O processo de digestão pode compreender um máximo de oito etapas digestivas.

Figure 5
Figura 5: Exemplo de perfis de digestão gástrica. (A) Proteólise gástrica da albumina sérica humana. Os meios digestivos são aplicados por troca subfásica com soluções detalhadas na seção experimental em T = 37 °C. Azul: tampão inicial com proteína, vermelho: sSGF com pepsina. Reproduzido com permissão de del Castillo-Santaella et al.12. (B) Lipólise gástrica de pectina cítrica. Os meios digestivos são aplicados por troca subfásica com soluções detalhadas na seção experimental em T = 37 °C. Azul: tampão inicial com pectina cítrica, amarelo: sSGF com lipase gástrica, cinza: sSGF. Reproduzido com permissão de Infantes-Garcia et al.17. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 5 mostra alguns resultados experimentais obtidos para a digestão gástrica de emulsionantes. Na Figura 5A, a albumina sérica humana (HSA)12 é primeiro adsorvida na interface azeite-água, diminuindo a tensão interfacial para atingir um platô após 1 h. No final desta fase, a reologia é medida a 0,1 Hz (10 s) de frequência (período). Na segunda etapa, o sSGF com pepsina é adicionado por troca de subfases. Isso consiste em introduzir um volume com uma seringa enquanto extrai o mesmo volume com a outra seringa. Desta forma, a área da gota não muda, mantendo os componentes irreversivelmente adsorvidos na interface óleo-água. A troca é repetida entre 10-15 vezes. Durante a troca subfásica com sSGF e pepsina, a tensão interfacial aumenta devido à hidrólise da proteína, que dilui a camada proteica inicial (Figura 5A). Na Figura 5B, a pectina cítrica (PB)17 adsorve na água oleosa de triglicerídeos por 40 min, seguida de reologia dilatacional a 0,1 Hz. Na segunda etapa, o sSGF com lipase gástrica é injetado na maior parte da gota; inversamente à proteólise, a lipólise resulta na adsorção da lipase e na formação de ácidos graxos, que permanecem na interface, reduzindo a tensão interfacial. A fase de dessorção é a terceira etapa, que avalia a produção de produtos hidrofílicos ou a solubilização de produtos lipofílicos de lipólise. A Figura 5B mostra que a troca de subfases com o sSGF fornece uma resposta nula da tensão interfacial. Isso pode ser interpretado como a produção de produtos digestivos lipofílicos, que adsorvem irreversivelmente e não são solubilizados, permanecendo ancorados na interface. A ausência de sais biliares na fase gástrica é responsável pela falta de solubilização. O grau de lipólise pode ser analisado qualitativamente pelo valor da tensão interfacial atingida.

Figure 6
Figura 6: Exemplo de perfis de digestão intestinal . (A) Perfis de adsorção-dessorção de sais biliares (quadrados pretos), lipase (triângulos cinzentos) e lipase + sais biliares (romboides alaranjados) em sSIF a 37 °C. Reproduzido com permissão de Macierzanka et al.13. (B) Adsorção de sais biliares + lipase em F68 (verde escuro) e F127 (verde claro) previamente adsorvidos, adsorção de sais biliares (amarelo) em sSIF. Dessorção: troca de subfases com sSIF em sais biliares (laranja), F68 (roxo escuro) e F127 (roxo claro). Reproduzido com permissão de Torcello-Gómez et al.19. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 6 mostra os resultados experimentais obtidos para a digestão intestinal de emulsionantes. Em contraste com a digestão gástrica, a presença de sais biliares no intestino delgado oferece diferentes perfis de dessorção na troca de subfases com sSIF e depleção da solução a granel. A Figura 6A mostra os perfis de dessorção obtidos para sais biliares puros, lipase pura e lipase/sais biliares mistos 8,9,10,13. Os sais biliares adsorvem reversivelmente na interface óleo-água e, portanto, são totalmente dessorvidos na troca subfásica com o sSIF, como indicado pelo aumento da tensão interfacial para atingir o valor da interface óleo-água nua 8,13. Por outro lado, a lipase adsorve irreversivelmente, como dado pelo valor constante da tensão interfacial após a troca de subfases pelo sSIF. A mistura lipase e sais biliares fornece um perfil de dessorção intermediário quantificado por um aumento limitado na tensão interfacial após a troca de subfases por sSIF para um valor intermediário. A camada interfacial restante contém lipase e ácidos graxos livres. Os sais biliares possivelmente dessorviam da interface e solubilizavam alguns dos ácidos graxos livres formados na lipólise. A Figura 6B mostra a evolução da tensão interfacial à lipólise de duas variantes do Pluronic: F127 e F6819. A Figura 6B mostra uma diminuição acentuada da tensão interfacial devido à adsorção de lipase e sais biliares e à produção de ácidos graxos livres em filmes interfaciais previamente formados de F68 e F127 na interface óleo-água. A etapa de dessorção mostra o aumento da tensão interfacial causada pela troca subfásica com o sSIF, que quantifica a solubilização dos produtos lipolíticos.

Figure 7
Figura 7: Exemplo de perfis dinâmicos completos de digestão gastrointestinal. (A) Perfil de digestão in vitro do filme adsorvido AS-48 na interface ar-água. Os meios digestivos são aplicados por troca subfásica com soluções detalhadas na seção experimental em T = 37 °C. Controle: tampão inicial com AS-48, pepsina: sSGF com pepsina, tripsina: sSIF com tripsina + quimotripsina, dessorção: sSIF. Reproduzido com permissão de del Castillo-Santaella et al.18. (B) Perfil de digestão in vitro de filmes adsorvidos de albumina sérica humana e bovina na interface azeite-água. Os meios digestivos são aplicados por troca subfásica com soluções detalhadas na seção experimental em T = 37 °C. Controle: tampão inicial com HSA/BSA, pepsina: sSGF com pepsina, tripsina: sSIF com tripsina + quimotripsina, lipólise: sSIF com lipase e sais biliares, dessorção: sSIF. As curvas plotadas são experimentos representativos com desvios <5%. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 7 mostra exemplos de perfis completos de digestão simulada. A Figura 7A mostra o perfil de digestão do bioconservante alimentar AS-48 adsorvido na interface ar-água18. O processo digestivo foi projetado para se concentrar na proteólise desse peptídeo, enquanto a lipólise do óleo não era necessária, estando na interface ar-água. Assim, a digestão simulada na Figura 7A compreende cinco etapas: controle/filme inicial, pepsinólise, tripsrinólise e dessorção. Os resultados experimentais mostraram que esta bacteriocina é resistente à hidrólise de pepsina e tripsina, uma vez que a tensão superficial permaneceu inalterada. Assim, o AS-48 foi considerado um bom bioconservante alimentar resistente à digestão in vitro . A Figura 7B compara os perfis de digestão in vitro das camadas adsorvidas de albuminas séricas humanas e bovinas adsorvidas na interface óleo-água22. Esta simulação foi projetada para imitar a digestibilidade de emulsões estabilizadas por essas duas proteínas23 e avaliar o encapsulamento da curcumina4. Assim, a digestão simulada foi customizada compreendendo cinco etapas: controle/inicial, pepsinólise, tripsinólise, lipólise e dessorção. Os resultados experimentais mostraram aumento da tensão interfacial após a digestão da pepsina, indicando maior suscetibilidade à pepsinólise. Isso foi atribuído ao aumento do desdobramento da variante bovina após a adsorção, expondo locais suscetíveis à pepsina. Em seguida, a tripsinólise e a lipólise forneceram perfis de digestão completamente semelhantes (Figura 7B).

Figure 8
Figura 8: Exemplo de valores finais da digestão gastrointestinal. (A) Tensão interfacial, (B) elasticidade dilatacional, (C) viscosidade dilatacional da digestão in vitro do filme adsorvido de β-lactoglobulina na interface azeite-água. Os parâmetros dilatacionais foram medidos em 1 Hz, 0,1 Hz e 0,01 Hz após o equilíbrio da interface digerida em cada etapa. Os meios digestivos são aplicados por troca subfásica com soluções detalhadas na seção experimental em T = 37 °C. Controle: tampão inicial com proteína, pepsina: sSGF com pepsina, tripsina: sSIF com tripsina + quimotripsina, lipólise: sSIF com lipase e sais biliares, dessorção: sSIF. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Em geral, para avaliar e comparar a natureza das diferentes camadas interfaciais digeridas, a tensão interfacial final e a elasticidade/viscosidade dilatacional obtidas para as interfaces digeridas são plotadas para cada uma das etapas consideradas no processo de digestão projetado. A Figura 8 mostra a tensão interfacial (Figura 8A), a elasticidade dilatacional (Figura 8B) e a viscosidade dilatacional (Figura 8C), medidas nas frequências de 1 Hz, 0,1 Hz e 0,01 Hz. Os valores plotados foram obtidos após cada etapa digestiva da adsorvida β-lactoglobulina na interface óleo-água16. A Figura 8A mostra que a proteólise (pepsina e tripsina) produz pequenos aumentos na tensão interfacial, enquanto a lipólise reduz esse valor e a dessorção aumenta novamente. Em relação à elasticidade dilatacional, a proteína forma filmes elásticos e interligados na interface óleo-água. A presença de sais biliares produz filmes interfaciais altamente móveis e fluidos com baixa elasticidade. Finalmente, os produtos lipolíticos restantes não podem desenvolver um filme elástico coesivo após a dessorção. A elasticidade dilatacional aumenta ligeiramente com a frequência de oscilação (Figura 8B). Finalmente, a viscosidade dilatacional dos filmes interfaciais mostrados na Figura 8C só é detectável na frequência mais baixa e detecta a existência de multicamadas, agregados ou outras estruturas dissipativas na interface. A comparação do perfil de digestão da β-lactoglobulina com o perfil de digestão obtido para a β-lactoglobulina tratada com pulso mostrou melhora da digestibilidade das proteínas submetidas a esse tipo de tratamento físico16.

Buffer inicial 0,00113 mol L-1 NaH2PO4, pH 7,0
Fluido Gástrico Simulado Simplificado (sSGF) [NaH2PO4] = 0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, pH 3,0
Fluido Intestinal Simulado Simplificado (sSIF) [NaH 2 PO4] =0,00113 mol L-1, [NaCl] = 0,15 mol L-1, [CaCl2] = 0,003 mol L-1, pH 7,0
Enzimas gástricas pepsina (50 ∙ 10 3 U L-1), lipase gástrica (0,5 ∙ 103 U L-1)
Enzimas intestinais tripsina (2,5 ∙ 10 3 U L-1), quimotripsina (0,625 ∙ 10 3 U L-1), lipase pancreática (50∙ 10 3 U L-1), colipase (150 ∙ 10 3 U L-1)
Mistura de sais biliares 0,01 mol L-1 M. Mistura de sais biliares: Taurocolato de sódio e desoxicolato de sódio (50/50) ou Taurocolato de sódio e glicodesoxicolato de sódio (50/50)

Tabela 1: Composição dos meios digestivos artificiais.

Figura 1 Suplementar: Operações básicas da interface do computador DINATEN. (A) Aparência geral da interface de computador DINATEN; a caixa de diálogo à esquerda mostra as duas seringas ligadas a todas as válvulas e controla a injeção/extracção e limpeza. A caixa de diálogo central contém o comando, a imagem de descarte e a tabela com resultados. (B) O cálculo em tempo real fornece medição automática em função do tempo. (C) Comando esquerdo para incluir a densidade diferencial. (D) Um processo dinâmico simples controla o volume de injeção/extração, a taxa e os tempos de captura. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 Suplementar: A interface para programar cada etapa digestiva (processo). (A) Formação de gotas com uma seringa esquerda de volume fixo e taxa de injeção fixa. (B) Adsorção em área interfacial constante: controle. (C) Reologia com amplitude, período e número de ciclos fixos. (D) Troca subfásica: injetar e extrair com ambas as seringas à mesma taxa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Cálculo dos parâmetros dilatacionais com o software para análise de imagens CONTACTO. (A) Análise das imagens correspondentes à oscilação em um período fixo. (B) Cálculo dos parâmetros dilatacionais da camada interfacial das imagens selecionadas. (C) Diálogo mostrando os resultados da análise dilatacional. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Este artigo descreve um protocolo generalizado para medir a digestão in vitro de camadas interfaciais usando equipamentos de gota pendente. O protocolo pode ser ajustado às necessidades específicas do experimento ajustando a composição dos tampões digestivos, que são baseados no protocolo harmonizado INFOGEST11,20 para facilitar a comparação com a literatura. As enzimas digestivas e os biossurfactantes podem ser adicionados individualmente, sequencialmente ou em conjunto. Esta última opção precisa ser conduzida com cuidado, pois a saturação da camada interfacial dificultaria os diferentes fenômenos, apenas proporcionando uma tensão interfacial muito baixa e poderia fazer com que a gotícula caísse. Para poder analisar o efeito de cada componente digestivo, as diferentes enzimas digestivas são adicionadas sequencialmente e em diferentes concentrações. Dessa forma, os efeitos de cada componente podem ser analisados e sistematizados, e as sinergias são avaliadas por adição sequencial. Além disso, para evitar que as gotículas caiam, algumas concentrações são diluídas9. Os resultados obtidos não podem ser diretamente extrapolados para sistemas emulsionados, pois as condições são ajustadas para levar em conta um sistema simplificado. No entanto, a evolução da tensão interfacial mostra a evolução da cobertura interfacial à medida que a camada interfacial é digerida10. Da mesma forma, a evolução da reologia dilatacional fornece algumas informações sobre as propriedades mecânicas da interface à medida que a digestão prossegue9. Estes resultados contêm informações úteis que podem ser adaptadas e cuidadosamente interpretadas para serem aplicadas a sistemas emulsionados.

O equipamento de gota pendente permite a avaliação de eventos in situ que ocorrem especificamente na camada interfacial, conforme ilustrado na Figura 2. Primeiro, uma camada interfacial inicial é formada, representando uma única gota de emulsão. Esta camada inicial é submetida a diferentes condições digestivas e altera sua composição sequencialmente devido à presença dos diferentes componentes na fase aquosa. Além disso, as lipases devem superar essa camada interfacial para acessar a fase oleosa e hidrolisar a gordura. Esses eventos interfaciais devem ser avaliados na mesma camada interfacial inicialmente criada. Submeter uma emulsão à digestão in vitro permitiria a amostragem em diferentes momentos e a avaliação das mudanças na emulsão à medida que é digerida (tamanho da gota, potencial zeta), mas não permitiria a avaliação in situ da camada interfacial que envolve cada gota de emulsão. Assim, o equipamento de gota pendente implementado com troca multifásica compreende uma técnica complementar com foco na engenharia interfacial de emulsões14.

A primeira limitação dessa metodologia está justamente relacionada à saturação da camada interfacial com produtos variados, que precisam ser diluídos para evitar a queda da gota. Outra questão experimental é a desgaseificação de todos os meios artificiais, a fim de evitar a nucleação de bolhas, o que também poderia causar descolamento de gotículas do capilar. Também é importante considerar a maior relação óleo-água em comparação com os sistemas de emulsão ao extrapolar para sistemas emulsionados. Finalmente, embora a reologia dilatacional contenha informações sobre as associações inter e intramoleculares dentro da camada interfacial, formadas e interrompidas por enzimas digestivas, é difícil interpretar e extrapolar para a estabilidade da emulsão. Ao todo, a gota pendente implementada com um dispositivo de troca multifásica é um equipamento útil para complementar os estudos de digestão in vitro de emulsões12, que acompanham a evolução da distribuição do tamanho das gotículas e do potencial zeta da digestão proteica com eletroforese22. Modificações do trato digestivo para explicar a variação de gênero, digestão infantil ou problemas digestivos compreendem futuras aplicações do procedimento experimental.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros ou relações pessoais concorrentes conhecidos que possam ter influenciado o trabalho relatado neste artigo.

Acknowledgments

Esta investigação foi financiada pelos projetos RTI2018-101309-B-C21 e PID2020-631-116615RAI00, financiados pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e pelo "FEDER Uma forma de fazer a Europa". Este trabalho foi (parcialmente) apoiado pelo Grupo de Biocoloides e Física dos Fluidos (ref. PAI-FQM115) da Universidade de Granada (Espanha).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

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References

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<em>In vitro</em> Digestão de emulsões em uma única gotícula <em>via</em> troca multifásica de fluidos gastrointestinais simulados
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