Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में औसत दर्जे के मिनीस्कोटिबियल लिगामेंट को काटकर माउस घुटने को अस्थिर करने के बाद आर्टिकुलर कार्टिलेज की सतह पर नियंत्रित माइक्रोब्लेड खरोंच का वर्णन किया गया है। यह पशु मॉडल ऑस्टियोफाइट गठन, ओस्टियोस्क्लेरोसिस और प्रारंभिक चरण के दर्द का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) का एक त्वरित रूप प्रस्तुत करता है।
Abstract
ऑस्टियोआर्थराइटिस 45 से अधिक उम्र के लोगों में सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल बीमारी है, जिससे आर्थिक और सामाजिक लागत बढ़ रही है। पशु मॉडल का उपयोग रोग के कई पहलुओं की नकल करने के लिए किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल पोस्ट-ट्रॉमेटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस के अस्थिरता और उपास्थि खरोंच मॉडल (डीसीएस) का वर्णन करता है। मेडियल मेनिस्कस (डीएमएम) मॉडल की व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली अस्थिरता के आधार पर, डीसीएस उपास्थि की सतह पर तीन खरोंच का परिचय देता है। वर्तमान लेख में कृत्रिम उपास्थि पर तीन जानबूझकर सतही खरोंच के बाद औसत दर्जे के मेनिस्कोटिबियल लिगामेंट को सही करके घुटने को अस्थिर करने के चरणों पर प्रकाश डाला गया है। गतिशील वजन-असर, माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी और हिस्टोलॉजी द्वारा संभावित विश्लेषण विधियों का भी प्रदर्शन किया जाता है। जबकि डीसीएस मॉडल को उन अध्ययनों के लिए अनुशंसित नहीं किया जाता है जो उपास्थि पर पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करते हैं, यह कम समय की खिड़की में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के विकास के अध्ययन को सक्षम बनाता है, जिसमें (1) ओस्टियोफाइट गठन, (2) ऑस्टियोआर्थराइटिस और चोट दर्द, और (3) पूरे जोड़ में उपास्थि क्षति का प्रभाव शामिल है।
Introduction
ऑस्टियोआर्थराइटिस (ओए) 45 से अधिक लोगों में सबसे प्रचलित मस्कुलोस्केलेटल बीमारी है, जिसमें 8.75 मिलियन सेअधिक ब्रिटेन में उपचार की मांग कर रहे हैं। बीमारी के बढ़ते प्रसार ने आर्थिक और सामाजिक लागत में वृद्धि की है, विकलांगता में एक प्रमुख योगदानकर्ता है,और रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता को कम करता है। उपलब्ध उपचार के बिना, रोग के विकास और प्रगति को समझने के लिए अनुसंधान में तेजी लाने की तत्काल आवश्यकता है। रोग जटिल है और इसकी प्रकृति में बहुक्रियाशील भी है। रोग के मुख्य नैदानिक माप दर्द और संयुक्त गतिशीलता2 हैं, और ओए संयुक्त में सभी ऊतकों को प्रभावित करता है, न कि केवल उपास्थि3। ओए को समझने में मुख्य चुनौतियों में से एक यह है कि प्रारंभिक प्रस्तुति / चोट से लेकर दर्द और गतिहीनता के साथ रोगसूचक रोग की प्रगति तक वर्षों, कभी-कभी दशकों लग सकते हैं।
कृन्तकों में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस मॉडलिंग ने ओए पैथोफिज़ियोलॉजी के हमारे ज्ञान को बढ़ाया है, जिससे हमें बहुत कम समय सीमा में दीक्षा और प्रगति को समझने और इसमें शामिल ऊतकों की विस्तृत परीक्षा के साथ अनुमति मिली है। आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों से सर्जिकल हस्तक्षेप मॉडल तक पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के कई मुराइन मॉडल हैं। पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए का सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला मुराइन मॉडल मेडियल मेनिस्कस (डीएमएम) 4,5 की अस्थिरता है। मॉडल की एक चेतावनी विभिन्न ऑपरेटरों के बीच परिवर्तनशीलता है। अनुभवी सर्जन न्यूनतम संयुक्त क्षति के साथ प्रक्रिया कर सकते हैं, जबकि अनुभवहीन ऑपरेटर संयुक्त कैप्सूल को लंबे समय तक उजागर करते हैं और उपास्थि को नुकसान पहुंचाते हैं। प्रक्रिया में यह परिवर्तनशीलता मॉडल की गंभीरता को प्रभावित करती है, जिसमें अधिक प्रारंभिक क्षति होती है जिससे उपास्थि क्षति स्कोर और ओस्टियोफाइट गठन में वृद्धि होती है। ऑपरेटरों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने और नैदानिक हस्तक्षेप से उपास्थि क्षति की नकल करने के इरादे से, इस मॉडल का एक संशोधित संस्करण विकसितकिया गया है, जिससे तीन सतही खरोंच के रूप में उपास्थि की सतह पर नियंत्रित अतिरिक्त क्षति होती है। यह कुछ नैदानिक हस्तक्षेपों के कारण उपास्थि क्षति के परिणामस्वरूप ओए प्रगति को मॉडलिंग करने की भी अनुमति देता है। मानक डीएमएम मॉडल की तुलना में, सीधे प्रेरित उपास्थि क्षति के परिणामस्वरूप लगातार तेजी से फैले हुए ओस्टियोफाइट गठन, उपास्थि क्षति और सूजन में वृद्धि, और पुरुष चूहों में औसत दर्जे का सरोगेट दर्द होता है।
यह मॉडल विशेष रूप से प्रारंभिक चरण के पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, जो ओस्टियोफाइट गठन, दर्द प्रस्तुति (पुरुष चूहों में), सिनोविटिस और हड्डी के मापदंडों में शुरुआती परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित करता है। इस मॉडल में ओस्टियोफाइट गठन की स्थिरता हड्डी की मरम्मत और एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन का अध्ययन करना प्रासंगिक बनाती है क्योंकि ओस्टियोफाइट गठन एंडोकॉन्ड्रल ओसिफिकेशन7 के माध्यम से मरम्मत की एक प्रक्रिया है। मॉडल नैदानिक हस्तक्षेपों के दौरान सीधे उपास्थि को पेश किए गए नुकसान की नकल करता है, जैसे कि आर्थोस्कोपिक सर्जिकल प्रक्रियाएं, और इस प्रकार यह पूरे जोड़ पर उपास्थि क्षति के प्रभाव के अध्ययन के लिए भी उपयुक्त है।
Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को ग्लासगो विश्वविद्यालय और स्कॉटलैंड के पश्चिम विश्वविद्यालय के नैतिक समीक्षा पैनल द्वारा अनुमोदित किया गया था, और पशु (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 (यूके) दिशानिर्देशों का पालन किया गया था। 10 सप्ताह के C57Bl6 / J नर चूहों, जिनका वजन लगभग 25 ग्राम था, का उपयोग वर्तमान अध्ययन के लिए किया गया था। चूहों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. जानवरों की तैयारी
नोट: अध्ययन के उद्देश्य के संबंध में माउस लिंग पर विचार करें क्योंकि पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए मॉडल लिंग 8,9,10 के आधार पर महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित करते हैं।
- सुनिश्चित करें कि एनेस्थेटिक अभिकर्मक (2% आइसोफ्लुरेन) तैयार है।
नोट: इंजेक्शन एनेस्थीसिया का भी उपयोग किया जा सकताहै। सर्जरी की त्वरित अवधि को देखते हुए, इनहेलेंट एनेस्थीसिया के उपयोग की सिफारिश की जाती है। - सर्जिकल नियंत्रण के रूप में एक अलग शाम-संचालित आयु-मिलान समूह का उपयोग करें।
नोट: विपरीत घुटने को सर्जिकल नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए (पैर पर शाम ऑपरेशन)। इसमें पशु कल्याण के संदर्भ में समस्याएं हो सकती हैं, और यह चाल और चाल माप को प्रभावित करेगा। विपरीत घुटने आंतरिक हड्डी मापदंडों12 को सामान्य करता है और दर्द परीक्षण13 पर युग्मित तुलना के रूप में कार्य करता है। - कंकाल रूप से परिपक्व चूहों का उपयोग करें।
नोट: अधिकांश साहित्य 8-12 सप्ताह की उम्र में ओए को प्रेरित करता है। वर्तमान अध्ययन में, चूहे 10 सप्ताह के हैं।
2. प्री-ऑपरेटिव देखभाल (एक सर्जिकल सहायक द्वारा किया जाता है)
- यदि एक अलग सुविधा से ले जाया जाता है, तो चूहों को अपने नए वातावरण में समायोजित करने के लिए शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप से कम से कम 1 सप्ताह पहले अनुमति दें।
- उचित रूप से नामित बाँझ कमरे में सर्जरी करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी सतह बाँझ हैं (उदाहरण के लिए, सर्जरी के क्षेत्रों को कवर करने के लिए बाँझ ड्रेप का उपयोग करें)।
नोट: सर्जरी सड़न रोकनेवाला है। - बाँझ ड्रेप पर बाँझ उपकरणों को व्यवस्थित और रखें।
- माउस का वजन करें।
- एक एनेस्थेटिक पिंजरे में माउस पेश करके संज्ञाहरण को प्रेरित करें और फिर एक मानक एनेस्थेटिक रिग का उपयोग करके 15 मिनट तक 2% आइसोफ्लोरेन पेश करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: माउस पेश करने से पहले पिंजरे में "अवशिष्ट" संज्ञाहरण नहीं होना चाहिए। - एक बार एनेस्थेटाइज्ड होने के बाद, माउस को एनेस्थेटिक कक्ष से बाहर निकालें और छोटे बाल क्लिपर के साथ मध्य-पिंडली से मध्य-जांघ तक घुटने, सामने और पार्श्व पक्षों पर फर को क्लिप करें।
नोट: हिंदलिम्ब घुटने का विकल्प ऑपरेटर की प्राथमिकता पर निर्भर करता है कि उन्हें किस तरफ सर्जरी करना आसान लगता है। यह प्रोटोकॉल बाएं पैर पर संचालित होता है। - सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड है (पैर को चुटकी लेने के लिए गैर-उत्तरदायी)।
- कटी हुई त्वचा पर जीवाणुरोधी त्वचा क्लींजर (उदाहरण के लिए, क्लोरहेक्सिडाइन या आयोडोफर युक्त, सामग्री की तालिका देखें) लगाकर त्वचा को कीटाणुरहित करें।
- एनाल्जेसिया के लिए, 0.05 मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन को चमड़े के नीचे प्रशासित करें।
- माउस को पृष्ठीय पक्ष पर रखें, घुटने को ऊपर की ओर संचालित करने के लिए छोड़ दें, और माउस नाक को एनेस्थेटिक रिग से जुड़े नोजल में रखें।
- माउस को एक छोटे कीहोल खोलने के साथ बाँझ ड्रेप के साथ कवर करें।
- पैर को 90 ° से कम पर घुटने के लचीले होने के साथ ऑपरेशन करने के लिए रखें, जिसमें पेटेलर लिगामेंट ऊपर की ओर हो और पैर सर्जिकल टेप के साथ स्थिर हो।
3. कार्टिलेज स्क्रैच के बाद मेडियल मेनिस्कस प्रक्रिया की अस्थिरता
- पेटेलर लिगामेंट पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप को समायोजित करें।
- घुटने की त्वचा को पार्श्व की ओर सेरेटेड फोर्सप्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पिंच करें, सर्जिकल कैंची का उपयोग करके डिस्टल पेटेलर कण्डरा के समानांतर एक छोटा सा कट बनाएं, कैंची पेश करें और कट को लगभग 1 सेमी तक बढ़ाएं। पेटेलर लिगामेंट और समीपस्थ टिबियल पठार को उजागर करते हुए त्वचा को औसत दर्जे की तरफ ले जाएं (चित्र 1)।
- एक संख्या 11 ब्लेड के साथ, लिगामेंट के ऊपर से नीचे तक, पेटेलर लिगामेंट के मध्यवर्ती पक्ष के साथ एक चीरा लगाएं (चित्रा 1 ए)। पेटेलर लिगामेंट के निचले हिस्से तक पहुंचते समय, ब्लेड को 90 डिग्री घुमाएं और संयुक्त कैप्सूल तक पहुंच प्राप्त करने के लिए पेटेलर लिगामेंट से चीरा को दूर मेडियल साइड की ओर बढ़ाएं।
नोट: रक्तस्राव इस या बाद के चरणों में हो सकता है। यदि रक्तस्राव होता है तो बाँझ कपास की कली का उपयोग करें और कुछ सेकंड (5 से 30 सेकंड) दबाव लागू करें। - पेटेलर लिगामेंट को कुंद टिप फोर्स के साथ पिंच करें और पेटेलर लिगामेंट को पार्श्व पक्ष में ले जाने के लिए कलाई को घुमाएं, बस इन्फ्रापेटेलर फैट पैड (आईएफपी) को उजागर करने के लिए पर्याप्त है।
नोट: पेटेलर लिगामेंट को नुकसान को कम करने के लिए, चिमटी को बहुत तंग न रखें, बस लिगामेंट को साइड में रखने के लिए पर्याप्त हैं। - अभी भी पेटेलर लिगामेंट को हल्के से पकड़ते हुए, आईएफपी को माइक्रो-ट्वीज़र्स ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ चुटकी लें ताकि इसे ऊपर उठाया जा सके और इसे थोड़ा ऊपर ले जाया जा सके। यह मेडियल मेनिस्कस लिगामेंट की कल्पना करने की अनुमति देता है।
- मेडियल मेनिस्कस के मेडियल मेनिस्कस (एमएमटीएल) की पहचान करें, जो मेडियल मेनिस्कस के कपाल सींग को पूर्ववर्ती टिबियल पठार (चित्रा 1 बी) तक लंगर डालता है।
- टिबियल पठार या ऊरु कोंडिल पर क्षति और लंबे समय तक उपास्थि जोखिम से बचें।
- एमएमटीएल को छोटे 2 मिमी ब्लेड वन्नास स्प्रिंग कैंची के साथ सावधानीपूर्वक अलग करें, जिससे औसत दर्जे के मेनिस्कस और अन्य स्नायुबंधन बरकरार रहें। इस बिंदु पर, डीएमएम मॉडल के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया पूरी हो जाती है (चित्रा 1 सी)।
- 3 मिमी माइक्रोसर्जिकल चाकू के साथ, टिबियल आर्टिकुलर कार्टिलेज पर पीछे से पूर्ववर्ती भाग तक की दिशा में तीन समान रूप से स्थान वाले इंडेंटेशन को चिह्नित करें।
नोट: स्कोर लंबाई में लगभग 1 मिमी हैं और केवल उपास्थि की सतह को नुकसान पहुंचाते हैं (चित्रा 2 डी)।- उपास्थि पर ब्लेड के साथ अत्यधिक बल का उपयोग न करें (यानी, सुनिश्चित करें कि खरोंच सतही हैं)। यह अतिरिक्त कदम उपास्थि क्षति पहुंचाता है, जो डीसीएस मॉडल को प्रेरित करता है।
- त्वचा को दो या तीन छोटे 7 मिमी घाव बंद धातु क्लिप या अवशोषित 6-0 सबडर्मल सर्जिकल सीवन के साथ बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: सबडर्मल सर्जिकल सीवन बेहतर होते हैं क्योंकि वे आगे के हस्तक्षेप से बचते हैं, लेकिन वे सर्जरी की अवधि बढ़ाते हैं। बाहरी सीवन चूहों के कुतरने से घाव खुलने का खतरा बढ़ जाता है। - शाम की सर्जरी के लिए मेडियल मेनिस्कस के मेडियल मेनिस्कस के मेडियल मेनिस्कोटिबायल लिगामेंट की पहचान करें, लेकिन अलग न करें।
- केवल उपास्थि खरोंच प्राप्त करने वाले चूहों के लिए, स्नायुबंधन को अलग किए बिना तीन सतही खरोंच बनाएं।
नोट: प्रत्येक माउस के बीच, दस्ताने बदलें और आटोक्लेव के माध्यम से उपकरणों को निष्फल करें। पुन: उपयोग से पहले उपकरणों को ठंडा करने की जांच करना याद रखें।
4. पोस्ट-ऑपरेटिव देखभाल
- यदि रक्तस्राव हुआ है (>50 यूएल), तो 500 μL गर्म बाँझ खारा चमड़े के नीचे (माउस के पीछे) इंजेक्ट करें।
नोट: हमारे अनुभव में, हालांकि चूहों में मामूली रक्तस्राव होता है, यह कभी भी एक छोटी बूंद से अधिक नहीं होता है, और इस प्रकार तरल पदार्थों को फिर से भरने की आवश्यकता नहीं होती है। - सर्जरी के बाद, माउस को एक साफ कागज के ऊतक पर रिकवरी पिंजरे में रखें और संज्ञाहरण (5-10 मिनट) से वसूली की अनुमति दें।
- सर्जरी के बाद पूरी तरह से जागरूक चूहों को ताजा बिस्तर के साथ एक साफ पिंजरे में स्थानांतरित करें।
- सर्जिकल हस्तक्षेप के बाद 72 घंटे में, दर्द या संकट के किसी भी संकेत के लिए निगरानी करें। इस पर ध्यान दें:
- शरीर के वजन में परिवर्तन। हालांकि पहले और दूसरे दिन शरीर का वजन कम हो सकता है, यह आमतौर पर पूर्व-सर्जिकल शरीर के वजन के 5% से अधिक नहीं होता है।
- चीरा के चारों ओर ग्रूमिंग या ओवर-ग्रूमिंग की सामान्य कमी।
- सामान्य स्वास्थ्य में गिरावट के संकेत, जैसे कि झुकी हुई मुद्रा, चेहरे की सूजन, और / या असामान्य श्वसन।
- घाव के संक्रमण जैसा कि किसी भी सूजन, निर्वहन या घाव के खुलने से संकेत मिलता है।
नोट: सर्जिकल घाव खुलने पर संक्रमण हो सकता है। चूंकि सर्जिकल घाव की मरम्मत (उदाहरण के लिए, लापता धातु क्लिप को बदलना या पुन: ट्यूरिंग) एक विनियमित प्रक्रिया है, यह सुनिश्चित करें कि मरम्मत करने से पहले प्रासंगिक अनुमोदन प्राप्त किया जाए।
- सर्जरी के बाद 5-7 दिनों के बीच धातु क्लिप हटा दें।
- अध्ययन डिजाइन के आधार पर चूहों को आमतौर पर 2-52 सप्ताह के बाद बनाए रखें।
- अध्ययन के दौरान किसी भी बिंदु पर दर्द / चाल का मूल्यांकन करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन चरण 5.1 में वर्णित गतिशील वजन-असर का उपयोग करता है। - राष्ट्रीय लाइसेंसिंग समझौतों, स्थानीय दिशानिर्देशों और प्रयोगात्मक अनुमोदन के अनुसार, एक अनुमोदित विधि द्वारा जानवर को इच्छामृत्यु करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, जानवरों को टर्मिनल एनेस्थीसिया के तहत एक्ससेंगुइनेशन (कार्डियक पंचर) के माध्यम से इच्छामृत्यु दी गई थी, जिसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था14 थी।
5. ऑस्टियोआर्थ्रिटिक रोग का मूल्यांकन
- नीचे दिए गए चरणों के बाद दर्द के सरोगेट माप के रूप में गतिशील वजन वहन को मापें।
नोट: चूंकि चूहे शिकार जानवर हैं, इसलिए वे दर्द व्यवहार को छिपाते हैं। इससे दर्द का मापन मुश्किल हो जाता है। दर्द को मापने के कई तरीके हैं, जैसे वॉन फ्रे15 और चाल विश्लेषण16। वर्तमान अध्ययन ने एक दबाव मैट पर संचालित ऑस्टियोआर्थ्रिटिक पैर और असंचालित नियंत्रण पैर के बीच अंतर भार को मापा, जबकि माउस एक पिंजरे में था ( सामग्री की तालिका, चित्रा 2 ए देखें)।- माउस का वजन करें। निर्माता के विशिष्ट निर्देशों के अनुसार दबाव मैट को तराएं और कैलिब्रेट करें ( सामग्री की तालिका में गतिशील वजन-असर उपकरण देखें)। पिंजरे में माउस का परिचय दें।
- 5 मिनट के लिए पिंजरे में माउस के आंदोलन और पंजे के दबाव को रिकॉर्ड करें। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए, 1 मिनट को मान्य करने के लिए अधिग्रहित डेटा का विश्लेषण करें।
नोट: डीडब्ल्यूबी सॉफ्टवेयर पर निर्माता का स्वचालित विश्लेषण ( सामग्री की तालिका में गतिशील वजन-असर उपकरण देखें) कुल शरीर के वजन के अनुपात में प्रत्येक पंजे पर माप प्रदान करता है, प्रत्येक पंजा मैट पर रहने वाले मान्य समय की मात्रा, और प्रत्येक पंजे द्वारा कब्जा किए गए मैट क्षेत्र का अनुमान। यह दो पीछे के पंजे के बीच अंतर भार की गणना, सामने और पीछे के पंजे के बीच अंतर भार, सामने के पंजे की लोडिंग में वृद्धि (यदि एक ही माउस को समय की अवधि में मापा गया है), विपरीत पैर और पंजे की सतह की तुलना में ओए पैर को उठाने में बिताया गया समय।
- माइक्रोकम्प्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) के माध्यम से कैल्सीफाइड ऊतक की मात्रा निर्धारित करें।
नोट: यद्यपि सबकॉन्ड्रल हड्डी ओस्टियोस्क्लेरोसिस और ओस्टियोफाइट गठन को हिस्टोलॉजिकल वर्गों में मापा जा सकता है, 3सीटी तीन आयामी रूप से मात्रा निर्धारित करने का अवसर प्रदान करता है। 5 μm पर μCT में छवि कैप्चर का रिज़ॉल्यूशन पर्याप्त है, क्योंकि यह ओस्टियोफाइट्स जैसी छोटी संरचनाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, हालांकि रिज़ॉल्यूशन जितना अधिक होगा, उतना ही बेहतर होगा।- घुटने के जोड़ों को 24 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में ठीक करें, फिर 70% ईटीओएच में स्थानांतरित करें।
- घुटने के जोड़ों को एक μCT स्कैनर में स्कैन करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में, नमूनों को 50 kV और 200 μA पर 0.5 एल्यूमीनियम फ़िल्टर सेट के साथ एक μCT स्कैनर ( सामग्री की तालिका देखें) पर स्कैन किया गया था। नमूने की जांच 4.5 μm के वोक्सेल आकार पर की गई थी; इमेजिंग के लिए 2 μm, 0.2 ° रोटेशन कोण, और परिमाणीकरण के लिए 0.5 ° रोटेशन कोण। - 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देने के लिए स्कैन का पुनर्निर्माण करें। यहां प्रस्तुत स्कैन को संगत सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुनर्निर्मित किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सबकॉन्ड्रल बोन स्केलेरोसिस (चित्रा 2 बी) का विश्लेषण करें।
- औसत दर्जे के टिबियल पठार17 के भार के केंद्र में 0.5 मिमी × 0.9 मिमी × 0.9 मिमी की आयतन (वीओआई) का चयन करें।
- अनियंत्रित पैर का विश्लेषण करके माउस के आंतरिक हड्डी फेनोटाइप के खिलाफ सामान्यीकरण करें।
- सीटीएएन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके स्टैक के द्वि-आयामी कोरोनल दृश्य में टिबियल एपिफिसिस, सबकॉन्ड्रल प्लेट, या कुल सबकॉन्ड्रल हड्डी के भीतर ट्रेब्युलर संरचना को चित्रित करते हुए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) का चयन करके सबकॉन्ड्रल अस्थि घनत्व और माइक्रो-आर्किटेक्चर का निर्धारण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: जैसे-जैसे रोग बढ़ता है, सबकॉन्ड्रल प्लेट और सबकॉन्ड्रल ट्रैब्युलर क्षेत्र के बीच अलगाव को अलग करना अधिक कठिन हो जाता है। फिर संयुक्त स्थान से विकास प्लेट तक चयनित सबकॉन्ड्रल हड्डी के क्षेत्र का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ओस्टियोफाइट्स (चित्रा 2 सी) की मात्रा निर्धारित करें।
- सीटीवोल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुनर्निर्मित त्रि-आयामी छवि ढेर में ओस्टियोफाइट्स की पहचान करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: खनिज युक्त ओस्टियोफाइट्स बुनी हुई हड्डी के समान प्रोट्रूशियंस हैं जो सबकॉन्ड्रल हड्डी18 के औसत पक्ष पर दिखाई देते हैं। इनमें से एक उदाहरण चित्रा 2 सी में पीले तीरों के साथ इंगित किया गया है। - मैन्युअल रूप से घुटने के जोड़ के औसत पक्ष में पहचाने गए ओस्टियोफाइट्स की संख्या की गणना करें।
- 2 डी अनुक्रमिक छवि विश्लेषण (सीटी विश्लेषक का उपयोग करके) में ओस्टियोफाइट की मात्रा को मापें, मैन्युअल रूप से ओस्टियोफाइट्स के किनारे को रेखांकित करके, विश्लेषण के लिए रुचि के क्षेत्र (आरओआई) के रूप में सबकॉन्ड्रल प्लेट से बाहर निकलकर।
- सीटी विश्लेषक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके ओस्टियोफाइट वॉल्यूम पर हड्डी की मात्रा के अनुपात के रूप में ओस्टियोफाइट हड्डी घनत्व की गणना करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- सीटीवोल सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुनर्निर्मित त्रि-आयामी छवि ढेर में ओस्टियोफाइट्स की पहचान करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- पैराफिन-एम्बेडेड 6 μm अनुभागों पर OARSI उपास्थि क्षति स्कोर19 और सिनोविटिस स्कोर20 के अनुसार उपास्थि क्षति और सिनोविटिस (चित्रा 2 डी) का मूल्यांकन करें।
- स्कैनिंग के बाद, घुटने के जोड़ों को कम से कम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% ईडीटीए में डिकैल्सीफाई करें, सप्ताह में दो बार घोल बदलें।
- पैराफिन में नमूने एम्बेड करें। उपचार और इनक्यूबेशन अवधि के लिए, अनुपूरक फ़ाइल 1 देखें।
- एक रोटरी माइक्रोटोम पर पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों के 5 μm कोरोनल खंडों को काटें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- उस क्षेत्र में अनुभागों का चयन करें जहां टिबियल और ऊरु कोंडिल्स मिलते हैं (चित्रा 2 डी)। जोड़ के तीन समान दूरी वाले क्षेत्रों में दो खंडों का चयन करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन में स्कोर किए गए अनुभागों को 80-100 μm के क्षेत्रों में चुना गया था। - नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए सैफ्रानिन-ओ और फास्ट ग्रीन ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ स्टेन सेक्शन।
- 5 मिनट (2x) के लिए जाइलीन में (उल्लिखित अनुक्रम में), 2 मिनट के लिए 100% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 95% इथेनॉल, 2 मिनट के लिए 80% इथेनॉल और 2 मिनट के लिए 70% इथेनॉल को डुबोकर खंडों को डीपैराफिनाइज़ करें।
- 30 सेकंड के लिए फ़िल्टर किए गए हेमेटॉक्सिलिन के साथ दाग ( सामग्री की तालिका देखें)। फिर 5 मिनट (तीन बार) के लिए नल के पानी में कुल्ला करें।
- स्कॉट के बफर (2 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट और 1 लीटर आसुत पानी में 10 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट) के साथ 2 मिनट के लिए धो लें। 5 मिनट (तीन बार) के लिए 'नल के पानी' में कुल्ला करें।
- 0.2% तेज हरे रंग के साथ 4 मिनट के लिए दाग। 1% ग्लेशियल एसिटिक एसिड में डुबकी, पांच बार (ताजा प्रत्येक सत्र बनाया गया)। नल के पानी में जल्दी से धो लें।
- 0.5% Safranin-O के साथ 5 मिनट के लिए दाग। 95% इथेनॉल में कुल्ला करें। 3 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में निर्जलित खंड और उसके बाद जाइलीन में 3 मिनट।
- कार्टिलेज19 के लिए ग्लासन एट अल और सिनोवाइटिस20 के लिए जैक्सन एट अल में बताए गए स्कोर सेक्शन।
नोट: परिमाणीकरण के अन्य तरीके मौजूद हैं, जैसे कि पिनामोंट एट अल.21 द्वारा कंप्यूटर-आधारित परिमाणीकरण। - दो अलग-अलग स्कोरर के साथ स्कोरिंग सिस्टम को मान्य करें, प्रयोग के लिए अंधे।
Representative Results
रियर संचालित/ओए लेग के कुल बॉडी वेट में प्रतिशत भार की तुलना विपरीत/नियंत्रण पैर से की गई थी। यद्यपि अन्य पैरामीटर भी महत्वपूर्ण अंतर दे सकते हैं, जैसे सर्जिकल हस्तक्षेप के बाद सामने के पंजे के भार में वृद्धि, रियर पंजा लोड में लगातार बदलाव एक पैर को दूसरे पर उपयोग करने की प्राथमिकता को इंगित करता है और ओए विकास के कारण माउस के लिए महत्वपूर्ण असुविधा का अधिक प्रत्यक्ष संकेतक है। प्रेरण के बाद 8 सप्ताह के भीतर डीएमएम मॉडल में रियर लेग लोड में कोई महत्वपूर्ण बदलाव नहीं हुआ, जबकि डीसीएस चूहे हस्तक्षेप के 2 सप्ताह बाद विपरीत / नियंत्रण पैर का पक्ष लेते हैं (चित्रा 3 ए)।
टिबियल कोंडिल के औसत दर्जे के लोडेड क्षेत्र के तहत मात्रा पर ध्यान केंद्रित करके सबकॉन्ड्रल हड्डी का विश्लेषण किया गया था। यहां हमने रुचि के क्षेत्र के भीतर खनिज हड्डी के प्रतिशत का निर्धारण करके इस क्षेत्र के हड्डी घनत्व का आकलन किया और विपरीत और निचले पैर के बीच अनुपात की गणना की। अनुपात इंगित करता है कि दोनों मॉडलों ने प्रेरण के 4 सप्ताह बाद प्रभावित अंग (1 से ऊपर का अनुपात) में हड्डी घनत्व में वृद्धि की है (चित्रा 3 बी)। ओस्टियोफाइट्स का उद्भव डीसीएस मॉडल में अधिक प्रमुख है, जहां हस्तक्षेप के 2 सप्ताह बाद डीएमएम मॉडल की तुलना में संख्या और मात्रा में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है (चित्रा 3 सी, डी)। डीसीएस प्रेरण के 4 सप्ताह बाद मेडियल टिबियल और फेमोरल डिब्बों और सिनोवाइटिस (चित्रा 3 ई, एफ) में ऊंचा उपास्थि क्षति प्रस्तुत करता है।
चित्रा 1: माउस में पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए को प्रेरित करने के लिए सर्जिकल हस्तक्षेप। अनुक्रमिक छवियां प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (ए) पेटेलर लिगामेंट के मध्यवर्ती पक्ष पर और स्नायुबंधन से दूर 11 स्केलपेल ब्लेड डालकर घुटने के चारों ओर सतही झिल्ली को काटने वाले संयुक्त कैप्सूल का संपर्क। यह इन्फ्रापेटलर वसा पैड को उजागर करेगा। (बी) मेडियल मेनिस्कोटिबियल लिगामेंट की पहचान और ट्रांससेक्शन। लिगामेंट की पहचान करने के लिए, पेटेलर लिगामेंट को पार्श्व पक्ष की ओर ले जाएं और फिर वसा पैड को ऊपर की ओर धकेलें। यह टिबियल कोंडल के ठीक ऊपर एक छोटी क्षैतिज सफेद रेखा के रूप में लिगामेंट के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है (यहां एक काले तीर के साथ इंगित किया गया है)। लिगामेंट को काटने के लिए, स्प्रिंग कैंची के निचले ब्लेड को लिगामेंट के नीचे रखा जाता है, इस बात का ध्यान रखा जाता है कि उपास्थि को नुकसान न पहुंचे। टिबियल कोंडिल की कल्पना करने के लिए मेनिस्कस को मेडियल साइड की ओर ले जाएं। (सी) उजागर उपास्थि की सतह को खरोंचना और घाव का बंद होना। उपास्थि को खरोंचने के लिए, माइक्रोब्लेड को पीछे की ओर डाला जाता है, जहां यह उपास्थि से संपर्क करता है और फिर जोड़ के पूर्ववर्ती भाग की ओर आगे बढ़ता है। एक बार खरोंच हो जाने के बाद, त्वचा को घुटने के ऊपर खींचें और घाव को या तो सबडर्मल ट्यूरिंग द्वारा या घाव क्लिप के साथ बंद करें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: माउस में पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस का मूल्यांकन। (A) गतिशील भार-असर में दबाव मैट पर लोड को संबंधित पंजे से मिलान करना शामिल है। लोड को तब कुल वजन के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया जाता है। (बी) सबकॉन्ड्रल हड्डी को मेडियल टिबियल कोंडिल के लोडिंग क्षेत्र में रुचि की मात्रा का चयन करके और सबकॉन्ड्रल प्लेट या ट्रिब्युलर हड्डी का चयन करके मापा जाता है। (सी) ओस्टियोफाइट्स को अधिग्रहित 3सीटी छवियों के त्रि-आयामी दृश्य में पहचाना और परिमाणित किया जाता है। ओस्टियोफाइट्स की मात्रा को ओस्टियोफाइट के किनारे को रेखांकित करने वाले आरओआई का चयन करके मापा जाता है। अस्थि घनत्व की गणना प्रति ओस्टियोफाइट वॉल्यूम में हड्डी की मात्रा के रूप में की जाती है। यहां प्रस्तुत छवियों को 2 μm के संकल्प पर लिया गया था, लेकिन परिमाणीकरण आमतौर पर 4.5 μm रिज़ॉल्यूशन के साथ किया जाता है। (डी) कार्टिलेज और सिनोविटिस स्कोर 6 μm वर्गों से लिए जाते हैं जो सैफ्रानिन-ओ और फास्ट ग्रीन से सना होता है। माउस घुटने का एक कोरोनल खंड जहां एक ब्लैक बॉक्स के साथ चिह्नित सभी चतुर्थांश स्कोरिंग के लिए दिखाई देते हैं और औसत दर्जे के पक्ष का आवर्धन दिखाया गया है। घुटने के जोड़ के मध्य पक्ष के आसपास सिनोविटिस भी दिखाई देता है, खासकर विस्थापित मेनिस्कस के ऊपर और नीचे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: डीएमएम और डीसीएस मॉडल में ओए का प्रतिनिधि मूल्यांकन। (ए) डीडब्ल्यूबी ने एक ही विशेषज्ञ ऑपरेटर द्वारा किए गए प्रयोगों पर प्रेरण के 8 सप्ताह बाद तक मापा। लोड को संचालित / ओए लोड बनाम विपरीत / नियंत्रण लोड के बीच अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है। दोनों पैरों के युग्मित टी-परीक्षण भी शाम (ग्रे), डीएमएम (नीले), और डीसीएस (गुलाबी) मॉडल में दिखाए गए हैं। सर्जिकल हस्तक्षेप के 4 सप्ताह बाद सीटी विश्लेषण। (बी) सर्जिकल हस्तक्षेप के 4 सप्ताह बाद सबकॉन्ड्रल हड्डी का विश्लेषण किया गया और इसे %BV/TV पर मस्तिष्क के अनुपात के रूप में व्यक्त किया गया। (सी) ओस्टियोफाइट संख्या और (डी) ओस्टियोफाइट वॉल्यूम का विश्लेषण प्रेरण के 2 सप्ताह बाद किया गया था। (ई) टिबियल और फेमोरल आर्टिकुलर कार्टिलेज और (एफ) सिनोविटिस के उपास्थि क्षति के प्रेरण के 4 सप्ताह बाद हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन मानकीकृत तरीकों19,20 के साथ स्कोर किया गया था। डेटा को मानक विचलन के औसत ± रूप में व्यक्त किया जाता है, एन ≥ 5। डेटा की तुलना एनोवा द्वारा एक सिडक परीक्षण सुधार (ए), युग्मित टी-टेस्ट (ए), या मानक छात्र के टी-टेस्ट (बी-एफ) के साथ बार-बार किए गए एनोवा द्वारा की गई थी। *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns = महत्वपूर्ण नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फ़ाइल 1: पैराफिन एम्बेडिंग के लिए उपचार और इनक्यूबेशन स्थिति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
पोस्ट-ट्रॉमेटिक ऑस्टियोआर्थराइटिस (पीटीओए) के सर्जिकल प्रेरण को करने के लिए, एक सहायक से समर्थन की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है (उदाहरण के लिए, चूहों को तैयार करने के लिए जबकि ऑपरेटर सर्जरी पर केंद्रित है)। यह सड़न रोकनेवाला सर्जरी की सुविधा प्रदान करता है, जिससे संक्रमण के जोखिम कम हो जाते हैं और बड़े प्रयोगों में हस्तक्षेप अधिक कुशल हो जाता है। सर्जरी के दौरान फोकस के विमान को खोना आसान है, इसलिए एक माइक्रोस्कोप जिसमें ध्यान केंद्रित करने के लिए पेडल शामिल हैं, सर्जरी के दौरान बाँझपन बनाए रखने में मदद करने में एक मूल्यवान विशेषता है। माउस और घुटने की स्थिति महत्वपूर्ण है। घुटने के जोड़ों की जगह को अधिकतम करने के लिए घुटने को ऊपर की ओर और पर्याप्त रूप से झुका हुआ होना चाहिए, जिससे कोंडिल सतह को खरोंचने के लिए माइक्रोब्लेड को पेश करने के लिए लिगामेंट तक आसान पहुंच की सुविधा मिल सके। एमएमटीएल की पहचान करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब वसा पैड सामान्य से बड़ा होता है या एक छोटा सा खून बहता है। खून बहने से बचने के लिए, आँसू और बाद में रक्तस्राव को रोकने के लिए वसा पैड को ऊपर की ओर धकेलें। यदि वसा पैड बड़ा है, तो इसमें थोड़ा अधिक समय लग सकता है, लेकिन धैर्यपूर्वक इसे ऊपर की ओर धकेलना जारी रखें।
एमएमटीएल टिबियल कोंडिल के काफी करीब है, इसलिए एमएमटीएल के तहत घुमावदार स्प्रिंग कैंची के निचले ब्लेड को तैनात करते समय उपास्थि को चोट न पहुंचाने का ध्यान रखना चाहिए। घुमावदार ब्लेड को कोंडिल के समानांतर, औसत दर्जे की ओर और थोड़ा ऊपर की ओर इंगित करना चाहिए। एमएमटीएल के सर्वोत्तम सेक्शनिंग के लिए, सुनिश्चित करें कि कैंची तेज है। जांचें कि मेनिस्कस लिगामेंट काटने के बाद मध्यम रूप से आगे बढ़ सकता है, क्योंकि कभी-कभी एक छोटा सा लगाव रहता है जिसे आगे काटने की आवश्यकता होती है। कोंडिल को खरोंचने के लिए माइक्रोब्लेड पेश करते समय, यह कोंडिल के लंबवत होना चाहिए। पहली खरोंच को जोड़ के बीच के करीब रखें, लेकिन इस बात का ध्यान रखें कि पूर्ववर्ती क्रूसिएट लिगामेंट को नुकसान न पहुंचे। फिर मेडियल साइड की ओर बढ़ें और फिर मेनिस्कस के पीछे जाएं। खरोंच उपास्थि पर धुंधली सफेद रेखाओं के रूप में दिखाई दे सकती है। क्योंकि हम आमतौर पर क्लिप का उपयोग करते हैं, प्रारंभिक चीरा पार्श्व पक्ष पर किया जाता है, इसलिए घाव को बंद करने के बाद क्लिप को पैर के किनारे पर तैनात किया जाता है। यह घुटने को रगड़ने वाली क्लिप से बचता है क्योंकि माउस आंदोलन को फिर से प्राप्त करता है। सीवन का उपयोग करते समय, सबडर्मल टांके के उपयोग की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। यदि बाहरी टांके का उपयोग किया जाता है, तो चूहों को टांके में घोंपने और उनके घाव को खोलने की संभावना होती है, जिससे संक्रमण की संभावना बढ़ जाएगी। जब सही तरीके से किया जाता है, तो इस सर्जरी को चीरा से घाव बंद होने तक 5-10 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए, इस प्रकार उपास्थि के जोखिम को कम करना और किसी भी अतिरिक्त अनियंत्रित क्षति हो सकती है। सर्जरी के बाद, चूहे बहुत जल्दी ठीक हो जाते हैं और लगभग तुरंत पिंजरे में चढ़ सकते हैं और सामान्य रूप से घूम सकते हैं। यदि चूहे सक्रिय नहीं हैं, तो इकाई में उपयुक्त विशेषज्ञ से परामर्श किया जाना चाहिए।
दर्द के व्यवहार मूल्यांकन के लिए, गतिशील वजन-असर का आकलन किया गया था। हालांकि, इस विधि को अन्य उत्तेजित दर्द परीक्षणों की तुलना में कम संवेदनशील माना जा सकता है, जैसे वॉन फ्रे परीक्षण15। यह अनुशंसा की जाती है कि दर्द की निगरानी और आकलन करने के लिए एक से अधिक तरीकों का उपयोग किया जाता है। डीसीएस में हस्तक्षेप के 2 सप्ताह बाद देखे गए परिवर्तन, भले ही क्षणिक हों, स्वस्थ पैर की तुलना में ओए पैर की आम तौर पर कम लोडिंग का संकेत देते हैं। इसलिए, डीसीएस हस्तक्षेप के 2 सप्ताह बाद माउस मॉडल में शुरुआती ऑस्टियोआर्थ्रिटिक या चोट के दर्द का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 3सीटी द्वारा खनिज युक्त ओस्टियोफाइट्स का विज़ुअलाइज़ेशन त्रि-आयामी परिमाणीकरण की अनुमति देता है, जिसे हिस्टोलॉजिकल सेक्शन12 से भी मिलान किया जा सकता है, जो ओस्टियोफाइट उद्भव और विकास के अध्ययन में एक और आयाम जोड़ता है। हमारे समूह में, ऑपरेटरों के बीच और भीतर डीएमएम मॉडल में ओस्टियोफाइट की उपस्थिति परिवर्तनशील थी (2.3 ± 1 बनाम 1.2 ± 1, एन > 7, पी = 0.0183), जबकि डीसीएस के प्रेरण ने ऑपरेटर के बावजूद सभी मामलों में ओस्टियोफाइट उत्पादन को मजबूत रूप से जन्म दिया (2.6 ± 0.7 बनाम 2.4 ± 0.5, एन > 7, पी = 0.711)। इसके अलावा, डीएमएम की तुलना में डीसीएस मॉडल में काफी अधिक और बड़े ओस्टियोफाइट्स हैं। इस प्रकार, डीसीएस ओस्टियोफाइट गठन के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है। सबकॉन्ड्रल हड्डी के लोडिंग क्षेत्र तक सीमित ओस्टियोस्क्लेरोसिस का परिमाणीकरण भी छोटे परिवर्तनों का पता लगाने में एक सुधार है। संचालित पैर के मध्यवर्ती डिब्बे की तुलना विपरीत पैर से करना भी उस विशेष माउस12 के आंतरिक हड्डी फेनोटाइप के खिलाफ सामान्य करने का एक तरीका प्रदान करता है। डीसीएस मॉडल में उपास्थि खरोंच के अलावा सर्जरी के दौरान केंद्रित उपास्थि क्षति को प्रेरित करने का एक नियंत्रित साधन है जो रोग के कई पहलुओं को तेज करता है। कार्टिलेज को जानबूझकर नुकसान से जुड़ी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के परिणामों में से एक यह है कि इस कलात्मक क्षति को उपास्थि ग्रेडिंग प्रणाली में बाहर रखा जाना चाहिए या समायोजित किया जाना चाहिए। इस सीमा के कारण, हम इस मॉडल की सिफारिश नहीं करते हैं यदि अध्ययन का मुख्य उद्देश्य उपास्थि पर ऑस्टियोआर्थराइटिस के प्रभाव को समझना है। अंत में, यह भी दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि कम से कम दो अंधे स्कोरर उपास्थि क्षति और सिनोविटिस स्कोर को ग्रेड दें। यह स्कोरिंग सिस्टम के मानकीकरण को मान्य और बढ़ाता है।
इस अध्ययन की एक सीमा यह है कि डीसीएस और डीएमएम मॉडल की तुलना करने वाले सभी मापदंडों में परिवर्तनशीलता की सीमा का पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया गया था। इसे भविष्य में अधिक व्यापक अध्ययनों के साथ संबोधित किया जाएगा, जिसमें विभिन्न संस्थानों के ऑपरेटरों के बीच परिवर्तनशीलता का आकलन भी शामिल हो सकता है।
निष्कर्ष में, वर्तमान डीसीएस मॉडल में त्वरित ओए रोगजनन पोस्ट-ट्रॉमेटिक ओए के प्रतिनिधित्व की अनुमति देता है और इस पुरानी दुर्बल संयुक्त बीमारी को चलाने वाले अंतर्निहित ओए पैथोफिजियोलॉजिकल तंत्र की जांच और स्पष्ट करने के लिए एक शक्तिशाली और मजबूत शोध उपकरण प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, यह ओए को कम समय की खिड़की में खोजने में सक्षम बनाता है, ओस्टियोफाइटोजेनेसिस, ओए दर्द और पूरे जोड़ पर उपास्थि क्षति के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करता है।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम लिवरपूल विश्वविद्यालय में जेम्मा चार्ल्सवर्थ और मंडी प्रायर के काम को स्वीकार करना चाहते हैं, जिन्होंने इस प्रकाशन में उपयोग की जाने वाली 3सीटी छवियों का अधिग्रहण किया। काम को वर्से अर्थराइटिस (अनुदान 20199 और 22483) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लिनेट डनिंग को बनाम आर्थराइटिस (अनुदान 20199) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। केंडल मैककुलोच को यूडब्ल्यूएस पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था। कारमेन ह्यूसा को वर्साइटिस (अनुदान 20199 और 22483) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
| 15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
| 6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | - | alternative method to close wound |
| Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | - | |
| Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | - | To sterilise surgical skin area |
| Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
| Balance | Generic (many different suppliers) | - | To weigh mouse |
| Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
| Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | Analgesia |
| CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
| Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
| EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
| Ethanol | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
| Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
| Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
| Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
| Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | - | |
| Mice | Charles river | - | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
| Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
| Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
| Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
| Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
| Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
| Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | - | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
| Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
| Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
| Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | - | To ensure sterility of surgical area |
| Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | To cover mouse and expose leg |
| Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
| Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | - | maintain sterile environment for surgical tools |
| Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | - | cover the mouse and keep leg through key hole |
| Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
| Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | - | Adjustable focus. |
| Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
| Xylene | Generic (many different suppliers) | - | for embedding decalcified bones |
References
- Arthritis Research UK. The State of Musculoskeletal Health 2018. Arthritis Research UK. , (2018).
- Mahir, L., et al. Impact of knee osteoarthritis on the quality of life. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59, 159 (2016).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2016).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Sophocleous, A., Huesa, C. Osteoarthritis mouse model of destabilization of the medial meniscus. Methods in Molecular Biology. 1914, 281-293 (2019).
- McCulloch, K., et al. Accelerated post traumatic osteoarthritis in a dual injury murine model. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (12), 1800-1810 (2019).
- Fan, X., Wu, X., Crawford, R., Xiao, Y., Prasadam, I. Macro, micro, and molecular changes of the osteochondral interface in osteoarthritis development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 659654 (2021).
- Hwang, H. S., Park, I. Y., Hong, J. I., Kim, J. R., Kim, H. A. Comparison of joint degeneration and pain in male and female mice in DMM model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (5), 728-738 (2021).
- Loga, I. S., et al. Does pain at an earlier stage of chondropathy protect female mice against structural progression after surgically induced osteoarthritis. Arthritis & Rheumatology. 72 (12), 2083-2093 (2020).
- Ma, H. L., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Cicero, L., Fazzotta, S., Palumbo, V. D., Cassata, G., Lo Monte, A. I. Anesthesia protocols in laboratory animals used for scientific purposes. Acta Biomedica. 89 (3), 337-342 (2018).
- Huesa, C., et al. Proteinase-activated receptor 2 modulates OA-related pain, cartilage and bone pathology. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (11), 1989-1997 (2016).
- Tappe-Theodor, A., King, T., Morgan, M. M. Pros and cons of clinically relevant methods to assess pain in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 100, 335-343 (2019).
- Stewart, K., Schroeder, V. A. Lab animal research. blood withdrawal I. JoVE Science Education Database. , Cambridge, MA. (2018).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of Neuroscience Methods. 53 (1), 55-63 (1994).
- Lakes, E. H., Allen, K. D. Gait analysis methods for rodent models of arthritic disorders: reviews and recommendations. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (11), 1837-1849 (2016).
- Das Neves Borges, P., Forte, A. E., Vincent, T. L., Dini, D., Marenzana, M. Rapid, automated imaging of mouse articular cartilage by microCT for early detection of osteoarthritis and finite element modelling of joint mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (10), 1419-1428 (2014).
- vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. Osteophytes: relevance and biology. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (3), 237-244 (2007).
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Van Den Berg, W. B., Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, SUPPL 3 17-23 (2010).
- Jackson, M. T., et al. Depletion of protease-activated receptor 2 but not protease-activated receptor 1 may confer protection against osteoarthritis in mice through extracartilaginous mechanisms. Arthritis and Rheumatology. 66 (12), 3337-3348 (2014).
- Pinamont, W. J., et al. Standardized histomorphometric evaluation of osteoarthritis in a surgical mouse model. Journal of Visualized Experiments. (159), e60991 (2020).
